專利名稱:28-表雷帕霉素類似物的制作方法
背景技術(shù):
雷帕霉素為由吸水鏈霉菌產(chǎn)生的大環(huán)內(nèi)脂類抗菌素。它與具有高親合力的FK506-結(jié)合蛋白結(jié)合,產(chǎn)生雷帕霉素FKBP配合物。報導(dǎo)的它們相互作用的Kd值低到200pM。雷帕霉素FKBP配合物對大量細(xì)胞蛋白質(zhì),F(xiàn)RAP,具有高親合力,產(chǎn)生三重的配合物[FKBP雷帕霉][FRAP]。在該配合物中雷帕霉素作為連接FKBP與FRAP的二聚因子或接合器。
雷帕霉素
雷帕霉素為有效的免疫抑制劑,臨床上用于預(yù)防器官移植的排斥。
作為FKBP與FRAP配合物的接合器,雷帕霉素也能夠充當(dāng)多聚化因子適當(dāng)?shù)鼐幦氚‵KBP衍生區(qū)域和FRAP衍生區(qū)域地嵌合的蛋白質(zhì)。由于那些活性,雷帕霉素及其各種衍生物或同型物也可用作多聚化因子激活以這樣的嵌合的蛋白質(zhì)為基準(zhǔn)的生物學(xué)轉(zhuǎn)變。參見,例如,WO96/41865;WO 99/36553;Rivera et al Proc NatI Acad Sci U S A 96,8657-8662;和Ye X et al(1999)Science 283,88-91。就雷帕霉素本身來說,它的顯著的生物學(xué)活性,包括有效的免疫抑制活性,限制了它在某些生物學(xué)轉(zhuǎn)變中的某些應(yīng)用,特別是那些對雷帕霉素敏感的動物或動物細(xì)胞。
大量雷帕霉素的結(jié)構(gòu)類似物已經(jīng)有報導(dǎo),它們典型地作為發(fā)酵產(chǎn)品替換物,或者從合成方面努力以便提高該化合物作為免疫抑制劑的治療指數(shù)。例如,有廣泛的文獻(xiàn)報導(dǎo)了在結(jié)構(gòu)上與雷帕霉素相關(guān)同系物,類似物,衍生物及其他化合物(“雷帕霉素類似物”)包括具有一個或多個下列修飾的雷帕霉素的一些變體C7,C42和/或C29甲氧基的脫甲基,消去或置換作用;C13,C43和/或C28羥基的消除,衍生或置換作用;C14,C24和/或C30酮的還原,消除或衍生作用;6-元的-哌啶酸環(huán)與5-元脯氨酰環(huán)的置換作用;和環(huán)己基環(huán)上的選擇性取代或環(huán)己基環(huán)與取代的環(huán)戊基環(huán)置換作用。其他背景資料存在于US專利Nos.5,525,610;5,310,903和5,362,718的背景技術(shù)部分,參見US專利No.5,527,907。
具有低的免疫抑制活性和/或有效的藥物動力學(xué)或生物利用率性能的新的雷帕霉素類似物非常適于用作多聚化藥劑或抗真菌藥劑。
相對于雷帕霉素具有改進(jìn)的特性,例如,治療指數(shù),生物利用率,藥物動力學(xué),穩(wěn)定性,等等的新的雷帕霉素類似物也可用作免疫抑制劑。
發(fā)明概要
當(dāng)研究各種路易斯酸的C7親核取代化學(xué)時,我們發(fā)現(xiàn)在沒有任何親核試劑的情況下用二氯甲烷中的Ti(OiPr)4處理雷帕霉素時導(dǎo)致一種全新的反應(yīng),得到的主要產(chǎn)品為一種未知的化合物。通過NMR分析接著X-ray結(jié)晶學(xué)分析,我們確實(shí)地測定并驚奇的是,我們已經(jīng)第一次制造出新的雷帕霉素類似物,28-表雷帕霉素
28-表雷帕霉素
這個轉(zhuǎn)變代表一種在極為適度和中性的條件下將雷帕霉素轉(zhuǎn)變?yōu)樵撔禄衔铮?8-表雷帕霉素的有效的和選擇性的差向異構(gòu)化方法。
這個發(fā)現(xiàn)開創(chuàng)了以28-表雷帕霉素為基礎(chǔ)的一類新的和令人感興趣的雷帕霉素類似物的領(lǐng)域。這一類新化合物包括28-表雷帕霉素及其除了C28之外一個或多個位置被修飾(關(guān)于雷帕霉素的結(jié)構(gòu))的衍生物和同型物。本發(fā)明也提供以這些新的28-表雷帕霉素類似物為基準(zhǔn)用于基因改造的細(xì)胞中使嵌合蛋白質(zhì)多聚化,并在某些情況下用于抑制免疫反應(yīng)或治療或預(yù)防需要治療的患者中致病真菌感染的組合物和方法。包括本發(fā)明28-表化合物的組合物優(yōu)選基本上排除同源的C28差向異構(gòu)體(即,排除具有在雷帕霉素中的C28立體化學(xué)的差向異構(gòu)體)。換句話說,優(yōu)選的組合物包括不超過20%天然存在的在28位上的差向異構(gòu)體的本發(fā)明28表化合物,更優(yōu)選少于10%,甚至更優(yōu)選少于5%,最優(yōu)選少于1%的同源的C28差向異構(gòu)體(以重量或摩爾計)。
本發(fā)明化合物包括28-表雷帕霉素和在C7,C13,C14,C24,C28,C30和帶有C43的環(huán)己基環(huán)上的一個或多個取代基修飾的28-表雷帕霉素類似物。在文獻(xiàn)中已知上述位置的各式各樣的合成變換,它們適應(yīng)于本發(fā)明,例如,雷帕霉素作為原料合成取代的28-表雷帕霉素。本申請注意到了許多變換。參見WO 99/36553。另外,如本申請描述,在文獻(xiàn)中已知許多天然存在的雷帕霉素同型物可在28位差向異構(gòu)化。本發(fā)明化合物還要包括以2-甲基哌啶基或脯氨酰環(huán)狀系統(tǒng)為基準(zhǔn)的28-表雷帕霉素類似物(即,“n”如下列結(jié)構(gòu)所示,可能是1或2)。本發(fā)明化合物還包括28-表雷帕霉素類似物的藥學(xué)上可接受的衍生物。這將在下面的詳細(xì)地論述。同樣,在文獻(xiàn)中已知許多另外的結(jié)構(gòu)修飾(即,除位置28差向異構(gòu)化以外的修飾)和得到雷帕霉素那些變體的方法的例子將在下文列舉,可適用于本發(fā)明提供全部28-表雷帕霉素類似物。
這樣的化合物的一個亞屬可以式I表示
其中
n為1或2;
R28和R43獨(dú)立地選自H和取代或未被取代的脂肪族基團(tuán),?;?,芳?;螂s芳?;糠?;
R7a和R7b之一為H以及另一個為鹵素,-RA,-ORA,-SRA,-OC(O)RA,-C(O)NRARB,-NRARB,-NRBC(O)RA,-NRBC(O)ORA,-NRBSO2RA或NRBSO2NRARB’;或R7a和R7b一起為下列四烯部分中的H
其中RA為H或取代或未被取代的脂肪族基團(tuán),雜脂肪族基團(tuán),芳基,雜芳基部分以及其中R8為H,OH或取代或未被取代的脂肪族基團(tuán),雜脂肪族基團(tuán),芳基,或雜芳基部分。
該化合物可以是基本上純的立體異構(gòu)體或立體異構(gòu)體的混合物,或其藥學(xué)上可接受的衍生物。優(yōu)選化合物為基本上純的28位的立體異構(gòu)體,更優(yōu)選28和43兩個位置的基本上純的立體異構(gòu)體。
這些化合物可以是以脯氨酰環(huán)(n=1)也可以是2-哌啶酸環(huán)(n=2)為基礎(chǔ)的,但后者目前特別令人感興趣。
一個使人感興趣的小組是式I的那些化合物,它們在雷帕霉素C7具有取代基,即其中R7a為OMe和R7b為H。該小組包括28-表雷帕霉素本身,相對于雷帕霉素結(jié)構(gòu)除C7以外的一個或多個位置(例如,在位置28和/或43)修飾的衍生物和同型物。
另一個使人感興趣的小組為包括上述的小組以及如下所述其中R28為除H以外的部分的式I化合物。例如,R28可以是烷基、芐基或其他取代的烷基、烯丙基,等等。
另一個使人感興趣的小組為包括上述的小組以及如下所述其中R28和R43為H的式I化合物。該小組包括28-表雷帕霉素本身,及其他在C7修飾的化合物。
另一個使人感興趣的小組為其中C7的一個或兩個取代基不同于相應(yīng)的雷帕霉素C7取代基,即,其中R7a為除-OMe以外的部分和/或R7b為除H以外的部分的式I的28-差向異構(gòu)化合物。在該小組的某些化合物中,R7a和R7b中的一個為取代或未被取代的芳基或雜芳基,取代或未被取代的不飽和脂肪族基團(tuán),芳基或雜芳基醚,取代或未被取代的芐基醚,-NRBCONRARB,-NRBC(O)RA,-NRBC(O)ORA,-NRBSO2RA或-NRBSO2NRARB。在某些情況下,式I其他化合物中更常見,R8可以是H,OH或烷基。這樣的部分的例子包括其-NH-C(O)ORA,-NHC(O)ORA,-NHSO2RA等等,以及N-烷基(例如N-甲基,N-乙基,等等)和其N-羥基衍生物。在某些使人感興趣的具體方案中,RA為H,而另一些為取代或未被取代的脂族基團(tuán),例如烷基部分。通常,該文件包括包含NH-部分(例如,-NHRA,-NHC(O)RA,-NHSO2RA,等等)的化合物,相關(guān)的N-烷基和N-羥基化合物(例如-N(RA’)RA,-N(RA’)C(O)RA,-N(RA’)SO2RA,-N(OH)RA,-N(OH)C(O)RA,-N(OH)SO2RA,等等)也包括,其中RA為H或取代或未被取代的脂族基團(tuán),雜脂族基團(tuán),芳基或雜芳基部分。
作為另外的說明,該小組包括其中C7具有下列類型的取代基的式I的28表雷帕霉素類似物
文獻(xiàn)中的方法可以在雷帕霉素C7位帶有這樣的取代基,而且那些方法可用來制造相應(yīng)C7 28-表雷帕霉素類似物。
上述小組包括其中只在C7進(jìn)一步修飾,即,其中R28和R43為H的28-表雷帕霉素類似物(其中n為1或2),以及其中除了C7和C28之外還包含一個或多個位置修飾的化合物。該小組更高級衍生的化合物包括其中R28為除H以外基團(tuán)的化合物。
另一個令人感興趣的式I化合物小組包括其中R43為除H以外的部分,即有或者沒有本申請公開的任何進(jìn)一步修飾的那些式I的28-表雷帕霉素類似物,包括上下文描述的該小組的化合物。該小組包括其中R43是脂族基團(tuán)或?;糠值氖絀化合物,脂族基團(tuán)部分的舉例包括取代或未被取代的烷基部分如羥基烷基基團(tuán)如-CH2CH2OH,烷氧基烷基基團(tuán)如CH3OCH2-,取代或未被取代的芐基等等,或取代或未被取代的烯基或炔基部分如烯丙基或取代的烯丙基部分,?;糠职ㄈ缤榛?CO-,氨基烷基-CO-,取代的氨基烷基-CO-,等等部分,包括取代或未被取代的甘氨酰(例如,RARBN-CH2-CO-)及其他在C43上取代和未被取代的酯。除了C43之外,這樣的官能團(tuán)可用來在28-表雷帕霉素類似物上衍生一種或多種其他的羥基部分。在任何場合,除如下記錄之外,C43取代基可以存在立體化學(xué)取向,或者該化合物可以存在兩個C43立體異構(gòu)體的混合物。
另一個使人感興趣的式I化合物的小組包括其中n is 2,R7a為-OMe以及R7b和R28都為H的I化合物。
本發(fā)明化合物也包括式II表示的24,30-四氫-28表雷帕霉素類似物
其中R基團(tuán)如上所述。母體化合物,24,30-四氫-28-表雷帕霉素可以使用文獻(xiàn)中轉(zhuǎn)換雷帕霉素至24,30-四氫-雷帕霉素的方法制備,但是原料用28-表雷帕霉素代替雷帕霉素。參見,例如WO 99/36553。
本發(fā)明的這些及其他些化合物既以脯氨酰環(huán)(n=1)也可以2-哌啶酸環(huán)(n=2)為基礎(chǔ),但后者目前特別令人感興趣。該部分-OR43可以是S或R定向。
一個使人感興趣的小組為在雷帕霉素C7具有取代基,即其中R7a為OMe和R7b為H的式II化合物。該小組包括24,30-四氫28-表雷帕霉素本身,以及相對于雷帕霉素結(jié)構(gòu)(例如,在位置28和/或43)除C7以外的一個或多個位置修飾的衍生物和同型物。
另一個使人感興趣的小組為包括上述的小組以及如下所述,其中R28和R43為H的式II化合物。該小組包括24,30-四氫28-表雷帕霉素本身,及其他在C7修飾的化合物。
另一個使人感興趣的小組為其中在C7的一個或兩個取代基不同于雷帕霉素相應(yīng)的C7取代基,即其中R7a為除-OMe的部分和/或R7b為除H以外的部分的式II的24,30-四氫28-表化合物。這樣的部分可以選自與C7修飾有關(guān)的文件中所論述的基團(tuán)。
上述小組包括其中只在C7進(jìn)一步修飾,即,其中R28和R43為H的24,30-四氫28-表雷帕霉素類似物(其中n為1或2),以及其中除了C7和C28之外還包含一個或多個位置修飾的化合物。該小組更高級衍生的化合物包括相對于雷帕霉素一個或兩個R28和R43也被修飾的化合物。
另一個令人感興趣的式II化合物小組包括其中R43為除H以外的部分,即有或者沒有本申請公開的修飾的那些式II的24,30-四氫28-表雷帕霉素類似物,包括上下文描述的小組的化合物。該小組包括其中R43為脂族基團(tuán)或?;糠值氖絀I化合物。典型的脂族基團(tuán)部分包括取代或未被取代的烷基如羥基烷基基團(tuán)如-CH2CH2OH,等等或取代或未被取代的烯基或炔基部分如烯丙基或取代烯丙基部分。典型的?;糠职ㄔ贑43的部分如烷基-CO-,氨基烷基-CO-,取代氨基烷基-CO-,等等,包括甘氨酰及其他取代和未取代的酯。
另一個使人感興趣的式II化合物小組包括其中n為2,R7a為-OMe以及R7b和R28都為H的式II化合物。
同樣使人感興趣的化合物為其中包含一種或多種相對于雷帕霉素進(jìn)一步的修飾,例如雷帕霉素中的C7,C13,C14,C24,C30和環(huán)己基環(huán)狀系統(tǒng)中一個或多個連接-OR43取代基的28,29-二表雷帕霉素類似物。
各種28-表雷帕霉素類似物可以用一種或多種藥學(xué)上可接受的載體,稀釋劑或賦形劑配制得到包括一種本發(fā)明化合物的藥學(xué)上可接受的組合物。
我們的差向異構(gòu)化方法廣泛地適用于羥醛,通??捎行У赜糜谒幬锖头撬幬锏暮铣伞R虼吮景l(fā)明進(jìn)一步提供一種使羥醛部分的羥基差向異構(gòu)化的新方法,其中包括在適宜條件下用四烷氧基鈦試劑與包含羥醛部分的化合物接觸并給予充分的時間使其差向異構(gòu)化。該反應(yīng)優(yōu)選地在低于約75C下進(jìn)行,更優(yōu)選低于約50C°,并且甚至優(yōu)選低于30C°。該反應(yīng)優(yōu)選不加入堿。合適的四烷氧基鈦試劑包括如四異丙醇鈦。在很多情況下,差向異構(gòu)化產(chǎn)品從反應(yīng)混合物中得到。各個異構(gòu)體可以分別回收和純化。盡管反應(yīng)可以用于各式各樣的羥醛,但特別適用于敏感分子如多功能的大環(huán)分子及其他天然產(chǎn)物,包括雷帕霉素和雷帕霉素衍生物和同型物中的醛醇進(jìn)行差向異構(gòu)化。該方法根據(jù)反應(yīng)時間和條件的不同,可以生產(chǎn)28-表雷帕霉素,28-表雷帕霉素類似物,29-表雷帕霉素,29-表雷帕霉素類似物,28,29-雙表雷帕霉素和28,29-雙表雷帕霉素類似物。
如同WO 98/02441所述的其他的雷帕霉素類似物(特別是C7-衍生的28-表雷帕霉素類似物),本發(fā)明新的28-表雷帕霉素類似物可以用作抗真菌藥。如同科學(xué)和專利文獻(xiàn)所述的雷帕霉素,例如以下引用的(特別是相對于雷帕霉素具有未修飾的C7取代基,或其中肯定缺乏龐大的替換C7取代基的28-表雷帕霉素類似物),它們也可用作免疫抑制劑。如WO 96/41865和WO 99/36553所詳細(xì)描述的雷帕霉素及其他雷帕霉素類似物一樣,本發(fā)明化合物也可用于許多重要目的的細(xì)胞中的嵌合蛋白的多聚化。28-表雷帕霉素類似物在基因工程細(xì)胞中嵌合蛋白質(zhì)多聚化中的應(yīng)用在下文進(jìn)一步描述。
以上所述的該基因工程細(xì)胞包含一種或多種本發(fā)明所述特定的編碼嵌合蛋白質(zhì)的重組體核酸結(jié)構(gòu)。第一嵌合蛋白典型地包含一種或多種能夠與本發(fā)明28-表雷帕霉素類似物結(jié)合FKBP區(qū)域。該第一嵌合蛋白也指“FKBP融合蛋白質(zhì)”并且進(jìn)一步包括至少一種與其至少一個FKBP區(qū)域異源的蛋白質(zhì)區(qū)域。由FKBP融合蛋白質(zhì)與雷帕霉素類似物結(jié)合形成的配合物能夠與其中包含一種或多種FRB區(qū)域的第二嵌合蛋白(“FRB融合蛋白質(zhì)”)結(jié)合。FRB融合蛋白質(zhì)進(jìn)一步包括至少一種與其至少一種FRB區(qū)域異源的蛋白質(zhì)區(qū)域。在一些具體方案中,F(xiàn)KBP融合蛋白質(zhì)和FRB融合蛋白質(zhì)彼此不同??墒?,在其他的具體方案中,F(xiàn)KBP融合蛋白質(zhì)也為FRB融合蛋白質(zhì)。在那些具體方案中嵌合蛋白包括一種或多種FKBP區(qū)域以及一種或多種FRB區(qū)域。在此情況下,第一和第二嵌合的蛋白質(zhì)可以為相同的蛋白質(zhì),可以稱為FKBP-FRB融合蛋白質(zhì),至少包含一種與FKBP和/或FRB區(qū)域異源的區(qū)域。
基于適當(dāng)?shù)剡x擇的異源區(qū)域的結(jié)合,該嵌合蛋白是容易設(shè)計的,以致于它們的多聚化觸發(fā)了一個或多個各式各樣的生物學(xué)反應(yīng)。由雷帕霉素類似物-介導(dǎo)的絡(luò)合作用觸發(fā)的生物反應(yīng)的性質(zhì)是由融合蛋白質(zhì)標(biāo)記物中異源的區(qū)域的選擇測定。因此異源的區(qū)域稱為“活性”或“效應(yīng)因子”區(qū)域。應(yīng)用于實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的基因工程細(xì)胞將包含一種或多種編碼嵌合蛋白的重組體核酸結(jié)構(gòu),并在某些應(yīng)用中,將進(jìn)一步包含一種或多種輔助核酸結(jié)構(gòu),如一種或多種靶基因結(jié)構(gòu)。典型的生物學(xué)反應(yīng)中該體系和輔助核酸結(jié)構(gòu)的應(yīng)用在下文中詳細(xì)地論述。
一個包括相關(guān)材料和方法的體系公開于WO 96/41865和WO 99/36553(Clackson et al),預(yù)期用于許多用途,尤其包括,研究用途和治療用途。參見Rivera VM,Ye X,Courage NL,Sachar J,Cerasoli F,Wilson JM和Gilman M.(1999)肌內(nèi)基因轉(zhuǎn)移小鼠中的生長激素的長期可調(diào)型表達(dá)。Proc Natl AcadSci U S A 96,8657-8662;和Ye X,Rivera VM,Zoltick P,Cerasoli F Jr,SchnellMA,Gao G-p,Hughes JV,Gilman M,和Wilson JM(1999)體內(nèi)體細(xì)胞基因轉(zhuǎn)移后治療蛋白質(zhì)的調(diào)節(jié)釋放,Science 283,88-91。
本發(fā)明部分是基于類似于公開在上述專利文件和相關(guān)的科技出版物中的一個體系,但是包括利用新的28-表雷帕霉素類似物作為多聚化藥劑。因此本發(fā)明提供一種使細(xì)胞中嵌合蛋白質(zhì)多聚化的方法,其中包括(a)適當(dāng)?shù)靥峁┌苯颖磉_(dá)所需的嵌合蛋白的核酸結(jié)構(gòu)和任何所需的輔助重組體結(jié)構(gòu)的基因工程細(xì)胞,和(b)用本申請描述的28-表雷帕霉素類似物或其藥學(xué)上可接受的衍生物接觸該細(xì)胞。該雷帕霉素類似物形成一種包含其本身和至少兩個嵌合蛋白分子的配合物。改進(jìn)的雷帕霉素類似物用于包括下列的本發(fā)明。
其中可以用于本發(fā)明各種的方法的新的雷帕霉素類似物包括式III表示的亞結(jié)構(gòu)
它具有許多各種各樣的取代基,和任選具有一個或多個碳碳不飽和鍵。取代基“a”為具有各種取代基的五或六員環(huán),本申請文件別處所述。某些本發(fā)明28-表雷帕霉素類似物,特別是其中C7取代基不同于雷帕霉素的本發(fā)明28-表雷帕霉素類似物,同雷帕霉素比較起來具有合乎需要的基本上降低的免疫抑制作用,可以用于實(shí)際用途?!盎旧辖档偷拿庖咭种谱饔谩敝概c等摩爾量的雷帕霉素相比,雷帕霉素類似物通過臨床或適當(dāng)?shù)捏w外或體內(nèi)的人類免疫抑制活性替代品優(yōu)選在淋巴系統(tǒng)中來的組織上測量時,觀察到或預(yù)期具有少于0.1,優(yōu)選少于0.01,并且甚至更優(yōu)選少于0.005倍的免疫抑制作用,或者另一個辦法,在這樣的體外測定中該雷帕霉素類似物產(chǎn)生的EC50值最小為在相同測定中的雷帕霉素所觀察到的EC50值的十倍,優(yōu)選至少100倍,更優(yōu)選至少250倍。
一種適當(dāng)?shù)捏w外替代品的人類患者的免疫抑制作用為哺乳動物T細(xì)增殖的體外抑制。這是傳統(tǒng)的測定方法可以使用在各種的人類或鼠科動物T細(xì)胞細(xì)胞系,包括人類PBLs和Jurkat細(xì)胞的一些眾所周知的變化。因此可以測定雷帕霉素類似物的免疫抑制活性并與雷帕霉素相比較。通過適當(dāng)?shù)捏w外測定發(fā)現(xiàn),相對于雷帕霉素免疫抑制活性的降低,預(yù)示可減少人類的免疫抑制活性。這樣的體外測定可用來評價雷帕霉素類似物的相對的免疫抑制活性。
本申請公開了28-表雷帕霉素類似物各種各樣的舉例說明。本申請公開的化合物也可能在例如C7,C43,C13,C24和C30等中的一個或多個位置,采用WO 96/41865,WO 98/02441,WO 99/36553及其他本申請引用的專利文件公開的適合的化學(xué)變化而被進(jìn)一步衍生。特別令人感興趣的28-表雷帕霉素類似物尤其包括那些與人類FKBP12結(jié)合,或抑制其旋轉(zhuǎn)異構(gòu)酶活性,在由雷帕霉素在任何傳統(tǒng)的FKBP結(jié)合或旋轉(zhuǎn)異構(gòu)酶測定中得到的在兩個,更優(yōu)選一個絕對值階以內(nèi)的28-表雷帕霉素類似物。
其他幾種可以用于實(shí)施本發(fā)明方法的28-表雷帕霉素類似物定義為如下表示的結(jié)構(gòu)
其中
(或另外衍生的5-或6-元環(huán)),其他的取代基定義如前,并且除非另有陳述各取代基可以存在立體化學(xué)取向,并其中R8各為H,鹵素,-CN,-CORA,-ORA,-NRARB,OSO2CF3,OSO2F,OSO2RB,OCORB,OCONRA′RB,或OCON(ORA)RB。
用于實(shí)施本發(fā)明的28-表雷帕霉素類似物,包括各種上文公式表示的雷帕霉素類似物,可以(在沒有確定立體化學(xué)的情況下)包含任何可能的立體異構(gòu)定向的取代基,可以包含基本上無其他立體異構(gòu)體的一個立體異構(gòu)體(>90%,優(yōu)選>95%,除其他的立體異構(gòu)體外,以摩爾計)或可以包含立體異構(gòu)體的混合物。本發(fā)明新的化合物特別地排除28,29-雙-表雷帕霉素或28,43-雙-表雷帕霉素本身(即,相對于雷帕霉素結(jié)構(gòu)無另外的修飾)。
同樣,本申請描述的28-表雷帕霉素類似物用于基因工程細(xì)胞中的嵌合蛋白質(zhì)多聚化的方法。該方法包括(a)適當(dāng)?shù)靥峁┌苯颖磉_(dá)所需的嵌合蛋白的核酸結(jié)構(gòu)和任何所需的輔助重組體結(jié)構(gòu)基因工程細(xì)胞,和(b)用本申請描述的28-表雷帕霉素類似物或其藥學(xué)上可接受的衍生物接觸該細(xì)胞。
在一個具體方案中,至少一個嵌合的蛋白質(zhì)包含至少一個其肽序列不同于天然存在的FKBP肽序列,例如人類FKBP12肽序列,在該肽序列中至多包含十個氨基酸殘基。肽序列變化的優(yōu)選數(shù)目限于5,更優(yōu)選1,2,或3。
在另一個具體方案中,至少一個嵌合的蛋白質(zhì)包含至少一個其肽序列不同于天然存在的FRB肽序列例如人類FRAP的FRB區(qū)域的FRB區(qū)域,在該肽序列中至多包含十個氨基酸殘基。肽序列變化的優(yōu)選數(shù)目限于5,更優(yōu)選1,2,或3。在很多情況下,F(xiàn)RB區(qū)域優(yōu)選地包含單個涉及相應(yīng)的人類FRAP或其他哺乳動物FRAP/TOR的FRB區(qū)域的肽序列的氨基酸替換物。特別令人感興趣的的突變包括用獨(dú)立選擇的替換氨基酸,例如A,N,H,L,或S替換一個或多個源自人類FRAP的FRB區(qū)域的T2098,D2102,Y2038,F(xiàn)2039,K2095的替代。其他使人感興趣的是用獨(dú)立選擇的替換氨基酸,例如H,L,S,A或V對一個或多個源自酵母TOR1 FRB區(qū)域的F1975,F(xiàn)1976,D2039和N2035的替換,或一個或多個源自酵母TOR2的FRB區(qū)域的F1978,F(xiàn)1979,D2042和N2038的替換。
在某些具體方案中,在一個或多個FKBP區(qū)域和一個或多個FRB區(qū)域中,嵌合蛋白包含至少一個,優(yōu)選至多三個相對于天然存在序列的肽序列中的修飾。
如前所述,在本發(fā)明的各種具體方案中,該嵌合蛋白包含一個或多個與FKBP和/或FRB區(qū)域異源的“活性”或“效應(yīng)因子”區(qū)域。效應(yīng)因子區(qū)域可以選自各式各樣的蛋白質(zhì)區(qū)域,包括DNA結(jié)合區(qū)域,轉(zhuǎn)錄激活作用區(qū)域,細(xì)胞定位區(qū)域和信號區(qū)域(即,其中在群集或多聚化時能觸發(fā)細(xì)胞生長,增殖,分化,細(xì)胞程序死亡,基因轉(zhuǎn)錄等等的區(qū)域)。可用于實(shí)施本發(fā)明的各種各樣的典型的效應(yīng)因子公開于本申請引用的各種科學(xué)和專利文件。
例如,在某些具體方案中,一個融合蛋白質(zhì)包含至少一個DNA結(jié)合區(qū)域(例如,GAL4或ZFHD1 DNA結(jié)合區(qū)域)而另一個融合蛋白質(zhì)包含至少一個轉(zhuǎn)錄激活作用區(qū)域(例如,VP16或p65轉(zhuǎn)錄激活作用區(qū)域)。融合蛋白質(zhì)配體介導(dǎo)締合表示轉(zhuǎn)錄因子配合物的形成,導(dǎo)致與辨認(rèn)融合蛋白質(zhì)上的DNA結(jié)合域的(即,可與其結(jié)合的)脫氧核糖核酸序列有關(guān)系的靶基因的轉(zhuǎn)錄的開始。
在其他的具體方案中,一個融合蛋白質(zhì)包含至少一個能夠指引融合蛋白質(zhì)到特別的細(xì)胞位置如細(xì)胞膜,核,ER或其他的細(xì)胞器或細(xì)胞組分。其中指向例如細(xì)胞膜的目標(biāo)的定位區(qū)域包括如十四?;恢玫膮^(qū)域或受體蛋白或其他的膜-跨越蛋白質(zhì)的橫跨膜的區(qū)域。另一個融合蛋白質(zhì)可以包含能激活細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑實(shí)現(xiàn)膜定位和/或群集的信號區(qū)域。信號區(qū)域的例子包括生長因子或細(xì)胞活素受體的胞內(nèi)區(qū)域,細(xì)胞程序死亡觸發(fā)區(qū)域如FAS或TNF-R1的胞內(nèi)區(qū)域,和源自其他的胞內(nèi)信號蛋白質(zhì)如SOS,Raf,Ick,ZAP-70,等等的區(qū)域。一些信號蛋白質(zhì)公開于PCT/US94/01617(參見例如pp.23-26)。在其他的具體方案中,每一融合蛋白質(zhì)包含至少一個FRB區(qū)域和至少one FKBP區(qū)域,以及一個或多個異源的區(qū)域。這樣的融合蛋白質(zhì)能夠使存在的雷帕霉素類似物實(shí)現(xiàn)均二聚化和觸發(fā)信號。一般說來,包含寄主細(xì)胞內(nèi)生的肽序列的區(qū)域優(yōu)選的應(yīng)用,包括整體有機(jī)體中的應(yīng)用。因此,對于人類基因治療的應(yīng)用源自人類的區(qū)域特別令人感興趣。
作為能夠指引其表達(dá)的核酸結(jié)構(gòu),本申請也提供編碼融合蛋白質(zhì)的重組體核酸結(jié)構(gòu),包含這樣的結(jié)構(gòu)的媒介物可以引導(dǎo)他們進(jìn)入細(xì)胞,特別是真核細(xì)胞,其中酵母和動物細(xì)胞特別令人感興趣。鑒于融合蛋白質(zhì)標(biāo)記物的組分,編碼它們的重組DNA分子能夠有選擇地與(a)編碼包括FRB區(qū)域或FKBP區(qū)域的多肽的DNA分子和(b)編碼異源的區(qū)域或由其衍生異源蛋白質(zhì)區(qū)域的蛋白質(zhì)的DNA分子雜交。DNA也包括其中能夠雜交而不是退化遺傳密碼的DNA。
通過使用編碼融合蛋白質(zhì)的核酸,在真核細(xì)胞中引導(dǎo)其表達(dá)的核酸結(jié)構(gòu),和引導(dǎo)這樣的結(jié)構(gòu)進(jìn)入細(xì)胞,特別是動物細(xì)胞的媒介物或其他試劑,人們可以將一些重要的用途使細(xì)胞,優(yōu)選哺乳動物細(xì)胞,最優(yōu)選人類細(xì)胞進(jìn)行基因改造。為了實(shí)現(xiàn)上述目標(biāo),首先要提供在所需的嵌合蛋白的真核生物(優(yōu)選動物)細(xì)胞中引導(dǎo)表達(dá)的表達(dá)載體或核酸結(jié)構(gòu),然后以DNA攝取許可的方式引導(dǎo)重組DNA進(jìn)入該細(xì)胞,在至少一部分該細(xì)胞中引導(dǎo)DNA的表達(dá)。人們可以使用任何方法和材料引導(dǎo)DNA進(jìn)入細(xì)胞進(jìn)行異源基因表達(dá),這些方法和材料為大家所熟知和/或在市場上可買到的。
