專利名稱：：測(cè)量用藥物洗脫支架治療的個(gè)體的血小板反應(yīng)性的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及診斷測(cè)定領(lǐng)域，并且特別涉及用于測(cè)量用藥物洗脫支架(drug-elutingstent)(DES)治療的個(gè)體的血小才反反應(yīng)性(plateletreactivity)的方法和試劑盒。
背景技術(shù)：
：血小板在哺乳動(dòng)物生理學(xué)中的作用是格外多樣的，但它們的主要作用是促進(jìn)止血。在許多情況下，評(píng)價(jià)血液凝結(jié)的能力是期望的，其是常常受血小板粘附和/或聚集能力控制的參數(shù)。因此，重要的是評(píng)估血小板的粘附功能。例如，重要的問(wèn)題包括是否給予會(huì)阻斷或促進(jìn)凝塊形成的藥物，或是否在外科手術(shù)前檢測(cè)血小板功能的缺陷。重要的還有評(píng)價(jià)作為新藥進(jìn)行測(cè)試或在患者中用作批準(zhǔn)的臨床治療的血小板抑制劑的有效性。已知血小板在各種條件下和在許多不同試劑的存在下聚集。血小板聚集是用于描述血小板彼此結(jié)合的術(shù)語(yǔ)。體外血小板聚集依賴于在通過(guò)聚集誘導(dǎo)劑例如凝血酶、ADP或膠原活化后血小板結(jié)合血纖蛋白原(fibrinogen)至其表面上的能力。血小板在維持正常止血中發(fā)揮關(guān)鍵作用。當(dāng)暴露于受損的血管時(shí)，血小板會(huì)粘附于暴露的內(nèi)皮下基質(zhì)。在最初的粘附后，在損傷部位釋放或產(chǎn)生的各種因子(例如凝血酶、凝血酶、ADP和膠原)活化血小板。一旦血小板被活化，在血小板糖蛋白GPIIb/IIIa受體中就發(fā)生構(gòu)象變化，這允許其結(jié)合血纖蛋白原和/或馮維勒布蘭德因子(vonWillebrandfactor)。通過(guò)GPIIb/IIIa受體使多價(jià)血纖蛋白原和/或馮維勒布蘭德因子分子結(jié)合到相鄰血小板上，正是這種結(jié)合使其它血小板募集到受損部位，并且它們的聚集形成了止血塞(hemostaticplug)或血栓。體外血小板集合度測(cè)定(aggregometry)是這樣的實(shí)驗(yàn)室方法，其用于評(píng)估血小板體內(nèi)形成導(dǎo)致初級(jí)止血塞的聚集物的能力。在這種技術(shù)中，將聚集劑(aggregatingagent)例如凝血酶、ADP或膠原加到全血或富含血小板的血漿中，并監(jiān)測(cè)血小板的聚集。血小板集合度測(cè)定是這樣的診斷工具，其可在患者診斷和療法選擇中其輔助作用。測(cè)量血小板聚集的目前測(cè)定是昂貴、費(fèi)時(shí)、繁瑣并通常不適于臨床環(huán)境的。已經(jīng)開發(fā)出快速的血小板功能測(cè)定，并描述在美國(guó)專利5,763，199(Coller)中。所述測(cè)定確定全血中的糖蛋白GPIIb/IIIa受體阻斷(blockade)。當(dāng)用GPIIb/IIIa配體例如血纖蛋白原涂覆的小的聚合物珠子(polymericbead)與含有血小板(其具有活化的未經(jīng)阻斷的GPIIb/IIIa受體)的全血接觸時(shí)，導(dǎo)致所述珠子的凝集。沒有凝集說(shuō)明GPIIb/nia受體沒有活化和/或GPIIb/IIIa受體沒有阻斷。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，加入凝血酶受體活化劑導(dǎo)致足夠快速和便利以在臨床進(jìn)行的測(cè)定，以及如果GPIIb/IIIa受體未被阻斷，則所述測(cè)定導(dǎo)致小的聚合物珠子在便利的已知的時(shí)段內(nèi)凝集。所述測(cè)定包括在不打開收集容器(collectioncontainer)的情況下將待測(cè)試的血液從收集容器中轉(zhuǎn)移到測(cè)定設(shè)備中的能力。這種血小板聚集測(cè)定可與活化凝結(jié)時(shí)間(ACT)同時(shí)進(jìn)行，進(jìn)行所述測(cè)定以評(píng)估肝素化的充足性(ad叫uacy)。血小板聚集在血栓形成和急性冠狀動(dòng)脈疾病的發(fā)病機(jī)理中發(fā)揮重要作用。有證據(jù)暗示，顯著的血小板功能差異存在于對(duì)各種抗血小板劑的應(yīng)答中。也已經(jīng)證明，當(dāng)P2Y12拮抗劑例如氯吡格雷(clopidogrel)用于治療患者以得到抗聚集效果時(shí)，在血小板聚集方面存在個(gè)體間差異。一項(xiàng)研究的結(jié)果表明，在接受所述藥物的患者中至少有10。/。沒有實(shí)現(xiàn)期望的對(duì)血小板聚集的抑制作用(Muller,etal.，Thromb.Haemost.(2003)89(5):783-787)。氯吡格雷和噻氯匹定(ticl叩idine)是抑制血小板聚集的噻吩并吡啶衍生物。認(rèn)為它們抑制5-二磷酸-腺苷(ADP)與其受體之一即P2Y12受體的結(jié)合。氯吡格雷的藥理學(xué)活性與噻氯匹定的藥理學(xué)活性非常相似。然而，已經(jīng)證明氯吡格雷與噻氯匹定相比具有更少的副反應(yīng)。基于有關(guān)氯吡格雷在血栓形成疾病(thromboticdisease)中的效力的確鑿"i正據(jù)，氯吡才各雷和其它P2Y12拮抗劑的使用可能會(huì)顯著增加。因?yàn)樵S多患有心血管疾病的患者目前服用噻吩并吡啶藥物之一，所以檢測(cè)對(duì)噻吩并吡啶的抗藥性和評(píng)估噻吩并吡啶治療的效力的方法將是有益的。因此，需要開發(fā)這樣的測(cè)定，其會(huì)提供關(guān)于阿司匹林和噻吩并吡啶(例如氯吡格雷或噻氯匹定)在給定患者中的治療敏感度和效力的信息。已經(jīng)用使用ADP、膠原或其它血小板活化劑的血小板集合度測(cè)定評(píng)估了這些藥物對(duì)血小板功能的作用。然而，因?yàn)锳DP活化至少兩種不同的受體(P2Y1和P2Y12以及還可能有P2X1)，所以其具有降低特異性和背景噪音的潛能。膠原是另一種選擇。然而，由于膠原的四級(jí)結(jié)構(gòu)(這顯著影響了其活化血小板的能力)和由于膠原源自生物組織并且對(duì)溫度和pH的微小變化敏感這一事實(shí)，膠原是高度可變的。膠原或ADP都不能提供對(duì)P2Y12受體的特異性，因此它們本身不是用于確定P2Y12抑制劑效果的最佳選擇。特別是如在幾項(xiàng)研究中所已經(jīng)證明的那樣，對(duì)這兩種激動(dòng)劑濃度的選擇顯著影響所測(cè)量的P2Y12拮抗劑的抑制程度。前列腺素(pg)屬于已知為類二十烷酸的普遍存在的一類化學(xué)物質(zhì)。在身體的幾乎每種組織中都發(fā)現(xiàn)了它們，并且它們具有非常廣譜的生物活性。類二十烷酸是花生四烯酸(一種多不飽和脂肪酸)的衍生物。術(shù)語(yǔ)類二十烷酸包括如下家族前列腺素(pg)家族、前列環(huán)素家族、血^r烷家族和白三烯家族。根據(jù)pg的結(jié)構(gòu)將它們分成不同的家族，每個(gè)家族用字母(a、E、f、g、h或i)命名。除了所述字母，每種單獨(dú)的前列腺素帶有一個(gè)數(shù)字，其表明在所述前列腺素的脂肪酸側(cè)鏈中的雙鍵數(shù)目。例如，前列腺素E1(PGE1)屬于E家族并在其側(cè)鏈中僅具有一個(gè)雙鍵。pg在血小板聚集和止血(血液凝結(jié))中發(fā)揮重要作用，并且通常具有顯著的血管舒張劑作用。PGE1是二高-y-亞麻酸(dihomo-Y陽(yáng)linolenicacid,DGLA)的理論環(huán)加氧酶代謝產(chǎn)物，但是其在正常人類或其它動(dòng)物的血漿中實(shí)際上是檢測(cè)不到的。其藥理學(xué)作用包括血管舒張、低血壓和抗血小板活性。已經(jīng)證明，PGE1通過(guò)增力。血小板中的環(huán)磷月泉苦(cyclicadenosinemonophosphate,CAMP)濃度來(lái)抑制血小板聚集。許多團(tuán)隊(duì)已經(jīng)證明，PGE1抑制ADP誘導(dǎo)的人血小板聚7隹AATrCAA々A/IA—IV/T呆"V丄LJU乂V少7寸U11丄V丄。對(duì)血小板反應(yīng)性進(jìn)行的研究已經(jīng)證明了在對(duì)氯吡格雷的抑制性應(yīng)答中有廣泛的個(gè)體間差異?；仡櫺匝芯亢托〉那罢靶匝芯恳呀?jīng)證明了對(duì)氯吡格雷的差的應(yīng)答與經(jīng)皮冠^l犬動(dòng)月永介入(percutaneouscoronaryintervention,PCI)后的臨床事件(clinicalevent)之間的關(guān)聯(lián)。與氯吡格雷所致的聚集減少(通過(guò)對(duì)ADP的應(yīng)答的減少百分比來(lái)判斷)不同，氯吡格雷后的血小板聚集(即治療后的反應(yīng)性)的絕對(duì)值可能是對(duì)隨后事件風(fēng)險(xiǎn)的充分測(cè)量。從臨床觀點(diǎn)來(lái)看，在PCI時(shí)對(duì)血小板反應(yīng)性進(jìn)行常規(guī)測(cè)量通常是不實(shí)際的，這是因?yàn)樾枰褂脤ｉT的實(shí)驗(yàn)室技術(shù)例如透光率集合度測(cè)定(LTA)。藥物洗脫支架(DES)是放置到變窄的患病的冠狀動(dòng)脈中的金屬架，所述金屬架將藥物逐漸直接釋放至動(dòng)脈壁，從而阻斷細(xì)胞增殖。如目前在臨床實(shí)踐中所使用的那樣，術(shù)語(yǔ)"藥物洗脫支架"指的是這樣的金屬支架，所述金屬支架洗脫出被指定用于限制新血管內(nèi)膜瘢痕組織(neointimalscartissue)生長(zhǎng)的藥物，從而減少再狹窄(即安裝有支架的動(dòng)脈的阻斷)的可能性。就治療先天性冠狀動(dòng)月永變窄(nativecoronaryarterynarrowing)而言，目前臨床使用的藥物洗脫支架已經(jīng)被證明是統(tǒng)計(jì)學(xué)上優(yōu)于棵金屬支架(bare-metalstent)(BMS)的，其具有嚴(yán)重有害心臟事件(將其定義為死亡的復(fù)合臨床終點(diǎn)(compositeclinicalendpoint))的4交"f氐發(fā)生率、心月幾才更塞(myocardialinfarction)的較低發(fā)生率和再狹窄所需反復(fù)介入的較低發(fā)生率。