因此如本申請描述,本發(fā)明的一個目的是在細(xì)胞,優(yōu)選動物細(xì)胞中多聚化融合蛋白質(zhì)的方法。扼要說明,一個融合蛋白質(zhì)能夠與本發(fā)明的28-表雷帕霉素類似物結(jié)合,包含至少一個FKBP區(qū)域和至少一個異源的區(qū)域。第二個融合蛋白質(zhì)包含至少一個FRB區(qū)域和至少一個異源的區(qū)域,能夠與第一個融合蛋白質(zhì)和28-表雷帕霉素類似物一個或多個分子形成三重配合物。在一些具體方案中,存在于該融合蛋白質(zhì)上的一個或多個異源的區(qū)域也存在于另一個融合蛋白質(zhì),即,兩個融合蛋白質(zhì)具有一個或多個共同的異源的區(qū)域。在其他的具體方案中,各個融合蛋白質(zhì)包含一個或多個不同的異源的區(qū)域。
該方法包括通過在其中存在該細(xì)胞的培養(yǎng)基中加入雷帕霉素類似物,或?qū)ζ渲写嬖谠摷?xì)胞的有機(jī)體使用雷帕霉素類似物給藥,使適當(dāng)?shù)幕蚬こ碳?xì)胞與28-表雷帕霉素類似物接觸。該細(xì)胞優(yōu)選真核細(xì)胞,更優(yōu)選動物細(xì)胞,最優(yōu)選哺乳動物細(xì)胞。靈長類細(xì)胞,特別是人類細(xì)胞特別令人感興趣。將28-表雷帕霉素類似物對人類或非人類動物給藥可以使用任何藥學(xué)上可接受的劑型和給藥途徑。目前最令人感興趣的是口服包含28-表雷帕霉素類似物和一種或多種藥學(xué)上可接受的載體,緩沖液或其他賦形劑的藥學(xué)上可接受的組合物。
如上面另外的描述,本發(fā)明的一個目的是提供一種以雷帕霉素類似物依賴的方式誘導(dǎo)靶基因轉(zhuǎn)錄的方法。該細(xì)胞典型地包含編碼兩個融合蛋白質(zhì)的重組體DNA,和包含一個靶基因的靶基因構(gòu)造,該靶基因是與處理其中對存在的該融合蛋白質(zhì)與28-表雷帕霉素類似物配合物起反應(yīng)的脫氧核糖核酸序列有聯(lián)系的。該靶基因結(jié)構(gòu)可以為重組體,并且該靶基因和/或與其連接的控制核酸序列可以與寄主細(xì)胞是異源的。在某些具體方案中,該細(xì)胞對與FKBP融合蛋白質(zhì)結(jié)合的雷帕霉素類似物起反應(yīng),參與FRB融合蛋白質(zhì)的配合物,可檢測出其優(yōu)選與包含內(nèi)源性FKBP和/或FRB的寄主細(xì)胞蛋白質(zhì)結(jié)合。
如上面另外的描述,本發(fā)明的另一個特殊的目的是提供一種以雷帕霉素類似物依賴的方式誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的方法。在這樣的細(xì)胞中,在至少一個融合蛋白質(zhì),通常兩個融合蛋白質(zhì)上的至少一個異源的區(qū)域?yàn)槿鏔AS或TNF-R1的胞內(nèi)域的區(qū)域,它們?nèi)杭?、觸發(fā)該細(xì)胞的細(xì)胞程序死亡。
如上面另外的描述,本發(fā)明的另一個特殊的目的是提供一種以雷帕霉素類似物依賴的方式,誘導(dǎo)細(xì)胞生長,分化或增殖的方法。在這樣的細(xì)胞中,至少一個融合蛋白質(zhì)的至少一個異源的區(qū)域?yàn)樾盘枀^(qū)域,例如,介導(dǎo)細(xì)胞生長,分化或增殖的激素的受體的胞內(nèi)區(qū)域,或這樣的受體的下游介質(zhì)的胞內(nèi)區(qū)域。隨著這樣的信號區(qū)域的群集,細(xì)胞生長,分化和/或增殖。這樣的群集隨著激素結(jié)合,以及與28-表雷帕霉素類似物接觸后,在本發(fā)明基因改造的細(xì)胞中自然出現(xiàn)。
人類來源的細(xì)胞優(yōu)選人類基因治療的應(yīng)用,雖然可以使用各種來源的細(xì)胞類型(人類或其他的物種),但是如果需要,可以裝入生物相容的材料的膠囊內(nèi)供受試驗(yàn)的人使用。
本申請也提供制造上述基因工程細(xì)胞的材料和方法。這個目的需要提供重組體核酸,典型地為DNA分子;編碼融合蛋白質(zhì),與任何所需的輔助重組體核酸如靶基因結(jié)構(gòu)一起;以及在容許通過細(xì)胞攝取核酸條件下,引導(dǎo)該重組體核酸進(jìn)入寄主細(xì)胞。這樣的轉(zhuǎn)染可以使用培養(yǎng)物維持的寄主細(xì)胞在體外作用。隨后可以將培養(yǎng)物中的基因工程細(xì)胞引入寄主有機(jī)體,例如體外基因治療應(yīng)用。因此構(gòu)成一種提供(如本申請描述)響應(yīng)本申請?zhí)峁┑?8-表雷帕霉素類似物存在的寄主有機(jī)體優(yōu)選人類或非人類哺乳動物的方法?;蛘?,使用存在于人類或非人類寄主有機(jī)體的寄主細(xì)胞,轉(zhuǎn)染可以體內(nèi)作用。在此情況下,在容許核酸一個或多個寄主有機(jī)體細(xì)胞攝取條件下,核酸分子立即被引導(dǎo)進(jìn)入該寄主有機(jī)體。因此該途徑構(gòu)成一種提供(如本申請描述)響應(yīng)本申請?zhí)峁┑?8-表雷帕霉素類似物存在的寄主有機(jī)體優(yōu)選人類或非人類哺乳動物的選擇性的方法。引導(dǎo)DNA和RNA進(jìn)入培養(yǎng)物或整個有機(jī)體中的細(xì)胞的各種材料和方法在本領(lǐng)域是已知的,并且可以在本發(fā)明實(shí)踐中改進(jìn)。
使用本申請描述的基因工程細(xì)胞可以實(shí)現(xiàn)其他的目的。例如,通過用有效量的容許雷帕霉素類似物與融合蛋白質(zhì)形成配合物的28-表雷帕霉素類似物接觸本申請描述的基因工程細(xì)胞,提供了一種本發(fā)明融合蛋白質(zhì)多聚化的方法。在具體方案中,融合蛋白質(zhì)的多聚化觸發(fā)靶基因的轉(zhuǎn)錄,這構(gòu)成了一種激活靶基因表達(dá)的方法。在具體方案中,融合蛋白質(zhì)包含一個或多個信號區(qū)域,這構(gòu)成了激活細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的方法。在特定的具體方案中,信號區(qū)域的選擇以它們的能力為基準(zhǔn)信號區(qū)域,接著群集觸發(fā)細(xì)胞生長,增殖,分化或細(xì)胞死亡,視情況而定,28-表雷帕霉素類似物-介導(dǎo)的群集構(gòu)成了一種驅(qū)動細(xì)胞生長,增殖,分化或細(xì)胞死亡的方法。這些方法可以在細(xì)胞培養(yǎng)物或整個有機(jī)體包括人類患者中進(jìn)行。在前一種情況下,雷帕霉素或雷帕霉素類似物加入培養(yǎng)基。在后一種情況下,雷帕霉素或雷帕霉素類似物(可以是藥物或獸醫(yī)組合物形式)以例如,口服,胃腸外等方式對整個有機(jī)體給藥。優(yōu)選地,28-表雷帕霉素類似物對動物給藥的劑量低于該接受者過度的免疫抑制的劑量水平。
如本申請描述,公開了用于人類或非人類動物細(xì)胞基因工程的試劑盒。一個這樣的試劑盒包含一種或多種本發(fā)明的編碼融合蛋白質(zhì)的重組體核酸結(jié)構(gòu)。該重組體核酸結(jié)構(gòu)通常由適用于引導(dǎo)進(jìn)入動物細(xì)胞并且能夠在其中引導(dǎo)該融合蛋白質(zhì)表達(dá)的真核生物的表達(dá)媒介物形成。這樣的媒介物可以是本申請在別處描述的病毒載體。該試劑盒也可包含能夠與該編碼的融合蛋白質(zhì)形成配合物的本發(fā)明28-表雷帕霉素類似物樣品。該試劑盒可進(jìn)一步包含多聚化拮抗劑如FK506,F(xiàn)K506M,已知的許多合成(非免疫抑制性的)FKBP配位體或能夠與融合蛋白質(zhì)結(jié)合但不能與兩個形成配合物的其它化合物中的一種。在某些具體方案中,編碼融合蛋白質(zhì)的重組體核酸結(jié)構(gòu)將包含代替編碼一個或多個異源的區(qū)域的DNA的克隆位點(diǎn),因此可容許引導(dǎo)編碼選擇的異源區(qū)域的DNA。如下文更詳細(xì)的描述,在一些具體方案中,該試劑盒可能也包含一種靶基因結(jié)構(gòu)該結(jié)構(gòu)含有與對配合的融合蛋白質(zhì)的存在起反應(yīng)的有關(guān)靶基因或克隆位點(diǎn)。該試劑盒可以包含與所包裝的核酸結(jié)構(gòu)一致的包裝說明書,和/或引導(dǎo)該結(jié)構(gòu)進(jìn)入寄主細(xì)胞或有機(jī)體的說明書。發(fā)明的詳細(xì)說明定義
下文定義和定位資料有助于完整了解本申請。
FRB區(qū)域?yàn)槎嚯膮^(qū)域(蛋白質(zhì)“區(qū)域”),典型地具有至少約89個氨基酸殘基,能夠與FKBP蛋白質(zhì)和雷帕霉素(或本發(fā)明28-表雷帕霉素類似物)形成三重的配合物。FRB區(qū)域存在于一些天然存在的蛋白質(zhì),包括人類及其他物種的FRAP蛋白質(zhì)(在文獻(xiàn)中也稱為“RAPT1”或“RAFT”);包括Tor1和Tor2的酵母蛋白質(zhì);和念珠菌屬(Candida)FRAP同系物。關(guān)于該蛋白質(zhì)的核苷酸序列,克隆,及其他方面的信息在本領(lǐng)域?yàn)橐阎?,例如,使用眾所周知的方法和以公開的序列為基準(zhǔn)的PCR引物,可以合成或克隆編碼所需的FRB肽序列的DNA。
本發(fā)明使用的FRB區(qū)域通常包含至少約89-100氨基酸殘基。上述Chiuet al的圖2顯示了包含保存的FRB區(qū)域的160-氨基酸跨度人類FRAP,鼠科動物FRAP S.cerevisiae TOR1和S.cerevisiae TOR2。本發(fā)明使用的典型的FRB序列將跨越至少89-氨基酸序列,Glu-39到Lys/Arg-127,如那個圖中的一些序列??梢詤⒖糃hen et al或Sabitini et al使用的編號,89-氨基酸序列的編號對于人類FRAP為Glu-2025到Lys-2113,以及對于Tor2為Glu-1965到Lys-2053,以及對于Tor1為Glu-1962到Arg-2050。用于本發(fā)明融合蛋白質(zhì)的FRB區(qū)域能夠與結(jié)合雷帕霉素的一種FKBP蛋白質(zhì)的配合物或與本發(fā)明的一種28-表雷帕霉素類似物結(jié)合(可以任何直接或間接的方式測定,這樣的結(jié)合測定包括,例如,使用本申請引用的FRAP/RAFT/RAPT和Tor-相關(guān)的資料測定這樣的結(jié)合)。這樣一個FRB區(qū)域的肽序列包括(a)跨越至少上面記錄顯示的蛋白質(zhì)89-氨基酸區(qū)域或相應(yīng)的蛋白質(zhì)的相應(yīng)區(qū)域的天然存在的肽序列;(b)一種天然存在的FRB序列的變體,其中至多約十個(優(yōu)選1-5,更優(yōu)選1-3個,在一些具體方案中僅一種)已經(jīng)缺失,插入或用取代氨基酸替換的天然存在肽序列的氨基酸;或(c)通過能夠有選擇地雜交到編碼天然存在的FRB區(qū)域的DNA分子上的脫氧核糖核酸序列編碼的或通過能,如果沒有遺傳密碼退化,有選擇地雜交到編碼天然存在FRB區(qū)域的DNA分子的脫氧核糖核酸序列編碼的肽序列。人類FRB的2098L突變株為目前優(yōu)選地用于C7具有修飾的28-表雷帕霉素類似物。Seee.g.WO99/36553。
FKBPs(FK506結(jié)合蛋白質(zhì))對于大環(huán)內(nèi)酯如FK506 FK520和雷帕霉素為胞質(zhì)受體,可跨越種界保存。對于本發(fā)明的目的,F(xiàn)KBPs為能夠與雷帕霉素或本發(fā)明28-表雷帕霉素類似物結(jié)合進(jìn)一步與FRB-包含的蛋白質(zhì)形成三重配合物的蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)區(qū)域。FKBP區(qū)域也可稱為“雷帕霉素結(jié)合區(qū)域”。關(guān)于該蛋白質(zhì)的核苷酸序列,克隆,及其他各種FKBP方面的信息在本領(lǐng)域?yàn)橐阎?,例如,使用眾所周知的方法和以公開的序列為基準(zhǔn)的PCR引物,可以合成或克隆編碼所需的FRB肽序列的DNA。參見例如Staendart et al,1990,Nature 346,671-674(人類FKBP12);Kay,1996,Biochem.J.314,361-385(review)。其他的哺乳動物,酵母,和其他有機(jī)體中相應(yīng)的FKBP蛋白質(zhì)在本領(lǐng)域也是已知的,可以用于本申請公開的融合蛋白質(zhì)。參見例如Kay,1996,Biochem.J,314,361-385(review)。用于本發(fā)明變化的FKBP區(qū)域的大小取決于所使用的FKBP蛋白質(zhì)。本發(fā)明融合蛋白質(zhì)的FKBP區(qū)域能夠與雷帕霉素或本發(fā)明28-表雷帕霉素類似物結(jié)合,參與與含F(xiàn)RB蛋白質(zhì)的三重配合物(可以任何直接或間接的用于測定這樣的結(jié)合的方式測定)。本發(fā)明FKBP融合蛋白質(zhì)的FKBP區(qū)域的肽序列包括(a)天然存在的FKBP肽序列,優(yōu)選源自人類FKBP12蛋白質(zhì)(下文舉例說明)的肽序列或源自另一個人的,鼠科動物其他的哺乳動物FKBP或其他動物,酵母或真菌的FKBP的肽序列的FKBP肽序列;(b)其中至多約十個,(優(yōu)選1-5,更優(yōu)選1-3個,在一些具體方案中僅一種)已經(jīng)缺失,插入或用取代氨基酸替換的天然存在肽序列的氨基酸的天然存在的FRB序列的變體;或(c)通過能夠有選擇地雜交到編碼天然存在的FKBP的DNA分子上的脫氧核糖核酸序列編碼的或通過,如果沒有遺傳密碼退化,能有選擇地雜交到編碼天然存在FKBP的DNA分子的脫氧核糖核酸序列編碼的肽序列。
“能夠有選擇地雜交”作為本申請使用的短語表示盡管存在其他的DNA分子,兩個DNA分子能彼此雜交,雜交條件可以選擇或通過本領(lǐng)域普通的專業(yè)人員憑經(jīng)驗(yàn)容易地測定。這樣的處理包括高嚴(yán)格條件如在從室溫到65-75C°的溫度下用包含0.2到6xSSC,和/或包含0.1%到1%SDS的緩沖液充分洗滌。參見FM.Ausubel et al.,Eds,Short Protocols in Molecular Biology,Units 6.3 and 6.4(John Wiley和Sons,New York,3d Ed,1995)。
術(shù)語“蛋白質(zhì)”,“多肽”和“肽”在本申請中可替交地使用。
“核酸結(jié)構(gòu)”,作為本申請使用的術(shù)語,表示用于實(shí)施本發(fā)明的核酸(通常為DNA,而且包括RNA,例如在逆轉(zhuǎn)錄病毒輸送系統(tǒng)),通常是重組體,作為下文定義的術(shù)語,可能處于自由形式(不以共價鍵聯(lián)系到其他的核酸序列)或可以存在于較大的分子如基因工程寄主細(xì)胞的DNA媒介物,逆轉(zhuǎn)錄病毒或其他病毒載體或染色體內(nèi)部。特別令人感興趣的核酸結(jié)構(gòu)是編碼本發(fā)明融合蛋白質(zhì)或包含靶基因和表達(dá)控制元件的那些。該結(jié)構(gòu)可以進(jìn)一步包括由一個或多個與轉(zhuǎn)錄,翻譯,和/或其他編碼區(qū)或其基因產(chǎn)物的處理有關(guān)的核酸部分轉(zhuǎn)錄促進(jìn)劑和/或增強(qiáng)劑序列,核糖體結(jié)合位點(diǎn),基因內(nèi)區(qū),等等。
“重組體”,“嵌合體”和“融合體”,作為本申請使用的術(shù)語,表示包括各種的組分域,序列或其他組分的材料,它們是互相異源的,本質(zhì)上不以相同排列共同存在。更具體地說,該組分部分不能在性質(zhì)上相同的連續(xù)的多肽或核苷酸序列中發(fā)現(xiàn),至少不在相同的細(xì)胞或序列或方向,或不具有存在于本發(fā)明的嵌合蛋白或重組DNA中的相同間隔。
“轉(zhuǎn)錄控制元件”表示控制的脫氧核糖核酸序列,如起始信號,增強(qiáng)劑,和促進(jìn)劑,它們通過控制連接從而誘導(dǎo)或控制蛋白質(zhì)編碼序列的轉(zhuǎn)錄。術(shù)語“增強(qiáng)劑”包括能夠從促進(jìn)劑提高,刺激,或增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)元素。這樣的轉(zhuǎn)錄控制組分可以存在于上游的編碼區(qū),或在某些情況下(例如,增強(qiáng)劑),也在其他位置,如基因內(nèi)區(qū),外顯子,編碼區(qū),3′旁側(cè)序列。
“二聚化”,“寡聚化”和“多聚化”在本申請可交替使用指通過一種藥劑與至少一種蛋白質(zhì)結(jié)合介導(dǎo)的兩個或更多蛋白質(zhì)分子的締合或群集。在優(yōu)選方案中,多聚化通過兩個或更多這樣的蛋白質(zhì)分子與設(shè)計為二價的或多價的共同的藥劑結(jié)合而介導(dǎo)。這樣的締合或群集的例子為包括兩個或更多蛋白質(zhì)分子,每個蛋白質(zhì)分子包含一個或多個FKBP區(qū)域,和一個或多個其中最小為二價的FKBP配位體分子(例如FK1012或AP1510)的配合物的形成。當(dāng)其中至少一種蛋白質(zhì)包含超過一種藥劑結(jié)合區(qū)域,例如,其中至少一種蛋白質(zhì)包含三個FKBP區(qū)域時,二價藥劑的存在導(dǎo)致超過兩個蛋白質(zhì)分子的群集。在其中能與(具有與藥劑結(jié)合區(qū)域的)蛋白質(zhì)結(jié)合的藥劑大于二價(例如三價)的具體方案中,也可以導(dǎo)致超過兩個蛋白質(zhì)分子的群集。這樣的蛋白質(zhì)群集的另一個例子為包括包含至少一種FRB區(qū)域的蛋白質(zhì),包含至少一種FKBP區(qū)域的蛋白質(zhì)和一分子雷帕霉素的三重配合物的形成。在本發(fā)明某些具體方案中,融合蛋白質(zhì)包含多個FRB和/或FKBP區(qū)域。這樣的蛋白質(zhì)的復(fù)合物可以包含超過一種的雷帕霉素分子或其衍生物(例如,28-表雷帕霉素類似物)或其他二聚化藥劑和超過一種的一個或多個蛋白質(zhì)組分的一個拷貝。同樣,這樣的多聚化配合物在此被稱為三重配合物,表示存在三種分子組分,甚至包含一個或多個多拷貝。包含至少一種二價藥劑和至少兩個蛋白質(zhì)分子每個至少包含一個藥劑結(jié)合區(qū)域的配合物的形成,可以稱為“寡聚化”或“多聚化”,或簡單地稱為“二聚化”,“群集”或“締合”。
“二聚體”表示本發(fā)明28表雷帕霉素類似物連接兩個或更多蛋白質(zhì)形成的多聚化配合物。28-表雷帕霉素類似物可以是相對于雷帕霉素具有另外的結(jié)構(gòu)修飾的28-表雷帕霉素或28-表雷帕霉素類似物。
“激活”在此用于基因的表達(dá)或轉(zhuǎn)錄,表示基因產(chǎn)物的產(chǎn)生直接或間接可觀察到的增加。
“基因工程細(xì)胞”表示已經(jīng)被重組體或異源的核酸(例如一種或多種DNA結(jié)構(gòu)或它們的RNA對應(yīng)物)引導(dǎo)修飾(“轉(zhuǎn)導(dǎo)”)的細(xì)胞,進(jìn)一步包括其中保持部分或所有這樣的遺傳的修飾的細(xì)胞的子代。
本發(fā)明28-表雷帕霉素類似物的“治療有效劑量”表示對于適當(dāng)?shù)鼗蚬こ碳?xì)胞的人類或非人類動物的治療或預(yù)防的有效劑量,例如,在接受者產(chǎn)生可檢測出的靶基因轉(zhuǎn)錄或細(xì)胞生長,增殖,分化,死亡,等等的劑量或從動物或細(xì)胞培養(yǎng)物模型推測得到的治療或預(yù)防有效劑量。治療有效劑量通常優(yōu)選地用于人類或非人類的哺乳動物的治療。
本發(fā)明包括使用28-表雷帕霉素類似物的基因工程細(xì)胞中的多聚化嵌合蛋白質(zhì)的方法和材料連同其它的應(yīng)用和材料。基于生物學(xué)轉(zhuǎn)變的各種設(shè)計和實(shí)施已經(jīng)被報導(dǎo),特別是,Spencer et al的文獻(xiàn)和本申請引用的各種國際性專利。其他一般的方法的成功的應(yīng)用也已被報導(dǎo)。包含與效應(yīng)因子區(qū)域融合的FRB區(qū)域的嵌合蛋白質(zhì)也被公開于Rivera et al,1996,Nature Medicine 2,1028-1032和WO 96/41865和WO99/36553(Clackson et al)以及WO 95/33052(Berlin et al)。如前所述,融合蛋白質(zhì)被設(shè)計用于效應(yīng)因子區(qū)域的締合,通過配位體介導(dǎo)包含它們的融合蛋白質(zhì)的“二聚化”或“多聚化”,觸發(fā)所需的生物學(xué)現(xiàn)象如所需的基因的轉(zhuǎn)錄,細(xì)胞死亡,細(xì)胞增殖,等等。例如,在從其中衍生的IL-2促進(jìn)劑或啟動元素的轉(zhuǎn)錄控制下,包含源自T細(xì)胞受體CDSξ區(qū)域胞內(nèi)部分的作用區(qū)域的嵌合蛋白質(zhì)的群集觸發(fā)基因的轉(zhuǎn)錄。在其他具體方案中,該作用區(qū)域包括源自蛋白質(zhì)如FAS或TNF-α受體(TNFalpha-Rl)胞內(nèi)部分的區(qū)域,可在低聚化時觸發(fā)該細(xì)胞的細(xì)胞程序死亡。在其他具體方案中,該作用區(qū)域包含DNA結(jié)合域DNA結(jié)合區(qū)域如GAL4或ZFHDl以及轉(zhuǎn)錄激活作用區(qū)域如VP16或p65,相互配對,該嵌合蛋白質(zhì)的寡聚化表示轉(zhuǎn)錄因子配合物的集合,觸發(fā)了與通過DNA結(jié)合區(qū)域辨認(rèn)(可相互作用實(shí)現(xiàn)特定的結(jié)合)的脫氧核糖核酸序列有關(guān)的基因的轉(zhuǎn)錄。
包含一個或多個配位體-結(jié)合區(qū)域和一個或多個作用,例如靶基因轉(zhuǎn)錄的激活作用,觸發(fā)細(xì)胞死亡或其他信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑,細(xì)胞定位,等等的區(qū)域的嵌合蛋白質(zhì),公開于上述PCT/US94/01617,PCT/US94/08008以及Spencer et al的文獻(xiàn)。用于配位體-介導(dǎo)的基因-剔除實(shí)驗(yàn)和用于配位體-介導(dǎo)的基因表達(dá)的阻斷或基因產(chǎn)物功能的抑制的嵌合蛋白質(zhì)的設(shè)計和使用公開于PCT/US95/10591。在包括靶基因的調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄的具體方案中,使用的新DNA結(jié)合區(qū)域和與其結(jié)合的脫氧核糖核酸序列公開于例如,Pomeranz et al,1995,Science26793-96。那些參考文獻(xiàn)提供了與編碼類似的嵌合體的DNA結(jié)構(gòu),靶基因結(jié)構(gòu),及其他方面有關(guān)的重要信息,指導(dǎo)和實(shí)施例,可能對本發(fā)明的專業(yè)人員有用。
通過適當(dāng)?shù)剡x擇嵌合蛋白質(zhì),本發(fā)明容許它所需基因的轉(zhuǎn)錄;啟動細(xì)胞生長,增殖,分化或細(xì)胞程序死亡;或在基因工程細(xì)胞中觸發(fā)其他類似于上文引用的專利文件及其他參考文獻(xiàn)描述的依賴于28-表雷帕霉素類似物生物學(xué)轉(zhuǎn)變?;蚬こ碳?xì)胞,優(yōu)選動物細(xì)胞,可以在培養(yǎng)物中生長或維持,或可以存在于有機(jī)體整體內(nèi)部,用于人類基因治療,轉(zhuǎn)基因動物,及其他這樣的應(yīng)用。根據(jù)具體情況,將FKBP融合蛋白質(zhì)和FRB融合蛋白質(zhì)多聚化有效量的28-表雷帕霉素類似物對細(xì)胞培養(yǎng)物或包含工程師細(xì)胞的有機(jī)體給藥(可通過監(jiān)視靶基因轉(zhuǎn)錄,細(xì)胞程序死亡或其他生物學(xué)方法間接地觀察該觸發(fā))。對有機(jī)體整體給藥時,28-表雷帕霉素類似物可以存在于包含28-表雷帕霉素類似物和一種或多種獸醫(yī)學(xué)或藥物上可接受的稀釋劑和/或賦形劑的組合物。
與一種嵌合蛋白質(zhì)結(jié)合但不形成具有兩個嵌合蛋白質(zhì)的三重配合物的化合物可以用作多聚化拮抗劑。同樣可以阻斷或反轉(zhuǎn)28-表雷帕霉素類似物預(yù)防,抑制或瓦解嵌合體多聚化有效量的上述化合物對基因工程細(xì)胞或包含它們的有機(jī)體給藥(優(yōu)選如上所述的對于整體動物給藥的組合物)。例如,不與FKBP和FRAP形成三重配合物的FK506,F(xiàn)K520或任何合成FKBP配位體都可以用作拮抗劑。
本發(fā)明的一個重要的方面是提供依賴28-表雷帕霉素類似物類似物的、所需的基因的轉(zhuǎn)錄的直接活化的材料和方法。在一個這樣的具體方案中提供一組兩個或更多不同的嵌合蛋白質(zhì),相應(yīng)的能夠直接表達(dá)它們的DNA結(jié)構(gòu)。這樣的一種嵌合蛋白包含作為其作用區(qū)域的一種或多種轉(zhuǎn)錄激活區(qū)域。另一個嵌合蛋白包含作為其作用區(qū)域的一種或多種DNA結(jié)合域。本發(fā)明28-表雷帕霉素類似物能夠與兩個嵌合體結(jié)合得到包含至少一個DNA結(jié)合區(qū)域和至少一個轉(zhuǎn)錄的激活區(qū)域的二聚的或多聚的配合物。在轉(zhuǎn)錄控制下,形成這樣的配合物導(dǎo)致與能夠結(jié)合DNA結(jié)合域的DNA序列有關(guān)系的靶基因的轉(zhuǎn)錄的激活作用,通過直接或間接地監(jiān)視該靶基因產(chǎn)品的濃度可以觀察該反應(yīng)。
優(yōu)選DNA結(jié)合區(qū)域和包含它的嵌合體,與它的具有充分的選擇性的辨認(rèn)DNA序列結(jié)合,所以盡管常常存在許多的其他DNA序列,但可以觀察(直接或間接地)到與該選擇DNA序列的結(jié)合。優(yōu)選地,當(dāng)結(jié)合研究體外測量或與任何選擇性的DNA序列比較的選擇DNA序列有關(guān)的基因轉(zhuǎn)錄相對速率或水平測量時,包括DNA結(jié)合域的嵌合體與選擇DNA序列的結(jié)合與任何一個的選擇性的DNA序列的結(jié)合最少大兩個,更優(yōu)選三個并且甚至更優(yōu)選超過四個數(shù)量級。
已經(jīng)基因改造含有這樣的一組結(jié)構(gòu)的細(xì)胞,與任何所需的輔助結(jié)構(gòu)一起,可以用于包括配位體-介導(dǎo),所需的生物學(xué)轉(zhuǎn)變的調(diào)節(jié)作用,它可調(diào)節(jié)所需的基因的轉(zhuǎn)錄,調(diào)節(jié)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通道的觸發(fā)如細(xì)胞程序死亡的觸發(fā),或另一個轉(zhuǎn)變。用于靶基因的可調(diào)表達(dá)的細(xì)胞基因工程,例如,能被用于調(diào)節(jié)通過靶基因編碼的所需蛋白質(zhì)(或其他基因產(chǎn)物)的生產(chǎn)。這樣的細(xì)胞可以通過傳統(tǒng)方法生長在培養(yǎng)物中。將28-表雷帕霉素類似物加入包含該細(xì)胞的培養(yǎng)基導(dǎo)致通過該細(xì)胞的靶基因的表達(dá)和通過那些基因編碼的蛋白質(zhì)產(chǎn)生。通過抑制媒介中藥劑的進(jìn)一步多聚化,通過從媒介中除去剩余的多聚化藥劑,或通過在媒介中加入多聚化拮抗劑試劑,可以終止該基因的表達(dá)和該蛋白質(zhì)的產(chǎn)生。
本發(fā)明基因工程細(xì)胞還可以體內(nèi)制造和/或用于體內(nèi),修飾有機(jī)體整體,優(yōu)選動物,特別是人類,例如該細(xì)胞制造所需的蛋白質(zhì)或動物內(nèi)部包含它們的其他產(chǎn)物。這樣的應(yīng)用包括基因治療應(yīng)用。
包括細(xì)胞程序死亡調(diào)節(jié)作用的具體方案包括提供使28-表雷帕霉素類似物易誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的基因工程細(xì)胞。如果它們具有或產(chǎn)生不需要的性質(zhì),或如果它們不再為有用的,安全的或所需的,在完成它們的預(yù)定目的后(例如產(chǎn)生所需的蛋白質(zhì)或其他產(chǎn)品),這樣的基因工程細(xì)胞可以從細(xì)胞培養(yǎng)物或寄主有機(jī)體中消除。通過在媒介中加入或?qū)闹饔袡C(jī)體使用28-表雷帕霉素類似物可以發(fā)生消除作用。在此情況下,該嵌合體的作用區(qū)域是如FAS或TNF-Rl的胞內(nèi)區(qū)域的蛋白質(zhì)區(qū)域,它們的信號通道的下游組分或其他寡聚化時觸發(fā)細(xì)胞程序死亡的蛋白質(zhì)區(qū)域。
因此本發(fā)明提供了為實(shí)現(xiàn)響應(yīng)本發(fā)明28-表雷帕霉素類似物的加入而使細(xì)胞中產(chǎn)生生物效應(yīng)的材料和方法。該方法包括提供本申請描述的基因工程細(xì)胞以及使該細(xì)胞與28-表雷帕霉素類似物接觸。
例如,本發(fā)明提供一種用于在細(xì)胞中激活靶基因轉(zhuǎn)錄的方法。該方法包括提供這樣的一些細(xì)胞,它們包含(a)編碼能開始轉(zhuǎn)錄靶基因引導(dǎo)本發(fā)明28-表雷帕霉素類似物介導(dǎo)的多聚化的一組嵌合蛋白質(zhì)的DNA結(jié)構(gòu)和(b)連接與對該多聚化轉(zhuǎn)變反應(yīng)的關(guān)聯(lián)的同源DNA序列連接的靶基因(例如辨認(rèn)DNA序列,即,能夠與在前的嵌合蛋白的DNA結(jié)合域結(jié)合的DNA序列)。該方法包括使該細(xì)胞與能夠以導(dǎo)致該靶基因表達(dá)有效量的嵌合蛋白質(zhì)結(jié)合的28-表雷帕霉素類似物接觸。當(dāng)細(xì)胞生長在培養(yǎng)物中時,使細(xì)胞與28-表雷帕霉素類似物的接觸可以通過在該培養(yǎng)基中加入28-表雷帕霉素類似物實(shí)現(xiàn)。當(dāng)該細(xì)胞處于寄主有機(jī)體內(nèi)部時,它們與28-表雷帕霉素類似物的接觸可以通過將28-表雷帕霉素類似物對該寄主有機(jī)體給藥而實(shí)現(xiàn)。例如,當(dāng)該寄主有機(jī)體是人類或非人類時,可以通過口服的,頰服,舌下,透皮,皮下,肌內(nèi),靜脈內(nèi),關(guān)節(jié)內(nèi)或適當(dāng)?shù)娜萜鞯奈虢o藥的方式將28-表雷帕霉素類似物對寄主有機(jī)體給藥。同樣,嵌合蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和任何輔助的結(jié)構(gòu)取決于該設(shè)計,28-表雷帕霉素類似物介導(dǎo)的生物學(xué)轉(zhuǎn)變可以激活細(xì)胞的功能如導(dǎo)致細(xì)胞生長、細(xì)胞增殖、基因轉(zhuǎn)錄、細(xì)胞程序死亡的信號轉(zhuǎn)導(dǎo);使人感興趣的基因的刪除,使人感興趣的基因表達(dá)的阻斷,或使人感興趣的基因產(chǎn)物功能的抑制;使人感興趣的基因的直接轉(zhuǎn)錄;等等。
本發(fā)明進(jìn)一步包括一種藥物組合物,它包括本發(fā)明28-表雷帕霉素類似物與藥學(xué)上可接受的載體,選擇性地與一種或多種藥學(xué)上可接受的賦形劑的混合物。這樣的藥物組合物可用于,例如在實(shí)現(xiàn)本申請公開的任何目的的人類基因治療應(yīng)用中,促進(jìn)動物整體的基因工程細(xì)胞中本發(fā)明嵌合體的多聚化。
換句話說,本發(fā)明提供一種實(shí)現(xiàn)任何上述目的的方法,該目的例如在需要和包含本發(fā)明基因工程細(xì)胞的動物,優(yōu)選人類患者中的靶基因轉(zhuǎn)錄的激活作用(典型地為治療蛋白質(zhì)的異源基因),細(xì)胞生長或增殖,細(xì)胞死亡或其它選擇的生物學(xué)轉(zhuǎn)變的激活作用。該方法包括通過給藥途徑對該動物給予包含至少導(dǎo)致一部分基因工程細(xì)胞中的嵌合蛋白質(zhì)多聚化有效量的28-表雷帕霉素類似物的藥物組合物。通過觀察靶基因表達(dá)的出現(xiàn);細(xì)胞生長,增殖或死亡;或其他為被設(shè)計的嵌合體和基因工程細(xì)胞的目標(biāo)可以間接地測定多聚化。
本發(fā)明進(jìn)一步包括一種藥物組合物,它包含本發(fā)明多聚化拮抗劑與藥學(xué)上可接受的載體和任選含或不含一種或多種藥學(xué)上可接受的賦形劑的混合物它可完全或部分抑制或者降低患者中的本發(fā)明基因工程細(xì)胞中嵌合蛋白質(zhì)的多聚化的范圍,并使靶基因的轉(zhuǎn)錄失活,或產(chǎn)生本發(fā)明的另一個生物學(xué)效果。因此,本發(fā)明包括通過利用28-表雷帕霉素類似物多聚化和多聚化拮抗劑試劑以制備藥物組合物和達(dá)到它們的藥理學(xué)的效果。
本發(fā)明也公開一種使寄主有機(jī)體,優(yōu)選動物,典型地為非人類的哺乳動物或人類患者能對本發(fā)明28-表雷帕霉素類似物起反應(yīng)的方法。該方法包括將其引入按照本發(fā)明已經(jīng)進(jìn)行的基因改造,即包含一種或多種編碼嵌合蛋白質(zhì)的核酸結(jié)構(gòu),等等的有機(jī)體細(xì)胞。在被引入寄主有機(jī)體之前,基因工程細(xì)胞可以使用任何材料和方法裝入膠囊?;蛘撸谌菰S其結(jié)合進(jìn)入一種或多種寄主哺乳動物細(xì)胞,例如使用病毒載體通過注射或通過導(dǎo)管,等等引導(dǎo)DNA的條件下,可以引導(dǎo)本發(fā)明核酸結(jié)構(gòu)進(jìn)入有機(jī)體,例如哺乳動物。
本發(fā)明也提供產(chǎn)生對本發(fā)明28-表雷帕霉素類似物起反應(yīng)的細(xì)胞的試劑盒。這樣的試劑盒包含一種或多種核酸結(jié)構(gòu),其可編碼以及能夠直接表達(dá)嵌合體,在28-表雷帕霉素類似物介導(dǎo)的寡聚化時,觸發(fā)所需的生物反應(yīng)。該試劑盒可以包含一些能夠通過該試劑盒的結(jié)構(gòu)編碼嵌合蛋白分子實(shí)現(xiàn)多聚化的28-表雷帕霉素類似物,以及可以包含另外一些多聚化拮抗劑。該試劑盒可以進(jìn)一步包含編碼與同源的DNA序列有關(guān)系的靶基因(或克隆位點(diǎn))的核酸結(jié)構(gòu),該DNA序列通過容許與多聚化嵌合蛋白分子中存在的同源的DNA序列有關(guān)系的基因轉(zhuǎn)錄的嵌合蛋白質(zhì)二聚化辨認(rèn)。該結(jié)構(gòu)可以與一種或多種便于選擇轉(zhuǎn)染子以及其他用于真核生物中的表達(dá)的原核生物中的復(fù)制的傳統(tǒng)的載體元素的選擇標(biāo)識物有關(guān)。該選擇標(biāo)識物可以是相同的或各具有不同的結(jié)構(gòu),容許包含各種這樣的結(jié)構(gòu)的細(xì)胞的選擇。
用于與同源的DNA序列相聯(lián)系的靶基因引入細(xì)胞的輔助結(jié)構(gòu)可以包含一個代替靶基因的克隆位點(diǎn)。包含這樣的結(jié)構(gòu)試劑盒容許專業(yè)人員提供的基因可調(diào)的表達(dá)細(xì)胞的基因改造。
本發(fā)明的其他試劑盒可以包含一或二(或更多)種嵌合蛋白質(zhì)的核酸結(jié)構(gòu),其中一種或多種核酸結(jié)構(gòu)包含代替轉(zhuǎn)錄激活因子或DNA結(jié)合蛋白的克隆位點(diǎn),容許使用者插入任何他希望的區(qū)域。這樣的試劑盒可以選擇性地包括其他如上所述的元素,例如有或者沒有預(yù)先選擇的DNA結(jié)合區(qū)域的同源的DNA序列的靶基因的核酸結(jié)構(gòu)。
任何試劑盒可能同時包含被本發(fā)明結(jié)構(gòu)穩(wěn)定地轉(zhuǎn)化的陽性對照細(xì)胞,因此該細(xì)胞暴露于28-表雷帕霉素類似物時表達(dá)報導(dǎo)基因(對于CAT,β-半乳糖苷酶或任何可方便地檢測出的基因產(chǎn)物)。也可被提供測定和/或定量該報導(dǎo)基因的表達(dá)的試劑。
關(guān)于適于本發(fā)明實(shí)施中使用的體系或組分的設(shè)計、結(jié)構(gòu)以及使用的更加詳盡的資料,可查閱下列出版物Spencer et al,1993,supra;Rivera et al 1996,supra;Spenceret al,1996,Current Biology 6,839-847;Luo et al,1996,Nature,383,181-185;Ho et al,1996,Nature 382,822-826;Belshaw et al,1996,ProcSci.USA 93,4604-4607;Spencer,1996,TIG 12(5),181-187;Spencer 1995,Proc.,Natl.Acad.Sci.USA 92,9805-9809;Holsinger et al,1995,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92,9810-9814;Pruschyetal,1994,Chemistry & Biologyl(3),163-172;以及公開的申請WO 94 18317,WO 95/02684,WO 95/33052,WO 96/20951和WO96/41865。
本發(fā)明的焦點(diǎn)是使用28-表雷帕霉素類似物作為使用如本申請上文與其他處描述的FKBP和FRB融合蛋白質(zhì)中的蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)相互作用的介質(zhì)。28-表雷帕霉素類似物可以用于隱性二聚化-定位技術(shù),包括觸發(fā)生長或維持在培養(yǎng)物中的或存在于有機(jī)體整體,包括人類及其他哺乳動物中的基因工程細(xì)胞中的生物學(xué)轉(zhuǎn)變。因此28-表雷帕霉素類似物可以用于體外生物學(xué)試驗(yàn),包含該基因工程細(xì)胞的動物實(shí)驗(yàn)中的研究試劑,以及作為包含基因工程細(xì)胞的人和動物的預(yù)防劑或治療劑。
28-表雷帕霉素類似物
本申請使用的術(shù)語“28-表雷帕霉素類似物”表示包括在C28具有與雷帕霉素相反的立體化學(xué)的雷帕霉素及其他在結(jié)構(gòu)上與雷帕霉素相關(guān)的化合物(總起來說,“雷帕霉素類似物”)的各種的類似物,同系物以及衍生物的一類化合物。除非本申請?zhí)貏e指定,可用于實(shí)施本發(fā)明方法的“28-表雷帕霉素類似物”包括其中包含顯示如下的亞結(jié)構(gòu),具有許多各種各樣的取代基,以及選擇性地具有一個或多個不飽和碳-碳鍵的化合物。
化合物典型地包含至多三個C1和C7之間的雙鍵;在本文件其它地方論述的各種型式的C7取代基;在一個或多個的C14,C24和C30上的非強(qiáng)制的以及獨(dú)立地選擇的酮基,鹵素,羥基或衍生的羥基(例如酯,酰胺,脲,氨基甲酸酯,醚,等等基團(tuán));烷氧基(通常為MeO),在C29上的羥基或H,本申請其它地方公開的“a”部分;以及本申請其它地方定義的R28部分。
那些化合物的典型的小組包括下列亞結(jié)構(gòu)
在其它地方,R43O-取代基可以按上面描述的定向,或,與相對于雷帕霉素的28-表雷帕霉素的其他修飾基團(tuán)結(jié)合,可以存在相反的立體化學(xué),或者該化合物可能表示兩個C43異構(gòu)體的混合物。
可以用于實(shí)施本發(fā)明方法的28-表雷帕霉素類似物尤其包括28-表雷帕霉素和具有一個或多個相對于雷帕霉素的下列修飾的各種衍生物在C7,C42和/或C29甲氧基上的脫甲基,消除或替換;在C13,C43和/或C28羥基上的消除,衍生或替換;在C14,C24和/或C30酮基上的還原,消除或者衍生作用;具有5-元脯氨酰環(huán)的6-元2-哌啶酸環(huán)上的替換;以及環(huán)己基環(huán)上的一個或多個取代基的消除,衍生或者替換或者具有取代或未被取代的環(huán)戊基環(huán)的環(huán)己基環(huán)的替換。以前報導(dǎo)的雷帕霉素類似物的說明的例子公開在列在表I上的文件中。以前報導(dǎo)的在C7上修飾的雷帕霉素類似物的實(shí)例顯示于表II。
表I
其他典型的雷帕霉素類似物包括于表III
可用于本發(fā)明各方面實(shí)施的其他使人感興趣的化合物包括包含一個或多個下列相對于雷帕霉素的修飾的28-表雷帕霉素類似物
(a)正如已知的雷帕霉素類似物一樣,環(huán)己基環(huán)是由5-元環(huán)狀體系衍生的或替換的(雖然43-表羥基(hydoxyl)僅僅包括與另外的修飾,例如在C7的結(jié)合,與24,30-四氫化修飾的結(jié)合,與一種或多種另外的變化的結(jié)合);
(b)烷基化(包括,例如,芐基化),芳基化,?;?,芳?;?,或一個或多個羥基部分與鹵素的替換;
(c)一個或兩個在C24和C30的羰基轉(zhuǎn)化為=NRA=NORA,=NNHRA,-NHORA,-NHNHRA,-ORA(尤其包括,-OH),-OCO)RA或-OC(O)NRA,鹵素或-H;
(d)C13和C28的一個或兩個羥基轉(zhuǎn)化為H,鹵素,-ORA,-SRA,-OC(O)RA或-OC(O)NRARB或C28和C30橋合的環(huán)部分(例如碳酸酯),-SC(O)RA,-SC(O)NRARB,-NRARB或-N(RB)(CO)RA(尤其包括其中-ORA是H,-OCH2苯基,或-OCH2Ar的上述具體方案);
(e)C14的羰基轉(zhuǎn)化為-ORA,-NRA,-H,=NC(O)RA,-NRBC(O)RA,-C(O)RA或-OC(O)NRARB;
(f)C43羥基轉(zhuǎn)化為H,鹵素,-CN,=O,-OH,-NRARB,OSO2CF3,OSO2F,OSO2RA,OCORA,OCONRARB,或OCON(ORA)RB。
用于實(shí)施本發(fā)明的28-表雷帕霉素類似物,可以包含任何可能的立體異構(gòu)定向的取代基,除非另外指定,可以包含基本上無其他立體異構(gòu)體的一種立體異構(gòu)體(>90%,優(yōu)選>95%,除其他的立體異構(gòu)體外,以摩爾計)或可以包含立體異構(gòu)體的混合物。
本發(fā)明也包括上述化合物的藥學(xué)上可接受的衍生物,其中短語“藥學(xué)上可接受的衍生物”表示任何這樣的化合物的藥學(xué)上可接受的鹽,酯,氨基甲酸酯,或這樣的酯或氨基甲酸酯的鹽,或任何其他加合物或衍生物,它對患者給藥時能夠直接或間接地提供本申請描述的28-表雷帕霉素類似物,或其代謝物或殘余物。因此藥學(xué)上可接受的衍生物尤其包括雷帕霉素類似物的前體藥物。前體藥物是化合物的衍生物,通常具有顯著地降低的藥理學(xué)活性,包含容易在體內(nèi)除去產(chǎn)生作為藥理學(xué)活性中心的母體分子的另外的部分。前體藥物的一個例子是在體內(nèi)分解生產(chǎn)使人感興趣的化合物的一種酯。雷帕霉素和其他化合物的各種前體藥物,衍生母體化合物產(chǎn)生前體藥物的原料和方法,是已知的可以適應(yīng)于本發(fā)明。
本申請使用的術(shù)語“脂族基團(tuán)”包括兩個飽和和不飽和的,直鏈的(即,無支鏈的),支鏈的,環(huán)狀的,或多環(huán)的脂肪族烴,它選擇性地被一種或多種官能團(tuán)取代。除非另作說明,烷基,其他脂族基團(tuán),烷氧基和酰基基團(tuán)優(yōu)選地包含1-8個,在很多情況下1-6個,連接的脂族碳原子。因此典型的脂族基團(tuán)包括,例如,甲基,乙基,正丙基,異丙基,環(huán)丙基,-CH2-環(huán)丙基,烯丙基,正丁基,仲丁基,異丁基,叔丁基,環(huán)丁基,-CH2-環(huán)丁基,正戊基,仲戊基,異戊基,叔戊基,環(huán)戊基,-CH2-環(huán)戊基,正己基,仲己基,環(huán)己基,-CH2-環(huán)己基等等,它們還可以連接一種或多種取代基。
取代基的例子包括-OH,-OR2′,-SH,-SR2′,-CHO,=O,-COOH(或其酯,氨基甲酸酯,脲,肟或碳酸鹽),-NH2(或其取代的胺,酰胺,脲,氨基甲酸酯或胍衍生物),鹵素,三鹵烷基,氰基,-SO2-CF3,-OSO2F,-OS(O)2R11,-SO2-NHR11,-NHSO2-R11,硫酸鹽,磺酸鹽,芳基和雜芳基。芳基和雜芳基取代基本身可以是被取代或未被取代的(例如,單,二和三烷氧基苯基;亞甲基二氧基苯基或亞乙基二氧基苯基;鹵代苯基;或-苯基-C(Me)2-CH2-O-CO-[C3-C6]烷基或烷基氨基)。
此處使用的術(shù)語“脂族”包括烷基,烯基,炔基,環(huán)烷基,環(huán)烯基,和環(huán)炔基。
本申請使用的術(shù)語“烷基”包括直鏈,支鏈和環(huán)狀的烷基。其他通用的術(shù)語如“烯基”,“炔基”等等也類似。此外,本申請使用的術(shù)語“烷基”,“烯基”,“炔基”等等包括取代和未被取代的基團(tuán)。
術(shù)語“烷基”通常指具有一到八,優(yōu)選一到六個碳原子的基團(tuán)。例如,“烷基”可為甲基,乙基,正丙基,異丙基,環(huán)丙基,丁基,異丁基,仲丁基,叔丁基,環(huán)丁基,戊基,異戊基,叔戊基,環(huán)戊基,己基,異己基,環(huán)己基,等等。合適的取代烷基包括,但不限于,氟甲基,二氟甲基,三氟甲基,2-氟乙基,3-氟丙基,羥甲基,2-羥乙基,3-羥丙基,芐基,取代芐基等等。
術(shù)語“烯基”通常指具有二到八,優(yōu)選二到六個碳原子的基團(tuán)。例如,“烯基”可為丙-2-烯基,丁-2-烯基,丁-3-烯基,2-甲基丙-2-烯基,己-2烯基,己-5-烯基,2,3-二甲基丁-2-烯基,等等。術(shù)語“炔基”也指具有二到八,優(yōu)選二到六個碳原子的基團(tuán),包括,但不限于,丙-2-炔基,丁-2-炔基,丁-3-炔基,戊-2-炔基,3-甲基戊-4-炔基,己-2-炔基,己-5-炔基,等等。
本申請使用的術(shù)語“環(huán)烷基”特別地指具有三到七,優(yōu)選三到十個碳原子的基團(tuán)。合適的環(huán)烷基包括,但不限于環(huán)丙基,環(huán)丁基,環(huán)戊基,環(huán)己基,環(huán)庚基等等,在其他脂族或雜脂族或雜環(huán)族的部分可能選擇性地被取代。
本申請使用的術(shù)語“雜脂族”指其中包含一個或多個,例如,氧,硫,氮,磷或硅原子代替碳原子的脂族部分。雜脂族部分可以是支鏈,無支鏈的或環(huán)狀的,包括雜環(huán)如嗎啉代基,吡咯烷基,等等。
本申請使用的術(shù)語“雜環(huán)”指環(huán)狀的雜脂族基團(tuán),優(yōu)選三到十個環(huán)原子,包括,但不限于,螺[4.4]二氧己烷(oxetane),四氫呋喃,四氫吡喃,氮丙啶,氮雜環(huán)丁烷,吡咯烷,哌啶,嗎啉,哌嗪等等。
本申請使用的術(shù)語“芳基”和“雜芳基”指具有3-14個碳原子的可以取代或未被取代的穩(wěn)定的單或多環(huán)的,雜環(huán)的,多雜環(huán)的不飽和部分。取代基包括以前提到的任何取代基。有用的芳基環(huán)基團(tuán)的非限制性例子包括苯基,鹵代苯基,烷氧基苯基,二烷氧基苯基,三烷氧基苯基,亞烷基二氧基苯基,萘基菲基,蒽基,菲并等等,典型的雜芳基環(huán)的例子包括5-元單環(huán)基團(tuán)如噻吩基,吡咯基,咪唑基,吡唑基,呋喃基,異噻唑基,呋咱基,異惡唑基,噻唑基等等;6-元單環(huán)基團(tuán)如吡啶基,吡嗪基,嘧啶基,噠嗪基,三嗪基等等;和多環(huán)的雜環(huán)基團(tuán)如苯并[b]噻吩基,萘并[2,3-b]噻吩基,噻蒽基,異苯并呋喃基,色烯基,占噸基,phenoxathienyl,中氮茚基,異氮茚基,吲哚基,吲唑基,嘌呤基,異喹啉基,喹啉基,2,3-二氮雜萘基,naphthyridinyl,喹喔啉基,喹唑啉基,苯并噻唑基,苯并咪唑基,,四氫喹啉1,2-二氮雜萘基,喋呤基,咔唑基,β-咔啉基,菲啶基,吖啶基,萘嵌二氮苯基,菲咯啉基,吩嗪基,異噻唑基,吩噻嗪基,苯并惡嗪基,等等(參見例如Katritzky,Handbook of Heterocyclic Chemistry)。芳基或雜芳基部分可以被一到五個選自羥基,C1-C8烷氧基,C1-C8支鏈或直鏈烷基,酰氧基,甲氨酰,氨基,N-酰胺基,硝基,鹵素,三鹵甲基,氰基,和羧基的基團(tuán)取代。因此芳基部分包括,例如苯基;具有一個或多個選自下列取代基的取代苯基鹵素如氯或氟,羥基,C1-C6烷基,?;?,酰氧基,C1-C6烷氧基(如甲氧基或乙氧基,尤其包括二烷氧基苯基如2,3-,2,4-,2,5-,3,4-或3,5-二甲氧基或二乙氧基苯基或如亞甲基二氧基苯基,或3-甲氧基-5-乙氧苯基;或三元取代的苯基,如三烷氧基苯基(例如,3,4,5-三甲氧基或乙氧苯基),3,5-二甲氧基-4-氯-苯基,等等),氨基,SO2NH2,-SO2NH(脂基),-SO2N(脂基)2,-O-脂基-COOH,和-O-脂基-NH2(它可以包含一或二個N-脂基或N-?;〈?。
本發(fā)明的“鹵素”取代基可以是氟,氯,溴或碘取代基。氟常常是優(yōu)選的鹵素。
28-表雷帕霉素類似物可以在一個,兩個,三個,四個,五個,六個或七個取代基部分不同于28-表雷帕霉素。這類化合物尤其包括相對于雷帕霉素在下列位置修飾的28-表雷帕霉素類似物在C7和C13;C7和C14;C7和a;C7和C43;C7和C24;C7和C28;C7和C30;C7C13和C14;C7,C13和a;C7,C13和C43;C7,C13和C24;C7,C13和C28;,C13和C30;C7,C14和a;C7,C14和C43;C7,C14和C24;C7,C14和C28;C7,C14和C30;C7,a和C24;C7,a和C28;C7,a.和C30;C7,C24和C30;C7,C24C30和a;C7 C24,C30和C13;C7,C24,C30和C14;C24,C30和C13;C24,C30和a;C24,C30和C14;以及,C30,C13和a。雷帕霉素類似物的結(jié)構(gòu)修飾因一些以前已知的雷帕霉素類似物而眾所周知(參見例如WO 99/36553,Table III and Liberles et al,1997,ProcNatI Acad Sci USA 9478257830 and infra)并可容易地適應(yīng)于本發(fā)明。
對于本發(fā)明方法特別令人感興趣的28-表雷帕霉素類似物的小組是那些其中RC7a是除OMe以外的基團(tuán)的28-表雷帕霉素類似物(或其藥學(xué)上可接受的衍生物)。該小組(“C7 28-表雷帕霉素類似物”)包括其中R7a和R7b中的一個是H另一個選自-RA,-Z-RA,-Z-(CO)RA,-Z-(CO)Z′RA,-NRASO2RA′和-NSO2RA的化合物,其中Z和Z′獨(dú)立地為O,S或NRA。該小組中的28-表雷帕霉素類似物具有選自下列基團(tuán)的C7取代基芳基;雜芳基;芳基,雜芳基或芐基醚;和-NH(CO)ORA,-NH(CO)RA,-NH(SO2)RA或-NH(SO2)NHRA(其中RA為取代或未被取代的低級烷基,例如甲基、乙基、異丙基、丁基、芐基等,或者是取代或未取代的苯基(例如,對-甲苯基)。在該小組的某些具體方案中,R7a和R7b獨(dú)立地選自下列基團(tuán)H;取代或未被取代的二到八個碳的直鏈,支鏈或環(huán)狀的烯基,烷氧基或烷巰基;和取代或未被取代的芳基,雜芳基,芳氧基或雜芳氧基,芳巰基或雜芳巰基。該小組的化合物尤其包括其中R7a為H;(與R7b一起)=O;烷氧基;烷巰基;氨基(1°,2°或3°);酰胺基;氨基甲酸酯基;芳基或取代芳基;苯基或取代苯基;取代或未被取代的雜芳基如取代或未被取代的噻吩基,呋喃基,吲哚基,等等;或芐氧基或取代的芐氧基的化合物??梢杂糜趯?shí)施本發(fā)明方法的其他典型的C7 28-表雷帕霉素類似物包括其中R7a和R7b之一為H和另一個選自-OEt,-O-丙基,-O-丁基,-OCH2CH2-OH,-O-芐基,-O-取代的芐基(包括例如,3-硝基,4-氯,3-碘-4-偶氮基,3,4-二甲氧基,和2-甲氧基-),-S-Me,-S-苯基,-O(CO)Me,-烯丙基,-CH2C(Me)=CH2,-OCH2-CCH,-OCH2-CC-Me,-OCH2-CC-Et,-OCH2-CC-CH2OH,或-2,4-二甲氧基苯基,2,4,6-三甲氧基苯基,呋喃基,噻吩基,甲基噻吩基,吡咯基和吲哚基的化合物。特別令人感興趣的C7修飾的28-表雷帕霉素類似物為在C7具有取代或未被取代的芳香醚,取代或未被取代的二芐醚或氨基甲酸酯部分的化合物。在C7-修飾具體方案中,C43的羥基取代基可以存在任何一個立體化學(xué)取向(或作為異構(gòu)體的混合物)或者按本申請其它地方描述的修飾。C7 28-表雷帕霉素類似物可以進(jìn)一步在一,二,三,四,五個或更多的其他位置變化。
式I,II和III 28-表雷帕霉素和C7 28-表雷帕霉素類似物特別令人感興趣,本質(zhì)上作為物質(zhì)的組分包括于本發(fā)明中。
實(shí)施本發(fā)明各種方法中特別令人感興趣的28-表雷帕霉素類似物的另一個小組為其中取代基在除C24和C30以外的式I,II or III化合物(=O)。具有C30和C24取代基的令人感興趣的化合物公開于WO 99/36553。該小組尤其包括其中RC30和RC24為OH以及RC7a和RC7b包括式II指定位置的任何替換取代基,包括與表II或III的化合物一致的任何C7取代基的所有的28-表雷帕霉素類似物。該小組尤其包括其中基團(tuán)a不同于雷帕霉素的28-表雷帕霉素類似物。例如,該小組包括下式化合物
其中至少一個RC7a和RC7b不是-OMe。RC7a和/或RC7b的選擇性的取代基公開于本申請其它地方。特別令人感興趣的化合物是其中一個RC7a和RC7b為可以選擇性地取代的環(huán)狀脂族基團(tuán),芳基,雜環(huán)基或雜芳基的化合物。該小組內(nèi)的其他化合物包括其中一,二,三,四或五個羥基被差向異構(gòu)化,氟化,烷基化,酰化或者經(jīng)過其他酯,氨基甲酸酯,碳酸鹽或尿素修飾的化合物。一個典型的化合物為其中C43羥基被差向異構(gòu)化和C28和C30的羥基被烷基化,酰化或形成碳酸鹽連接的28-表雷帕霉素類似物。
另一個特別令人感興趣的28-表雷帕霉素類似物的小組為其中在C13,C43,和C28的一個或多個包含F(xiàn)的單,二和三氟-28-表雷帕霉素類似物,公開于WO 99/36553,在28-表雷帕霉素類似物分子中有或者沒有其它地方的另外的變化。
另一個使人感興趣的的28-表雷帕霉素類似物小組為其中RC24不是=O的式II化合物,同樣,在其他相對于雷帕霉素的其他有或者沒有一種或多種其他修飾。
其他使人感興趣的28-表雷帕霉素類似物包括其中RC14為OH的28-表雷帕霉素類似物。
此外,本發(fā)明包括其中雷帕霉素中的1,2,3,4或5,6位置的一個或多個碳碳雙鍵為飽和的、單獨(dú)的或與本分子其他位置修飾的組合,例如在一個或多個C7,C13,C43,C24,C28和/或C30修飾的28-表雷帕霉素類似物。同時也包括其中使用本領(lǐng)域已知的方法使C3,C4雙鍵環(huán)氧化;C6甲基被-CH2OH或-CH2OMe替換;C43羥基變?yōu)镕,Cl或H或其他取代基;以及C42甲氧基脫甲基的本申請公開的任何化合物。同樣地,基團(tuán)a可以替換為下列任何基團(tuán)
合成指導(dǎo)
通過發(fā)酵和全合成生產(chǎn)雷帕霉素是已知的。一些作為發(fā)酵產(chǎn)品的雷帕霉素類似物的生產(chǎn)也是已知的。尤其包括具有雷帕霉素的環(huán)己基環(huán)或2-哌啶酸環(huán)特征的選擇性的基團(tuán)的雷帕霉素類似物,以及C7-脫甲基-雷帕霉素,C29-脫甲基-雷帕霉素和C29-脫甲氧基-雷帕霉素。
在室溫下,在二氯甲烷中,使用Ti(OiPr)4可以容易地使雷帕霉素轉(zhuǎn)化為28-表雷帕霉素。如此生產(chǎn)的28-表雷帕霉素可以進(jìn)一步使用已經(jīng)被用于雷帕霉素及其他雷帕霉素類似物的方法和原料進(jìn)一步修飾?;蛘?,在某些情況下(不包括C30酮基的修飾)所需的變換可以用雷帕霉素或其衍生物進(jìn)行,并將前末基(penalfimate)的產(chǎn)品進(jìn)行C28差向異構(gòu)化以及通過本申請公開的方法可以從反應(yīng)混合物的其他產(chǎn)品中分別回收所需的產(chǎn)品,盡管這樣做常常不是優(yōu)選的。
如同通過發(fā)酵得到雷帕霉素和各種雷帕霉素類似物的方法,雷帕霉素和結(jié)構(gòu)上相關(guān)的大環(huán)內(nèi)酯的各種化學(xué)變化的方法和原料在領(lǐng)域是已知的。雷帕霉素和各種雷帕霉素類似物的許多這樣的化學(xué)變化公開于上述表I中的專利文件中,用來說明可以應(yīng)用于本發(fā)明的實(shí)施中的化學(xué)合成和產(chǎn)品回收,提純和制劑的領(lǐng)域中的技術(shù)和知識的水平。以下是可以用于所需的雷帕霉素類似物的生產(chǎn)的典型變換和/或參考文獻(xiàn)
另外,用于本發(fā)明的28-表雷帕霉素類似物以及生產(chǎn)這樣的28-表雷帕霉素類似物的中間體可以通過直接的生物合成制備,例如按照Katz et al,WO 93/13663和Cane et al,WO 9702358所述。也參見Khaw et al,1998,J.Bacteriology 180(4)809-814的另外的生物學(xué)方法。