盡管對(duì)于藥物洗脫支架來(lái)說(shuō)較不常見，但DES仍然可能發(fā)生新血管內(nèi)膜增殖(neointimalproliferation)并造成再狹窄。例如，在所述過(guò)程中、在所("支架血栓形成(stentthrombosis)，，)。用抗血栓藥物例如阿司匹林和氯吡格雷進(jìn)行的治療似乎減少血栓形成的風(fēng)險(xiǎn)，并且已經(jīng)證明在構(gòu)建藥物洗脫支架后早早停用這些藥物中的一種或兩種將顯著增加支架血栓形成和心肌梗塞的風(fēng)險(xiǎn)(Iakovou,etal"JAMA(2005)293(17):2126-2130)。如上所述，不同的個(gè)體在對(duì)抗血栓藥物例如氯吡格雷的血小板抑制性應(yīng)答中存在廣泛的差異。因此，急需提供用于測(cè)量用藥物洗脫支架(DES)治療的個(gè)體的血小板反應(yīng)性的方法。本發(fā)明的目的是提供測(cè)量用藥物洗脫支架(DES)治療的個(gè)體的血小板反應(yīng)性的方法。本發(fā)明的另一目的是提供識(shí)別用DES治療而處于支架血栓形成風(fēng)險(xiǎn)中的個(gè)體的方法。本發(fā)明另一目的是提供測(cè)量在用DES治療的個(gè)體中的氯吡格雷誘導(dǎo)的對(duì)血小板反應(yīng)性的抑制作用的方法。本發(fā)明的這些目的和其它目的在測(cè)量用DES治療的個(gè)體的血小板反應(yīng)性的方法中實(shí)現(xiàn)。首先，從用DES和P2Y12拮抗劑治療的個(gè)體中得到血液樣品。然后，將所述血液樣品與含有附著的GPIIb/IIIa受體配體(attachedGPIIb/IIIareceptorligand)的顆粒、二磷酸腺苷(ADP)和前列腺素E1(PGE1)混合。將所述混合物在適于使顆粒凝集的條件下培養(yǎng)，并且在所述混合物中評(píng)估血小板介導(dǎo)的凝集。凝集的缺失或減少表明用DES和P2Y12拮抗劑治療的個(gè)體具有降低的血小板反應(yīng)性。另一個(gè)實(shí)施方案提供了測(cè)量具有DES的PCI患者的血小板反應(yīng)性的可選擇方法。從所述患者中得到血液樣品。將所述血液樣品與如下物質(zhì)混合成組合(combination):l)抗湊是劑；2)足以將抗;疑4匕血液(anticoagulatedblood)的pH和鹽濃度維持在適于血小板聚集的范圍內(nèi)的緩沖液；3)固定在固體表面上的血小板GPIIb/IIIa受體配體；4)一種或多種增強(qiáng)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的藥物；和5)受體活化劑。將所述組合在用于使顆粒凝集的條件下培養(yǎng)。在所述混合物中評(píng)估血小板介導(dǎo)的凝集。凝集的缺失表明所述患者具有降低的形成血小才反血4全(plateletthrombi)的能力。另一個(gè)實(shí)施方案提供了測(cè)量具有DES的患者的血小板反應(yīng)性的方法。將ADP血小板活化劑加入到得自所述患者的血液樣品中。向所述樣品中提供一種或多種血小板抑制劑。所述血小板抑制劑中的至少一種為前列腺素H1(PGE1)。在對(duì)提供ADP血小板活化劑和一種或多種血小板抑制劑的應(yīng)答中產(chǎn)生了交替信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑(alternatesignaltransductionpathway)。在對(duì)產(chǎn)生所述交替信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的應(yīng)答中，ADP的最終濃度為約2至35|aM，以及PGE1的最終濃度為約2至30nM。在對(duì)最終濃度的ADP的應(yīng)答中測(cè)量所述患者的血小板反應(yīng)性。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案提供了識(shí)別用DES治療而處于支架血栓形成風(fēng)險(xiǎn)中的個(gè)體的方法。首先，從用DES和P2Y12拮抗劑治療的個(gè)體中得到血液樣品。然后，將所述血液樣品與含有附著的GPIIb/IIIa受體配體的顆粒、二磷酸腺苷(ADP)和前列腺素E1(PGE1)混合。將所述混合物在適于使顆粒凝集的條件下培養(yǎng)，并在所述混合物中評(píng)估血小板介導(dǎo)的凝集。凝集的缺失或減少表明用DES和P2Y12拮抗劑治療的個(gè)體具有降低的血小板反應(yīng)性?；谘“宸磻?yīng)性的水平對(duì)個(gè)體的支架血栓形成的風(fēng)險(xiǎn)水平作出評(píng)估。另一個(gè)實(shí)施方案提供了識(shí)別具有DES的處于支架血栓形成風(fēng)險(xiǎn)中的患者的方法。從所述患者中得到血液樣品。將所述血液樣品與如下物質(zhì)混合成組合l)抗凝劑；2)足以將抗凝化血液的pH和鹽濃度維持在適于血小板聚集的范圍內(nèi)的緩沖液；3)固定在固體表面上的血小板GPIIb/IIIa受體配體；4)一種或多種增強(qiáng)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的藥物；以及5)受體活化劑。將所述組合在用于使顆粒凝集的條件下培養(yǎng)。凝集的缺失表明所述患者具有降低的形成血小板血栓的能力。測(cè)量患者的血小板反應(yīng)性。在對(duì)所述測(cè)量的應(yīng)答中確定所述患者的支架血栓形成的風(fēng)險(xiǎn)水平。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案提供了測(cè)量在用DES治療的個(gè)體中的氯吡格雷誘導(dǎo)的對(duì)血小板反應(yīng)性的抑制作用的方法。首先，從用DES和氯吡格雷治療的個(gè)體中得到血液樣品。然后，將所述血液樣品與含有附著的GPIIb/IIIa受體配體的顆粒、二磷酸腺苷(ADP)和前列腺素E1(PGE1)混合。將所述混合物在適于使顆粒凝集的條件下培養(yǎng)，以及在所述混合物中評(píng)估血小板介導(dǎo)的凝集。凝集的缺失或減少表明用DES和氯吡格雷治療的個(gè)體具有降低的血小板反應(yīng)性。另一個(gè)實(shí)施方案提供了確定患者是否具有氯吡格雷誘導(dǎo)的對(duì)血小板的抑制作用的可選擇方法。從所述患者中得到血液樣品。將所述血液樣品與如下物質(zhì)混合成組合l)抗凝劑；2)足以將抗凝化血液的pH和鹽濃度維持在適于血小板聚集的范圍內(nèi)的緩沖液；3)固定在固體表面上的血小板GPIIb/IIIa受體配體；4)一種或多種增強(qiáng)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的藥物；以及5)受體活化劑。將所述組合在用于使顆粒凝集的條件下培養(yǎng)。在所述混合物中評(píng)估血小板介導(dǎo)的凝集。凝集的缺失表明患者具有降低的形成血小板血栓的能力。測(cè)量所述患者的血小板反應(yīng)性。然后確定所述患者是否具有氯吡格雷誘導(dǎo)的對(duì)血小板的抑制作用。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案提供了一種試劑盒，所述試劑盒用于測(cè)量P2Y12受體拮抗劑對(duì)血小板聚集的抑制作用，所述試劑盒包括固定在顆粒上的GPIIb/IIIa受體配體、二磷酸腺苷(ADP)和前列腺素E1(PGE1)。另一個(gè)實(shí)施方案還提供了抗凝劑和將抗凝化血液維持在適于血小板聚集的條件下的緩沖液。圖1說(shuō)明了來(lái)自用P2Y12受體拮抗劑治療的血液樣品的血小板聚集程度，其通過(guò)本發(fā)明的測(cè)定來(lái)測(cè)量。圖2顯示了在實(shí)施例3(CABG為冠狀動(dòng)脈旁路移植(coronaryarterybypassgrafting);PCI為經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入；SES為西羅莫司(sirolimus)洗脫支架)中描述的臨床研究的流程圖。圖3說(shuō)明了用于VERIFYNOWP2Y12測(cè)定的接收器工作特性(receiver-operatingcharacteristic,ROC)曲線。，見察到0.711的曲線下面積(P=0.03)。圖4說(shuō)明了在具有高治療后反應(yīng)性和不具有高治療后反應(yīng)性的患者中沒有醫(yī)院外心血管死亡、非致死性心肌梗塞和支架血栓形成的存活率。具體實(shí)施例方式的普通技術(shù)人員所通常理解的含義相同的含義。將本文提到的所有專利、專利申請(qǐng)(公開的或未公開的)和其它出版物完整并入作為參考。如果在本節(jié)中陳述的定義與在并入本文作為參考的專利、申請(qǐng)、公開的申請(qǐng)和其它出版物中陳述的定義相反或不一致，則在本節(jié)中陳述的定義優(yōu)先于在并入本文作為參考的專利、申請(qǐng)、公開的申請(qǐng)和其它出版物中陳述的定義。對(duì)出版物或文獻(xiàn)的引用不是意在認(rèn)可任意這樣的出版物或文獻(xiàn)為相關(guān)的現(xiàn)有技術(shù)，也不構(gòu)成對(duì)這些出版物或文獻(xiàn)的內(nèi)容或日期的認(rèn)可。本文使用的"一個(gè)(種)"是指"至少一個(gè)(種)"或"一個(gè)(種)或多個(gè)(種)"。本文使用的術(shù)語(yǔ)"個(gè)體"不限于具體的物種或樣品類型。例如，術(shù)語(yǔ)"個(gè)li體，，可以指的是患者，并且通常指的是人類患者。然而，該術(shù)語(yǔ)不限于人類，因此涵蓋各種哺乳動(dòng)物物種。本文使用的"治療"是指其中病癥、紊亂或疾病的癥狀得以改善或有益改變的任意措施。治療也涵蓋本文組合物的任意藥學(xué)使用。本文使用的術(shù)語(yǔ)"評(píng)估"指的是任意形式的測(cè)量，并且包括確定要素(dement)是否存在。術(shù)語(yǔ)"評(píng)估"、"確定"、"測(cè)量"、"評(píng)價(jià)"和"測(cè)定，，可互換使用，并且既包括定量確定也包括定性確定。因此，術(shù)語(yǔ)"評(píng)估"既涵蓋確定某物的存在量，也涵蓋確定其是否存在。本文使用的術(shù)語(yǔ)"血d、板反應(yīng)性，，指的是在對(duì)損傷和/或化學(xué)刺激物的應(yīng)答中血小板的活化。血小板聚集是對(duì)血小板反應(yīng)性的最常見測(cè)量。因此，本文使用的術(shù)語(yǔ)"血小板反應(yīng)性，，寬泛地指在對(duì)血小板活化劑(例如ADP、凝血酶、膠原等)的應(yīng)答中血小板的聚集。本文使用的術(shù)語(yǔ)"藥物洗脫支架"或"DES"指的是通常由金屬或復(fù)合材料制成的支架(即可張開的架)，所述支架涂覆有已知可干擾再狹窄(動(dòng)脈的再阻斷)過(guò)程的藥物。該術(shù)語(yǔ)不限于任意具體的藥物洗脫支架。例如，其涵蓋CYPHERtm西羅莫司洗脫支架(Cordis)、TAXUStm紫杉醇(paclitaxel)洗脫支架(BostonScientific),ENDEAVORABT-578洗脫支架(Medtronic)、XIENCETM依維莫司(everolimus)洗脫支架(Abbott)等。本文^吏用的術(shù)語(yǔ)"支架血^全形成1皮定義成如AcademicResearchConsortium(ARC)(Mauri,etal.，N.Engl.J.Med.(2007)356:1020-1029)所提出的那樣。所述ARC定義包括具有"確定的"、"很可能的(probable)"和"可能的(possible)，，支架血栓形成的患者。當(dāng)通過(guò)血管造影術(shù)得以確認(rèn)時(shí)或當(dāng)對(duì)急性血栓形成作出病理確認(rèn)時(shí)，將支架血栓形成定義為"確定的"。將"很可能的"支架血栓形成定義為30天內(nèi)的不明原因的死亡，或定義為在血栓形成沒有血管造影確認(rèn)的情況下靶血管的心肌梗塞(MI)。將"可能的，，支架血栓形成定義為30天后的不明原因的死亡。本文使用的"急性，，支架血栓形成指的是在經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入(PCI)的24小時(shí)內(nèi)發(fā)生的支架血栓形成；"亞急性"支架血栓形成指的是在PCI后的1至30天內(nèi)發(fā)生的支架血栓形成；以及"遲發(fā)性"支架血栓形成指的是晚于PCI后的30天發(fā)生的支架血栓形成。如上所述，本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案提供了測(cè)量用DES治療的個(gè)體的血小板反應(yīng)性的方法。另一個(gè)實(shí)施方案提供了識(shí)別那些用DES治療而處于支架血栓形成風(fēng)險(xiǎn)中的個(gè)體的方法。另一個(gè)實(shí)施方案提供了測(cè)量在用DES治療的個(gè)體中的氯吡格雷誘導(dǎo)的對(duì)血小板的抑制作用的方法。在本發(fā)明的各種實(shí)施方案中，在測(cè)量全血樣品中P2Y12拮抗劑(諸如噻吩并吡啶)對(duì)血小板聚集的抑制作用中將ADP和PGE1的組合物用作活化劑。因此，前述組合物可用于確定涉及用噻吩并吡啶對(duì)患者進(jìn)行治療的抗血小板療法的有效性。上述組合物可與如下物質(zhì)聯(lián)用涂覆有GPIIb/IIIa受體配體的顆粒和對(duì)p塞吩并吡咬的效力進(jìn)行測(cè)定所需的任意其它試劑?？墒箁nT一/—厶1_-^".1/,rt入丄/_'丄-/,n八丄乙>4"|入l、丄-。1L/L>士,l/,n人屯S丄二tV_"iir乂t)^卞丁日'、JTAWJ5iL3、H"，〃IA5且3~f乂。_i~A/3'HWJ且a"和矛貝丼乂。杜一？Pf措施中，將待測(cè)量的計(jì)量體積的樣品(例如全血)與所述凍干的試劑機(jī)械混合。監(jiān)測(cè)光透過(guò)(lighttransmission)的變化，并計(jì)算血小板活性指數(shù)。在一個(gè)方面，將全血樣品與前述凍干的試劑在小容器(cuvette)或組合筒(unitizedcartridge)中混合?？墒褂醚b置來(lái)進(jìn)行所述測(cè)定。所述裝置包含用于接受所述樣品的孔，其中所述孔含有所述凍干的試劑和用于進(jìn)行所述測(cè)定的其它試劑。所述其它試劑可以是各種緩沖液和/或凍干穩(wěn)定劑。如上所述，本發(fā)明的一個(gè)方面涉及對(duì)全血樣品進(jìn)行血d、板功能活性測(cè)定的方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述樣品是已經(jīng)被5-磷酸-腺苷(ADP)拮抗劑影響的樣品。例如，所述樣品可來(lái)自用5-磷酸-腺苷(ADP)拮抗劑進(jìn)行治療的患者。就本發(fā)明而言，在測(cè)定介質(zhì)中提供組合，其中所述組合包含ADP年，pn口i^!々n入/^"f"gfr;i41旦壹ArDAA罷4夂、:化，53《，，A/f^r';去，為15至20jiM，以及PGE1的最終濃度為2至30nM,優(yōu)選為20至25nM。士^r'n卜1+,、+一"';乂志rtl7A'、爪房古"TT乂P入/UiAA繭石一夫糸)g斤；末yfp物可導(dǎo)致血小板的特異性凝集，即血小板由于血小板上的受體和顆粒上的化合物之間的特異性相互作用而凝集。所述化合物包括(為了說(shuō)明而非限制)針對(duì)血小板受體的抗體和GPIIb/IIIa受體配體，所述化合物可以是與血小板表面上的GPIIb/IIIa受體結(jié)合、絡(luò)合或相互作用的小的有機(jī)分子、多肽、蛋白質(zhì)、單克隆抗體或核酸。當(dāng)血小板表面上GPIIb/IIIa受體與顆粒上的GPIIb/IIIa受體配體結(jié)合、絡(luò)合或相互作用時(shí)，導(dǎo)致血小板介導(dǎo)的顆粒聚集。典型的GPIIb/IIIa配體包括血纖蛋白原、單克隆抗體10E5(Colter,etal.,J.Clin.Invcst.(1983)72:325)、單克隆抗體c7E3(TheEPICInvestigators,N.E.JournalofMed.(1994)330:956)、馮維勒布蘭德因子、纖連蛋白、玻連蛋白和具有精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)序列的其它配體或模擬該序列的其它肽或仿肽(peptidomimetic)(Cook，etal.,DrugsoftheFuture(1994)19:135)。其它重要的4匕合物包括凝血酶抑制劑、低分子量肝素等。所述化合物所附著的顆粒為至少約O.lp,并且不大于約20n。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述顆粒為約O.lia至約10(i。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述顆粒為至少約lp，并且小于約8(i。所述顆?？蓪?shí)際上是任意形狀，但通常為具有均勻直徑的球形。所述顆?？删哂腥我饷芏?，但優(yōu)選具有接近水的密度，通常為約0.7至約1.5g/ml。所述顆粒可在表面上帶有或不帶有電荷，所述電荷可以是正電荷或負(fù)電荷，優(yōu)選為負(fù)電荷。所述顆粒被功能化或是可功能化的，從而被動(dòng)地將上述部件(member)直接或間接地結(jié)合或附著在它們表面上。所述顆粒可以是固體(例如由有機(jī)和無(wú)機(jī)聚合物或膠乳構(gòu)成)、小油滴(例如烴、氟碳化合物、有機(jī)硅(silicon)流體)或小嚢泡(例如合成嚢泡諸如磷脂嚢泡或天然嚢泡諸如細(xì)胞(cell)和細(xì)胞器(organelle))。所述固體顆粒通常為聚合物(加聚物或縮聚物)，其在液體介質(zhì)中是可容易分散的?？蓱腋☆w粒(suspendableparticle)的實(shí)例為聚合物材料例如膠乳、脂質(zhì)雙層、小油滴、細(xì)胞(cell)和水凝膠。其它顆粒組分包括聚合物，例如硝化纖維素、乙酸纖維素、聚氯乙烯、聚丙烯酰胺、聚丙烯酸酯(鹽)、聚乙烯、聚丙烯、聚(4-曱基丁烯)、聚苯乙烯、聚曱基丙烯酸酯(鹽)、聚對(duì)苯二曱酸乙二酯、尼龍、聚丁酸乙烯酯、多糖(例如葡聚糖和改性葡聚糖)等；它們可單獨(dú)使用或與其它材料聯(lián)用。所述固體顆粒可由以下物質(zhì)構(gòu)成聚苯乙烯、聚丙烯酰胺、丙烯酸酯(鹽)衍生物(特別是酯和酰胺)和甲基丙烯酸酯(鹽)衍生物(特別是酯和酰胺)的均聚物和共聚物、硅氧烷等。如上所述，將所述化合物涂覆在所述顆粒上。通常，所述化合物被動(dòng)地與顆粒結(jié)合。這樣的被動(dòng)結(jié)合可通過(guò)一般可在文獻(xiàn)中得到的公知技術(shù)來(lái)咒成。參見如H口ImmobilizedEnzymes,IchiroChibata，HalstedPress,NewYork(1978)和Cuatrecasas,J.Biol.Chem.(1970)245:3059。簡(jiǎn)言之，如上所述，顆粒的表面可以是多功能的或可被多功能化。很多種官能團(tuán)是可用的或可被引入。官能團(tuán)包括羧基、醛基、氨基、氰基、亞乙基(ethylenegroup)、羥基、巰基等。使很多種化合物與表面連接的方式是公知的并在文獻(xiàn)(參見如上)中得以充分的說(shuō)明。側(cè)部件的連接可通過(guò)鍵來(lái)直接實(shí)現(xiàn)或通過(guò)居間的連接基來(lái)間接實(shí)現(xiàn)。連接基的長(zhǎng)度可變化很大，這取決于側(cè)部件的性質(zhì)和顆粒的性質(zhì)。在化合物分子與顆粒的連接中控制化合物分子與顆粒的比例。在一種方法中，可通過(guò)對(duì)引入到顆粒表面上的位點(diǎn)的數(shù)目進(jìn)行調(diào)整來(lái)控制顆粒表面上的經(jīng)官能化的所述位點(diǎn)的數(shù)目?？蛇x擇地或與上述方法結(jié)合，可通過(guò)與顆粒的比例。鑒于上述教導(dǎo)，其它方法對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯見的。本發(fā)明使用的顆粒試劑可以用足量的物質(zhì)處理以阻斷顆粒上的吸附區(qū)域。