按本申請公開的指導(dǎo),使用本領(lǐng)域已知的方法和原料,本領(lǐng)域普通的技術(shù)人員可以制備本發(fā)明新的28-表雷帕霉素類似物。例如,由上述引用的文件中陳列或引用的已知的方法可以得到的方法和原料。上述引用的文件的全部內(nèi)容作為參考編入本申請。本申請?zhí)峁┑牧硗獾闹笇?dǎo)和例子作為對專業(yè)人員的說明和進(jìn)一步指導(dǎo)。顯然,本領(lǐng)域普通的化學(xué)工作者可以容易地對上述進(jìn)行改變,例如在合成期間在敏感的基團(tuán)上添加適當(dāng)?shù)谋Wo(hù)基,不再需要或要求時除去該保護(hù)基,可以容易地確定其他的合成方法。
FKBP區(qū)域和融合蛋白質(zhì)
FKBP融合蛋白質(zhì)包括至少一個包含全部或部分FKBP區(qū)域肽序列的FKBP區(qū)域和至少一個異源的作用區(qū)域。該嵌合蛋白必須能夠與本發(fā)明28-表雷帕霉素類似物結(jié)合,按直接結(jié)合測量(例如熒光猝滅),競爭結(jié)合測量(例如與FK506比較),F(xiàn)KBP酶活性的抑制(旋轉(zhuǎn)異構(gòu)酶),或其他測定方法,優(yōu)選的Kd值低于約100nM,更優(yōu)選低于約10nM并且甚至更優(yōu)選低于約1nM。例如如國際專利申請PCT US94/01617所述,嵌合蛋白典型地將包含一個或多個蛋白質(zhì)區(qū)域,包括選自天然存在的FKBP蛋白質(zhì)如人類FKBP12。通常通過替換,插入或刪除10個或更少,優(yōu)選5個或更少氨基酸殘基,可以整修那些肽序列,調(diào)整結(jié)合專一性。在某些具體方案中,選擇這樣的修飾產(chǎn)生一個或兩個下列結(jié)合方式(a)28-表雷帕霉素類似物與修飾的FKBP區(qū)域,或包含優(yōu)選至少一個,更優(yōu)選至少兩個,并且甚至更優(yōu)選三或四個或更多的修飾的FKBP區(qū)域的嵌合體的結(jié)合,結(jié)合量值大于與FKBP12或基因改造的寄主細(xì)胞的內(nèi)源的FKBP的結(jié)合;和(b)FKBP28-表雷帕霉素類似物配合物與,優(yōu)選至少一個,更優(yōu)選至少兩個,并且甚至更優(yōu)選至少三個FRB融合蛋白質(zhì)的結(jié)合,結(jié)合量值大于與FRAP或其他的基因改造寄主細(xì)胞的內(nèi)源的包含蛋白質(zhì)的FRB的結(jié)合。
FKBP嵌合體也可包含至少一個異源的作用區(qū)域,即,包含非FKBP肽序列的蛋白質(zhì)區(qū)域。該作用區(qū)域可以是DNA結(jié)合域,轉(zhuǎn)錄激活作用區(qū)域,細(xì)胞定位區(qū)域,胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)區(qū)域,等等,如本申請其它地方或PCT/US94/01617或引用的其他參考文獻(xiàn)所述。一般說來,該作用區(qū)域能夠引導(dǎo)嵌合蛋白選擇細(xì)胞位置或啟動與另一個作用區(qū)域的締合或聚集,例如,包含相同的或不同的作用區(qū)域的蛋白質(zhì)的多聚化,的生物效應(yīng)。
這樣的編碼融合蛋白質(zhì)的重組體核酸能夠有選擇地與母體FKBP蛋白質(zhì),例如人類FKBP12編碼的DNA雜交,或這樣的雜交能夠不產(chǎn)生遺傳密碼的退化。所以這些嵌合蛋白質(zhì)包含源自另一個蛋白質(zhì),例如Ga14,VP16,F(xiàn)AS,CD3ξ鏈,等等的作用區(qū)域,該嵌合蛋白編碼的重組DNA也能夠有選擇地與其他編碼蛋白質(zhì)的DNA雜交,或者這樣的雜交能夠不產(chǎn)生遺傳密碼的退化。
本發(fā)明FKBP融合蛋白質(zhì),以及下文更詳細(xì)論述的FRB融合蛋白質(zhì),可以包含一個或多個不同的配體結(jié)合區(qū)域的一種或多種拷貝和一個或多個作用區(qū)域的一種或多種拷貝。該配體結(jié)合區(qū)域(s)(即FKBP和FRB區(qū)域)可以是N-末端,C-末端,或可被散布于該作用區(qū)域(s)。包括配體結(jié)合區(qū)域多拷貝的具體方案通常具有2,3或4個這樣的拷貝。例如,F(xiàn)KBP融合蛋白質(zhì)可以包含2,3或4個FKBP區(qū)域。該FKBP融合蛋白質(zhì)(以及下文論述的FRB融合蛋白質(zhì))的各種的區(qū)域通過連接源自相鄰區(qū)域或異源的肽區(qū)域而選擇性地分離。
可用于實(shí)施本發(fā)明的FKBP融合的典型的例子包括PCT/US94/01617(Stanford & Harvard),PCT/US94/08008(Stanford & Harvard),Spencer et al(supra),PCT/US95/10591(ARIAD),PCT/US95/06722(Mitotix,Inc.)及其他本申請引用的參考文獻(xiàn)公開的FKBP融合蛋白質(zhì);FKBP融合蛋白質(zhì)公開于隨后的例子中;所有上述FKBP融合蛋白質(zhì)的變體包含至多10個(優(yōu)選1-5)氨基酸插入,刪除或替換一個或多個FKBP區(qū)域,仍然能夠與雷帕霉素或28-表雷帕霉素類似物結(jié)合;所有上述FKBP融合蛋白質(zhì)的變體包含一種或多種通過DNA序列編碼的FKBP區(qū)域的拷貝,能夠有選擇地與編碼天然存在的FKBP區(qū)域的DNA序列雜交,并仍然能夠與雷帕霉素或28-表雷帕霉素類似物雜交;所有上述變體中一種或多種異源的作用區(qū)域刪除,替換或補(bǔ)充以不同的異源的作用區(qū)域;所有上述FKBP融合蛋白質(zhì)的變體能夠與雷帕霉素或28-表雷帕霉素類似物結(jié)合,并包含源自非人類來源的FKBP區(qū)域;以及所有上述FKBP融合蛋白質(zhì)的變體包含一種或多種與人類FKBP12的Tyr26,Phe36,Asp37,Arg42,Phe46,Phe48,Glu54,Val55,或Phe99相應(yīng)的氨基酸殘基,其中一個或多個上述氨基酸殘基被不同的氨基酸替代,該變體能夠與雷帕霉素或28-表雷帕霉素類似物結(jié)合。
例如,在一些情況下,F(xiàn)KBP融合蛋白質(zhì)包含F(xiàn)KBP區(qū)域的多個拷貝,該FKBP區(qū)域包含人類FKBP12氨基酸1-107,通過由ACTAGA編碼的接頭Thr-Arg2-氨基酸分離,DNAs連接產(chǎn)品分別由限制酶Spel和Xbal消化。下表提供以上述FKBP12序列為基準(zhǔn)的突變體FKBP區(qū)域的典型的小組典型的突變體FKBPs注解這些條目是通過單字母代碼和序列位置確定天然的氨基酸,接著在該突變體中替換的氨基酸。因此,F(xiàn)36V指定為其中位置36的苯基丙氨酸由纈氨酸替代的人類FKBP12序列。F36V/F99A顯示其中位置36和99的苯基丙氨酸分別由纈氨酸和丙氨酸替代的雙突變體。
FRB區(qū)域和融合蛋白質(zhì)
FRB融合蛋白質(zhì)包括至少一個FRB區(qū)域(如其它地方描述,其中可以包含全部或部分FRAP蛋白質(zhì)或其變體的肽序列)和至少一個異源的效應(yīng)因子區(qū)域。
一般說來,F(xiàn)RB區(qū)域,或包括它的嵌合蛋白,由能夠有選擇地與將包括天然存在的FRB區(qū)域編碼的DNA分子,例如編碼人類或其他哺乳動物FRAP蛋白質(zhì)或酵母蛋白質(zhì),Tor-1或Tor-2或以前提到的包含Candida FRB的蛋白質(zhì)中的一個DNA分子雜交。本發(fā)明FRB區(qū)域能夠與FKBP蛋白質(zhì)和本發(fā)明28-表雷帕霉素類似物的配合物結(jié)合。
FRB融合蛋白質(zhì)必須能夠與由FKBP融合蛋白質(zhì)與本發(fā)明28-表雷帕霉素類似物形成的配合物結(jié)合。優(yōu)選地,F(xiàn)RB融合蛋白質(zhì)與具有按常規(guī)方法測量的低于200uM,更優(yōu)選低于10uM的Kd值的配合物結(jié)合。FRB區(qū)域應(yīng)具有足夠長度和組成,可以對28-表雷帕霉素類似物與FKBP融合蛋白質(zhì)的配合物維持高親合力。在一些具體方案中,F(xiàn)RB區(qū)域跨越少于約150個氨基酸的長度在某些情況下少于約100個氨基酸。一個這樣的區(qū)域包括從Val2012到Tyr2144的133個人類FRAP氨基酸區(qū)域。參見Chiu etal,1994,Proc.Natl.AcadSci.USA 9112574-12578。一個特別令人感興趣的FRB區(qū)域跨越人類FRAP的Glu2025到Gln2114,對于FKBP12雷帕霉素配合物或?qū)τ贔KBP-28-表雷帕霉素類似物配合物保持親合力。在一些具體方案中,從90-氨基酸序列中除掉Q2214,得到89-氨基酸FRB區(qū)域。通常通過替換,插入或刪除10個或更少,優(yōu)選5個或更少氨基酸,F(xiàn)RB肽序列可以被修飾,調(diào)整結(jié)合專一性。在某些具體方案中,這樣的修飾使得形成包括一種或多種FKBP融合蛋白質(zhì),F(xiàn)RB融合蛋白質(zhì)和28表雷帕霉素類似物的配合物的趨勢超過形成內(nèi)源的FKBP和FRAP蛋白質(zhì)與雷帕霉素類似物的配合物的趨勢。那樣的趨勢優(yōu)選最少一個,更優(yōu)選至少兩個,并且甚至更優(yōu)選三個大小級次(通過任何測量)。
編碼這樣的蛋白質(zhì)的重組DNA能夠有選擇地與編碼FKBP蛋白質(zhì)的DNA雜交,或這樣的雜交能夠不產(chǎn)生遺傳密碼的退化。此外,因?yàn)檫@些嵌合蛋白質(zhì)包含源自另一個蛋白質(zhì),例如Ga14,VP16,F(xiàn)AS,CD3ξ鏈,等等的效應(yīng)因子區(qū)域,該編碼嵌合蛋白的重組DNA也能夠有選擇地與編碼其他蛋白質(zhì)的DNA雜交,或者這樣的雜交能夠不產(chǎn)生遺傳密碼的退化。
用于上述本發(fā)明的FRB嵌合體的典型的例子包括隨后的實(shí)施例公開那些,其中一個或多個異源的區(qū)域被選擇性的異源的區(qū)域替換或一種或多種另外的異源的區(qū)域補(bǔ)充的變體,其中一個或多個FRB區(qū)域?yàn)榉侨祟愲男蛄衼碓吹膮^(qū)域(如Tor 2或Candida)的變體,以及其中FRB區(qū)域按本申請描述被氨基酸取代,替換或插入的變體,條件是該嵌合體能夠與FKBP蛋白質(zhì)和本發(fā)明28-表雷帕霉素類似物形成的配合物結(jié)合。典型的FRB融合蛋白質(zhì)包含一種或多種FRB,該FRB至少具有89-氨基酸,包含至少跨越人類FRAP殘基2025-2113的序列,通過按先前提到的Spel-Xbal位置的連接形成的接頭Thr-Arg分離開。顯然,本發(fā)明任何融合蛋白質(zhì)中的這樣的限制性位點(diǎn)或接頭可以被使用常規(guī)方法如定位誘變來刪除,置換或伸展。
混合的嵌合蛋白質(zhì)
第三類型的嵌合蛋白包括一個或多個FKBP區(qū)域,一個或多個異源的效應(yīng)因子區(qū)域,和一個或多個如FRB融合蛋白質(zhì)所述的FRB區(qū)域。
混合的嵌合蛋白分子能夠在可與它們結(jié)合的28-表雷帕霉素類似物的存在下形成同源二聚體或同源多聚體蛋白配合物。具體方案包括將具有需要引入單一重組體核酸結(jié)構(gòu)代替二重組體核酸結(jié)構(gòu)的細(xì)胞的,否則需要引導(dǎo)FKBP融合蛋白質(zhì)和FRB融合蛋白質(zhì)表達(dá)的嵌合體混合。
編碼混合嵌合蛋白的重組DNA能夠有選擇地與編碼FKBP蛋白質(zhì)的DNA,編碼FRAP的DNA,和編碼從中能夠衍生一個或多個效應(yīng)因子區(qū)域的DNA序列(例如Ga14,VP16,F(xiàn)as,CD3ξ鏈,等等)雜交,或者這樣的雜交能夠不產(chǎn)生遺傳密碼的退化。
異源的區(qū)域
如上所述,F(xiàn)KBP和FRB融合蛋白質(zhì)的異源的效應(yīng)因子區(qū)域?yàn)榈鞍踪|(zhì)區(qū)域,結(jié)合它們的嵌合蛋白質(zhì)相互關(guān)聯(lián),它們能夠觸發(fā)(或者抑制)靶基因的DNA-結(jié)合和/或轉(zhuǎn)錄;啟動細(xì)胞生長,分化,增殖或者細(xì)胞程序死亡;引導(dǎo)蛋白質(zhì)到一個特殊的細(xì)胞位置;或者啟動其他生物學(xué)轉(zhuǎn)變。
在包括可調(diào)基因轉(zhuǎn)錄的具體方案中,在對第一和第二嵌合蛋白質(zhì)的異源的區(qū)域的締合或多聚化起反應(yīng)的DNA元素的轉(zhuǎn)錄控制下,使用其中包含靶基因(編碼使人感興趣的多肽,反義RNA,核糖酶,等等)的靶基因結(jié)構(gòu)。
在包括轉(zhuǎn)錄的直接活化的本發(fā)明的具體方案中,第一和第二嵌合蛋白質(zhì)的異源的區(qū)域包含DNA結(jié)合區(qū)域如Ga14或嵌合DNA結(jié)合區(qū)域如ZFHD1,論述如下,和轉(zhuǎn)錄激活區(qū)域如分別源自VP16或p65的那些。包含這樣的轉(zhuǎn)錄激活區(qū)域的嵌合蛋白與包含DNA結(jié)合區(qū)域的嵌合蛋白的多聚化將轉(zhuǎn)錄激活因子導(dǎo)向啟動子元件,因此DNA結(jié)合區(qū)域結(jié)合,從而激活與那些啟動子元件有關(guān)系的靶基因的轉(zhuǎn)錄。放棄轉(zhuǎn)錄激活作用區(qū)域或使用阻抑區(qū)域代替轉(zhuǎn)錄激活作用區(qū)域(參見PCT/US94/01617)可提供用于靶基因轉(zhuǎn)錄的抑制。復(fù)合材料DNA結(jié)合區(qū)域和與它們結(jié)合的DNA序列公開于Pomerantz et al,1995,supra,其內(nèi)容作為參考收編在此。這樣的復(fù)合材料DNA結(jié)合區(qū)域,與包含結(jié)合復(fù)合材料DBD的同源的DNA序列的靶基因結(jié)構(gòu)一起,可以用作本發(fā)明實(shí)施中的DNA結(jié)合區(qū)域,
在包括轉(zhuǎn)錄的間接激活的具體方案中,嵌合體的異源的區(qū)域?yàn)樵陧憫?yīng)促進(jìn)劑的控制下轉(zhuǎn)錄激活作用的引發(fā)劑聚集或多聚化的信號蛋白質(zhì)的效應(yīng)因子區(qū)域。例如,該信號區(qū)域可以為T細(xì)胞受體ξ亞基的胞內(nèi)區(qū)域,聚集時,引發(fā)與IL-2促進(jìn)劑或其衍生物有關(guān)系的基因的轉(zhuǎn)錄(例如重復(fù)NF-AT結(jié)合部位)。
在本發(fā)明的另一個方面,該異源的區(qū)域?yàn)槠渲邢嗷リP(guān)聯(lián)能夠引發(fā)細(xì)胞死亡的蛋白質(zhì)區(qū)域。這樣的區(qū)域的例子為Fas抗原或TNF R1的胞內(nèi)區(qū)域。通過類似于PCT/US94/01617公開的方法,可以被設(shè)計和制備包含F(xiàn)as區(qū)域的嵌合蛋白質(zhì)。
基因改造的受體區(qū)域
如先前注解,F(xiàn)KBP和FRB區(qū)域可包含選自天然存在的FKBP和FRB區(qū)域的一些肽序列的一種肽序列。天然存在的序列包括人類FKBP12和人類FRAP的FRB區(qū)域的肽序列。或者,該肽序列可以源自這樣的天然存在的肽序列,但通常也包含一個或兩個這樣的肽序列中至多10個,優(yōu)選1-5個的突變。如本申請別處更詳細(xì)的公開,這樣的突變可以給予一些重要的特征。例如,可以修飾FKBP區(qū)域使它能夠優(yōu)先地結(jié)合28-表雷帕霉素類似物,即比未修改的結(jié)合28-表雷帕霉素類似物的FKBP區(qū)域多至少一,優(yōu)選二,并且甚至更優(yōu)選三或四或更多的數(shù)量級??梢孕揎桭KBP區(qū)域使它能夠優(yōu)先地結(jié)合(修飾或未修飾)FKBP28-表雷帕霉素類似物配合物,即比未修飾的FRB區(qū)域多至少一,優(yōu)選二,并且甚至更優(yōu)選三的數(shù)量級。可以修飾FKBP和FRB區(qū)域使它們能夠優(yōu)先地與28-表雷帕霉素類似物得到三重配合物,即比未修飾的FKBP和FRB區(qū)域多至少一,優(yōu)選二,并且甚至更優(yōu)選三的數(shù)量級。
(a)FKBP
確定增強(qiáng)與包含各種的取代基(“隆起塊”)的FK506衍生物結(jié)合的能力的FKBP突變的方法公開于PCT/US94/01617。相似的策略可用于修飾優(yōu)先地結(jié)合凸形的雷帕霉素衍生物,即,28-表雷帕霉素類似物的FKBP。雷帕霉素和FKBP12的配合物的結(jié)構(gòu)是已知的(參見,例如Van Duyne et al.,J.Am.Chem.Soc.(1991)113,7433-7434)。這樣的數(shù)據(jù)可用于顯示與各種的28-表雷帕霉素類似物取代基不匹配的氨基酸殘基。在該方法中,分子模型用來確定容納28-表雷帕霉素類似物取代基的FKBP區(qū)域中的候選的氨基酸取代基。該突變體通過標(biāo)準(zhǔn)方法表達(dá),如果該突變體保持適當(dāng)?shù)幕钚?親合力。以及通過例如抑制旋轉(zhuǎn)異構(gòu)酶活性,通過與一個分子如FK506結(jié)合的競爭,可測量它們對于28-表雷帕霉素類似物結(jié)合的親合力。
更特別地,我們預(yù)期本發(fā)明的某些28-表雷帕霉素類似物,例如相對于雷帕霉素在C-13或C-14修飾的28-表雷帕霉素類似物優(yōu)先地與其中一個或多個殘基,Tyr26,Phe36,Asp37,Tyr82和Phe99被具有較小側(cè)鏈的氨基酸(如Gly,Ala,Val,Met和Ser)取代的FKBP結(jié)合。在位置26或36修飾的突變體FKBP的例子如上述的“典型的突變體FKBPs”表。同樣地,我們預(yù)期在C20修飾(即,其中R4不是H)的28-表雷帕霉素類似物優(yōu)先地與其中Tyr82和/或lle56被其他氨基酸,特別是具有較小側(cè)鏈的氨基酸代替的FKBP結(jié)合。在另一個例子中,我們預(yù)期在C24修飾(即,其中W不是=O)的28-表雷帕霉素類似物優(yōu)先地與其中一個或多個Phe46,Phe48和Val55T被其他氨基酸,特別是具有較小側(cè)鏈的氨基酸代替的FKBP結(jié)合。另外,我們預(yù)計在C28和/或C30修飾的28-表雷帕霉素類似物優(yōu)先地與其中Glu54被另一個氨基酸,特別是具有較小側(cè)鏈的氨基酸替代的FKBP結(jié)合。在所有上述例子中,可以產(chǎn)生單個或多個氨基酸取代作用。同樣,特定的例子如上述的表。
重復(fù)的基因改造試驗(yàn)和單或多突變體的試驗(yàn)的取舍將在結(jié)構(gòu)確定的殘基共隨機(jī)化,該殘基是接觸或接近28表雷帕霉素類似物或雷帕霉素取代基的殘基。使用常規(guī)的合成或基因工程法可制備許多包含隨機(jī)法確定位置(如上述段落所述)的FKBP區(qū)域的多肽的集合。這樣的集合表示一組包含在一個或多個位置替換氨基酸的FKBP區(qū)域。篩選該集合并選擇具有所需的28-表雷帕霉素類似物結(jié)合性質(zhì)的FKBP變體。一般說來,如果把側(cè)鏈之間有益的協(xié)同作用的可能性增加到最大限度,將幾個殘基同時隨機(jī)化可以生產(chǎn)對于撞擊雷帕霉素類似物具有高親合力和專一性的補(bǔ)償突變體。在不連續(xù)位置隨機(jī)法制備基因庫的技術(shù)是已知的,包括使用簡并寡核苷酸引物-定向誘變,具有簡并寡核苷酸的PCR,和具有簡并寡核苷酸的盒式誘變(參見,例如Lowman,H.B,和Wells,J.A.MethodsComp.Methods Enzymol.1991.3,205-216;Dennis,M.S.和Lazarus,R.A.1994.J.Biol.Chem.269,22129-22136;以及其中的參考文獻(xiàn))。
我們進(jìn)一步預(yù)期,在很多情況下,僅僅雷帕霉素中的給定位置中的或與其接近直接接觸的少數(shù)殘基的隨機(jī)化不能完全探測可以最佳地容納28-表雷帕霉素類似物取代基(隆起塊)的FKBP構(gòu)象中的全部可能的變化。因此該結(jié)構(gòu)也預(yù)計不偏離包含不以結(jié)構(gòu)的原因?yàn)榛鶞?zhǔn)的隨機(jī)的取代作用的基因庫,與優(yōu)先與凸起的28-表雷帕霉素類似物結(jié)合的敏感的突變或結(jié)合一致。幾個合適的誘變方案已經(jīng)被公開,包括丙氨酸-掃描誘變(Cunningham和Wells(1989)Science 244,1081-1085),PCR錯誤參入誘變(參見例如Cadwell和Joyce,1992,PCR Meth.Applic.2,28-33),和′DNA改組′(Stemmer,1994,Nature 370,389-391和Crameri et al,1996,Nature Medicine 2,100-103)。這些技術(shù)生產(chǎn)隨機(jī)的突變體的基因庫,或單突變體的集合,然后通過篩選或選擇方法探測。
在很多情況下,鑒定優(yōu)先結(jié)合隆起塊的最好突變體的有效策略為結(jié)構(gòu)-定位和無偏置的途徑的結(jié)合。參見Clackson和Wells,1994,Trends Biotechnology12,173-184(review)。例如,我們預(yù)期基因庫的結(jié)構(gòu)中的關(guān)鍵聯(lián)絡(luò)殘基通過具有簡并寡核苷酸的PCR隨機(jī)化,但是使用誤差-啟動條件在隨機(jī)位置引導(dǎo)進(jìn)一步的突變進(jìn)行擴(kuò)增。另一個例子為使用DNA改組的結(jié)構(gòu)決定的和無偏見的隨機(jī)基因庫的組分DNA碎片的結(jié)合。
基因庫對于合乎需要的突變的篩選可以通過利用酵母2-混雜系統(tǒng)進(jìn)行(Fields和Song(1989)Nature 340,245-246)。例如,F(xiàn)RB-VP 16融合可以被引入一個媒介物,隨機(jī)化的FKBP序列的基因庫克隆進(jìn)入分離的GAL4融合媒介物。用28-表雷帕霉素類似物處理酵母共同轉(zhuǎn)化體,那些包含互補(bǔ)的FKBP突變體可通過(例如根據(jù)使用的媒介物)β-半乳糖苷酶或熒光素酶的生產(chǎn)(篩選),或缺乏必需營養(yǎng)素的板上的幸存者(選擇)測定。橋接FKBP-FRAP相互作用的凸起的雷帕霉素的必要條件可用于篩選消除假陽性。
從FKBP(或FRB)突變體的基因庫分離修飾的配位體-結(jié)合區(qū)域的進(jìn)一步策略使用Hu et.al.描述的對于功能性的二聚物形成的遺傳選擇(Hu,J.C.,etal.1990.Science.2501400-1403;for review see Hu,,J.C.1995.Structure.3431-433)。這些策略利用噬菌體λ阻抑物cl與作為同型二聚體結(jié)合,以及這樣的同型二聚體與操縱基因DNA的結(jié)合可預(yù)防涉及噬菌體生活周期的裂解途徑的噬菌體基因的轉(zhuǎn)錄。因此,表達(dá)功能性的λ阻抑物的細(xì)菌細(xì)胞通過超感染噬菌體λ對裂解免疫。阻抑物蛋白質(zhì)包括氨基末端DNA結(jié)合區(qū)域(氨基酸1-92),通過40氨基酸柔韌性的接頭與羧基末端二聚化區(qū)域連接。由于形成效率低的二聚物,分離的N-末端區(qū)域與具有低親合力的DNA結(jié)合。異源的二聚化區(qū)域如GCN4“亮氨酸拉鏈”可以修復(fù)高親合力DNA的結(jié)合。Hu etal已經(jīng)公開了其中噬菌體免疫性用于遺傳選擇分離能夠從大量序列中介導(dǎo)λ阻抑物二聚物形成的GCN4亮氨酸拉鏈突變體的體系(Hu et.al.,1990)。
例如,為了使用λ阻抑物體系鑒定與凸起的28-表雷帕霉素類似物互補(bǔ)的FRAP突變體,具有突變體FRAP序列的λ阻抑物-FRAP基因庫被改造成表達(dá)天然λ阻遏物-FKBP蛋白質(zhì)的大腸桿菌細(xì)胞。從在包含高滴定度λ噬菌體和“隆起的”雷帕霉素化合物的細(xì)菌板上幸免于裂解的菌落分離表達(dá)FRAP突變體的質(zhì)粒?;蛘撸瑸榱朔蛛xFKBP突變體,上述策略是用其中突變體FKBP序列被轉(zhuǎn)化成表達(dá)天然λ阻抑物-FRAP蛋白質(zhì)大腸桿菌細(xì)胞的λ阻抑物-FKBP基因庫重復(fù)。
進(jìn)一步的選擇是將隨機(jī)化的FKBP序列克隆進(jìn)入噬菌體展示媒介物,進(jìn)行與28-表雷帕霉素類似物良好地結(jié)合的變體的體外選擇??梢砸院芏喾椒ㄟM(jìn)行親合力體外選擇。例如,在用親合力處理(例如六-組氨酸標(biāo)記,或GST)標(biāo)記的重組體FRAP的存在下,將28-表雷帕霉素類似物與溶液中的基因庫噬菌體集合體混合,在富集包含互補(bǔ)突變的噬菌體展示FRBP的適當(dāng)?shù)挠H合力基質(zhì)上捕捉所得配合物。噬菌體展示技術(shù)已經(jīng)公開,還可以預(yù)期其他離體選擇系統(tǒng)(例如λ噬菌體展示,質(zhì)粒展示,桿狀病毒展示)。此外,選擇和篩選策略還可以用來改進(jìn)其他有益于本發(fā)明實(shí)施的性質(zhì),如增強(qiáng)在體內(nèi)穩(wěn)定性。綜述參見Clackson,T,& Wells,J.A.1994.Trends Biotechnol.12,173-184。
(b)FRAP
相似的原因致力于優(yōu)先地與包含相對于大環(huán)分子的FRAP-結(jié)合部分中的雷帕霉素的修飾(即,′隆起′)的28-表雷帕霉素類似物結(jié)合的突變體FRB區(qū)域的產(chǎn)生。例如,使用在C7位置具有除-OMe以外的取代基的28-表雷帕霉素類似物與以人類FRAP FRB肽序列為基準(zhǔn)但具有一個或多個Tyr2038,Phe2039,Thr2098,Gln2099,Trp2101和Asp2102殘基的氨基酸取代基的FRBs,可以得到優(yōu)先的結(jié)合。典型的突變包括Y2038H,Y2038L,Y2038V,Y2038A,F(xiàn)2039H,F(xiàn)2039L,F(xiàn)2039A,F(xiàn)2039V,D2102A,T2098A,T2098N,和T2098S。在C28具有除-OH以外的取代基和/或在C30具有除=O以外的取代基的28-表雷帕霉素類似物可用來獲得與具有氨基酸取代基Glu2032的FRAP蛋白質(zhì)的優(yōu)先的結(jié)合。突變的例子包括E2032A和E2032S。使用上面描述的方法確定優(yōu)先地與隆起的28-表雷帕霉素類似物結(jié)合的突變體FRAPs,制備包括在上述位置包含一種或多種氨基酸置換的FRB的蛋白質(zhì),在那些位置隨機(jī)化(即,在那些殘基包含各種各樣的取代氨基酸)的蛋白質(zhì)或肽的基因庫,全部蛋白質(zhì)區(qū)域隨機(jī)化的基因庫,或突變體的這些集合的結(jié)合。
FKBP蛋白質(zhì)與28-表雷帕霉素類似物的配合物的試驗(yàn)對象突變體FRBs的可以通過一些技術(shù)測定;例如在藥物存在下將FRB突變體體外轉(zhuǎn)化為GST-FKBP的結(jié)合(Chen et al.1995.Proc.Natl.Acad Sci.USA 92,4947-4951);或用酵母二雜種測定中的適當(dāng)?shù)腇KBP融合蛋白質(zhì)參與28-表雷帕霉素類似物-依賴的轉(zhuǎn)錄激活配合物的能力。
使用各種各樣的分類策略可以從噬菌體上展示的基因庫分離具有所需的結(jié)合性質(zhì)的FRB突變體。例如,在用親合力處理(例如六-組氨酸標(biāo)記,或GST)標(biāo)記的重組體FRAP的存在下,將28-表雷帕霉素類似物與溶液中的基因庫噬菌體集合體混合,在富集包含互補(bǔ)突變的噬菌體展示FRBP的適當(dāng)?shù)挠H合力基質(zhì)上捕捉所得配合物。
可以在本發(fā)明各種具體方案中變化的FRB融合蛋白質(zhì)的輔助特征為FRB區(qū)域使用的正確序列。在一些應(yīng)用中,較大的FRB部分比最小的(89氨基酸)FRB區(qū)域優(yōu)選使用。這些包括延長的殘基Glu2025的N-末端(優(yōu)選至少延伸到Arg2018或lle2021),以及延伸超過位置2113的C末端(例如到位置2113,2141或2174或更遠(yuǎn)),其中在某些情況下可以改進(jìn)折疊的FRB區(qū)域的穩(wěn)定性和/或表達(dá)效率??梢允褂貌煌腇RB序列末端的其他應(yīng)用包括其中該FRB區(qū)域的一或兩邊具有空間因素需要的長接頭,例如容納在細(xì)胞膜或DNA上FRB-介導(dǎo)的蛋白質(zhì)相互結(jié)合需要的多肽鏈的變形。相反地,在其他FRB區(qū)域一或兩邊的短接頭的應(yīng)用可以優(yōu)選或要求存在具有適當(dāng)生物學(xué)功能的異源的效應(yīng)因子區(qū)域(s)。在通過利用天然存在的人類FRAP序列的人類基因治療應(yīng)用中,這樣的接頭通常優(yōu)選異源序列的引導(dǎo),或降低在寄主有機(jī)體引起免疫反應(yīng)的風(fēng)險。