所述物質(zhì)不會(huì)影響顆粒就它們?cè)诒景l(fā)明中的預(yù)期目的而言所發(fā)揮的功能。所述阻斷物質(zhì)包括蛋白質(zhì)(例如牛血清白蛋白、牛血清丙種球蛋白等)、多糖(例如葡聚糖等)等。在可與上述方法聯(lián)用的另一種方法中，使用如下顆粒，其中經(jīng)官能化的用于連接的位點(diǎn)的數(shù)目基本上減少了顆粒表面上的吸附區(qū)域。所述顆粒通常包含標(biāo)記物(label)，其附著在所述顆粒上或結(jié)合在所述顆粒中。所述標(biāo)記物可以是可用于檢測(cè)目的的任意部分(moiety)。所述標(biāo)記物常常是信號(hào)產(chǎn)生系統(tǒng)(signalproducingsystem)的部件。所述標(biāo)記物能夠被直接或間接地檢測(cè)。所述標(biāo)記物可以是同位素的或非同位素的，通常是非同位素的，并且可以是染料、熒光分子、化學(xué)發(fā)光分子、催化劑(例如酶)、對(duì)催化劑進(jìn)行編碼的多核苷酸、啟動(dòng)子、輔酶、酶底物、放射性基團(tuán)、小的有機(jī)分子、可擴(kuò)增的多核苷酸序列等。在本發(fā)明的一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述顆粒含有一種或多種在紅外線中有吸收的染料。這樣的染料包括菌綠素(bacterioehlorin)、細(xì)菌葉綠素(bacheriochlorophytin)、meropolymethinedye、苯并輪烯類(benzoannulene)、插烯的口卜p林(vinylogousporphyrin)、多次曱基染料(polymethinedye)、花青(cyanine)和部花青(merocyanine)等。重要的具體染料是四叔丁基-四(二曱基氨基)-29H-31H-酞菁銅(II)(copper(II)-tetra-tert-butyl-tetrakis(dimethylamino)-29H-31H-phthalocyanine)和四叔丁基-四(二曱基氨基)-MH-31H-酞菁氧釩15(vanadyl-tetra-tent-butyl-tetrakis(dimethylamino)-29H隱31H-phthalocyanine)。戶斤選擇的具體染料具有便利、可用、穩(wěn)定、與所述顆粒相容等性質(zhì)之一?？赏ㄟ^(guò)聚合或被動(dòng)吸附而將這些染料直接引入到顆粒本身中。所述染料可以是逐一負(fù)載的(即順序負(fù)載)或是組合負(fù)載的(即同時(shí)負(fù)載)。可選擇地，所述染料可與連接組分一起與珠子連接，從而使它們不會(huì)從表面滲出。不論使用哪種負(fù)載方法，條件是顆粒表面就在合適條件下凝集的能力而言是不受影響的。所述染料吸收在約750-900nm的紅外線范圍內(nèi)特別是在約750-850nm的范圍內(nèi)的光。對(duì)于具有高水平紅細(xì)胞的樣品來(lái)說(shuō)，所述光為約800士10nm,其對(duì)于氧合血紅蛋白和還原血紅蛋白來(lái)說(shuō)是等吸光點(diǎn)。與顆粒一起使用的染料的量隨染料在重要光范圍(lightrange)內(nèi)的消光系數(shù)、測(cè)定所需的靈敏度、顆粒的尺寸、染料與顆粒的結(jié)合模式、染料與顆粒基質(zhì)的相容性等而變化。通常，所結(jié)合的染料的量其范圍為約1至20%重量，更常見是5至15%重量。在本發(fā)明中具有具體用途的染料是酞菁。不含金屬的酞菁在約700nm處有吸收(e二162,000)。與不含金屬的酞菁相比，金屬絡(luò)合物使吸收移向較短的波長(zhǎng)或較長(zhǎng)的波長(zhǎng)，大多數(shù)金屬使吸收移向非常較短的波長(zhǎng)，但是一些金屬(例如鉛)在非常較長(zhǎng)的波長(zhǎng)處有吸收。過(guò)渡金屬和酞菁形成的絡(luò)合物(金屬酞菁(metollophthalocyanine)和n]etallonaphthalocyanine)化學(xué)上對(duì)光和熱是非常穩(wěn)定的。它們通過(guò)在合適金屬的存在下對(duì)鄰笨二曱腈進(jìn)行縮合來(lái)形成。用于形成所述金屬酞菁的一些金屬除銅(Cu)和釩(V)外還有鎂(Mg)、鋅(Zn)和鈷(Co)。在本發(fā)明的一個(gè)具體的實(shí)施方案中使用具有平坦最大吸收值的羧化微粒。這些微粒通過(guò)結(jié)合在805nm處附近具有不同最大吸收值的多種染料來(lái)制備。這得到跨越寬范圍波長(zhǎng)(780-820nm)的平坦最大吸收譜。所述樣品可以是待分析的任意溶液(合成的或天然的)，其中所述樣品已經(jīng)接受P2Y12拮抗劑(特別是噻吩并吡啶)(其可能與阿司匹林聯(lián)用)的作用。術(shù)語(yǔ)樣品包括來(lái)自宿主的生物組織(包括體液)等。可直接對(duì)所述樣品進(jìn)行檢查，或可如通常那樣對(duì)其進(jìn)行預(yù)處理。本發(fā)明具體用于包含血小板的樣品，所述樣品包括體液例如全血、含有血小板的血液組分例如血漿等。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明具體用于全血樣品。所述樣品的量取決于所述樣品的性質(zhì)。就流體樣品例如抗凝化全血(wholeanticoagulatedblood)而言，所述樣品的量通常為約30^1至5ml，優(yōu)選為約100至300^1。術(shù)語(yǔ)"樣品"包括直接來(lái)自患者的未經(jīng)加工的樣品或已在任意便利的液體介質(zhì)(通常是含水介質(zhì)(例如含有枸櫞酸鈉的含水介質(zhì)))中經(jīng)預(yù)處理和制備的樣品。優(yōu)選地，本發(fā)明用于進(jìn)行所述測(cè)定的介質(zhì)是含水介質(zhì)。其它極性共溶劑也可用在介質(zhì)中，其通常是具有1-6個(gè)碳原子的氧合有機(jī)溶劑(oxygenatedorganicsolvent),更通常是具有1-4個(gè)碳原子的氧合有機(jī)溶劑，包括醇、醚等。通常，所述共溶劑以小于約70%重量的量存在，更通常以小于約30%重量的量存在。此外，在本發(fā)明方法中常常使用各種輔助物質(zhì)。例如，緩沖劑一般存在于測(cè)定介質(zhì)中，以及存在有針對(duì)測(cè)定介質(zhì)和測(cè)定組分的穩(wěn)定劑、表面活性劑(特別是非離子型表面活性劑)、結(jié)合增強(qiáng)劑(例如聚亞烷基二醇)等。所述介質(zhì)的pH通常在約2至約11的范圍內(nèi)，優(yōu)選為約4至約9?？墒褂酶鞣N緩沖液以實(shí)現(xiàn)所期望的pH并且在所述方法中維持所述pH。示例性緩沖液包括HEPES緩沖液、硼酸鹽緩沖液、磷酸鹽緩沖液、碳酸鹽緩沖液、Tris(三羥曱基氨基甲烷)緩沖液、巴比妥(barbital)緩沖液等。所使用的具體緩沖液就所述方法而言不是至關(guān)重要的，但一種緩沖液在某些情況下與其它緩沖液相比可能是優(yōu)選的。在一些情況下，HEPES是優(yōu)選的，并以約.05M至約lmM的濃度存在，但通常以約0.01M的濃度存在。測(cè)定介質(zhì)的體積為約25^1至約500^1,通常為約75pl至約250^1。所述測(cè)定可在任意合適的容器中進(jìn)行。便利地，所述容器為小容器或筒，其與進(jìn)行所述測(cè)定并對(duì)測(cè)定結(jié)果進(jìn)行測(cè)量的設(shè)備一起使用。所述反應(yīng)容器通常含有本發(fā)明的呈干燥凍干形式的活化引發(fā)劑及其它試劑(例如顆粒試劑等)、穩(wěn)定劑等。將樣品和顆粒試劑的組合在適于使顆粒凝集的條件下培養(yǎng)。通常使用適于進(jìn)行所述方法的溫度。所述溫度可以是恒定的或可以是變化的。通常，在反應(yīng)步驟中使用恒定的溫度。所使用的溫度通常為約10至約80°C,更通常為約15至約45。C，優(yōu)選地，所述溫度應(yīng)為至少25°C，更優(yōu)選在約30至約40。C的范圍內(nèi)，通常約為37。C。確定顆粒的凝集程度，且所述程度與樣品中P2Y12拮抗劑的存在和/或)而視覺確定，其中顆粒的聚集可表明凝集。優(yōu)選地，如上所述，可對(duì)顆粒進(jìn)行著色以有助于使基質(zhì)的凝集或聚集可視化。凝集的程度可通過(guò)觀察介質(zhì)的光密度(optical(turbidimetrically)、t匕5蟲〉去(nephelometrically)等來(lái)觀'J量。在本發(fā)明的一個(gè)具體的實(shí)施方案中，對(duì)來(lái)自用噻吩并吡啶進(jìn)行治療的患者的全血樣品進(jìn)行血小板功能活性測(cè)定。將所述樣品在合適的容器(例如反應(yīng)小容器)中與ADP和PGE1的組合物及涂覆有血纖蛋白原的顆?；旌弦孕纬蓽y(cè)定介質(zhì)。顆粒試劑的顆粒具有結(jié)合在其中的一種或多種紅外線染料。使所述組合經(jīng)受有助于凝集的條件，并且所述介質(zhì)用紅外線照射。確定紅外線在測(cè)定混合物中的透過(guò)性，其中透過(guò)水平與血小板反應(yīng)性相關(guān)。選擇在約800nm處具有高吸收的凝集介質(zhì)。凝集介質(zhì)吸收系數(shù)和全血吸收系數(shù)之間的比例在800nm處應(yīng)該優(yōu)選大于約4:1。就具體測(cè)定而言的吸收比例既是凝集介質(zhì)吸收系數(shù)的函數(shù)，又是測(cè)定樣品中凝集介質(zhì)濃度的函數(shù)。所述樣品與所述試劑混合后，期望的是將其加熱至高于室溫但低于會(huì)妨礙測(cè)定的溫度，從而保證溫度可被控制而不會(huì)不利地影響測(cè)定結(jié)果。期望的是，溫度應(yīng)該是至少25°C，優(yōu)選在30-4(TC的范圍內(nèi)，更優(yōu)選為約37°C。當(dāng)將所述試劑與所述樣品混合時(shí)和在反應(yīng)期間，通常對(duì)反應(yīng)介質(zhì)進(jìn)行溫和的攪拌。攪拌程度足以實(shí)現(xiàn)和保持測(cè)定樣品的均勻性。從零時(shí)間(混合時(shí)間)起的讀數(shù)總時(shí)間其范圍可為約10秒至IO分鐘，更常見的是約30秒至8分鐘，以及優(yōu)選為約30秒至3分鐘?？赏ㄟ^(guò)任意便利的手段特別是使用可處理與校準(zhǔn)試驗(yàn)(calibrator)和/或?qū)φ赵囼?yàn)(control)有關(guān)的數(shù)據(jù)的算法來(lái)分析數(shù)據(jù)。凝集水平是所測(cè)試樣品的血小板反應(yīng)性的指標(biāo)。凝集水平可與已知血小板反應(yīng)性的標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)(standard)進(jìn)行比較。通常，結(jié)果可與校準(zhǔn)試驗(yàn)進(jìn)行比較，所述校準(zhǔn)試驗(yàn)可伴隨進(jìn)行或先前已經(jīng)進(jìn)行或可按標(biāo)準(zhǔn)曲線的形式提供。在用藥物洗脫支架(DES)治療的個(gè)體中，血小板反應(yīng)性可用于評(píng)估出院后不利后果(adversepost-dischargeoutcome)(包括支架血栓形成)的可能性。本發(fā)明方法可與用于血小板計(jì)數(shù)(plateletcount)的測(cè)定聯(lián)用，所述用于A,l、i-、:iml々AnJ法；7k'tM_間4茌il由；備no/177qc/i/1ooeEl，qpi提交)和國(guó)際申請(qǐng)PCT/US1999/24670(1999年10月20日提交)(公開號(hào)為WO/2000/025140)中，將這些申請(qǐng)的相關(guān)公開內(nèi)容并入本發(fā)明作為參考。上述測(cè)定可優(yōu)選在裝置中進(jìn)行，所述裝置允許本發(fā)明的反應(yīng)發(fā)生并且測(cè)量其結(jié)果。所述設(shè)備應(yīng)該基于活化的血小板與血纖蛋白原結(jié)合的能力而評(píng)估血小板的功能。當(dāng)活化的血小板與涂覆有血纖蛋白原的顆粒結(jié)合并使其凝集時(shí)，透光率增加。一般而言，對(duì)測(cè)定結(jié)果進(jìn)行測(cè)量的設(shè)備是可對(duì)凝集進(jìn)行測(cè)量的設(shè)備。優(yōu)選地，所述設(shè)備測(cè)量由凝集導(dǎo)致的光信號(hào)變化。合適的設(shè)備包括(用于說(shuō)明而非限制)動(dòng)態(tài)分光光度計(jì)(kineticspectrophotometer)即VERIFYNOWSystem設(shè)備(從Accumetrics,Inc.,SanDiego，CA購(gòu)得并用于對(duì)正常的樣品進(jìn)行快速的血小板功能活性測(cè)量)等。VerifyNowSystem設(shè)備是基于濁度計(jì)量的光學(xué)4企測(cè)系統(tǒng)，其將血'J、板i秀導(dǎo)的聚集測(cè)量為透光率的增加u所述系統(tǒng)包4舌^^斤4義、一次性筒和4空制器(control)。所述筒含有基于微粒凝集技術(shù)的試劑。所述質(zhì)量控制系統(tǒng)包括電子控制器、兩級(jí)測(cè)定"濕"控制器(twolevelsofassayed"wet"control)(WQC)、筒內(nèi)(in-cartridge)濕度傳感器、包裝內(nèi)(in-packaging)溫度指儀對(duì)測(cè)定順序進(jìn)行控制、建立測(cè)定溫度、控制試劑-樣品在所需持續(xù)時(shí)間內(nèi)的混合、確定血小板功能的程度、顯示結(jié)果和進(jìn)行自檢。為了用在本發(fā)明方法中，所述系統(tǒng)的測(cè)試筒含有凍干的制劑，所述制劑包含ADP和PGEl的組合物、具有被動(dòng)結(jié)合的GPIIb/IIIa受體配體的顆粒和緩沖液。來(lái)自患者的樣品通常為枸櫞酸鹽化的全血(citratedwholeblood),其被分析儀自動(dòng)從血液采集管中分配到所述筒中而無(wú)需使用者進(jìn)行任何血液操作。相互作用通過(guò)顆粒的紅外線吸收特征來(lái)監(jiān)測(cè)。當(dāng)所述顆粒與血小板相互作用時(shí)，顆粒的凝集通過(guò)VerifyNowTM分析儀的光學(xué)系統(tǒng)來(lái)測(cè)量。所述凝集被檢測(cè)為紅外線在所述樣品中透過(guò)率的增加。對(duì)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)(reactionkinetics)進(jìn)行分析并轉(zhuǎn)化成"P2Y12應(yīng)答單位，，(PRU)。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案是一種試劑盒，所述試劑盒在包裝的組合中包括凍干的制劑，所述凍干的制劑包含ADP和PGE1的組合物、具有被動(dòng)結(jié)合的血纖蛋白原的顆粒和緩沖液。所述凍干的制劑可存在于反應(yīng)容器(例19如在分析設(shè)備中使用的筒)中。對(duì)于上述VerifyNowSystem,可將所述凍干的制劑置于在分析儀中使用的四孔筒的外孔中。所述試劑盒也可包括樣品采集容器和Z或用于進(jìn)行本發(fā)明方法的裝置。試劑的相對(duì)量可變化很大以提供所述試劑在溶液中使測(cè)定靈敏度基本上最佳的濃度。當(dāng)合適時(shí)，可將所述試劑置于氣密的包裝中，以便保持任意試劑的活性。所述包裝可以是例如由濕氣基本上不能透過(guò)的材料制成的袋、嚢(pouch)等。所述材料包括(示例而非限制)塑料、鋁箔等。對(duì)于血液樣品，所述試劑盒還可包括用于刺入人體皮膚的物品、消毒劑或滅菌墊(sterilizingpad)等。所述試劑盒也可包括校準(zhǔn)品和標(biāo)準(zhǔn)品。另外，所述試劑盒也可包括一種或多種用于進(jìn)行血小板計(jì)數(shù)測(cè)定的試劑。所述試劑盒可包括進(jìn)行本發(fā)明測(cè)定所需的試劑。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述試劑盒包括血液小瓶、使所評(píng)估的血液樣品的pH和鹽濃度保持在適于血,j、板介導(dǎo)的固體表面的凝集的范圍內(nèi)的緩沖液和涂覆有血小板GPIIb/IIIa受體配體的小的聚合物珠子。所述緩沖液可呈溶液形式，或可僅由緩沖組合物和鹽構(gòu)成，向所述緩沖組合物和鹽中加入已知量的水以得到期望的緩沖溶液。任選地，所述試劑盒也可包含抗凝劑。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述緩沖液是HEPES;所述抗凝劑是枸櫞酸鹽；GPIIb/IIIa受體配體是血纖蛋白原；小的聚合物珠子是聚丙烯腈或羧化聚苯乙烯，其中肽GPIIb/IIIa受體配體(例如血纖蛋白原)通過(guò)所述肽和珠子表面上的官能團(tuán)之間的疏水性相互作用和/或氬鍵相互作用而被動(dòng)地與珠子表面結(jié)合。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述試劑盒還包含血小板活化劑，例如ADP和PGE1的組合物。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，在經(jīng)歷PCI的接受DES的患者中使用護(hù)理時(shí)測(cè)試(point-of-caretesting)來(lái)確定以下關(guān)系即對(duì)氯吡格雷的應(yīng)答、治療后的反應(yīng)性(其如下定義血小板功能相對(duì)于基線的抑制百分比或通過(guò)PRU測(cè)量的絕對(duì)反應(yīng)性)和有害事件之間的關(guān)系，其中在出院前采集血液樣品。在另一個(gè)實(shí)施方案中，可考慮在體重超過(guò)約100kg的具有DES的PCI患者中增加氯吡格雷的劑量。對(duì)PCI時(shí)的血小板功能進(jìn)行的護(hù)理時(shí)測(cè)試可識(shí)別在30天隨訪中處于支架血栓形成高風(fēng)險(xiǎn)中的患者。處于風(fēng)險(xiǎn)中的患者可受益于增加的氯吡格雷給藥方案或受益于可選擇的抗血小板策略(例如普拉雷格(prasugrel))。實(shí)施例下述實(shí)施例意在說(shuō)明本發(fā)明而不是意在限制其范圍。除非另有說(shuō)明，份和百分比為重量份和重量百分比。實(shí)施例1用最終濃度分別為20pM和22nM的ADP(Chrono-logCorp.,Havertown，PA)和PGE1(SIGMA)進(jìn)行劑量-應(yīng)答測(cè)試。將ADP在Hepes/Saline(pH7,4)緩沖液中稀釋至最終濃度為200jiM,之后在集合度計(jì)(aggregometer)上使用。將PGE1在Hepes/Saline(pH7.4)緩沖液中稀釋至最終濃度為220nM,之后在集合度計(jì)上使用。將P2Y12受體拮抗劑在DMF中稀釋至最終濃度為lmM、2mM和5mM。將5微升稀釋的P2Y12拮抗劑加入(spike)到5mL全血中。將樣品倒轉(zhuǎn)并在室溫培養(yǎng)l小時(shí)。全血基線樣品沒有接受任何添加劑。培養(yǎng)結(jié)束后，對(duì)于富含血小板的血漿(PRP)，將全血樣品以1500rpm旋轉(zhuǎn)15分鐘，以及對(duì)于缺乏血小板的血漿(PPP),將全血樣品以3500rpm旋轉(zhuǎn)15分鐘。對(duì)于使用PPP的每種樣品，將血小板計(jì)數(shù)調(diào)整至約250,000個(gè)/VL。對(duì)于集合度測(cè)定，將450pL經(jīng)調(diào)整的PRP加入到玻璃小容器中。空白樣品含有450|aLPPP和50|iLHepes/Saline緩沖液。將200(iMADP和220nMPGE1的50微升組合物加入到每種PRP樣品中，并在集合度計(jì)上測(cè)試10分鐘。如圖l所示，上述試劑和系統(tǒng)成功地檢測(cè)了來(lái)自用P2Y12拮抗劑處理的血液樣品的血小板聚集程度。圖1和2分別說(shuō)明了一名個(gè)體的平均應(yīng)答和五名個(gè)體的平均應(yīng)答。從上述圖1說(shuō)明的結(jié)果中顯而易見的是，本發(fā)明提供了一種簡(jiǎn)單快速的方法來(lái)對(duì)已經(jīng)通過(guò)暴露于P2Y12拮抗劑而被影響的樣品進(jìn)行血d、板活性測(cè)定。