一些28-表雷帕霉素類似物,特別是在被認(rèn)為接近FKBP結(jié)合區(qū)域和FRAP結(jié)合區(qū)域之間的界限的位置,如C28,C30,C7和C24,具有修飾或取代基(相對于雷帕霉素)的雷帕霉素類似物,相對于雷帕霉素能力降低,與哺乳動物FKBP和FRB區(qū)域,特別是,與包含天然存在的人類肽序列的區(qū)域形成配合物。按本申請?zhí)岬饺魏沃苯踊蜷g接的測定方法測定,能力降低表示結(jié)合親合力的降低,或者按適當(dāng)?shù)臏y定如T cell增殖測定能力降低表示免疫抑制活性的降低。在此情況下,重復(fù)法可用來確定能夠比包含天然存在的人類肽序列的相應(yīng)的區(qū)域更有效地與雷帕霉素類似物配合的突變體FKBPs和突變體FRBs對。例如,可以首先確定能夠按上述與雷帕霉素類似物結(jié)合的互補(bǔ)修飾FKBP區(qū)域,然后使用突變體FKBP區(qū)域作為具有雷帕霉素類似物的配合物中的親合力基質(zhì),選擇能夠與那些配合物聯(lián)合的互補(bǔ)修飾FRB區(qū)域。幾個這樣的誘變和篩選周期可以完成該蛋白質(zhì)配對的優(yōu)化。
對于一些具體方案,可以使用包含可以影響蛋白質(zhì)相互作用的突變的FRB和/或FKBP區(qū)域。例如,令人特別感興趣的是,與給定的雷帕霉素類似物結(jié)合時,突變體FKBP區(qū)域能適度地與內(nèi)源的FRB配合,小于與突變體FRB結(jié)合時。同樣使人感興趣的是突變體FKBP區(qū)域與突變體FKBP和給定的雷帕霉素類似物的配合物的聯(lián)合,比與內(nèi)源的FKBP和雷帕霉素類似物的配合物的聯(lián)合更有效。可使用與前述相似的選擇和篩選(i)確定氨基酸對FKBP區(qū)域的取代、刪除或插入,適度地減弱該區(qū)域與給定的雷帕霉素類似物和內(nèi)源的FRB形成三重配合物的能力;(ii)確定氨基酸對FKBP區(qū)域的取代、刪除或插入,適度地減弱該區(qū)域與給定的雷帕霉素類似物和內(nèi)源的FKBP形成三重配合物的能力;以及(iii)在配對蛋白質(zhì)中選擇和/或確定補(bǔ)償突變(s)。有效減弱三重配合物形成的突變體FKBP的合適的例子包括哺乳動物,優(yōu)選人類的FKBP,其中一個或兩個His87和lle90被包含龐大的側(cè)鏈基團(tuán)的氨基酸如Arg,Trp,Phe,Tyr或Lys代替;優(yōu)選哺乳動物更優(yōu)選人類肽序列的FRB區(qū)域,該肽序列可能如上所述突變產(chǎn)生能夠與突變體FKBP和給定的雷帕霉素類似物形成三重配合物的互補(bǔ)變體。典型的可用于H87W或H87R hFKBP12s的FRB突變包括其中Y2038由V,S,A或L替代;F2039由A替代;和/或R2042由L,A或S替代的人類FRBs。典型的可用于I90W或I90R hFKBP12s的FRB突變包括其中K2095由L,S,A或T代替的人類FRBs。
另外,顯然,本發(fā)明的受體區(qū)域的優(yōu)化中,多肽序列的免疫原性被認(rèn)為需要通過MHC蛋白質(zhì)結(jié)合肽,通過內(nèi)源的T細(xì)胞受體識別作為外源的肽存在。至少在人類基因治療應(yīng)用中優(yōu)選改編給定的外源肽序列,包括連接肽序列,使存在于人類中的免疫的概率最小化。例如,與人類MHC類別I分子結(jié)合的肽嚴(yán)格要求在結(jié)合肽中的關(guān)鍵′錨′位置存在某種殘基例如HLA-A2在位置2需要亮氨酸,甲硫氨酸或異亮氨酸以及在C-末端需要亮氨酸或纈氨酸(參見Stern和Wiley(1994)Structure 2,145-251)。因此在實(shí)施本發(fā)明中的基因改造蛋白質(zhì)中,特別是人類基因治療應(yīng)用中,優(yōu)選地避免這些殘基的周期性。前述事項應(yīng)用于本發(fā)明全部蛋白質(zhì)改造方面,包括無限制的點(diǎn)突變進(jìn)入受體區(qū)域的基因工程,以及應(yīng)用于各種的蛋白質(zhì)區(qū)域之間的邊界的選擇或設(shè)計。其他組分,設(shè)計特點(diǎn)和應(yīng)用
嵌合蛋白質(zhì)可以包含作為異源的區(qū)域的細(xì)胞定位區(qū)域如膜保留區(qū)域。參見例如PCT/US94/01617,特別是26-27頁。簡要地,膜保留區(qū)域可以從任何便于膜-結(jié)合的蛋白質(zhì)中分離,無論是否為寄主細(xì)胞內(nèi)源的。膜保留區(qū)域可以為跨膜的保留區(qū)域,即,氨基酸序列延伸橫跨膜到達(dá)細(xì)胞表面蛋白質(zhì),授與許多受體。橫跨膜肽序列可以延伸跨越部分或全部細(xì)胞外的和/或胞內(nèi)的區(qū)域。選擇性地,膜保留區(qū)域可以為類脂膜保留區(qū)域如容許締合細(xì)胞表面膜脂質(zhì)的十四?;蜃貦磅;恢梦稽c(diǎn)。對于與膜結(jié)合的N-末端,類脂膜保留區(qū)域通常添加在編碼序列的5′末端,對于結(jié)合的C末端,鄰近的3′端。包括翻譯后加工的提供類脂膜結(jié)合的肽序列公開于Carr,et al.,PNAS USA(1988)79,6128;Aitken,et al,F(xiàn)EBS Lett.(1982)150,314;Henderson,et al.,PNAS USA(1983)80,319;Schuiz,et aL,Virology(1984),123,2131;Dellman,et al.,Nature(1985)314,374;和Ann.Rev.of Biochem.(1988)57,69的綜述。使人感興趣的氨基酸序列包括序列M-G-S-S-K-S-K-P-K-D-P-S-Q-R。各種DNA序列可用于本發(fā)明各種的嵌合蛋白質(zhì)中的這樣的序列的編碼。其他定位區(qū)域包括細(xì)胞器-目標(biāo)域和序列如-K-D-E-L和-H-D-E-L,它們將具有它們的蛋白質(zhì)定向到內(nèi)質(zhì)網(wǎng),以及核定位序列,它們對嵌合蛋白質(zhì)對于(直接)轉(zhuǎn)錄的規(guī)則的設(shè)計特別有用。各種的細(xì)胞定位序列和信號在本領(lǐng)域是已知的。
可用于實(shí)施本發(fā)明的更詳細(xì)的資料涉及包含各種包括細(xì)胞質(zhì)信號引發(fā)區(qū)域如CD3ξ鏈的效應(yīng)因子區(qū)域,核轉(zhuǎn)錄因子區(qū)域尤其包括VP16和GAL4,包括Fas細(xì)胞質(zhì)區(qū)域的能夠引發(fā)細(xì)胞程序死亡的區(qū)域的編碼嵌合蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)的設(shè)計,裝配和使用公開于PCT/US94/01617和PCT/US95/10591。后一個國際申請進(jìn)一步公開了適用于產(chǎn)生可用作生物藥理學(xué)中的疾病模型遺傳工程動物的附加特征。那些特征包括在表達(dá)嵌合蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)中使用組織特定的調(diào)節(jié)元件和將調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄作為導(dǎo)致loxP序列側(cè)面的使人感興趣的基因的消除的靶基因應(yīng)用于Cre重組酶的表達(dá)。選擇性地,flp和它的同源識別序列可以代替Cre和lox使用。那些特征適應(yīng)于本發(fā)明。
在各種情況中,特別是在包括包含按照本發(fā)明基因工程設(shè)計的細(xì)胞的整體動物的具體方案中,嵌合蛋白質(zhì)的區(qū)域源自于同種寄主細(xì)胞的蛋白質(zhì)常常是優(yōu)選的,在某些情況下是必要的。因此,對于人類細(xì)胞的基因工程,異源的區(qū)域(以及FKBP和FRB區(qū)域)常常優(yōu)選人類來源的,而不是細(xì)菌,酵母或其他非人類來源的。
我們也注意到抗原表位標(biāo)記物也可能并入本發(fā)明嵌合蛋白質(zhì)以便于檢測。
組織特異性的或細(xì)胞類型特異性的表達(dá)
在某些具體方案中,嵌合蛋白質(zhì)優(yōu)選地以細(xì)胞特異性或組織特異性的方式表達(dá)。適當(dāng)?shù)厥挂粋€或多個編碼嵌合蛋白(s)的DNA序列與細(xì)胞類型特定的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列(例如促進(jìn)劑/增強(qiáng)劑)連接可以實(shí)現(xiàn)這樣的特異性的表達(dá)。許多細(xì)胞類型特定的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列是已知的。其它的可以從以細(xì)胞特定的方式表達(dá)的基因中獲得。參見例如PCT/US95/10591,特別是36-37頁。
例如,表達(dá)嵌合蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)可以包含源自選擇組織中的特定的表達(dá)的已知基因的調(diào)節(jié)序列。典型的例子列表如下靶基因結(jié)構(gòu)
在本發(fā)明的具體方案中,設(shè)計嵌合蛋白質(zhì)使其多聚化激活靶基因的轉(zhuǎn)錄,適當(dāng)?shù)陌谢蚪Y(jié)構(gòu)也被用于基因改造的細(xì)胞。適當(dāng)?shù)陌谢蚪Y(jié)構(gòu)包含靶基因和轉(zhuǎn)錄控制元件如對嵌合蛋白質(zhì)多聚化起反應(yīng)的促進(jìn)劑和/或增強(qiáng)劑。在包括直接活化轉(zhuǎn)錄的具體方案中,通過由本發(fā)明嵌合蛋白的DNA結(jié)合域辨認(rèn)的一種或多種DNA序列(即,與嵌合蛋白結(jié)合的DNA序列)靶基因結(jié)構(gòu)的存在可以實(shí)現(xiàn)那些響應(yīng)。在這樣的具體方案中,靶基因結(jié)構(gòu)典型地包含由下列組成的合成轉(zhuǎn)錄單位(1)具有高-親合力的通過融合蛋白質(zhì)的一個組分DNA結(jié)合區(qū)域辨認(rèn)DNA序列的一個或多個拷貝;(2)最低限度地組成TATAbox的促進(jìn)劑序列和選擇性地包括其他轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合部位的引發(fā)劑序列;(3)編碼所需產(chǎn)品的序列,如果合適的話,包括啟動翻譯的引發(fā)和結(jié)束的序列;(4)由剪接供體,剪接受體,和插入內(nèi)含子DNA組成的非強(qiáng)制的序列;以及(5)引導(dǎo)RNA轉(zhuǎn)錄物裂解和聚腺苷酸化的序列?;蚪Y(jié)構(gòu)典型地包含表達(dá)靶基因的拷貝,適當(dāng)?shù)嘏c包含最小的促進(jìn)劑和一種或多種對轉(zhuǎn)錄因子起反應(yīng)的DNA識別序列的拷貝的轉(zhuǎn)錄控制序列關(guān)聯(lián)。在包括轉(zhuǎn)錄間接激活的具體方案中,通過由嵌合蛋白質(zhì)多聚化產(chǎn)生的胞內(nèi)信號激活的促進(jìn)劑和/或增強(qiáng)劑序列的靶基因結(jié)構(gòu)的存在可以實(shí)現(xiàn)響應(yīng)。例如,嵌合蛋白質(zhì)包含TCRξ鏈胞內(nèi)區(qū)域時,靶基因連接并且處于IL-2促進(jìn)劑區(qū)域的表達(dá)控制之下。
各式各樣的基因可以作為靶基因使用,包括使人感興趣的編碼治療蛋白質(zhì)的基因,反義序列或核糖酶。靶基因可以為提供所需的表型的任何使人感興趣的序列。它可以編碼表面膜蛋白,分泌性蛋白質(zhì),胞漿蛋白,或可為編碼不同產(chǎn)品的多元靶基因。靶基因可以是反義序列,它可通過抑制轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)或調(diào)節(jié)特別通道或通過抑制通道的抑制劑的翻譯打開特別通道。靶基因可以編碼核糖酶,該核糖酶可以在RNA水平通過干涉相應(yīng)的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)劑的表達(dá)或特別通道的抑制劑的表達(dá)調(diào)節(jié)特別通道。單獨(dú)或結(jié)合表達(dá)的蛋白質(zhì)可以參與歸航,細(xì)胞毒性,增殖,免疫反應(yīng),炎癥性反應(yīng),凝塊或溶解凝塊,激素調(diào)節(jié),等等。表達(dá)的蛋白質(zhì)可以是天然存在的蛋白質(zhì),天然存在蛋白質(zhì)的突變體,單一序列,或其組合。
各種分泌產(chǎn)品包括激素,如胰島素,人生長激素胰高血糖素,垂體釋放因子,ACTH,促黑激素,松弛肽,等等;生長因子,如EGF,IGF-1,TGF-α,-β,PDGF,G-CSF,M-CSF,GM-CSF,F(xiàn)GF,紅細(xì)胞生成素,促血小板生成素,巨核細(xì)胞刺激因子和生長因子,等等;白細(xì)胞介素,如IL-1到-13;TNF-α和-β,等等;以及酶和其他因子,如組織纖溶酶原激活物,補(bǔ)體串聯(lián)的單元,穿孔素,過氧化物歧化酶,凝血因子,抗凝血酶-III,因子Vlllc,vWF,F(xiàn)actor IX,α-抗胰蛋白酶,蛋白質(zhì)C,蛋白質(zhì)S,內(nèi)啡肽,強(qiáng)啡肽,骨形態(tài)發(fā)生蛋白,CFTR,等等。
該基因可以通過引導(dǎo)合適的信號肽和橫跨膜序列編碼天然存在的表面膜蛋白或蛋白質(zhì)。各種這樣的蛋白質(zhì)包括歸巢受體,例如L-選擇蛋白(Mel-14),血液-相關(guān)的蛋白質(zhì),特別是具有kringle結(jié)構(gòu)的,例如因子Vlllc,因子VlllvW,造血細(xì)胞標(biāo)識物,例如CD3,CD4,CD8,B細(xì)胞受體,TCR亞單位α,β,γ或δ,CD10,CD19,CD28,CD33,CD38,CD41,等等,受體,如白細(xì)胞介素受體IL-2R,IL-4R,等等,離子流入或流出的通道蛋白質(zhì),例如H+,Ca+2,K+,Na+,Cl-,等等,等等;CFTR,酪氨酸激活基元,zap-70,等等。
蛋白質(zhì)可以修飾轉(zhuǎn)運(yùn)到胞吐作用小泡。通過從定向小泡的蛋白質(zhì)添加序列,該序列修飾鄰近的一個或其他末端,或位于該蛋白質(zhì)來源的類似位置,該修飾蛋白質(zhì)指向包裝在小泡中的高爾基體。該方法結(jié)合胞吐作用嵌合蛋白質(zhì)的存在,可將該蛋白質(zhì)迅速轉(zhuǎn)移到細(xì)胞外的媒介并且可保持比較高的定位濃度。
同樣,胞內(nèi)蛋白質(zhì)也可令人感興趣,如代謝途徑中的蛋白質(zhì),調(diào)節(jié)蛋白質(zhì),類固醇受體,轉(zhuǎn)錄因子,等等,取決于寄主細(xì)胞的性質(zhì)。如上所述的一些蛋白質(zhì)也可充當(dāng)胞內(nèi)蛋白質(zhì)。
作為進(jìn)一步說明,在T細(xì)胞中,它可以引導(dǎo)基因編碼一個或兩個T細(xì)胞受體鏈。對于B細(xì)胞,它可以提供免疫球蛋白分泌的重鏈和輕鏈。對于皮膚細(xì)胞,例如角質(zhì)化細(xì)胞,特別是干細(xì)胞角化細(xì)胞,它可以通過分泌α,β或γ干擾素,抗趨化因子,特定的細(xì)菌細(xì)胞壁蛋白質(zhì)蛋白酶,等等,提供感染預(yù)防。
除了提供具有治療價值的基因的表達(dá)之外,在許多情況下,它可以引導(dǎo)細(xì)胞到特別的位點(diǎn)。該位點(diǎn)可以包括解剖學(xué)的位點(diǎn),如淋巴結(jié),粘膜組織,皮膚,滑膜,肺或其他內(nèi)臟或功能性的位點(diǎn),如凝塊,損傷位點(diǎn),外科手術(shù)位點(diǎn),炎癥位點(diǎn),感染位點(diǎn),等等。通過提供寄主目標(biāo)區(qū)域與天然存在的抗原表位的結(jié)合,表面膜蛋白質(zhì)引導(dǎo)寄主細(xì)胞到特別的位點(diǎn),通過提供該蛋白質(zhì)的表達(dá),可以達(dá)到分泌產(chǎn)品的定位濃度。使人感興趣的蛋白質(zhì)包括歸巢受體,例如L-選擇蛋白,GMP140,CLAM-1,等等,或地址素,例如ELAM-1,PNAd,LNAd,等等,凝塊結(jié)合蛋白質(zhì),或響應(yīng)趨化因子的定位梯度細(xì)胞表面蛋白質(zhì)。在許多情況下,它將引導(dǎo)細(xì)胞到特別的位點(diǎn),有效釋放治療的產(chǎn)品。
本發(fā)明包括各種各樣的嵌合蛋白質(zhì)構(gòu)型??墒牵谌魏紊婕鞍谢蜣D(zhuǎn)錄激活的情況下,嵌合蛋白質(zhì)分擔(dān)重要的特征多聚化配位體存在下,包含編碼嵌合體的結(jié)構(gòu)和表達(dá)靶基因的靶基因結(jié)構(gòu)的細(xì)胞比該配位體缺乏時多至少一個,優(yōu)選至少二,更優(yōu)選至少三或四個或更多大小級次。最佳地,除非該細(xì)胞被暴露或已經(jīng)暴露于多聚化配位體,不必觀察選擇基因的表達(dá)。
扼要說明,將細(xì)胞暴露于28表雷帕霉素類似物時,即,隨著嵌合體多聚化,基因工程細(xì)胞內(nèi)靶基因轉(zhuǎn)錄的可探測水平。嵌合蛋白質(zhì)能夠啟動暴露因此,將細(xì)胞暴露于能夠多聚化嵌合蛋白分子的28-表雷帕霉素類似物后,本發(fā)明的基因工程細(xì)胞中的靶基因轉(zhuǎn)錄被激活。換句話說,本發(fā)明基因工程細(xì)胞包含如上所述的嵌合蛋白質(zhì),對能夠多聚化嵌合蛋白分子的28-表雷帕霉素類似物的存在和/或濃度起反應(yīng)。該效應(yīng)被靶基因轉(zhuǎn)錄的激活證明。這樣的轉(zhuǎn)錄的活性可以通過靶基因轉(zhuǎn)錄的任何常規(guī)分析容易地測定。在其他具體方案中,配位體-介導(dǎo)的嵌合體多聚化的生物反應(yīng)為細(xì)胞死亡或其他生物學(xué)轉(zhuǎn)變而不是靶基因轉(zhuǎn)錄的直接活化。
DNA結(jié)構(gòu)的設(shè)計和裝配
結(jié)構(gòu)可以按照公開于本申請引用的專利文件和科學(xué)文獻(xiàn)中的原則,說明的例子和原料和方法設(shè)計,它們作為參考編入本申請,如本申請所述它們具有改進(jìn)和進(jìn)一步的例證。該結(jié)構(gòu)的組分可以常規(guī)方式制備,其中編碼序列和調(diào)節(jié)區(qū)可以酌情分離,連接,在合適的克隆寄主中克隆,通過限制或定序,或其他常規(guī)的方式。特別地,使用PCR,可以分離包括全部或部分功能單元的個體碎片,其中可以酌情使用引物修補(bǔ)”,連接,體外誘變,等等引導(dǎo)一種或多種突變。對于編碼融合蛋白質(zhì)的DNA結(jié)構(gòu),編碼個體區(qū)域的DNA序列和子域相連以致于它們構(gòu)成編碼能夠在細(xì)胞或溶解產(chǎn)物中被翻譯的融合蛋白質(zhì)的單一開放讀框,進(jìn)入包含全部分量域的單一多肽。編碼該融合蛋白質(zhì)的DNA結(jié)構(gòu)可被投入媒介物,引導(dǎo)合適的細(xì)胞類型(s)中的蛋白質(zhì)的表達(dá)。對于編碼嵌合體的生化分析,結(jié)構(gòu)質(zhì)粒需要引導(dǎo)細(xì)菌或網(wǎng)狀紅血細(xì)胞-溶解產(chǎn)物體系中的蛋白質(zhì)的表達(dá)。為了在哺乳動物細(xì)胞中生產(chǎn)蛋白質(zhì),該蛋白質(zhì)-編碼序列被引入引導(dǎo)這些細(xì)胞中的表達(dá)的表達(dá)載體。適用于這樣的運(yùn)用的表達(dá)載體在本領(lǐng)域是已知的。各種的的類型媒介物為市場上可買到的。
編碼本發(fā)明嵌合蛋白質(zhì)和靶基因的結(jié)構(gòu)作為一種或多種DNA分子或結(jié)構(gòu)可以被引入細(xì)胞,在很多情況下與允許選擇包含該結(jié)構(gòu)(s)的寄主細(xì)胞的一種或多種標(biāo)識物相聯(lián)系。只要完成該結(jié)構(gòu)(s)并且證明具有合適的定序,該結(jié)構(gòu)可通過任何適當(dāng)?shù)姆绞奖灰爰闹骷?xì)胞。結(jié)構(gòu)可以被并入能夠游離型復(fù)制的媒介物(例如BPV或EBV媒介物)或進(jìn)入被設(shè)計整合進(jìn)入寄主細(xì)胞染色體的媒介物。該結(jié)構(gòu)可以被整合包裝進(jìn)入非復(fù)制,有缺陷的病毒的基因組如腺病毒(Adenovirus),腺病毒相關(guān)病毒(AAV),或單純皰疹病毒(HSV)或其它的病毒,感染或轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)入細(xì)胞。病毒的釋放系統(tǒng)將在下面的詳細(xì)地論述。選擇性地,可以通過原生質(zhì)體融合,電穿孔法,生物排列,磷酸鈣轉(zhuǎn)染,脂轉(zhuǎn)染,DNA的顯微注射等等引導(dǎo)該結(jié)構(gòu)。在某些情況下,寄主細(xì)胞將在該結(jié)構(gòu)(s)引導(dǎo)之前生長并且擴(kuò)張培養(yǎng)物,接著合適地處理,引導(dǎo)該結(jié)構(gòu)(s)以及整合該結(jié)構(gòu)(s)。然后該細(xì)胞膨脹,依靠存在于該結(jié)構(gòu)中的標(biāo)識物篩選。可以成功地使用的各種標(biāo)識物包括hprt,新霉素阻抗,胸苷激酶,潮霉素阻抗,等等,以及各種的細(xì)胞表面標(biāo)識物如Tac,CD8,CD3,Thy1以及NGF受體。
在有些情況下,它可具有源重組目標(biāo)區(qū)域,其中要求結(jié)構(gòu)以特別的基因座整合。例如,它可以刪除和/或用本發(fā)明重組體靶結(jié)構(gòu)替換內(nèi)源的基因(在相同的基因座或其它地方)。對于源重組,通常使用Ω或O-媒介物。參見,例如,Thomas和Capecchi,Cell(1987)51,503-512;Mansour,et al.,Nature(1988)336,348-352;以及Joyner,et al.,Nature(1989)338,153-156。
該結(jié)構(gòu)可以引導(dǎo)編碼全部基因的單個的DNA分子,具有一種或多種基因的不同的DNA分子。該結(jié)構(gòu)可以同時或連續(xù)地引導(dǎo),各使用相同的或不同的標(biāo)識物。
包含有用的元件如細(xì)菌或酵母復(fù)制源,可選擇的和/或可擴(kuò)增的標(biāo)識物,在原核生物或真核生物中表達(dá)的促進(jìn)劑/增強(qiáng)子元件,和哺乳動物表達(dá)控制元件,等等,它可用來制備結(jié)構(gòu)DNAs的原種并且進(jìn)行轉(zhuǎn)染,這些媒介物在本領(lǐng)域是已知的,其中許多為市場上可買到的。
核酸的釋放體外和體內(nèi)
任何引導(dǎo)異源的核酸進(jìn)入寄主細(xì)胞,特別是真核細(xì)胞,特別是動物細(xì)胞,優(yōu)選人類或非人類哺乳動物細(xì)胞的方法都可適應(yīng)于本發(fā)明的實(shí)施。為了論述,本申請公開的各種核酸結(jié)構(gòu)可以共同稱為轉(zhuǎn)基因。DNA釋放的體外途徑包括磷酸鈣沉淀,電穿孔法,脂轉(zhuǎn)染和經(jīng)病毒載體的感染。兩種一般的體內(nèi)基因治療途徑包括(a)DNA的“裸”制劑,脂質(zhì)配合物或脂質(zhì)體制劑或者相反的制劑的釋放和(b)異源的核酸經(jīng)病毒載體的釋放。在前述方法中,在,例如用脂質(zhì)DNA配制之前,首先用實(shí)驗(yàn)方法完善包含具有所需的DNA結(jié)構(gòu)的質(zhì)粒的表達(dá)(例如,5非翻譯區(qū)中的內(nèi)含子的包含和不必要的序列的消除(Feigner,et al.,Ann NY Acad Sci 126-139,1995))。然后使用已知的方法和原料,例如用各種脂質(zhì)或脂質(zhì)體原料配制,對哺乳動物接受者給藥。
在可以用于實(shí)施本發(fā)明的各種病毒載體中,逆轉(zhuǎn)錄病毒-,AAV-和腺病毒定位的方法特別令人感興趣。參見,例如,Dubensky et al.(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81,7529-7533;Kaneda et al.,(1989)Science 243,375-378;Hiebert et al.(1989) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86,3594-3598;Hatzoglu et al.(1990)J.Biol.Chem.265,17285-17293和Ferry,et al.(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88,8377-8381。下列關(guān)于病毒載體的選擇和使用的附加指導(dǎo)有助于專業(yè)人員。逆轉(zhuǎn)錄病毒載體
反向病毒為一類RNA病毒,其中RNA反向地轉(zhuǎn)錄到受感染細(xì)胞中的DNA。逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組可以整合進(jìn)入寄主細(xì)胞基因組,必要三個病毒的基因,gag,pol和env,以及病毒的長末端重復(fù)(LTRs)。LTRs也作為病毒基因的增強(qiáng)劑和促進(jìn)劑。病毒的包裝序列,(Y),允許病毒RNA與該細(xì)胞中的其他RNAs不同(Verma et al.,Nature 389239-242,1997)。為了表達(dá)異體基因,病毒蛋白質(zhì)被病毒載體中使人感興趣的基因代替,然后翻譯進(jìn)入包含病毒包裝組分的包裝線。包裝病毒從包裝線分泌進(jìn)入培養(yǎng)基,然后應(yīng)用培養(yǎng)物中的細(xì)胞感染。因?yàn)榉聪虿《静荒芨腥痉欠至鸭?xì)胞,因此它們主要應(yīng)用體外基因治療。AAV載體
腺病毒相關(guān)病毒(AAV)定位的媒介物主要用作各種組織,包括肌肉和肺的運(yùn)載工具。AAV媒介物感染并且經(jīng)常穩(wěn)定地整合進(jìn)入細(xì)胞基因組。AAV可以感染并且整合進(jìn)入生長抑制的細(xì)胞(如肺上皮細(xì)胞),并且是不致病的。
用于AAV定位的表達(dá)載體典型地包括145核苷酸AAV末端反向重復(fù)序列(ITRs)側(cè)翼限制性位點(diǎn),它可用于轉(zhuǎn)基因的亞克隆化,既可直接使用有用的限制性位點(diǎn),也可用限制性內(nèi)切酶切除該轉(zhuǎn)基因,接著鈍化該末端,連接合適的DNA接頭,限制消化,并且連接進(jìn)入ITRs之間的位點(diǎn)。AAV媒介物的載量大約4.4kb。下列蛋白質(zhì)已經(jīng)被使用各種AAV定位媒介物,和各種各樣的促進(jìn)劑/增強(qiáng)劑表達(dá)新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶,氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶,先天性全血細(xì)胞減少癥,囊性纖維化跨膜傳導(dǎo)調(diào)節(jié)蛋白,和粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集群-刺激因子(Kotin,R.M.,Human Gene Therapy 5793-801,1994,Table I)。編入本發(fā)明各種DNA結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)基因同樣可以被歸入AAV定位媒介物。AAV促進(jìn)劑能被作為包含組成型促進(jìn)劑如CMV驅(qū)動編碼融合蛋白質(zhì)(s)的重組DNA表達(dá)的替換物使用(ITR本身或AAV p5(Flotte,et al.J,Biol.Chem.2683781-3790,1993)。