實(shí)施例2對(duì)PCI患者進(jìn)行了研究。所選擇的患者具有至少一種如下情況至少一處需要PCI的損傷250。/。直徑的狹窄、直徑在2.25和4.0mm之間的參考脈管(referencevessel)、位于天然冠狀動(dòng)脈或旁路移植物(bypassgraft)中的新形成或再狹窄的耙標(biāo)損傷和對(duì)阿司匹林、氯吡格雷或DES的任意組分沒有已知的變態(tài)反應(yīng)。全血在抗凝劑治療或抗凝血酶治療前以及通過(guò)在PCI后的12小時(shí)進(jìn)行的放血術(shù)(phlebotomy)得自動(dòng)脈套管的側(cè)口(sideport)。使用VerifyNowP2Y12測(cè)定(Accumetrics,Inc.,SanDiego,Calif.)來(lái)測(cè)量氯吡格雷的抑制作用。在患者中由氯吡格雷誘導(dǎo)的抑制作用占在氯吡格雷暴露前基線樣品的百分比使用如下公式來(lái)計(jì)算l-(氯吡格雷后PRU/PRU基線)x100。如果氯吡格雷治療后的ADP誘導(dǎo)的聚集大于基線，則認(rèn)為抑制百分比為零。在沒有氯吡格雷暴露前的基線樣品的患者中(即在PCI前接受慢性氯吡格雷治療的患者)，使用通過(guò)設(shè)備(使用內(nèi)部參考通道)報(bào)道的抑制百分比。所有患者在所述操作(procedure)的當(dāng)天接受325mg未包衣的阿司匹林而不考慮先前是否使用阿司匹林。先前沒有服用氯吡格雷的患者在所述操作結(jié)束時(shí)用600mg負(fù)荷劑量治療，然后離開導(dǎo)管插入實(shí)驗(yàn)室。在所述操作期間給予操作中的肝素(具有>250秒的目標(biāo)活化凝結(jié)時(shí)間(goalactivedclottingtime))或比伐盧定(bivalimdin),這由操作者決定。指示患者無(wú)限期(indefmitely)服用阿司匹林325mg/天，以及歷時(shí)最短3個(gè)月服用氯吡格雷75mg/天。從分析中排除接受糖蛋白Ilb/IIIa抑制劑的患者或在所述操作前的24小時(shí)內(nèi)已經(jīng)接受負(fù)荷劑量的氯吡格雷的患者。將"高治療后反應(yīng)性(highpost-treatmentreactivity)，，定義為當(dāng)進(jìn)行氯他才各雷治療(進(jìn)行慢性治療或負(fù)荷劑量后的12小時(shí))時(shí)絕對(duì)PRU的最高四分位(highestquartile)，而將"氯吡格雷無(wú)應(yīng)答性，，定義為血小板功能抑制百分比(與患者的基線或參考通道相比血小板反應(yīng)性在氯吡格雷治療后的相對(duì)變化)的最低四分位(lowestquartile)。如果患者的穩(wěn)態(tài)模型評(píng)估指數(shù)(HomeostasisModelAssessmentindex)(計(jì)算為[禁食情況下的胰島素(nU/mL)P[禁食情況下的葡萄糖(mg/d1)]/405)〉3.0，或如果患者患有需要藥物療法的糖尿病，則所述患者被判斷是胰島素抗性的(insulinresistant)。所測(cè)量的臨床終點(diǎn)(clinicalendpoint)為死亡、MI(非Q波和Q波)和支架血栓形成。將圍操作期的(peri-procedural)非Q波心肌梗塞(MI)定義為在沒有病理性Q波的情況下CK-MB大于正常上限的3倍。將30天隨訪期內(nèi)的Ml定義為臨床事件委員會(huì)認(rèn)為是缺血所致的心臟酶(cardiacenzyme)的任意升高。將"支架血栓形成，，定義為下述任意情況支架閉合或血栓的血管造影顯示(demonstration)、無(wú)法解釋的猝死和無(wú)患者支架伴隨記錄(concomitantdocumentation)的MI。將"急性血栓形成，，定義為在PCI的24小時(shí)內(nèi)發(fā)生的血栓形成，以及將"亞急性血栓形成，，定義為在24小時(shí)和30天隨訪之間發(fā)生的血栓形成。基于計(jì)算機(jī)的分析程序SPSS(StatisticalPackagefortheSocialSciences,12.0forPC,SPSSInc.,Chicago,Ill.)用于統(tǒng)計(jì)學(xué)計(jì)算。f檢驗(yàn)(chi-squaretest)或費(fèi)氏確切檢驗(yàn)(Fisherexacttest)(此時(shí)就2x2表格而言任意期望的細(xì)胞計(jì)數(shù)(anyexpectedcellcount)〈5)用于才全觀J分類變量(categoricalvariable)的差異；i人為p<0.05是具有顯著性的。使用斯氏t-檢驗(yàn)(Studentt-test)來(lái)對(duì)連續(xù)變量(continuousvariable)進(jìn)行比較。進(jìn)行單變量邏輯回歸分析和向前條件法(forwardconditional)(準(zhǔn)入標(biāo)準(zhǔn)(entrycriteria)為0.05以及準(zhǔn)出標(biāo)準(zhǔn)(exitcriteria)為O.IO)多變量邏輯回歸分析來(lái)識(shí)別與氯吡格雷無(wú)應(yīng)答性獨(dú)立相關(guān)的特征或變量。檢驗(yàn)下述變量并且如果單變量分析的p值X).10則進(jìn)入到多變量分析中，所述變量為年齡、性別、體重、體重指數(shù)(BMI)^30kg/m2、糖尿病史、胰島素抗性、CHF史、MI史、HTN史、當(dāng)前吸煙、腎功能不全(肌酸酐^1.5)、L:l'，<40o/o、表現(xiàn)出MI、表現(xiàn)出心絞痛(angina)、使用比伐盧定和先前使用阿司匹林、卩阻斷劑或阿托伐他汀?；€臨床特征如下面表1所示。表l<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>操作的適應(yīng)癥通過(guò)如下情況之一來(lái)確定在261名患者(93%)中有穩(wěn)定型心絞痛(stableangina)或缺血(ischemia)，在13名患者(4.8。/。)中有不穩(wěn)定型心絞痛(unstableangina),在6名患者(2.2%)中有急性ML<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>氯吡格雷治療。就2號(hào)患者而言的抑制百分比為0%。3號(hào)患者在PCI后的34天患上亞急性血栓形成，并且在所述操作時(shí)首次(naive)接受氯吡格雷治療且用600mg負(fù)載。就3號(hào)患者而言的抑制百分比為0%。4號(hào)患者在PCI后的8天患上亞急性血栓形成，并且在所述操作時(shí)首次接受氯吡格雷治療且用600mg負(fù)載。就4號(hào)患者而言的抑制百分比為44%。所有四名具有血栓形成和無(wú)應(yīng)答的患者處于絕對(duì)氯吡格雷后反應(yīng)性的最高四分位中。在這個(gè)實(shí)施例中，進(jìn)行PCI的患者中的四分之一具有氯吡格雷誘導(dǎo)的對(duì)血小板的抑制作用(將其定義為<10%(通過(guò)護(hù)理時(shí)測(cè)定(point-of-careassay)來(lái)測(cè)量))。表現(xiàn)出MI的患者具有較重的體重，并且p阻斷劑的使用獨(dú)立地與氯吡格雷無(wú)應(yīng)答性相關(guān)。在30天的隨訪中氯吡格雷無(wú)應(yīng)答顯著地與支架血栓形成相關(guān)，特別是在高絕對(duì)治療后反應(yīng)性的情況下。從這個(gè)實(shí)施例中注意到的是，就大于100kg的患者而言應(yīng)該增加氯吡格雷的給藥。相應(yīng)地，在PCI時(shí)對(duì)血小板功能進(jìn)行的護(hù)理時(shí)測(cè)試可用于識(shí)別在30天的隨訪中處于支架血栓形成高風(fēng)險(xiǎn)中的患者。處于風(fēng)險(xiǎn)中的患者可受益于增加的氯吡格雷給藥方案或受益于可選擇的抗血小板策略(包括但不限于普拉雷格等)。實(shí)施例3進(jìn)行另一項(xiàng)研究以確定在接受氯吡格雷治療的患者中的血小板反應(yīng)性(通過(guò)VerifyNowP2Y12測(cè)定(Accumetrics,Inc.,SanDiego,CA)來(lái)評(píng)估)是否與植入藥物洗脫支架(DES)后的出院后結(jié)果(包括支架血栓形成)相關(guān)。這項(xiàng)研究發(fā)表在Price,etal.,Eur.HeartJ.(2008)29(8):992-1000中，將其完整引如果患者具有至少一處需要PCI的損傷250%直徑的狹窄并且對(duì)阿司匹林、氯吡格雷或西羅莫司洗脫支架(SES)沒有已知的變態(tài)反應(yīng)，則所述患者有資格應(yīng)征。正在接受氯吡格雷治療的患者或沒有接受過(guò)氯吡格雷治療的患者都有資格包括在其中。然而，為了保證在所述操作前接受氯吡格雷治療的患者在血小板功能評(píng)估時(shí)被最佳且一致地治療，僅包括那些在所述操作前的至少12小時(shí)已經(jīng)接受600mg負(fù)荷劑量的患者或那些接受氯吡格雷75mg/天的維持劑量超過(guò)5天的患者。在圍操作期接受糖蛋白抑制劑的患者由于干擾P2Y12測(cè)定而沒有征集。在PCI和就沒有接受過(guò)氯吡格雷治療的患者而言的600mg氯吡格雷負(fù)荷劑量后的12小時(shí)，在接受先前氯吡格雷治療的患者中，在抗凝劑治療前，在導(dǎo)管插入術(shù)時(shí)，以及通過(guò)放血術(shù)，從動(dòng)脈套管的側(cè)口得到全血。將血液置于含有3.2%枸櫞酸鈉的1.8mL拉伸塑料Vacuette⑧管(Greiner,Monroe,NC)中。使用VERIFYNOWTMP2Y12測(cè)定(Accumetrics,Inc.)來(lái)測(cè)量氯吡格雷的抑制作用。VerifyNowTMP2Y12是基于筒的快速血小板功能測(cè)定，其用于直接測(cè)量藥物對(duì)P2Y12受體的作用。所述測(cè)定含有20mMADP和22nM前列腺素El以減少ADP與P2Y1受體的結(jié)合所致的活化貢獻(xiàn)。涂覆有血纖蛋白原的微粒在VerifyNowP2Y12筒中用于與可得到的血小板受體結(jié)合。所述VerifyNowTM裝置將血小板誘導(dǎo)的聚集測(cè)量為透光率的增加，并使用專有的算法來(lái)報(bào)道單位為P2Y12反應(yīng)單位(PRU)的值。在此測(cè)定中，較高的PRU反映了較大的ADP介導(dǎo)的血小板反應(yīng)性。已經(jīng)寺艮道在患有冠狀動(dòng)脈疾病的患者中測(cè)試精確度的平均變化系數(shù)為3.2%。介入策略由操作者決定。在所述操作期間使用操作中的未分級(jí)肝素(具有>250秒的目標(biāo)活化凝結(jié)時(shí)間)或比伐盧定。所有患者接受SES，并且他們?cè)谒霾僮鞯漠?dāng)天接受325mg阿司匹林而不考慮先前是否使用阿司匹林。先前沒有接受過(guò)氯吡格雷治療的患者在所述操作結(jié)束時(shí)接受600mg負(fù)荷劑量，然后離開導(dǎo)管插入實(shí)驗(yàn)室。已經(jīng)接受氯吡格雷治療的患者(如前面的包括/排除標(biāo)準(zhǔn)所示)沒有接受額外的負(fù)荷劑量。指示患者無(wú)限期服用阿司匹林325mg/天，以及歷時(shí)操作后的最短3個(gè)月服用氯吡格雷75mg/天。將"治療后的血小板反應(yīng)性"定義為氯吡格雷的PRU(在PCI和就先前沒有接受過(guò)氯吡格雷治療的患者而言的600mg負(fù)荷劑量后的12小時(shí)或在已經(jīng)接受氯吡格雷治療的患者中在PCI前在導(dǎo)管插入術(shù)時(shí))。將"技術(shù)成功(technicalsuccess)"定義為最終直徑狹窄^30。/。和心肌梗塞溶栓(TIMI)流動(dòng)等級(jí)為3。所測(cè)量的臨床終點(diǎn)是心血管(CV)死亡、非致死性心肌梗塞(MI)和支架血栓形成。將"隨訪中的MI"定義為在與心臟缺血相符的臨床征候或癥狀的情況下心臟生物標(biāo)志的任意典型升高和降低，其按照AmericanCollegeofCardiology的定義(Cannon,etal"J.Am.Coll.Cardiol.(2001)38:2114-2130)。AcademicResearchConsortium的定義用于"支架血栓形成，，(確定的、很可能的和可能的)(Mauri,etal.,N.Engl.J.Med.(2007)356:1020-1029)。將"亞急性支架血栓形成，，定義為出院后至30天隨訪時(shí)發(fā)生的支架血栓形成，以及將遲發(fā)性支架血栓形成定義為在30天隨訪和6個(gè)月隨訪之間發(fā)生的支架血栓形成?；谟?jì)算機(jī)的分析程序SPSS(StatisticalPackagefortheSocialSciences,12.0forPC,SPSSInc.,Chicago,IL,USA)用于統(tǒng)計(jì)學(xué)計(jì)算。對(duì)具有和不具有噻吩并吡啶治療的支架植入進(jìn)行的隨機(jī)研究已經(jīng)顯示與單獨(dú)的阿司匹林相比在用雙重抗血小板療法進(jìn)行治療的患者中心臟事件相對(duì)減少75-85%。本發(fā)明人估計(jì)，假設(shè)應(yīng)答者中的事件率為1.0%和氯吡格雷無(wú)應(yīng)答率為三分之一，則380名患者的樣本大小就使用單向費(fèi)氏確切檢驗(yàn)(Fisher，sexacttest)來(lái)檢測(cè)事件率的80%相對(duì)差異而言可提供70%的效力(power)。使用斯氏t-檢驗(yàn)來(lái)對(duì)連續(xù)變量進(jìn)行比較。f檢驗(yàn)用于檢測(cè)分類變量的差異，以及當(dāng)就2x2表格而言任意期望的細(xì)胞計(jì)數(shù)〈5時(shí)，使用費(fèi)氏確切檢驗(yàn)?？?斯二氏檢驗(yàn)(Kolmogorov-Smirnovtest)用于4全驗(yàn)正態(tài)(normality)。接收器工作特性(R()C)曲線分析用于確定VERIFYNOWP2Y12測(cè)定對(duì)PCI后發(fā)生出院后事件的患者和PCI后不發(fā)生出院后事件的患者進(jìn)行區(qū)分的能力。通過(guò)確定治療后的PRU來(lái)計(jì)算最佳截止點(diǎn)(optimalcut-offpoint),其4是供了靈敏度和特異性的最大總和。使用R軟件進(jìn)行自展確認(rèn)(bootstrapvalidation)。使用卡普蘭-邁耶(Kaplan-Meier)方法生成存活曲線，并且曲線之間的差異通過(guò)對(duì)數(shù)秩檢驗(yàn)(log-ranktest)來(lái)評(píng)估。認(rèn)為P值<0.05是具有顯著性的。這項(xiàng)研究總共征集了380名患者(參見圖2)?；€臨床特征、損傷特征和操作特征顯示在表6和7中?？偟膩?lái)說(shuō)，平均年齡為68士11歲，76.8%為男性，14.2%患有腎功能不全，28.9%為糖尿病，以及44.5%在PCI時(shí)正在接受氯吡格雷治療。在大多數(shù)患者(93.9%)中操作適應(yīng)癥為穩(wěn)定型心絞痛(stableangina)或缺血。治療了平均1.7±0.8處損傷/患者。平均損傷長(zhǎng)度為20.0士13.1mm，并且植入了平均1.4±0.7個(gè)SES/損傷。在所有患者中都實(shí)現(xiàn)了技術(shù)成功。表6<table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table>*將高反應(yīng)性定義為高于ROC曲線分析的最佳截止點(diǎn)的治療后反應(yīng)性(PRl^235),以及將較低反應(yīng)性定義為低于該閾值。表7損傷特征和操作特征<table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table>治療后的PRU是正態(tài)分布的(單樣本科-斯二氏檢驗(yàn)，Pi.2)。治療后的平均反應(yīng)性為184±85PRU。治療后的反應(yīng)性在接受先前氯吡格雷治療的患者和沒有服用過(guò)氯吡格雷的接受負(fù)荷劑量的患者之間沒有差異(186土73PRU對(duì)183±94PRU,P=0.7)，并且反應(yīng)性在接受才喿作中的肝素或比伐盧定的患者之間也沒有差異(184土86PRU對(duì)184±84PRU,P=1.0)。98.9。/。的患者完成了6個(gè)月的臨床隨訪。出院后，有三例CV死亡(0.80/0)，其中兩例為猝死(在操作后的84天和186天)。在操作后的32天有一例非CV死亡(由于敗血病)。在五名患者(1.3。/。)中發(fā)生非致死性MI。有六例支架血栓形成發(fā)作(1.6%):三例為確定的亞急性支架血栓形成，一例為確定的遲發(fā)性支架血栓形成，并且兩例為可能的遲發(fā)性支架血栓形成。在10名患者(2.6%)中發(fā)生CV死亡、非致死性MI或支架血栓形成的合并終點(diǎn)(combinedendpointofCVdeath,non-fatalMI，orstentthrombosis)。這些患者中沒有一名具有欠佳的血管造影結(jié)果或有關(guān)在冊(cè)操作(indexprocedure)中的后遺癥解剖結(jié)構(gòu)(residualdissection)的血管造影證據(jù)。在PCI后的8天患上亞急性支架血栓形成的一名患者在出院后沒有服用氯吡格雷(即在所述操作后的24小時(shí)以后沒有服用氯吡格雷)。當(dāng)患者正在接受雙重抗血小板治療時(shí)發(fā)生所有其它事件。具有支架血栓形成的患者當(dāng)接受抗血小板治療時(shí)的治療后反應(yīng)性為283PRU、292PRU、236PRU、244PRU和271PRU。總共373名患者(98.2%)在操作后的3個(gè)月保持氯吡格雷治療，以及317名患者(83.4%)在6個(gè)月的隨訪中保持治療。表8說(shuō)明了在整個(gè)6個(gè)月的隨訪中在接受氯吡格雷治療的患者中的事件率，以及表9說(shuō)明了在完成最少3個(gè)月氯吡4各雷療程的患者中的6個(gè)月事件率。發(fā)生有害事件的患者與沒有發(fā)生有害事件的患者相比具有顯著較高的血小板反應(yīng)性(242PRU對(duì)186PRU,單尾t-檢驗(yàn)，P=0.03)。__<table>tableseeoriginaldocumentpage29</column></row><table>*在具有高反應(yīng)性的組和具有較低反應(yīng)性的組之間的比較(表6)。<table>tableseeoriginaldocumentpage29</column></row><table>*在具有高反應(yīng)性的組和具有較低反應(yīng)性的組之間的比較(表6)。對(duì)在整個(gè)6個(gè)月的隨訪中在保持氯吡格雷治療的患者中的治療后血小板反應(yīng)性進(jìn)行的ROC曲線分析表明，治療后的PRU能夠區(qū)分具有隨后事件的患者和不具有隨后事件的患者[曲線下面積0.711[95%置信區(qū)間0.529至0.893)，P二0.03](圖3)。PRUS235被認(rèn)為是預(yù)測(cè)出院后6個(gè)月結(jié)果的最佳截止值，其提供了78。/。(95。/。CI(置信區(qū)間)46-94)的敏感度，68%的特異性(95%(3167-69)和99%(95%CI98-100)的負(fù)預(yù)測(cè)值。通過(guò)使用10000份復(fù)制品(replicate)進(jìn)行的自展分析，最佳截止的95%置信區(qū)間的范圍為179PRU至291PRU。在完成至少3個(gè)月氯吡格雷治療的患者群中，最佳截止為235PRU(95。/。CI(其通過(guò)自展來(lái)確定)174PRU至291PRU)[曲線下面積0,720(95%置信區(qū)間0,540至0,900)(P=0,02);靈敏度78%(95%CI46至94);特異性70%(95%CI69至70)]。該截止與治療后反應(yīng)性的上三分位(uppertertile)的界限^231PRU)相似。治療后反應(yīng)性高于最佳截止值的患者^(guò)皮認(rèn)為具有"高"治療后反應(yīng)性。與具有較低治療后反應(yīng)性的患者相比，具有高治療后反應(yīng)性的患者是顯著較老的，較有可能是糖尿病患者，傾向于患有腎功能不全，以及較有可能正在服用卩阻斷劑(表6)。