這樣的媒介物可以通過公開的方法包裝進(jìn)入AAV病毒粒子。例如,在內(nèi)源的AAV促進(jìn)劑或異源的促進(jìn)劑的控制下,人類細(xì)胞系如293可以被AAV定位表達(dá)載體和另一個包含編碼AAV rep和cap的開放讀框共同翻譯。在沒有輔助病毒的情況下,rep蛋白質(zhì)Rep68和Rep78防止復(fù)制形式的累積,但是用腺病毒或皰疹病毒超感染,這些蛋白質(zhì)容許從ITRs(僅僅存在于包含該轉(zhuǎn)基因的結(jié)構(gòu))復(fù)制和病毒衣殼蛋白質(zhì)的表達(dá)。這些體系導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因DNA包裝進(jìn)入AAV病毒粒子(Carter,BJ.,Current Opinion in Biotechnology 3533-539,1992;Kotin,R.M,Human Gene Therapy 5793-801,1994))。改進(jìn)AAV滴度的方法也可用來表達(dá)AAV病毒粒子中的轉(zhuǎn)基因。這樣的策略包括,但是不局限于穩(wěn)定地表達(dá)細(xì)胞系中的ITR側(cè)翼轉(zhuǎn)基因,接著用第二質(zhì)粒轉(zhuǎn)染引導(dǎo)病毒包裝;使用誘導(dǎo)地表達(dá)AAV蛋白質(zhì),如溫度敏感的誘導(dǎo)型表達(dá)或藥理學(xué)的誘導(dǎo)型表達(dá)的細(xì)胞系。另外,如Wilson et al.,W096/39530所述通過用促進(jìn)雙鏈形式向單鏈形式轉(zhuǎn)化的藥劑處理細(xì)胞,可以提高AAV轉(zhuǎn)導(dǎo)的效率。
通過公開的方法如氯化銫梯度使集結(jié)成可以濃縮和提純病毒,如用于體內(nèi)AAV向量表達(dá)式的初始報道(Flotte,et al.J.Biol Chem.2683781-3790,1993)或?qū)游鎏峒?,如O′Riordan et al.,WO97/08298所述。
至于可以用于實(shí)施本發(fā)明的AAV技術(shù)另外的詳細(xì)指導(dǎo),包括摻入轉(zhuǎn)基因的方法和原料,包含該轉(zhuǎn)基因的重組體AAV媒介物的繁殖和提純,以及轉(zhuǎn)染細(xì)胞和哺乳動物中的使用,參見例如Carter et al,US Patent No.4,797,368(10Jan 1989);Muzyczka et al,US Patent No.5,139,941(18 Aug 1992);Lcbkowskiet al,US Patent No.5,173,414(22 Dec 1992);Srivastava,US Patent No.5,252,479(12 Oct 1993);Lebkowski et al,US Patent No.5,354,678(11 Oct1994);Shenk et al,US Patent No.5,436,146(25 July 1995);Chatterjee et al,USPatent No,5,454,935(12 Dec 1995),Carter et al WO 93/24641(公開于9 Dec1993),以及Flotte et al.,US Patent No.5,658,776(19 Aug 1997)。腺病毒載體
各種腺病毒媒介物已經(jīng)被證明可用于哺乳動物,包括人類基因的轉(zhuǎn)移。復(fù)制缺損的腺病毒媒介物已經(jīng)用于表達(dá)肺中的標(biāo)識物蛋白質(zhì)以及CFTR。第一代Ela缺損的腺病毒媒介物已經(jīng)由第二代產(chǎn)品改進(jìn),其中包括溫度敏感的E2a病毒蛋白質(zhì),用來表達(dá)較小的病毒蛋白質(zhì),從而制造比免疫系統(tǒng)更小的病毒感染細(xì)胞(Goldman et al.,Human Gene Therapy 6839-851,1995)。近年來,刪除所有病毒開放讀框的病毒載體已經(jīng)公開(Fisher et al.,Virology 21711-22,1996)。而且,已經(jīng)顯示病毒IL-10抑制腺病毒抗原的免疫反應(yīng)(Qin et al.,Human Gene Therapy 81365-1374,1997)。
一些腺病毒類型的DNA序列可以從Genbank得到。腺病毒DNA序列可以從任何目前確定的41人類腺病毒類型中獲得。各種腺病毒菌株從AmericanType Culture Collection,Rockville,Maryland得到或從一些商業(yè)以及學(xué)會會員來源得到。通過與用于在媒介物插入CFTR或其他基因相同的方法(限制性內(nèi)切酶酶切消化,接頭連接或裝入末端,以及連接),本申請公開的轉(zhuǎn)基因可以并入任何腺病毒媒介物安德釋放流程。由包含選擇的腺病毒序列序列的部分的腺病毒衣殼代表的雜種腺病毒AAV媒介物,5′和3′AAV ITR序列側(cè)翼轉(zhuǎn)基因及其他常規(guī)的媒介物調(diào)節(jié)元件也可被使用。參見例如Wilson et al,國際專利申請公開No.WO 96/13598。可以應(yīng)用于本發(fā)明的腺病毒和雜種腺病毒-AAV技術(shù)的另外的詳細(xì)指導(dǎo)包括摻入轉(zhuǎn)基因的方法和原料,包含轉(zhuǎn)基因的重組病毒的繁殖和提純,以及在轉(zhuǎn)染細(xì)胞和哺乳動物中的用法,也參見Wilson etal,WO 94/28938,WO 96/13597和WO 96/26285,和本申請引用的參考文獻(xiàn)。
通常DNA或病毒顆粒被轉(zhuǎn)入生物學(xué)上兼容的溶液或藥學(xué)上可接受的載體,如無菌鹽水,或其他含水的或無水的等滲無菌的注射溶液或懸浮液,其中許多例子在本領(lǐng)域是已知的,包括Ringer′s,磷酸鹽緩沖鹽水,或其他相似的載體。
優(yōu)選地,在基因治療應(yīng)用中,DNA或重組病毒以足以轉(zhuǎn)染細(xì)胞的量給藥,其水平為提供治療,不產(chǎn)生過度的副作用。如其它地方論述,DNA或病毒的最佳劑量取決于各種各樣的因素,因此患者與患者之間可以有所變化。此外,病毒的治療有效劑量可在20到約50毫升約1×107到約1×1010pfu病毒/毫升,例如1×108到1×109病毒/毫升的濃度的鹽溶液的范圍之內(nèi)。寄主細(xì)胞
本發(fā)明對基因工程動物細(xì)胞和涉及這樣的基因工程動物細(xì)胞的應(yīng)用是特別有用的。該動物細(xì)胞可以是昆蟲,蠕蟲或哺乳動物或其他動物的細(xì)胞。盡管可以使用各種哺乳動物細(xì)胞,例如包括馬,牛,綿羊,犬科動物,貓科動物,鼠科動物,和非人類靈長類動物細(xì)胞,但是人類細(xì)胞是特別令人感興趣的。在各種種類中,可以使用各種型式的細(xì)胞,如造血的,,神經(jīng)的,神經(jīng)膠質(zhì)的,間質(zhì)的,皮膚的,粘膜的,基質(zhì)的,肌肉的(包括平滑肌細(xì)胞),脾的,網(wǎng)狀內(nèi)皮組織的,上皮的,內(nèi)皮的,肝臟的,腎的,胃腸的,肺的,成纖維細(xì)胞,及其他細(xì)胞類型。特別令人感興趣的是造血細(xì)胞,其中可以包括任何與紅細(xì)胞,淋巴或骨髓瘤系譜有關(guān)的有核細(xì)胞,以及成肌細(xì)胞和成纖維細(xì)胞。使人感興趣的還有莖和祖細(xì)胞,如造血的,神經(jīng)的,基質(zhì)的,肌肉的,肝臟的,肺的,胃腸的和間質(zhì)的干細(xì)胞
細(xì)胞可以是自體同源的細(xì)胞,同種同基因的細(xì)胞,異源的細(xì)胞并且甚至在某些情況下是,預(yù)定的寄主有機(jī)體的異種的細(xì)胞。該細(xì)胞可以通過下列方法修飾改變主要組織相容性復(fù)合體(“MHC”)輪廓,鈍化β2-微球蛋白防止形成功能性的Class I MHC分子,鈍化Class II分子,提供一種或多種MHC分子的表達(dá),通過增強(qiáng)或抑制與細(xì)胞毒素活性有關(guān)的基因的表達(dá)增強(qiáng)或鈍化細(xì)胞毒素的性能,等等。
在有些情況下,使人感興趣的是特定的克隆或寡克隆細(xì)胞,該細(xì)胞具有特別的特異性,如T細(xì)胞和B細(xì)胞具有特定的抗原特異性或歸航目標(biāo)區(qū)域特異性。
編碼嵌合轉(zhuǎn)錄因子或其他融合蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和包含靶基因的結(jié)構(gòu)作為一種或多種DNA分子或結(jié)構(gòu)可以被引入細(xì)胞,在很多情況下與允許選擇包含該結(jié)構(gòu)(s)的寄主細(xì)胞的一種或多種標(biāo)識物相聯(lián)系。只要完成該結(jié)構(gòu)(s)并且證明具有合適的定序,該結(jié)構(gòu)可通過任何適當(dāng)?shù)姆绞奖灰爰闹骷?xì)胞。結(jié)構(gòu)可以被并入能夠游離型復(fù)制的媒介物(例如BPV或EBV媒介物)或進(jìn)入被設(shè)計整合進(jìn)入寄主細(xì)胞染色體的媒介物。該結(jié)構(gòu)可以被整合包裝進(jìn)入非復(fù)制,有缺陷的病毒的基因組如腺病毒(Adenovirus),腺病毒相關(guān)病毒(AAV),或單純皰疹病毒(HSV)或其它的病毒,感染或轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)入細(xì)胞。病毒的釋放系統(tǒng)將在下面的詳細(xì)地論述?;蛘?,可以通過原生質(zhì)體融合,電穿孔法,生物排列,磷酸鈣轉(zhuǎn)染,脂轉(zhuǎn)染,DNA的顯微注射等等引導(dǎo)該結(jié)構(gòu)。在某些情況下,寄主細(xì)胞將在該結(jié)構(gòu)(s)引導(dǎo)之前生長并且擴(kuò)張培養(yǎng)物,接著合適地處理,引導(dǎo)該結(jié)構(gòu)(s)以及整合該結(jié)構(gòu)(s)。然后該細(xì)胞膨脹,依靠存在于該結(jié)構(gòu)中的標(biāo)識物篩選??梢猿晒Φ厥褂玫母鞣N標(biāo)識物包括hprt,新霉素阻抗,胸苷激酶,潮霉素阻抗,等等,以及各種的細(xì)胞表面標(biāo)識物如Tac,CD8,CD3,Thy1以及NGF受體。
在有些情況下,它可具有源重組目標(biāo)區(qū)域,其中要求結(jié)構(gòu)以特別的基因座整合。例如,它可以刪除和/或用本發(fā)明重組體靶結(jié)構(gòu)替換內(nèi)源的基因(在相同的基因座或其它地方)。對于源重組,通常使用Ω或O-媒介物。參見,例如,Thomas和Capecchi,Cell(1987)51,503-512;Mansour,et al.Nature(1988)336,348-352;以及Joyner,et al..Nature(1989)338,153-156。
該結(jié)構(gòu)可以引導(dǎo)編碼所有基因的單個的DNA分子,具有一種或多種基因的不同的DNA分子。該結(jié)構(gòu)可以同時或連續(xù)地引導(dǎo),各使用相同的或不同的標(biāo)識物。
包含有用的元件如細(xì)菌或酵母復(fù)制源,可選擇的和/或可擴(kuò)增的標(biāo)識物,在原核生物或真核生物中表達(dá)的促進(jìn)劑/增強(qiáng)子元件,和哺乳動物表達(dá)控制元件,等等,它可用來制備結(jié)構(gòu)DNAs的原種并且進(jìn)行轉(zhuǎn)染,這些媒介物在本領(lǐng)域是已知的,其中許多為市場上可買到的。
引導(dǎo)結(jié)構(gòu)進(jìn)入動物
在選擇性的條件下,已經(jīng)用DNA結(jié)構(gòu)體外修飾的細(xì)胞可以在培養(yǎng)物中生長,然后被選擇具有所需的結(jié)構(gòu)(s)的細(xì)胞可被膨脹和進(jìn)一步分析,使用,例如,用于測定該結(jié)構(gòu)在寄主細(xì)胞和/或中的存在和/或分析所需的基因產(chǎn)物(s)的生產(chǎn)。只要寄主細(xì)胞已經(jīng)確定,它們就可用于,例如在培養(yǎng)物中生長或被引入寄主有機(jī)體。
取決于細(xì)胞的性質(zhì),該細(xì)胞可以各式各樣的方法被引入寄主有機(jī)體,例如哺乳動物。造血細(xì)胞可以通過注射給藥進(jìn)入血管系統(tǒng),通常至少約104細(xì)胞,通常至多約1010細(xì)胞。使用的細(xì)胞的數(shù)目取決于一些環(huán)境,引導(dǎo)的目的,細(xì)胞的生存期,使用的方案,例如,給藥的數(shù)量,細(xì)胞繁殖的能力,治療劑的穩(wěn)定性,治療劑的生理需要,等等。通常,例如對于成肌細(xì)胞或成纖維細(xì)胞,細(xì)胞的數(shù)目至少約104,至多約109,可以分散使用,通常注入在使人感興趣的位點(diǎn)上或附近。該細(xì)胞通常在生理學(xué)可接受的媒介中。
本發(fā)明基因工程細(xì)胞也可在植入寄主有機(jī)體或患者以產(chǎn)生治療的蛋白質(zhì)之前,例如使用常規(guī)的生物相容的原料和方法,被裝入膠囊。參見例如Hguyen et al,Tissue Implant Systems and Methods for Sustaining viable High CellDensities within a Host(寄主體內(nèi)維持有活力的高細(xì)胞密度的組織植入體系和方法),US Patent No.5,314,471(Baxter Intemational,Inc.);Uludag和Sefton,1993,J Biomed.Mater.Res.27(10)1213-24(HepG2細(xì)胞/甲基丙烯酸羥乙酯-異丁烯酸甲酯膜;Chang et al,1993,Hum Gene Ther 4(4)433-40(小鼠Ltk-細(xì)胞表達(dá)hGH/免疫保護(hù)perm-選擇性的藻朊酸鹽微膠囊);Reddy et al,1993,J Infect Dis 168(4);1082-3(alginate);Tai和Sun,1993,F(xiàn)ASEB J 7(11)1061-9(小鼠成纖維細(xì)胞表達(dá)hGH/藻朊酸鹽-poly-L-賴氨酸-藻朊酸鹽膜);Ao et al,1995,Transplanataion Proc.27(6)3349,3350(alginate);Rajotte et al,1995,Transplantation Proc.27(6)3389(alginate);Lakey et al,1995,Transplantation Proc.27(6)3266(alginate);Korbutt et al,1995,Transplantation Proc.27(6)3212(alginate);Dorian et al US Patent No5,429,821(alginate);Emerich et al,1993,Exp Neurol 122(1)37-47(聚合體-裝入膠囊PC12細(xì)胞);Sagen et al,1993,J Neurosci 13(6)2415-23(裝入半滲透性的聚合體膜的膠囊牛嗜鉻細(xì)胞以及植入鼠脊髓蛛網(wǎng)膜下腔);Aebischeret al,1994,Exp Neurol 126(2)151-8(裝入膠囊的聚合體鼠PC12細(xì)胞植入猴子);也參見Aebischer,WO 92/19595);Savelkoul et al,1994,JImmunol Methods 170(2)185-96(裝入膠囊的雜交瘤產(chǎn)生的抗體;裝入膠囊的表達(dá)各種細(xì)胞活素的轉(zhuǎn)染細(xì)胞系);Winn et al,1994,PNAS USA 91(6)2324-8(表達(dá)人類神經(jīng)生長因子的基因工程BHK細(xì)胞在免疫分離聚合的裝置中裝入膠囊以及移植大鼠);Emerich et al,1994,ProgNeuropsychopharmacol Biol Psychiatry 18(5)935-46(裝入膠囊的聚合體PC12細(xì)胞植入大鼠);Kordower et al,1994,PNAS USA 91(23)10898-902(裝入膠囊的聚合體的表達(dá)hNGF的基因改造BHK細(xì)胞植入猴子)和Butleret al WO 95/04521(裝入膠囊的裝置)。然后可將微囊劑中的細(xì)胞引入動物寄主,優(yōu)選哺乳動物,更優(yōu)選需要的治療的人。優(yōu)選的膠囊材料半滲透性的,容許釋放進(jìn)入通過裝入膠囊的細(xì)胞產(chǎn)生分泌的蛋白質(zhì)的寄主。在許多具體方案中,半滲透性的膠囊化作用使裝入膠囊的細(xì)胞與引入裝入膠囊的細(xì)胞的寄主有機(jī)體免疫地分離。在那些具體方案中,裝入膠囊的細(xì)胞可以表達(dá)一種或多種含源自寄主種類蛋白質(zhì)和/或源自病毒蛋白質(zhì)的分量域的蛋白質(zhì)或寄主以外的種類的病毒蛋白質(zhì)。例如,在此情況下,該嵌合體可以包含源自GAL4和VP16的元件。該細(xì)胞可以源自一種或多種除接受者以外的個體,可以源自除接受者有機(jī)體或患者以外的種類。
在許多情況下,人們希望體內(nèi)細(xì)胞修飾代替體外細(xì)胞修飾。為了這個目的,已經(jīng)發(fā)展了體內(nèi)遺傳修飾靶組織和細(xì)胞的各種技術(shù)。已經(jīng)發(fā)展一些允許轉(zhuǎn)導(dǎo)以及,在某些情況下,整合病毒進(jìn)入寄主的病毒載體,如腺病毒,腺伴隨病毒,和反向病毒。參見,例如,Dubensky et al.(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81,7529-7533;Kaneda et al.,(1989)Science 243,375-378;Hiebert et al.(1989)Proc.Natl.Acad,Sci.USA 86,3594-3598;Hatzoglu et al.(1990)J.Bid.Chem.265,17285-17293和Ferry,et al.1991)Proc.Natl Acad.Sci.USA 88,8377-8381。媒介物可以通過注射,例如血管內(nèi)注射或肌內(nèi)注射,吸入,或其他腸胃外的方式給藥。也可使用非病毒釋放方法如經(jīng)與脂質(zhì)體的配合物的DNA的給藥或通過注射,導(dǎo)管或生物排列給藥,參見e.g.WO 96/41865,PCT/US97/22454和USSN 60/084819,例如,關(guān)于重組體核酸向細(xì)胞和有機(jī)體給藥的配制和釋放的附加指導(dǎo)。那些參考文獻(xiàn)以及先前引用的參考文獻(xiàn),包括有關(guān)的tetR-定位體系,黃體酮-r-定位體系和蛻皮激素-定位體系,提供了關(guān)于各種配位體向體外細(xì)胞和向有機(jī)體給藥的制劑,配制和釋放的詳細(xì)的附加指導(dǎo)。如其它地方所述,引用文件的那些內(nèi)容作為參考編入本申請。
根據(jù)體內(nèi)遺傳修飾,修飾方式取決于組織的性質(zhì),細(xì)胞修飾需要的效率,修飾特別的細(xì)胞的機(jī)會的數(shù)目,組織對被引入的DNA組合物的可及性,等等。如果需要,通過使用稀釋的或修飾的傳送靶轉(zhuǎn)錄的引發(fā)區(qū)域的反向病毒,人們可以使用患者轉(zhuǎn)錄因子結(jié)構(gòu)激活該病毒,該病毒可以產(chǎn)生和轉(zhuǎn)染鄰近的細(xì)胞。
DNA引導(dǎo)不必在任何情況下導(dǎo)致整合。在某些情況下,瞬時維持足以引入DNA。因此,它可具有短時效應(yīng),其中細(xì)胞可以被引入寄主,預(yù)定時間后(例如細(xì)胞已能在特別的位點(diǎn)安家后)閉合。
結(jié)合性質(zhì),測定
雷帕霉素與人類蛋白質(zhì)FKBP12結(jié)合,得到hFKBP12和FRAP的三重配合物,酵母蛋白質(zhì)TOR1和TOR2.的人類配對物是已知的??梢澡b定雷帕霉素類似物,比較其與雷帕霉素的與人類FKBP12結(jié)合的能力和/或與人類FKBP12和人類FRAP(或包含其FRB區(qū)域的融合蛋白質(zhì)或碎片)形成三重配合物的能力。參見WO 96/41865(Clackson et al)。該申請公開了可用于分別測定與人類FKBP12結(jié)合或與包含人類FKBP12和人類FRAP的FRB區(qū)域的蛋白質(zhì)形成三重配合物(即,“heterodimerize”)的能力的方法。這樣的測定包括測量結(jié)合的熒光偏振測定。也包括細(xì)胞定位轉(zhuǎn)錄測定,其中通過對比該化合物存在下基因工程哺乳動物細(xì)胞產(chǎn)生的指示基因產(chǎn)品的的觀察水平間接地測量化合物形成三重配合物的能力。相應(yīng)的細(xì)胞-定位測定也可在酵母細(xì)胞中引導(dǎo)。參見例如WO 95/33052(Berlin et al)。
常常優(yōu)選生理學(xué)可接受的(即,對于將其使用的細(xì)胞或有機(jī)體沒有過度的毒性)本發(fā)明雷帕霉素類似物,可以被動物口服(即,在動物整體應(yīng)用中,包括基因治療,是口服活性的),和/或可以跨越細(xì)胞膜及特別應(yīng)用中必須的其他膜。
另外,在某些情況下,優(yōu)選的雷帕霉素類似物是其中優(yōu)先地與天然的突變體親免素或天然存在的親免素結(jié)合的雷帕霉素類似物(作為非限制性的例子,親免素為其中Phe36被不同的氨基酸,優(yōu)選具有較小R基閉的氨基酸如纈氨酸或丙氨酸,代替的人類FKBP)。例如,這樣的化合物可以優(yōu)先地與突變體FKBPs結(jié)合,至少超過它們與人類FKBP12的結(jié)合,在某些情況下,按照系統(tǒng)有效的或領(lǐng)域接受的測定方法測定,與突變體FKBPs的超過它們與人類FKBP12的結(jié)合2以至3或更多大小級次。
本發(fā)明各種雷帕霉素類似物對于人類FKBP12,其變體或其他親免素蛋白質(zhì)的結(jié)合親合力可以通過合適的用于FKBP的已知方法測定。例如,專業(yè)人員可以測量本發(fā)明化合物與已知的配位體競爭結(jié)合使人感興趣的蛋白質(zhì)的能力。參見例如Sierkierka et al,1989,Nature 341,755-757(試驗(yàn)化合物與標(biāo)記的FK506衍生物對FKBP結(jié)合的競爭)。
與人類FKBP12,與如以上討論的其突變體,與包含這樣的FKBP區(qū)域的融合蛋白質(zhì)結(jié)合的本發(fā)明的一類優(yōu)選的雷帕霉素類似物,按照直接結(jié)合測量(例如熒光猝滅),競爭結(jié)合測量(例如與FK506比較),F(xiàn)KBP酶活性的抑制旋轉(zhuǎn)異構(gòu)酶),或其他測定方法,其Kd價值低于約200nM,更優(yōu)選低于約50nM,甚至更優(yōu)選低于約10nM,并且甚至更優(yōu)選低于約1nM。在這樣的化合物的一個小組中,F(xiàn)KBP區(qū)域中位置36的苯基丙氨酸已經(jīng)被具有較小側(cè)鏈的氨基酸,例如丙氨酸,纈氨酸,甲硫氨酸或絲氨酸代替。
競爭性結(jié)合FP測定詳細(xì)描述于WO99/36553和WO96/41865。那些測定可為給定的化合物的IC50的體外測量,它反映與標(biāo)記FKBP配位體,如FK506,競爭結(jié)合FKBP蛋白質(zhì)的能力。
一類優(yōu)選地本發(fā)明化合物為,相對于熒光標(biāo)記的FK506標(biāo)準(zhǔn),對于具有至多10,優(yōu)選至多5個氨基酸置換的給定的FKBP區(qū)域和配位體配對,例如人類FKBP12或其變體,的競爭性結(jié)合FP測定的IC50值好于1000nM,優(yōu)選好于300nM,更優(yōu)選好于100nM,并且甚至更優(yōu)選好于10nM的雷帕霉素類似物。
在細(xì)胞-定位測定中,雷帕霉素類似物多聚化嵌合蛋白質(zhì)的能力可以通過測量這樣的多聚化引發(fā)的信號計數(shù)而測量。例如,可以使用包含并且能夠表達(dá)編碼包含一種或多種FKBP區(qū)域和一種或多種效應(yīng)因子區(qū)域的第一嵌合蛋白的DNA以及編碼包含F(xiàn)RB區(qū)域和一種或多種能夠在多聚化中啟動生物反應(yīng)的效應(yīng)因子區(qū)域的第二嵌合蛋白的DNA的細(xì)胞。我們優(yōu)選使用其中進(jìn)一步包含對嵌合蛋白質(zhì)多聚化起反應(yīng)的調(diào)節(jié)元件(即,促進(jìn)劑)的轉(zhuǎn)錄控制中的指示基因的細(xì)胞。典型的組分的設(shè)計和制劑以及它們在基因工程細(xì)胞中的用途公開于WO99/36553和WO96/41865以及相當(dāng)于本申請和上述部分的另一個國際專利申請中。(也參見WO99/10510關(guān)于對使人感興趣的雷帕霉素類似物起反應(yīng)的細(xì)胞和動物釋放的核酸的設(shè)計,裝配和釋放的附加指導(dǎo)和應(yīng)用這樣的體系的附加指導(dǎo)。)該細(xì)胞在培養(yǎng)物中生長或維持。雷帕霉素類似物加入培養(yǎng)基,合適的潛伏期后(容許基因表達(dá)和分泌,例如幾個小時或過夜)測量指示基因產(chǎn)品的存在。通過指示基因產(chǎn)品的外觀觀察,陽性結(jié)果,即,多聚化,與指示基因的轉(zhuǎn)錄有關(guān)。指示基因產(chǎn)品可以是方便檢測的蛋白質(zhì)(例如通過ELISA)或可以催化方便檢測的產(chǎn)品的產(chǎn)生(例如顏色)。產(chǎn)生引導(dǎo)這樣的測定的合適的細(xì)胞系的原料和方法公開于本節(jié)上述引用的國際專利申請。典型地使用的靶基因包括,例如SEAP,hGH,β-半乳糖苷酶,綠色熒光的蛋白質(zhì)和熒光素酶,它們便于測定,是市場上可買到的。
本發(fā)明另一類優(yōu)選的化合物是在以包含F(xiàn)KBP區(qū)域的融合蛋白質(zhì)為基準(zhǔn)的2-雜種轉(zhuǎn)錄測定中能夠誘導(dǎo)可檢測信號的化合物。優(yōu)選地,該FKBP區(qū)域是除野生型的人類FKBP12以外的FKBP區(qū)域。
如同細(xì)胞-定位轉(zhuǎn)錄測定,測量雷帕霉素類似物多聚化嵌合蛋白質(zhì)的能力的另一測定為測量這樣的多聚化引發(fā)的信號計數(shù)的細(xì)胞-定位。在這種情況下,使用持續(xù)表達(dá)可檢測的產(chǎn)品的細(xì)胞。該細(xì)胞也包含并且能夠表達(dá)編碼包含一種或多種親免素衍生的配體結(jié)合區(qū)域和一種或多種效應(yīng)因子區(qū)域,如FAS胞內(nèi)區(qū)域,多聚化時能引發(fā)細(xì)胞死亡的嵌合蛋白質(zhì)的DNAs。典型的組分的設(shè)計和制劑以及它們在工程細(xì)胞中的用途公開于WO95/02684。也參見WO96/41865。細(xì)胞在容許細(xì)胞生長或延續(xù)生存能力的培養(yǎng)基中維持或培養(yǎng)。測定該細(xì)胞或媒介中的組成的細(xì)胞產(chǎn)品的存在,并且由此建立指示器的基線水平??梢允褂胔GH組成的生產(chǎn)的基因工程細(xì)胞或any其他方便的可檢測的產(chǎn)品作為指示器。將試驗(yàn)化合物加入培養(yǎng)細(xì)胞的,在一個或多個時點(diǎn)檢驗(yàn)細(xì)胞溶解產(chǎn)物或媒介中的指示器的存在。融合蛋白質(zhì)多聚化的間接的測量中,指示器產(chǎn)生的減少顯示細(xì)胞死亡。
另一類優(yōu)選的本發(fā)明化合物為能夠在這樣的FKBP/FRB-定位細(xì)胞程序死亡測定中誘導(dǎo)可檢測信號的化合物。優(yōu)選地,該FKBP區(qū)域是除野生型的人類FKBP12以外的FKBP區(qū)域。正如以上的討論,在某些情況下,F(xiàn)KBP區(qū)域被修飾。優(yōu)選地,該FRB區(qū)域是除人類FRAP的野生型FRB以外的FRB區(qū)域。如上所述,在某些情況下,F(xiàn)RB區(qū)域在位置2098被修飾。
這樣的測定容許專業(yè)人員選擇具有所需的IC50值的雷帕霉素類似物和/或比優(yōu)先結(jié)合突變體FKBP而不是野生型人類FKBP12的雷帕霉素類似物。競爭性結(jié)合FP測定容許人們選擇具有所需的IC50值的雷帕霉素類似物和/或相對于控制組,如FK506優(yōu)先結(jié)合突變體FKBP或野生型FKBP的雷帕霉素類似物。
應(yīng)用
如WO94/18317,WO95/02684,WO96/20951,WO95/41865,和WO99/36553所述,除了用作免疫抑制劑和抗真菌藥之外,28-表雷帕霉素類似物可用于,例如在生長在培養(yǎng)中的基因工程細(xì)胞或有機(jī)體整體中調(diào)節(jié)所需的基因轉(zhuǎn)錄的激活,刪除靶基因,啟動細(xì)胞程序死亡或引發(fā)其他生物學(xué)轉(zhuǎn)變,包括基因治療應(yīng)用。下列為本發(fā)明的非限制性應(yīng)用實(shí)例。
1.調(diào)節(jié)基因治療。在許多情況下,斷斷續(xù)續(xù)地隨意轉(zhuǎn)變治療的基因的能力或滴定精確表達(dá)能力對于治療效能是重要的。本發(fā)明特別適于實(shí)現(xiàn)人類基因治療前后治療的靶基因的可調(diào)型表達(dá)。作為一個運(yùn)用嵌合蛋白質(zhì)對(一個至少一個FRB區(qū)域,另一個包含至少一個FKBP區(qū)域)的例子,本發(fā)明28-表雷帕霉素類似物能夠使嵌合體,和被表達(dá)的靶基因結(jié)構(gòu)聚合成二聚物。一個嵌合蛋白質(zhì)包含DNA結(jié)合域,優(yōu)選如Pomerantz et al,supra,所述的作為異源的效應(yīng)因子區(qū)域的復(fù)合DNA結(jié)合域。第二個嵌合蛋白包含作為異源的效應(yīng)因子區(qū)域的轉(zhuǎn)錄區(qū)域。28-表雷帕霉素類似物能夠與兩個嵌合體結(jié)合,由此有效地與該嵌合體,編碼DNA分子嵌合體,并且能夠引導(dǎo)被引入基因工程的細(xì)胞的嵌合蛋白質(zhì)的表達(dá)。被引入的細(xì)胞也是與DNA結(jié)合域能夠?qū)Υ私Y(jié)合的DNA序列有關(guān)系的靶基因。用28-表雷帕霉素類似物接觸基因工程細(xì)胞或其子代(通過將其向動物或患者給藥)導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄因子配合物的集會,由此表達(dá)該靶基因。相似的組分的設(shè)計和使用公開于PCT/US93/01617和WO 96/41865(Clackson et al)。實(shí)施中,靶基因表達(dá)的水平應(yīng)該是嵌合轉(zhuǎn)錄因子配合物的數(shù)目或濃度的函數(shù),它也是28-表雷帕霉素類似物濃度的函數(shù)。劑量(28-表雷帕霉素類似物的)-效應(yīng)的基因表達(dá)典型地被觀察。
28-表雷帕霉素類似物可以依照要求向患者給藥激活靶基因的轉(zhuǎn)錄。取決于28-表雷帕霉素類似物結(jié)合的親合力,要求的反應(yīng),給藥的方式,雷帕霉素類似物和/或靶基因mRNA的生物半衰期,存在的基因工程細(xì)胞的數(shù)目,各種方案都可以使用。28-表雷帕霉素類似物可以通過各種途徑給藥,包括胃腸外或口服。的數(shù)目取決于上面描述的因素。28-表雷帕霉素類似物可以作為藥丸,粉末,或分散體口服;頰服;舌下給藥;血管內(nèi),腹膜下,肌內(nèi),皮下注射;吸入給藥,等等。28-表雷帕霉素類似物(和單體拮抗劑化合物)可以使用本領(lǐng)域眾所周知的常規(guī)方法和原料制備用于各種給藥途徑的制劑。給藥的精確劑量和特別方法取決于上述因素,可通過主治醫(yī)師或者人或動物保健供應(yīng)者測定。在很大程度上,給藥方式憑經(jīng)驗(yàn)測定。
通過28-表雷帕霉素類似物轉(zhuǎn)錄激活被反轉(zhuǎn)或者終止時,28-表雷帕霉素類似物的給藥被終止。此外,如果需要,可以將與28-表雷帕霉素類似物競爭的單體化合物給藥。因此,如果產(chǎn)生有害反應(yīng)或者希望終止治療作用,可以以任何方便的方式將二聚化藥劑的拮抗劑給藥,如果需要迅速的反轉(zhuǎn)特別優(yōu)選血管內(nèi)注射。選擇性地,可以在配體結(jié)合區(qū)域提供鈍化區(qū)域(或者轉(zhuǎn)錄的失活劑)。在另一個途徑中,可以通過提供其它地方公開的Fas或TNF受體的信號通過細(xì)胞程序死亡消除細(xì)胞。參見國際專利申請PCT/US94/01617和PCT/US94/08008。
根據(jù)用于治療的劑量監(jiān)視的方法可以測定28-表雷帕霉素類似物在任何應(yīng)用中的特殊的劑量,表達(dá)的特殊的水平的維持需要一個延長期,例如,大于約兩周,或者短時間內(nèi)用單獨(dú)或重復(fù)doses28-表雷帕霉素類似物重復(fù)治療時,需要延伸的間隔,例如,兩周或更多。預(yù)定范圍內(nèi)的28-表雷帕霉素類似物劑量被給定并且監(jiān)控反應(yīng),以致獲得時間-表達(dá)水平的相互關(guān)系,以及觀察治療的反應(yīng)。取決于周期水平觀察和治療的反應(yīng),反應(yīng)后,下一次可以提供較大的或者較小的劑量。重復(fù)該方法,直到獲得治療的范圍內(nèi)的劑量。28-表雷帕霉素類似物長期給藥時,首先測定28-表雷帕霉素類似物的維持劑量,然后測定疏開間隔,確定細(xì)胞系統(tǒng)提供合適的反應(yīng)和表達(dá)產(chǎn)物的水平。
顯然,本系統(tǒng)受許多變量支配,如細(xì)胞對28-表雷帕霉素類似物的反應(yīng),表達(dá)的效率,視情況而定,分泌的水平,表達(dá)產(chǎn)物的活性,患者的特殊的需要,可以隨時間和情況變化,作為細(xì)胞損失結(jié)果的細(xì)胞活動損失率或個體細(xì)胞的表達(dá)活性,等等。
2.重組體蛋白質(zhì)和病毒的產(chǎn)生商業(yè)和研究目的的重組體治療蛋白質(zhì)的產(chǎn)生常常通過使用基因工程哺乳動物細(xì)胞線高水平表達(dá)蛋白質(zhì)而實(shí)現(xiàn)。使用哺乳動物細(xì)胞,而不是細(xì)菌或酵母,顯示需要翻譯后修飾的蛋白質(zhì)的正常功能一般不通過異源的細(xì)胞完成。這樣大批產(chǎn)生的蛋白質(zhì)的例子包括紅細(xì)胞生成素,組織纖溶酶原激活物,凝血因子如因子Vllhc,抗體,等等。用這種方式產(chǎn)生的蛋白質(zhì)的成本與基因工程細(xì)胞實(shí)現(xiàn)的表達(dá)的水平有直接的關(guān)系。生產(chǎn)這樣的蛋白質(zhì)的第二個限制是對寄主細(xì)胞的毒性蛋白質(zhì)表達(dá)可以防止細(xì)胞變得高密度,急劇地減少生產(chǎn)水平。因此,作為所述調(diào)節(jié)基因治療,緊緊地控制蛋白質(zhì)表達(dá)的能力容許在沒有蛋白質(zhì)生產(chǎn)的情況下,細(xì)胞逐漸高密度。只是在最佳的細(xì)胞密度達(dá)到以后,表達(dá)激活的基因,隨后收獲蛋白產(chǎn)品。
在生產(chǎn)商業(yè)使用的(例如,基因治療)和實(shí)驗(yàn)使用的重組病毒的“包裝”的結(jié)構(gòu)和使用中遭遇相似的問題。這些細(xì)胞系經(jīng)基因工程改造產(chǎn)生包含有缺陷的重組體基因組的傳染性的病毒顆粒的集合需要的病毒蛋白質(zhì)。取決于這樣的包裝線的病毒載體包括反向病毒,腺病毒,和腺病毒相關(guān)病毒。在后面的情況下,從包裝線中獲得病毒原種的滴度與病毒rep和核心蛋白質(zhì)的生產(chǎn)水平直接有關(guān)系。但是這些蛋白質(zhì)對寄主細(xì)胞是高毒性的。因此,難以產(chǎn)生高-滴度重組體AAV病毒。本發(fā)明提供解決這些問題的答案,即允許在這里公開的可調(diào)轉(zhuǎn)錄因子的控制下放置rep和核心基因的包裝線的結(jié)構(gòu)。包裝細(xì)胞系可以變得高密度,用輔助病毒感染,以及用重組體病毒基因組轉(zhuǎn)染。然后,通過加入二聚劑誘導(dǎo)包裝細(xì)胞編碼的病毒蛋白質(zhì),允許在高滴度生產(chǎn)病毒。
3.生物學(xué)研究本發(fā)明適用于各種各樣的需要精確的控制靶基因的生物學(xué)試驗(yàn)。其中包括(1)用于生化凈化的使人感興趣的核糖核酸的蛋白質(zhì)或RNA的表達(dá);(2)用于評價生物學(xué)功能的目的的組織培養(yǎng)細(xì)胞中的(或體內(nèi),經(jīng)基因工程細(xì)胞)使人感興趣的蛋白質(zhì)或RNA的可調(diào)型表達(dá);(3)用于評價其生物學(xué)功能的目的的轉(zhuǎn)基因動物中的使人感興趣的蛋白質(zhì)或RNA的可調(diào)型表達(dá);(4)用于那些基因的生物學(xué)功能的評價的目的的作用于內(nèi)源的基因的編碼另一個調(diào)節(jié)蛋白的基因的表達(dá)的調(diào)節(jié)。本發(fā)明組分可以適應(yīng)的轉(zhuǎn)基因動物模型及其他申請公開于PCT/US95/10591。
本發(fā)明進(jìn)一步提供可用于上述應(yīng)用的試劑盒。這樣的試劑盒包含編碼以及能夠引導(dǎo)本發(fā)明嵌合蛋白質(zhì)的DNA結(jié)構(gòu)(以及可以包含如以上討論的附加區(qū)域)以及,在涉及調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄的具體方案中,包含與一種或多種通過嵌合蛋白質(zhì)多聚化激活的轉(zhuǎn)錄控制元件有關(guān)系的靶基因的靶基因結(jié)構(gòu)。選擇性地,該靶基因結(jié)構(gòu)可以包含用于專業(yè)人員插入需要的靶基因的克隆位點(diǎn)。這樣的試劑盒也可包含能夠使兩個重組體蛋白質(zhì)二聚化并且激活靶基因的轉(zhuǎn)錄的二聚劑的樣品。配制,劑量和用法
根據(jù)其啟動蛋白質(zhì)相互作用的能力,本發(fā)明雷帕霉素類似物可以用于在包含本發(fā)明基因改造細(xì)胞的人或非人哺乳動物中促進(jìn)形成本發(fā)明嵌合蛋白質(zhì)的配合物的藥物組合物和方法。
這樣的治療或預(yù)防的優(yōu)選的方法為對哺乳動物給予有效量的化合物來啟動在基因工程細(xì)胞中的這樣的配合物的形成,或優(yōu)選地,啟動通過這樣的絡(luò)合作用,例如靶基因的轉(zhuǎn)錄,基因改造細(xì)胞的細(xì)胞程序死亡,等等,測量需要的生物學(xué)信號計數(shù)的作用。
治療/預(yù)防給藥與藥物組合物
雷帕霉素類似物可以處于游離形式或,合適的話,處于鹽形式。許多化合物類型的藥學(xué)上可接受的鹽和它們的制劑對于本領(lǐng)域技術(shù)人員是已知的。本發(fā)明化合物的藥學(xué)上可接受的鹽包括由,例如,無機(jī)的或有機(jī)的酸形成的這樣的化合物的常規(guī)的無毒鹽或季銨鹽。
本發(fā)明化合物可以形成水合物或溶劑化物。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知用水冷凍干燥時帶電荷的化合物形成水合物,濃縮合適的有機(jī)溶劑的溶液形成溶劑化物。
本發(fā)明也涉及包含治療(或預(yù)防)有效量的本化合物,和一種或多種藥學(xué)上可接受的載體和/或其他賦形劑的藥物組合物。載體包括例如鹽水,緩沖鹽水,葡萄糖,水,甘油,乙醇,和它們的結(jié)合,下文更詳細(xì)地論述。如果需要,該組合物還可以包含較小量的潤濕劑或乳化劑,或pH緩沖劑。該組合物可以是液體溶液,懸浮液,乳劑,片劑,丸劑,膠囊,持續(xù)釋放制劑,或粉末。該組合物可以用傳統(tǒng)的粘合劑和載體如三酸甘油酯配制成栓劑??诜苿┛梢园?biāo)準(zhǔn)載體如藥物品級的甘露糖醇,乳糖,淀粉,硬脂酸鎂,糖精鈉,纖維素,和碳酸鎂,等等。視需要制劑而定,配制可以涉及混合,粒化和壓縮或溶解成分。在另一個途徑中,該組合物可以配制成納米顆粒(nanoparticles)。
使用的藥物載體可以為,例如,固體或者液體。
典型的固體載體包括乳糖,石膏粉,蔗糖,滑石,凝膠,瓊脂,果膠,阿拉伯膠,硬脂酸鎂,硬脂酸等等。固體載體可以包括一種或多種可能同時作為增香劑,潤滑劑,增溶劑,懸浮劑,填料,助流劑,壓縮助劑,粘合劑或片劑-崩解劑的物質(zhì);它還可以是包封材料。在粉末中,載體為精細(xì)粉碎的固體,它是與精細(xì)粉碎的活性成分的混合物。在片劑中,活性成分與具有必要的壓縮性質(zhì)的載體以合適的比例混合,以需要的形狀和大小壓縮。粉末和片劑優(yōu)選包含至多99%活性成分。合適的固體載體包括,例如,磷酸鈣,硬脂酸鎂,滑石,糖,乳糖,糊精,淀粉,凝膠,纖維素,甲基纖維素,羧甲基纖維素鈉鹽,聚乙烯吡咯烷酮,低熔點(diǎn)蠟和離子交換樹脂。
典型的液體載體包括糖漿,花生油,橄欖油,水,等等。液體載體用于制備溶液,懸浮液,乳劑,糖漿,酏劑和密封的組合物?;钚猿煞挚梢匀芙饣驊腋∮谒帉W(xué)上可接受的液體載體如水,有機(jī)溶劑,二者的混合物或藥學(xué)上可接受的油類或脂肪。液體載體可以包含其他合適的藥物添加劑如增溶劑,乳化劑,緩沖劑,防腐劑,增甜劑,增香劑,懸浮劑,增稠劑,顏料,粘度調(diào)節(jié)劑,穩(wěn)定劑或滲透壓-調(diào)節(jié)劑。用于口服和腸胃外給藥的液體載體的合適的例子包括水(部分地包含如同上述的添加劑,例如纖維素衍生物,優(yōu)選羧甲基纖維素鈉鹽溶液),醇(包括一元醇和多元醇,例如乙二醇)和它們的衍生物,和油類(例如分餾椰子油和花生油)。用于腸胃外給藥的載體還可以為油酯如油酸乙酯和異丙基肉豆蔻酸鹽。無菌的液體載體用于腸胃外給藥的無菌的液態(tài)組合物。用于加壓組合物的液體載體可以為鹵代烴或其他藥學(xué)上可接受的推進(jìn)劑。無菌溶液或懸浮液液體藥物組合物可以用來,例如,肌內(nèi),腹膜內(nèi)或皮下注射。無菌溶液還可以靜脈內(nèi)給藥。該化合物還可以以液體或者固體組合物的形式口服給藥。
載體或賦形劑可以包括本領(lǐng)域已知的時間延遲材料,如單獨(dú)的或與蠟混合的單硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯,乙基纖維素,羥丙基甲基纖維素,異丁烯酸甲脂等等。當(dāng)制劑用于口服時,公認(rèn)PHOSAL PG-50(phospholipidconcentrate with 1,2-propylene glycol,A.Nattermann & Cie.GmbH)中的0.01%吐溫80用于其他化合物的可接受的口服制劑的配制,可以適應(yīng)于本發(fā)明各種化合物的配制。
可以使用各式各樣的藥物形式。如果使用固體載體,制劑可以片劑,被放入硬膠囊中的粉末或小藥丸形式或錠劑或糖錠形式。固體載體的量在很大程度上變化,但是優(yōu)選從約25mg到約1g。如果使用液體載體,制劑可為糖漿,乳劑,軟膠膠囊,在安瓿或小瓶或非水的液體懸浮液中的無菌注射溶液或懸浮液。
為了獲得穩(wěn)定的水溶性的劑型,可以將多聚化劑的藥學(xué)上可接受的鹽溶于有機(jī)或無機(jī)酸的水溶液,0.3M琥珀酸或檸檬酸溶液。選擇性地,酸性的衍生物可以溶于合適的堿性溶液。如果得不到可溶鹽形式,可將化合物溶于合適的共溶劑或它們的結(jié)合。這樣的合適的共溶劑的例子包括,但是不局限于,濃度范圍從0-60%總體積的,醇,丙二醇,聚乙二醇300,聚山梨酸酯80,甘油,聚氧乙烯脂肪酸酯,脂肪醇或甘油羥脂肪酸酯等等。
各種釋放系統(tǒng)是已知的并且可用于多聚化劑的給藥,或它們的各種制劑,包括片劑,膠囊,可注射的溶液,脂質(zhì)體中的膠囊,微粒,微膠囊,等等。引入的方法包括但是不局限于皮膚的,皮內(nèi),肌內(nèi),腹膜內(nèi)的,靜脈內(nèi)的,皮下的,鼻腔內(nèi)的,肺的,硬膜外的,眼睛的和(通常優(yōu)選的)口服途徑?;衔锟梢酝ㄟ^任何方便的或者相反適當(dāng)?shù)耐緩浇o藥,例如通過注入或快速濃注,通過上皮的或粘膜線路(例如,口腔粘膜,直腸和腸粘膜,等等)吸收以及可以與其他生物活性劑一起給藥??梢匀砘蚓植拷o藥。用于鼻,支氣管或肺疾病的治療或預(yù)防時,優(yōu)選的給藥途徑為口服,鼻給藥或支氣管煙霧劑或噴霧器。
在某些具體方案中,化合物對需要治療的區(qū)域局部給藥也許合乎需要;實(shí)現(xiàn)這樣的給藥可以通過,例如,而不是作為限制,外科手術(shù)局部注入,局部施用,通過注射,通過導(dǎo)管,通過栓劑,或依靠蒙皮補(bǔ)片或植入物,上述的植入物為多孔的,無孔的,或凝膠狀的材料,包括膜,sialastic膜,或纖維。
在特定的具體方案中,組合物根據(jù)常用方法制劑,用作適合于向人靜脈內(nèi)的給藥的藥物組合物。典型地,用于靜脈內(nèi)的給藥的組合物為無菌的等滲的含水的緩沖劑中的溶液。在必要時,組合物也可能包括增溶劑和在注射位點(diǎn)鎮(zhèn)痛的局部麻醉劑。一般地,成分被分別或混合地提供于單位劑型,例如,冷凍干燥粉末或無水的濃縮物在密閉容器如顯示活性劑的數(shù)量的安瓿或sachette中。組合物通過注入給藥時,它可以分裝于包含無菌的藥物級的水或鹽水的輸液瓶。組合物通過注射給藥上,可以提供滅菌注射水或鹽水的安瓿,可以在給藥之前混合各成分。
將有效量的化合物向個體給藥還可以通過將化合物(s)直接向個體皮膚的受影響的區(qū)域局部地給藥而實(shí)現(xiàn)。對于這個目的,化合物給藥或應(yīng)用的組合物包括藥理學(xué)可接受的局部給藥載體,如凝膠,油膏,洗液,奶油,其中包括,無限制的,這樣的載體如水,甘油,醇,丙二醇,脂肪醇,甘油三酯,脂肪酸酯,或礦物油。
其他局部給藥的載體包括液體石油產(chǎn)品,異丙基棕櫚酸酯,聚乙二醇,乙醇(95%),水中的聚氧化乙烯單月桂酸酯(5%),或水中的十二烷基硫酸鈉(5%)。其他原料如抗氧化劑,濕潤劑,粘度穩(wěn)定劑,和相似的藥劑可以根據(jù)需要添加。也可能包括經(jīng)皮滲透增強(qiáng)劑如Azone。
另外,某些情況下,預(yù)計該化合物可以安排在裝置內(nèi),放置于皮膚的上面,里面或下面。這樣的裝置包括補(bǔ)片,植入物,和注射液,通過鈍態(tài)的或者活性的釋放機(jī)制,將化合物釋放到皮膚內(nèi)。
產(chǎn)生各種制劑的原料和方法在本領(lǐng)域是已知的,可以適合于實(shí)施本發(fā)明。參見例如US Patent Nos.5,182,293和4,837,311(片劑,膠囊及其他口服的制劑以及靜脈內(nèi)的制劑)和European Patent Application Publication Nos.O649 659(published April 26,1995;IV給藥的的典型制劑)和0 648 494(published April 19,1995;口服的典型制劑)。
化合物的有效劑量典型地在about 0.01到約50mg kgs,優(yōu)選約0.1到約10mg/kg哺乳動物體重的范圍之內(nèi),以單或多劑量給藥。一般地,對需要這樣的治療的病人的給藥的日劑量范圍為每位患者約1到約2000mg。
有效治療或預(yù)防特殊的紊亂或癥狀的化合物的量部分地取決于多聚化劑融合蛋白質(zhì)的特性,基因工程細(xì)胞的特性和位置,以及紊亂或癥狀的性質(zhì),可以通過標(biāo)準(zhǔn)的臨床技術(shù)測定。另外,可以選擇性地使用體外或體內(nèi)測定幫助確定最佳的劑量范圍。有效劑量可以從源自體外或動物模型測試系統(tǒng)的劑量反應(yīng)曲線推斷。主治醫(yī)師其他衛(wèi)生保健提供者可測定精確的劑量水平,它取決于眾所周知的因素,包括給藥途徑,個體的年齡,體重,性別和總的健康狀態(tài);疾病的性質(zhì),嚴(yán)重程度和臨床階段;伴隨治療的使用(與否);以及患者的基因工程的性質(zhì)和范圍。
本發(fā)明也提供具有包含一個或多個本發(fā)明藥物組合物成分的包裝物的藥物包裝或試劑盒。與這樣的包裝物選擇性地關(guān)聯(lián)的技術(shù)可以為政府機(jī)構(gòu)規(guī)定的布告形式,藥物或生物制品的制造,使用或銷售,該布告反映政府機(jī)構(gòu)批準(zhǔn)用于人給藥的制造,使用或銷售。該布告或包裝說明書可能包含與本申請公開的一致的本發(fā)明28-表雷帕霉素類似物的使用說明書。
下列實(shí)施例包含重要的附加信息,例證和指導(dǎo),可以適應(yīng)本發(fā)明各種具體方案及其同等物的實(shí)施。實(shí)施例提供說明,不應(yīng)該被理解為以任何方式的限制。本發(fā)明的許多修飾和變化對本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見。這樣的修飾和變化,包括28-表雷帕霉素類似物選擇,制備,制劑和給藥的設(shè)計選擇,以及異源的作用區(qū)域的選擇,融合蛋白質(zhì)設(shè)計,DNA配制,病毒載體或其他DNA的釋放方法,轉(zhuǎn)基因給藥的方式和途徑等等包括于本發(fā)明的范圍和附加的 的范圍內(nèi)。
所有引用的包括參考文獻(xiàn)包括本文件引用的參考文獻(xiàn)書目,發(fā)布的專利,以及公開專利申請,特此作為參考編入。除非另有陳述,本發(fā)明的實(shí)施將使用合成有機(jī)化學(xué)的常規(guī)方法,包括產(chǎn)品回收,提純和及配制,以及細(xì)胞生物學(xué),細(xì)胞培養(yǎng)物,分子生物學(xué),轉(zhuǎn)基因的生物學(xué),微生物學(xué),重組DNA,以及免疫學(xué),都在本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的范圍之內(nèi)。這樣的技術(shù)完全在專利和科學(xué)文獻(xiàn)中說明。參見,例如,下列生物技術(shù)Molecular Cloning+A Laboratory+Manual,2ndEd.,ed.by Sambrook,F(xiàn)ritsch和Maniatis(Cold Spring Harbor Laboratory Press1989);DNA Cloning,Volumes I and II(D.N.Glover ed.,);OligonucleotideSynthesis(低聚核苷酸合成)(M.J.Gait ed.,1984);Mullis et al.U.S.Patent No4,683,195;Nucleic Acid Hybridization(核酸雜交)(B.D.Hames & S.J.Higginseds.1984);Transcription And Translation(轉(zhuǎn)錄和翻譯)(B.D.Hames & S.J.Higgins eds.1984);Culture Of Animal Cells(動物細(xì)胞的培養(yǎng))R.I.Freshney,Alan R.Liss,Inc.,1987);Immobilized Cells Immobilized Cells And Enzymes(固定細(xì)胞和酶)(IRL Press,1986);B.Perbal,A Practical Guide To Guide ToMolecular Cloning(分子擴(kuò)增的實(shí)際的指導(dǎo))(1984);論文,Methods InEnzymology(酶學(xué)中的方法)(Academic Press,Inc.,N.Y.);Gene TransferVectors For Mammalian Cells(用于哺乳動物細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)移載體)(J.H.Miller和M.P.Calos eds.,1987,美國冷泉港實(shí)驗(yàn)室);Methods In Enzymology(酶學(xué)中的方法),vols.154和155(Wu et al eds.),Immunochemical MethodsIn Cell And Molecular Biology(細(xì)胞中的免疫化學(xué)方法和分子生物學(xué))(Mayer和Walker,eds.Academic Press,London,1987);Handbook OfExperimental Immunology(實(shí)驗(yàn)免疫學(xué)手冊)Volumes I-IV(D.M.Weir和C.C.Blackwell,eds.,1986);Manipulating the Mouse Embryo(小鼠胚胎的操作)(Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.1986)。
實(shí)施例實(shí)施例1.28-表雷帕霉素的探索和分析
當(dāng)研究選擇性的路易斯酸的C7親核取代化學(xué)時,我們發(fā)現(xiàn)在沒有任何親核試劑的情況下用二氯甲烷中的Ti(OiPr)4處理雷帕霉素時導(dǎo)致全新的反應(yīng),得到的主要產(chǎn)品為一種分子量與雷帕霉素相同的未知的化合物2(分離的產(chǎn)率超過60%)(流程1)。
初步的NMR分析顯示C26,C28和C29質(zhì)子共振改變,暗示在C28,C29或C28和C29二者可能差向異構(gòu)化?;衔?和雷帕霉素1分別地處于相同的逆向醛醇(retroaldol)反應(yīng)條件(ZnCl2,THF,50-OC,4hr)。如HPLC(反相,85∶15 MeOH∶H20)和1H NMR分析所示,兩個反應(yīng)均產(chǎn)生開環(huán)的開環(huán)雷帕霉素3,證明C28和/或C29立構(gòu)中心被差向異構(gòu)化。流程1
對化合物2和雷帕霉素進(jìn)行了進(jìn)一步NMR分析(COSY,ROESY,TOCSY,NOESY,HETCOR和HMBC)。雷帕霉素NMR譜帶歸屬與文獻(xiàn)報導(dǎo)的非常吻合。2的HMBC和NOESY數(shù)據(jù)均顯示C28的立體化學(xué)已經(jīng)反向。
結(jié)晶化合物2用甲醇/水重結(jié)晶,進(jìn)行X射線晶體結(jié)構(gòu)測定。它清楚地證實(shí)新分離的產(chǎn)品為雷帕霉素的C28差向異構(gòu)體。
除2和殘余的雷帕霉素之外,也從本反應(yīng)分離出一些較少的副產(chǎn)品(通過HPLC分析各少于5%)。通過類似于28-表雷帕霉素進(jìn)行的NMR分析測定,發(fā)現(xiàn)它們?yōu)殚_環(huán)雷帕霉素3,29-表雷帕霉素4和28,29-二表雷帕霉素5。
粗反應(yīng)混合物中存在微量開環(huán)雷帕霉素3暗示受Ti(OiPr)4的影響可能存在雷帕霉素的反向羥醛(retroaldol)和反羥醛(realdol)大環(huán)內(nèi)酯化(macrolization)的反應(yīng)途徑。
在五當(dāng)量苯甲醛存在下進(jìn)行差向異構(gòu)化反應(yīng)時可以通過苯甲醛來截留鈦(IV)配合的反向羥醛中間體。苯甲醛和反向羥醛中間體之間的醛醇縮合得到高產(chǎn)率的非對映體6的混合物(流程2)。流程2
通過HPLC(正常的和反向的相)可以嚴(yán)密監(jiān)視反應(yīng)過程。引入Ti(OiPr)4后立即可檢測到開環(huán)雷帕霉素3,它在反應(yīng)全部過程中保持恒量然而為最低的水平(-1%)而雷帕霉素變?yōu)樗母鞣N非對映體。當(dāng)純的28-表雷帕霉素2,29-表雷帕霉素4和28,29-二表雷帕霉素5分別處于差向異構(gòu)化條件時,可以觀察相同的產(chǎn)品與雷帕霉素的比率。這些實(shí)驗(yàn)證明鈦(IV)配合的雷帕霉素的反向羥醛限制該反應(yīng)的速度。與鈦(IV)配合的開環(huán)中間體一旦產(chǎn)生便迅速地重羥醛化。反向羥醛和重羥醛步驟繼續(xù)進(jìn)行直到反應(yīng)達(dá)到平衡。最終產(chǎn)品分布顯示28-表雷帕霉素2是熱力學(xué)最穩(wěn)定的非對映體。
這些中和狀態(tài)下的通過Ti(OiPr)4介導(dǎo)的β-羥基酮的新的反向羥醛和重羥醛平衡不是這里公開的雷帕霉素特定的。原始數(shù)據(jù)證實(shí)它也適用于非環(huán)的系統(tǒng)中的β-羥基酮。1-羥基-1-苯基-2-甲基3-戊酮與Ti(OiPr)4的2∶1混合物(syn/anti)的處理導(dǎo)致4∶5(syn/anti)混合物,證實(shí)反向異構(gòu)體熱力學(xué)更穩(wěn)定。由金屬如Zn(11),Mg(11)和Ba(11)平衡的羥醛已經(jīng)在文獻(xiàn)中報導(dǎo)??墒?,該平衡需要強(qiáng)堿條件,常常產(chǎn)生如Hayward在雷帕霉素全合成中證明的反向羥醛產(chǎn)品。
將28-表雷帕霉素進(jìn)行與雷帕霉素比較的生物檢定。按熒光偏振競爭測定計算,28-表雷帕霉素對FKBP的親合力比雷帕霉素弱大約5倍,按照與FKBP結(jié)合的雷帕霉素的X射線晶體結(jié)構(gòu)可以想象,也許由于C28羥基與FKBP上的Glu54主鏈羰基之間氫鍵作用的損失。與對FKBP結(jié)合的親合力降低一致,在脾細(xì)胞增殖測定中,2的免疫抑制活性雷帕霉素減少一定數(shù)值。比較數(shù)據(jù)顯示于實(shí)施例5。
因此已經(jīng)發(fā)現(xiàn)免疫抑制的天然產(chǎn)物雷帕霉素的新的選擇性的差向異構(gòu)化反應(yīng),差向異構(gòu)化產(chǎn)品的結(jié)構(gòu)已經(jīng)通過NMR和X射線結(jié)晶學(xué)分析證實(shí)。體外測定28-表雷帕霉素,發(fā)現(xiàn)具有較小效力的免疫抑制活性。這些非常溫和的和有效率的反向羥醛和反羥醛差向異構(gòu)化條件還可以被用于無環(huán)的β-羥基酮而產(chǎn)生熱力學(xué)更穩(wěn)定的立體異構(gòu)體。這些方法應(yīng)該廣泛地適用于具有β-羥基酮的其他天然產(chǎn)物和化合物。實(shí)施例2.28-表雷帕霉素和C43-修飾的28-表雷帕霉素類似物的合成2.0 28-表雷帕霉素
一般方法所有的試劑和溶劑為分析純的,市場購買未進(jìn)一步提純。使用Bruker ARX-300或DRX600儀器記錄1H和13C NMR光譜。化學(xué)位移單位為從四甲基硅烷向低場的ppm。如果存在旋轉(zhuǎn)異構(gòu)體混合物,僅僅記錄主要的旋轉(zhuǎn)異構(gòu)體的化學(xué)位移。低分辨率質(zhì)譜(LRMS)由Micromass Platform II四極質(zhì)譜儀以電噴射方式獲得。閃式層析法使用硅膠(Merck,230-400 mesh)進(jìn)行。分析TLC使用硅膠60 F254板(Merck)進(jìn)行。由正常相位和反向相位分析HPLC在280nm波長監(jiān)控雷帕霉素的相關(guān)反應(yīng)。該正常相位HPLC使用Kromasil硅膠柱(4.6mm×25cm),在室溫下以1.0mL/min的流速用4.0/42,5/50/200MeOH/EtOAc/己烷/CH2C12洗脫。反向相位HPLC使用Kromasilc18柱(4.6mm×25cm),在50℃的溫度下以1.0mL/min的流速用80/20MeOH/H2O洗脫。制備HPLC分離使用Kromasil硅膠柱(21.4mm×25cm)以20mL/min的流速進(jìn)行。
雷帕霉素差向異構(gòu)化的一般程序在室溫下,在雷帕霉素(510mg,0.56mmol)在CH2Cl2(35.2mL)中的溶液中,滴加Ti(OiPr)4(494uL,1.67mmol)。反應(yīng)混合物變?yōu)闇\黃色。30分鐘后,將該溶液倒入包含1N HCl和EtOAc的不均勻混合物的分液漏斗。隨后將該有機(jī)層用NaHCO3飽和水溶液,H2O,鹽水洗滌,用Na2SO4干燥,過濾并在真空下濃縮。所有產(chǎn)品的保留時間列于如下。2.1 C43-O-烯丙基C28差向異構(gòu)化方法(一罐法)
在室溫及攪拌下,將雷帕霉素(219mg,0.240mmoles)溶于二氯甲烷(12.3ml)。加入Ti(OiPr)4(212mL,0.720mmoles)產(chǎn)生淺黃色溶液。在室溫放置75分鐘后,將該溶液冷卻到-78℃,接著加入2,6-二甲基吡啶(156mL,1.2mmoles)和烯丙基三氟乙酸酯。將該反應(yīng)物在-78℃攪拌100分鐘,然后溫?zé)岬絆℃。2小時后,將該溶液倒入包含1N HCl和CH2Cl2的不均勻溶液的分液漏斗猝滅。將有機(jī)層用NaHCO3,鹽水和水洗滌,用NaSO4干燥,過濾并且在真空下濃縮物至大約2mL。用硅膠閃式層析法提純(3/1己烷/丙酮),接著通過半制備HPLC(4.0∶42.5∶50∶200/MeOH∶EtOAc∶己烷∶CH2Cl2),得到清潔的28epi-表-43-O-烯丙基雷帕霉素(14%∶41%以轉(zhuǎn)化為基準(zhǔn))。MS(M-H)-952.44。2.2 C43 O-烯丙基C28差向異構(gòu)化方法(從純的28-表雷帕霉素)
在-78℃下,將烯丙醇(15.5mL 0.228mmoles)和2,6-二-叔丁基吡啶(46mg,0.225mmoles)在CH2Cl2(1.12mL)中的溶液加入三氟乙酸酐(38.0mL,0.229mmoles)溶于CH2Cl2(546mL)形成的第二溶液。90分鐘后,將28-表雷帕霉素(101mg,0.111mmoles),和2,6-二-叔丁基吡啶(46mg,0.225mmoles)在CH2Cl2(7.0mL)中的溶液加入烯丙基三氟乙酸酯溶液。將該反應(yīng) 物在-78℃攪拌30分鐘,然后溫?zé)岬?℃,再攪拌7小時。將該溶液加入包含用NaSO4干燥,過濾并且濃縮。通過硅膠閃式層析法提純(梯度為2/1到3/2的己烷/乙酸乙酯)得到白色固體裝28-表43-O-烯丙基雷帕霉素(59%,以回收的原料為基準(zhǔn))。MS(M-H)-952.44。2.3 C43 O-O-甲基C28差向異構(gòu)化方法(一罐法)
將雷帕霉素(1.39g 1.52mmoles)溶于CH2Cl2。迅速地滴加異丙氧基鈦(1.35mL,4.57mmoles)。將該溶液在室溫下攪拌30分鐘,然后冷卻到0℃。同時加入2,6二甲基吡啶(994mL,7.61mmoles)和三氟乙酸甲酯(861mL,7.61)。將該反應(yīng)物攪拌110分鐘,通過加入包含1N HCl和CH2Cl2的多相混合物的分液漏斗猝滅,提取,用NaHCO3,鹽水和水洗滌,用NaSO4干燥,過濾并且濃縮。經(jīng)硅膠閃式層析法(3/1到1/1己烷烷/丙酮)及隨后的制備HPLC(4.0/42.5/50.0/200MeOH/EtOAc/Hex/CH2Cl2)提純,得到白色固體狀28-表雷帕霉素-43-O-烯丙基(24%,以回收的原料為基準(zhǔn))。MS(M-H)-926.71。2.4其他C-43-修飾的28-表雷帕霉素類似物
使用28-表雷帕霉素作為原料,使用已知的變化,可以制備43-O-芐基-28-表雷帕霉素,43-O-甲氧基亞甲基-28-表雷帕霉素,以及43-N,N-二甲基甘氨酰(dimethylgylcinate)-28-表雷帕霉素。用與要求的產(chǎn)品相關(guān)的C7 28-表雷帕霉素類似物作為原料(參見實(shí)施例4,下文),可以類似地制備在C7和C43修飾的28-表雷帕霉素類似物。
2.5幾個C-43-修飾的28-表雷帕霉素類似物的比較特性
1.使用先前報導(dǎo)的以熒光偏振(FP)為基準(zhǔn)的競爭性結(jié)合測定方法可以測定雷帕霉素類似物與FKBP的親合力。在包含亞飽和FKBP和作為競爭者的可變量雷帕霉素類似物的平衡結(jié)合實(shí)驗(yàn)中,使用熒光素標(biāo)記的FK506探針(AP1491),其熒光極化的增加直接讀出探針的%結(jié)合。參見例如,WO 99/36553,實(shí)施例11,119-120頁。
2.在使用結(jié)構(gòu)上表達(dá)分別包含F(xiàn)KBP和2098L突變體FRB區(qū)域的轉(zhuǎn)錄的轉(zhuǎn)換組分,調(diào)節(jié)地表達(dá)轉(zhuǎn)換組分多聚化的化合物中的分泌堿性磷酸酶(SEAP)的基因改造的HD1080細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄測定中,測量各種化合物的EC50值。該測定是用文獻(xiàn)中的測定方法。參見WO 99/36553,例如實(shí)施例12,120-121頁(&Fig2D)。
3.常規(guī)的鼠科動物脾細(xì)胞對于免疫抑制活性的測定。實(shí)施例3.典型的C-24修飾的28-表雷帕霉素類似物的合成
E和Z形式的C-24肟的雷帕霉素的制備方法是已知的。參見例如WO96/41865和WO99/36553。使用那些方法,但是用28-表雷帕霉素代替雷帕霉素,得到28表雷帕霉素的相應(yīng)的肟,
其中,為了這些實(shí)施例中使用的目的,RB為-OH,-OMe,-OEt,-OisoBu,OtBu-Obenzyl,-OCH2CO2H,-OCH2CONH2。實(shí)施例4.C7 28表雷帕霉素類似物的合成
WO96/41865和WO99/36553公開了使用除注解外的文獻(xiàn)的所述的一般化學(xué)方法,合成一系列包含各種C7取代基,尤其包括,支鏈和無支鏈的烷氧基,芳基烷氧基,-NHCO-OalkyI,-NHSO2alkyl和取代的芳基和雜芳基基團(tuán)的一系列C7同型物(參見例如,Luengo et al 1995 Chemistry and Biology 2,471-481,和附加背景技術(shù)的表II中引用的參考文獻(xiàn))。使用相同的方法,除了用28-表雷帕霉素代替雷帕霉素,得到相應(yīng)的28-表雷帕霉素的C7衍生物,例如,下列結(jié)構(gòu)的化合物
其中一個R7a和R7b為H,另一個為-OEt,-OiPr,-Obenzyl,-NH-CO-OMe,-NH-SO2-Me,-呋喃基,-甲基噻吩,-乙基噻吩,-叔丁基噻吩,-o.p-二甲氧基苯基,-吲哚基,-o.p-二甲氧基苯基,-甲基噻吩,-N-甲基吡咯等等。實(shí)施例5.幾個C-7-修飾的28-表雷帕霉素類似物的比較特性
按實(shí)施例4所述制備不同基團(tuán)的C7-修飾的28-表雷帕霉素類似物。典型的實(shí)施例列在下兩頁的表上,具有與FKBP結(jié)合的比較數(shù)據(jù),細(xì)胞轉(zhuǎn)錄測定中的活性,和使用上述實(shí)施例2.5論述的方法的小鼠脾細(xì)胞(splenocyte)測定中的活性。(+)峰>125%雷帕霉素峰(-)峰<80%雷帕霉素峰實(shí)施例6 24(S),30(S)-四氫-和30-二氫-28-表雷帕霉素的制備
WO99/36553公開了24(S),30(S)-四氫化雷帕霉素的合成和特征。使用相同的方法,除了用28-表雷帕霉素代替雷帕霉素,得到24(S),30(S)-四氫-28-表雷帕霉素。
除了用28-表雷帕霉素代替雷帕霉素作為原料,使用常規(guī)方法也可制備28-表-30-二氫雷帕霉素。實(shí)施例7在C24,C30和C7修飾的28-表雷帕霉素類似物的制備使用在先的C7雷帕霉素類似物實(shí)施例中說明的方法,在C7可以修飾實(shí)施例6中制備的24(S),30(S)-四氫化-28-表雷帕霉素。例如7(S)-(2′,4′-二甲氧基苯基)-7-去甲氧基-24(S),30(S)-四氫化-28-表雷帕霉素
將24(S),30(S)-四氫化-28-表雷帕霉素(20mg,0.022mmol)溶于二氯甲烷(1.0mL)。加入1,3-二甲氧基苯(0.20mL,1.5mmol),并將該溶液冷卻到-60℃。加入三氟乙酸(0.030mL,0.39mmol),將該反應(yīng)混合物在60℃攪拌1小時,然后在乙酸乙酯(10mL)和碳酸氫鈉飽和水溶液(1mL)之間分配。將有機(jī)相用水(2mL)和鹽水(1mL)洗滌,用無水硫酸鎂干燥,過濾,并且濃縮。使用閃式層析法(硅膠,15∶75∶50∶200甲醇∶乙酸乙酯∶己烷∶二氯甲烷)回收產(chǎn)品-lit.ref.Luengo,J.I.;Konialian-Beck,A.;Rozamus,L.W.;Holt,D.A.J.Org.Chem.1994,59,6512-6513。
通過相似的方法,可以產(chǎn)生如本申請其它地方公開的,具有其他C7取代基,例如,選擇性地包含取代的芳基基團(tuán),雜芳基,--脂族基,硫醚,或先前對于RC7a或RC7b指定的任何其他類型的基團(tuán)的24(S),30(S)-四氫化-28-表雷帕霉素。通過在C24和C30還原合適的C7 28-表雷帕霉素類似物,或通過變化C24,C30-四氫化-28-表雷帕霉素的C7可以得到這些化合物。說明的例子如下。
在C24 C30和C7修飾的雷帕霉素類似物也可能在本申請論述的各種位置不同于雷帕霉素,例如,關(guān)于一個或多個RC13,RC43,RC28,RC29,R4,”a”等。例如,用13-氟-雷帕霉素代替雷帕霉素得到相應(yīng)的13-氟代類似物。
可以相似地制備的其他典型的化合物包括7-乙氧基-(7-去甲氧基)-24(S),30(S)-四氫化-28-表雷帕霉素7-異丙氧基-(7-去甲氧基)-24(S),30(S)-四氫化-28-表雷帕霉素7-芐氧基-(7-去甲氧基)-24(S),30(S)-四氫化-28-表雷帕霉素7-(7-去甲氧基)-24(S),30(S)-四氫化-28-表雷帕霉素7-甲基氨基甲酸酯(7-去甲氧基)-24(S),30(S)-四氫化-28-表雷帕霉素7-甲氨磺酰胺7-呋喃基-(7-去甲氧基)-24(S),30(S)-四氫化-28-表雷帕霉素7-甲基噻吩-(7-去甲氧基)-24(S),30(S)-四氫化-28-表雷帕霉素7-乙基噻吩-(7-去甲氧基)-24(S),30(S)-四氫化-28-表雷帕霉素7-t叔丁基噻吩-(7-去甲氧基)-24(S),30(S)-四氫化-28-表雷帕霉素7-吲哚基-(7-去甲氧基)-24(S),30(S)-四氫化-28-表雷帕霉素7-o,p-二甲氧基苯基-(7-去甲氧基)-24(S),30(S)-四氫化-28-表雷帕霉素7-(N-甲基吡咯)-(7-去甲氧基)-24(S),30(S)-四氫化-28-表雷帕霉素7-(2,4,6-三甲氧基苯基)-(7-去甲氧基)-24(S),30(S)-四氫化-28-表雷帕霉素實(shí)施例8
關(guān)于對如本申請公開的雷帕霉素類似物起反應(yīng)的基因改造細(xì)胞或動物的核酸結(jié)構(gòu)的設(shè)計的詳細(xì)信息,和關(guān)于這樣的核酸的集合,向細(xì)胞和動物的釋放,和評價,參見例如WO99/36553,其內(nèi)容特別地編入本申請。該文件實(shí)施例8-10公開了使用雷帕霉素在細(xì)胞和動物中激活靶基因轉(zhuǎn)錄的實(shí)例,而其實(shí)施例14公開了使用雷帕霉素在基因改造細(xì)胞中激活信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的用途。那些實(shí)施例也特別地作為參考編入本申請。那些指導(dǎo)可以適合于類似地使用本發(fā)明的28-表雷帕霉素類似物。
權(quán)利要求
1.下式化合物
其中n為1或2;R28和R43獨(dú)立地選自H和取代或未被取代的脂肪族基團(tuán)或?;鶊F(tuán);一個R7a和R7b是H而另一個是鹵素,-RA,-ORA,-SRA,OC(O)RA,-OC(O)NRARB,-NRARB,-NRBC(O)RA,-NRBC(O)ORA,-NRBSO2RA或NRBSO2NRARB′;或R7a和R7b,合起來,是四烯基團(tuán)中的H
其中RA為H或取代或未被取代的脂肪族基團(tuán),雜脂肪族基團(tuán),芳基,雜芳基部分以及其中RB為H,OH或取代或未被取代的脂肪族基團(tuán),雜脂肪族基團(tuán),芳基,或雜芳基部分;
該化合物為基本上純的立體異構(gòu)體或立體異構(gòu)體的混合物,并且作為其藥學(xué)上可接受的衍生物。
2.權(quán)利要求1的化合物,其中n是2。
3.權(quán)利要求1或2的化合物,其中R7a是OMe而R7b是H。
4.權(quán)利要求1-3中任何一項的化合物,其中R28是H。
5.權(quán)利要求1-4中任何一項的化合物,其中R43是H。
6.權(quán)利要求1,2,4或5中任何一項的化合物,其中或者R7a是除-OMe以外的基團(tuán)或者R7b是除H以外的基團(tuán)。
7.權(quán)利要求6的化合物,其中一個R7a和R7b是-NRBC(O)RA,-NRBC(O)ORA,-NRBSO2RA或-NRBSO2NRARB′。
8.權(quán)利要求7的化合物,其中RB是H,OH或烷基。
9.權(quán)利要求1-4和6-8中任何一項的化合物,其中R43是脂族基團(tuán)。
10.權(quán)利要求9的化合物,其中R43選擇性地被烷基基團(tuán)取代。
11.權(quán)利要求10的化合物,其中烷基基團(tuán)是羥基烷基基團(tuán)。
12.權(quán)利要求9的化合物,其中R43選擇性地是取代的烯基基團(tuán)。
13.權(quán)利要求12的化合物,其中烯基基團(tuán)是烯丙基或取代的烯丙基。
14.權(quán)利要求1-4和6-8中任何一項的化合物,其中R43是酰基基團(tuán)。
15.權(quán)利要求14的化合物,其中R43阿是取代的?;鶊F(tuán)。
16.權(quán)利要求15的化合物,其中R43是式RARBN-烷基-C(O)-。
17.權(quán)利要求2的化合物,其中R28和R43是H,R7a是OMe,而R7b是H。
18.權(quán)利要求6-8中任何一項的化合物,其中n是2,而R28和R43是H。
19.權(quán)利要求9-18中任何一項的化合物,其中n是2,R28是H,R7a是OMe,而R7b是H。
20.下式化合物
其中n為1或2;R28和R43獨(dú)立地選自H和取代或未被取代的脂肪族基團(tuán)或?;鶊F(tuán);一個R7a和R7b是H而另一個是鹵素,-RA,-ORA,-SRA,OC(O)RA,-OC(O)NRARB,-NRARB,-NRBC(O)RA,-NRBC(O)ORA,-NRBSO2RA或NRBSO2NRARB′;或R7a和R7b,合起來,是四烯基團(tuán)中的H
其中RA為H或取代或未被取代的脂肪族基團(tuán),雜脂肪族基團(tuán),芳基,或雜芳基部分以及其中RB為H,OH或取代或未被取代的脂肪族基團(tuán),雜脂肪族基團(tuán),芳基,或雜芳基部分;
該化合物為基本上純的立體異構(gòu)體或立體異構(gòu)體的混合物,并且作為其藥學(xué)上可接受的衍生物。
21.權(quán)利要求20的化合物,其中n是2。
22.權(quán)利要求20或21的化合物,其中-OR43為S定向。
23.權(quán)利要求20或21的化合物,其中OR43為R定向。
24.權(quán)利要求20-24中任何一項的化合物,其中R7a是OMe而R7b是H。
25.權(quán)利要求20-24中任何一項的化合物,其中R28是H。
26.權(quán)利要求20-25中任何一項的化合物,其中R43是H。
27.權(quán)利要求20-23或25-26中任何一項的化合物,其中或者R7a是除-OMe以外的基團(tuán)或者R7b是除H以外的基團(tuán)。
28.權(quán)利要求27的化合物,其中一個R7a和R7b是-NRBC(O)RA,-NRBC(O)ORA,-NRBSO2RA或-NRBSO2NRARB′。
29.權(quán)利要求28的化合物,其中RB是H,OH或烷基。
30.權(quán)利要求20-25或27-29中任何一項的化合物,其中R43是脂族基團(tuán)。
31.權(quán)利要求30的化合物,其中脂族基團(tuán)選擇性地被取代的烷基基團(tuán)取代。
32.權(quán)利要求31的化合物,其中烷基基團(tuán)是羥基烷基基團(tuán)。
33.權(quán)利要求30的化合物,其中脂族基團(tuán)選擇性地被取代的烯基基團(tuán)取代。
34.權(quán)利要求33的化合物,其中烯基基團(tuán)是烯丙基或取代的烯丙基。
35.權(quán)利要求20-25或27-29中任何一項的化合物,其中R43是?;?。
36.權(quán)利要求35的化合物,其中R43是取代的?;鶊F(tuán)。
37.權(quán)利要求36的化合物,其中R43是式RARBN-烷基-C(O)-。
38.權(quán)利要求26的化合物,其中R28和R43是H,R7a是OMe,而R7b是H。
39.權(quán)利要求27-29中任何一項的化合物,其中n是2,而R28和R43是H。
40.權(quán)利要求30-39中任何一項的化合物,其中n是2,R28是H,R7a是-OMe,而R7b是H。
41.包含權(quán)利要求1-40中任何一項的化合物和一種或多種藥學(xué)上可接受的載體,稀釋劑或賦形劑的組合物。
42.一種醛醇部分羥基差向異構(gòu)化的方法,其中包括在適宜條件下用四烷氧基鈦試劑與包含羥醛部分的化合物接觸并給予充分的時間使其差向異構(gòu)化。
43.權(quán)利要求42的方法,其中鈦四烷氧基試劑是四異丙醇鈦。
44.權(quán)利要求42或43的方法,其中進(jìn)一步包含差向異構(gòu)化產(chǎn)品的回收。
45.權(quán)利要求42-44中任何一項的方法,其中包含羥醛的化合物是雷帕霉素或雷帕霉素衍生物或類似物。
46.在細(xì)胞中多聚化嵌合蛋白質(zhì)的方法,其中包含(a)提供包含下列物質(zhì)的細(xì)胞(i)編碼與雷帕霉素或其衍生物結(jié)合并且包含至少一個FKBP區(qū)域和至少一個與其異源的蛋白質(zhì)區(qū)域的第一嵌合蛋白的第一重組體核酸,其中FKBP區(qū)域包含選自下列的肽序列
(1)天然存在的FKBP
(2)其中至多10個氨基酸殘基已經(jīng)被刪除,插入,或用取代的氨基酸代替的天然存在的FKBP的變體
(3)通過能夠有選擇性地與編碼FKBP(i)或(ii)的DNA序列雜交的DNA序列編碼的FKBP;(ii)編碼第二嵌合蛋白的第二重組體,該第二嵌合蛋白形成具有(a)雷帕霉素或雷帕霉素類似物和(b)第一嵌合蛋白的配合物,并且包含至少一個FRB區(qū)域和至少一個與其異源的區(qū)域,其中FRB區(qū)域包含選自下列的肽序列
(1)天然存在的FRB區(qū)域,
(2)其中至多10個氨基酸殘基已經(jīng)被刪除,插入,或用取代的氨基酸代替的天然FRB區(qū)域的變體,
(3)通過能夠有選擇性地與編碼FRB(iv)或(v)的DNA序列雜交的DNA序列編碼的FRB區(qū)域;以及(b)用形成包含本身以及第一和第二嵌合蛋白質(zhì)每種的至少一個分子配合物的28-表雷帕霉素類似物接觸該細(xì)胞,其中28-表雷帕霉素類似物具有少于雷帕霉素0.01倍的免疫抑制作用并包含式I的亞結(jié)構(gòu)
具有一種或多種非強(qiáng)制的取代基,在1到8碳之間非強(qiáng)制地具有一個或多個不飽和的碳-碳鍵,該結(jié)構(gòu)是基本上純的立體異構(gòu)體或立體異構(gòu)體的混合物,或其藥學(xué)上可接受的衍生物。
47.在細(xì)胞中多聚化嵌合蛋白質(zhì)的方法,其中包含(a)提供包含下列物質(zhì)的細(xì)胞(i)編碼與雷帕霉素或其類似物結(jié)合并且包含至少一個FKBP區(qū)域和至少一個與其異源的蛋白質(zhì)區(qū)域的第一嵌合蛋白的第一重組體核酸,其中FKBP區(qū)域包含選自下列的肽序列
(1)天然存在的FKBP
(2)其中至多10個氨基酸殘基已經(jīng)被刪除,插入,或用取代的氨基酸代替的天然存在的FKBP的變體
(3)通過能夠有選擇性地與編碼FKBP(i)或(ii)的DNA序列雜交的DNA序列編碼的FKBP;(ii)編碼第二嵌合蛋白的第二重組體,該第二嵌合蛋白形成具有(a)雷帕霉素或雷帕霉素類似物和(b)第一嵌合蛋白的配合物,并且包含至少一個FRB區(qū)域和至少一個與其異源的區(qū)域,其中FRB區(qū)域包含選自下列的肽序列
(1)天然存在的FRB區(qū)域,
(2)其中至多10個氨基酸殘基已經(jīng)被刪除,插入,或用取代的氨基酸代替的天然FRB區(qū)域的變體,
(3)通過能夠有選擇性地與編碼FRB(iv)或(v)的DNA序列雜交的DNA序列編碼的FRB區(qū)域;以及(b)用形成包含本身以及第一和第二嵌合蛋白質(zhì)每種至少一個分子的配合物的28-表雷帕霉素類似物接觸該細(xì)胞,其中28-表雷帕霉素類似物為下式化合物
其中
RC7a和RC7b中一個是H而另一個是,鹵素,-R2,-OR1-SR1,-OC(O)R1,-OC(O)NHR1,NHR1,-NHR1R2,-NHC(O)R1,或-NH-SO2-R1,其中R2=脂族基團(tuán),雜脂族基團(tuán),芳基,雜芳基或烷基芳香基,RC30是鹵素,-OR3或(=O),RC24是=O,=NR4,=NOR4或=NNHR4,-NHOR4或-NHNHR4,-OR4,-OC(O)R4,OC(O)NR4,鹵素或-H,RC14是=O,-OR6,-NR6,-H,-NC(O)R6,-OC(O)R6或-OC(O)NR6R30是H,-R7,-C(O)R7或-C(O)NHR7或橋接C28和C30的環(huán)狀基團(tuán)RC28是鹵素或-OR3RC29是H,OH或OMe其中除非另有陳述,各取代基存在于任何立體化學(xué)取向,并其中R1,R4,R5,R6,R7,R9,R10和R11獨(dú)立地選自H,脂族基團(tuán),雜脂族基團(tuán),芳基或者雜芳基;R8是H,鹵素,-CN,=O,-OH,-NR9R10,OSO2CF3,OSO2F,OSO2R4′,OCOR4′,OCONR4′R5′,或OCON(OR4′)R5′;其中RC13和RC28中一個或兩個是鹵素取代基;RC24和RC30均是除=O以外的基團(tuán);一個RC7a和RC7b是H而另一個是苯基,二或三取代苯基或單或二取代的雜環(huán)基團(tuán);n是1;和/或基團(tuán)“a”是除下式以外的基團(tuán)
該化合物為基本上純的立體異構(gòu)體或立體異構(gòu)體的混合物,或其藥學(xué)上可接受的衍生物。
48.權(quán)利要求47的方法,其中RC13是鹵素。
49.權(quán)利要求48的方法,其中RC13是氟。
50.權(quán)利要求47,48或49的方法,其中RC28是鹵素。
51.權(quán)利要求50的方法,其中RC28是氟。
52.權(quán)利要求47-51中任何一項的方法,其中RC24和RC30是除(=O)以外的基團(tuán)。
53.權(quán)利要求52的方法,其中一個或兩個的RC24和RC30是-OH,-OR1或鹵素。
54.權(quán)利要求47-53中任何一項的方法,其中至少一個RC7a和RC7b是除-OMe以外的基團(tuán)。
55.權(quán)利要求54的方法,其中RC7a和RC7b一個是H而另一個是苯基,二或三取代的苯基或單或二取代的雜環(huán)基團(tuán)。
56.權(quán)利要求54的方法,其中RC7a和RC7b一個是H而另一個是鄰、對二烷氧基苯基或三烷氧基苯基。
57.權(quán)利要求54的方法,其中一個RC7a和RC7b是H而另一個是鄰、對二甲氧基苯基,鄰-甲氧基-對-乙氧苯基,鄰-乙氧基-對-甲氧苯基,鄰、對-二乙氧基苯基,三甲氧基苯基或三乙氧基苯基。
58.權(quán)利要求46-57中任何一項的方法,其中28-表雷帕霉素類似物的免疫抑制作用比雷帕霉素小0.01倍。
59.權(quán)利要求46-49,51,53或55-58中任何一項的方法,其中嵌合蛋白通過包含至少一個FKBP區(qū)域的第一重組體核酸編碼,該FKBP區(qū)域的肽序列包含至多三個相對于天然存在FKBP肽序列的氨基酸置換。
60.權(quán)利要求50的方法,其中嵌合蛋白通過包含至少一個FKBP區(qū)域的第一重組體核酸編碼,該FKBP區(qū)域的肽序列包含一個相對于天然存在FKBP肽序列的氨基酸置換。
61.權(quán)利要求52的方法,其中嵌合蛋白通過包含至少一個FKBP區(qū)域的第一重組體核酸編碼,該FKBP區(qū)域的肽序列包含一個相對于天然存在FKBP肽序列的氨基酸置換。
62.權(quán)利要求54的方法,其中嵌合蛋白通過包含至少一個FKBP區(qū)域的第一重組體核酸編碼,該FKBP區(qū)域的肽序列包含一個相對于天然存在FKBP肽序列的氨基酸置換。
63.權(quán)利要求59的方法,其中嵌合蛋白通過包含至少一個FKBP區(qū)域的第一重組體核酸編碼,該FKBP區(qū)域的肽序列包含一個對于天然存在FKBP肽序列的苯丙氨酸-36的替換氨基酸。
64.權(quán)利要求60-63中任何一項的方法,其中嵌合蛋白通過包含至少一個FKBP區(qū)域的第一重組體核酸編碼,該FKBP區(qū)域的肽序列包含一個對于天然存在FKBP肽序列的苯丙氨酸-36的替換氨基酸。
65.權(quán)利要求46-49,51,53,55-58或60-63中任何一項的方法,其中嵌合蛋白通過包含至少一個FRB的第二重組體核酸編碼,該FRB的肽序列包含至多三個相對于天然存在FRB肽序列的氨基酸置換。
66.權(quán)利要求50的方法,其中嵌合蛋白通過包含至少一個FRB的第二重組體核酸編碼,該FRB的肽序列包含一個相對于天然存在FRB肽序列的氨基酸置換。
67.權(quán)利要求52的方法,其中嵌合蛋白通過包含至少一個FRB的第二重組體核酸編碼,該FRB的肽序列包含一個相對于天然存在FRB肽序列的氨基酸置換。
68.權(quán)利要求54的方法,其中嵌合蛋白通過包含至少一個FRB的第二重組體核酸編碼,該FRB的肽序列包含一個相對于天然存在FRB肽序列的氨基酸置換。
69.權(quán)利要求59的方法,其中嵌合蛋白通過包含至少一個FRB的第二重組體核酸編碼,該FRB的肽序列包含天然存在的FRB肽序列中的一個或多個Tyr2038,Phe2039,Thr2098,Gln2099,Trp2101或Asp2102的替換氨基酸。
70.權(quán)利要求46-69中任何一項的方法,其中至少一個嵌合蛋白質(zhì)包含一個如下作用區(qū)域DNA結(jié)合域,轉(zhuǎn)錄激活區(qū)域或與另一個包含至少一個這樣的信號區(qū)域的蛋白二聚化時引發(fā)生長,增殖,分化或細(xì)胞程序死亡的細(xì)胞信號區(qū)域。
71.權(quán)利要求46-69中任何一項的方法,其中細(xì)胞生長在培養(yǎng)基中并通過在該培養(yǎng)基中加入28-表雷帕霉素類似物而與該28-表雷帕霉素類似物接觸。
72.權(quán)利要求46-69中任何一項的方法,其中細(xì)胞存在于整體有機(jī)體中并通過使用28-表雷帕霉素類似物對該整體有機(jī)體給藥而與該28-表雷帕霉素類似物接觸。
73.權(quán)利要求72的方法,其中細(xì)胞是哺乳動物細(xì)胞而有機(jī)體是哺乳動物。
74.權(quán)利要求73的方法,其中細(xì)胞為靈長類來源的細(xì)胞而有機(jī)體為靈長類。
75.權(quán)利要求74的方法,其中靈長類是人。
76.權(quán)利要求73-75中任何一項的方法,其中28-表雷帕霉素類似物是口服給藥。
77.產(chǎn)生包含式IV亞結(jié)構(gòu)的28表,29表,或28,29雙表化合物的方法,其中包括使式IV化合物處于合適的差向異構(gòu)化條件并從反應(yīng)混合物中回收需要的差向異構(gòu)體
全文摘要
本發(fā)明公開了涉及28-表雷帕霉素的方法和物質(zhì)。
文檔編號A61P37/06GK1371378SQ0081205
公開日2002年9月25日 申請日期2000年8月24日 優(yōu)先權(quán)日1999年8月24日
發(fā)明者楊伍, 謝里爾·A·迪吉茨, 倫納德·羅澤莫斯, 丹尼斯·A·霍爾特 申請人:阿里亞德基因治療公司