具有高治療后反應(yīng)性的患者也具有較少的損傷/患者，并且具有平均較大的植入支架直徑(表7)。具有高治療后反應(yīng)性的患者具有顯著較大的CV死亡率(2.8%對(duì)0%,P=0.04)、顯著較大的任意支架血栓形成(4.6%對(duì)0%,P=0.004)、顯著較大的確定或可能的支架血栓形成(2.8%對(duì)0。/。，P^0.04)和顯著較大的CV死亡、非致死性MI或支架血栓形成的合并終點(diǎn)(6.5%對(duì)1.0%,P^0.008)(表8和9)。當(dāng)考慮所有原因的死亡、非致死性MI或支架血栓形成時(shí)，結(jié)果之間的差異仍然是顯著的(6.5%對(duì)1.4。/。，P=0.035)。無(wú)事件存活率曲線(event-freesurvivalcurve)顯示在圖4中。無(wú)C—V死亡、非致死性MI或支架血對(duì)全形成的合并終點(diǎn)的存活率在具有高治療后反應(yīng)性的患者中為91.4%,以及在不具有高治療后反應(yīng)性的患者中為99.0%(P=0.004)。在這個(gè)實(shí)施例中，對(duì)經(jīng)歷PCI的具有DES的患者群進(jìn)行ROC分析，從而(i)確定VERIFYNOWP2Y12護(hù)理時(shí)測(cè)定(Accumetrics,Inc.)對(duì)具有隨后出院后事件的患者和不具有隨后出院后事件的患者進(jìn)行區(qū)分的能力，以及(ii)識(shí)別以下基于臨床的閾值，所述閾值用于確定在具有高反應(yīng)性的患者和具有較低反應(yīng)性的患者之間的事件相對(duì)率。吡格雷治療時(shí)的血小板反應(yīng)性纟皮發(fā)現(xiàn)就DES植入后的醫(yī)院外結(jié)果30(out-of-hospitaloutcome)(包括支架血栓形成)而言是具有預(yù)測(cè)性的。用于識(shí)別高風(fēng)險(xiǎn)患者的最佳截止為PRL^235;所有CV死亡和支架血栓形成都發(fā)生在反應(yīng)性高于此閾值的患者中。此截止點(diǎn)與所研究的群中的PRU的上三分位的界限相似，這與氯吡格雷后的高反應(yīng)性與隨后的CV事件相關(guān)這一先前觀察結(jié)果一致。關(guān)于最佳截止的95%置信區(qū)間的自展評(píng)價(jià)是相當(dāng)寬的，這可能是由于在此項(xiàng)研究中發(fā)生的事件的數(shù)目是低的。值得注意的是，95%置信區(qū)間的低范圍(lowrange)仍然高于所述群中的平均PRU，這與剩余的血小板反應(yīng)性高于在PCI前后的中值的患者處于隨后事件的較高風(fēng)險(xiǎn)中這一先前發(fā)現(xiàn)結(jié)果一致。這個(gè)實(shí)施例說(shuō)明了在支架血栓形成和血栓形成事件前存在氯吡格雷后的高血小板反應(yīng)性之間的顯著關(guān)系。所述研究中的亞急性支架血栓形成(0.8%)和遲發(fā)性支架血栓形成(0.8%)的總發(fā)生率與先前報(bào)道的一致。由于在血栓形成事件前進(jìn)行了血小板功能評(píng)估，所以上述數(shù)據(jù)支持以下假設(shè)氯吡格雷后的高反應(yīng)性在支架血栓形成中是病因性因素。這個(gè)實(shí)施例表明，處于醫(yī)院外缺血事件風(fēng)險(xiǎn)中的患者，特別是處于醫(yī)院外支架血栓形成風(fēng)險(xiǎn)中的患者，可使用在在冊(cè)住院期間進(jìn)行的護(hù)理時(shí)血小板功能評(píng)估來(lái)分級(jí)。增加的氯吡格雷的維持給藥方案可在未經(jīng)選擇的患者中和在處于受損應(yīng)答高風(fēng)險(xiǎn)中的糖尿病患者中改善對(duì)血小板的抑制作用。第三代噻吩并吡啶即普拉雷格和其它新穎的P2Y12抑制劑也可用于提供更強(qiáng)效和更均一的對(duì)P2Y12的抑制作用。盡管出于清楚理解的目的已經(jīng)通過(guò)說(shuō)明和實(shí)施例而在某些細(xì)節(jié)方面對(duì)上述發(fā)明進(jìn)行了描述，但對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)顯而易見的是，根據(jù)本發(fā)明的教導(dǎo)，可對(duì)本發(fā)明進(jìn)行一些變化和修改而不背離所附權(quán)利要求書的主旨和范圍。將在本說(shuō)明書中引用的所有出版物和專利申請(qǐng)并入本文作為參考，就如同具體和單獨(dú)地指明各篇出版物或?qū)＠暾?qǐng)被引入作為參考。權(quán)利要求1.一種測(cè)量在用藥物洗脫支架(DES)治療的個(gè)體中P2Y12拮抗劑對(duì)血小板反應(yīng)性的抑制作用的方法，所述方法包括如下步驟a)提供含有血小板的血液樣品，所述樣品來(lái)自用DES和P2Y12拮抗劑治療的個(gè)體；b)使所述含有血小板的血液樣品與顆粒、二磷酸腺苷(ADP)和前列腺素E1(PGE1)在適于使所述顆粒通過(guò)所述血液樣品中的所述血小板介導(dǎo)而凝集的條件下接觸，所述顆粒包含固定在其上的GPIIb/IIIa受體配體；以及c)評(píng)估所述凝集，從而確定在所述個(gè)體中所述P2Y12拮抗劑對(duì)血小板聚集的抑制作用的存在、缺失和/或程度，其中所述凝集的缺失或減少表明所述個(gè)體在應(yīng)答所述P2Y12拮抗劑治療中具有降低的血小板反應(yīng)性。2.—種識(shí)別用藥物洗脫支架(DES)治療而處于支架血栓形成風(fēng)險(xiǎn)中的個(gè)體的方法，所述方法包括如下步驟a)提供來(lái)自用DES和P2Y12拮抗劑治療的個(gè)體的含有血小板的血液樣口口,b)使所述含有血小板的血液樣品與顆粒、二磷酸腺苷(ADP)和前列腺素I':1(PGE1)在適于使所述顆粒通過(guò)所述血液樣品中的所述血'J、板介導(dǎo)而凝集的條件下接觸，所述顆粒包含固定在其上的GPIIb/IIIa受體配體；c)評(píng)估所述凝集，從而確定在所述個(gè)體中所述P2Y12拮抗劑對(duì)血小板聚集的抑制作用的存在、缺失和/或程度，其中所述凝集的缺失或減少表明所述個(gè)體在應(yīng)答所述P2Y12拮抗劑治療中具有降低的血小板反應(yīng)性；以及d)評(píng)估所述個(gè)體就支架血栓形成而言的風(fēng)險(xiǎn)水平。3.權(quán)利要求1或2的方法，其中所述含有血小板的血液樣品為全血樣口口o4.權(quán)利要求1或2的方法，其中所述含有血小板的血液樣品為血漿樣口口Oo5.權(quán)利要求4的方法，其中所述血漿樣品為富含血小板的血漿(PRP)樣品。6.權(quán)利要求1或2的方法，其中所述P2Y12拮抗劑為謹(jǐn):吩并吡啶類。7.權(quán)利要求6的方法，其中所述噻吩并吡啶類為氯吡格雷。8.權(quán)利要求6的方法，其中所述噻吩并吡啶類為噻氯匹定。9.權(quán)利要求1或2的方法，其中所述個(gè)體用P2Y12拮抗劑和阿司匹林治療。10.權(quán)利要求1或2的方法，其中所述顆粒包含聚苯乙烯或膠乳。11.權(quán)利要求1或2的方法，其中所述顆粒包含紅外線染料，含有血小板的血液樣品和所述顆粒之間的接觸形成測(cè)定混合物，由所述血小板介導(dǎo)的所述顆粒的凝集如下評(píng)估用紅外線光譜中的光照射所述測(cè)定混合物，并評(píng)估紅外線在所述測(cè)定混合物中的透過(guò)性。12.權(quán)利要求1或2的方法，其中所述GPIIb/IIIa受體配體包括選自如下的物質(zhì)血纖蛋白原、單克隆抗體10E5、單克隆抗體c7E3、馮維勒布蘭德因子、纖連蛋白、玻連蛋白、具有精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)序列的配體和才莫擬RGD序列的肽或仿肽。13.權(quán)利要求1或2的方法，其中所述GPIIb/IIIa受體配體為血纖蛋白原。14.權(quán)利要求1或2的方法，其中所述ADP具有2至35pM的最終濃度，以及所述PGE1具有2至3OnM的最終濃度。15.權(quán)利要求1或2的方法，其中所述ADP具有15至20)iM的最終濃度。16.4又利要求1或2的方法，其中所述PGE1具有20至25nM的最終濃度。17.權(quán)利要求1或2的方法，其中所述顆粒、ADP和PGE1包含在測(cè)定介質(zhì)中。18.權(quán)利要求17的方法，其中所述測(cè)定介質(zhì)在約800nm處具有高吸收。19.權(quán)利要求1或2的方法，所述方法在范圍為30。C至40。C的溫度進(jìn)行，從使含有血小板的血液樣品、包含附著的GPIIb/IIIa受體配體的顆粒、ADP和PGE1接觸的時(shí)間起的讀數(shù)總時(shí)間為約10秒至約10分鐘。20.—種試劑盒，所述試劑盒用于測(cè)量在用藥物洗脫支架(DES)治療的個(gè)體中P2Y12受體拮抗劑對(duì)血小板聚集的抑制作用，所述試劑盒包含固定在顆粒上的GPIIb/IIIa受體配體、二磷酸腺苷(ADP)和前列腺素E1(PGE1)。21.權(quán)利要求20的試劑盒，其還包含抗凝劑和使抗凝化血液的pH和鹽濃度保持在適于血小板聚集的范圍內(nèi)的緩沖液。22.權(quán)利要求20的試劑盒，其中所述GPIIb/IIIa受體配體包括選自如下的物質(zhì)血纖蛋白原、單克隆抗體10E5、單克隆抗體c7E3、馮維勒布蘭德因子、纖連蛋白、玻連蛋白、具有精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)序列的配體和模擬RGD序列的肽或仿肽。23.權(quán)利要求20的試劑盒，其中所述GPIIb/IIIa受體配體包括血纖蛋白原。24.權(quán)利要求20的試劑盒，其中所述顆粒包含聚苯乙烯或膠乳。25.權(quán)利要求20的試劑盒，其中所述顆粒具有約1微米至約8微米的直徑。全文摘要本發(fā)明披露了一種測(cè)量在用藥物洗脫支架(DES)治療的個(gè)體中對(duì)血小板反應(yīng)性的抑制作用的方法。首先，從用DES和P2Y12拮抗劑治療的個(gè)體中得到血液樣品。然后，將所述血液樣品與含有附著的GPIIb/IIIa受體配體的顆粒、二磷酸腺苷(ADP)和前列腺素E1(PGE1)混合。將所述混合物在適于使顆粒凝集的條件下培養(yǎng)，并且在所述混合物中評(píng)估血小板介導(dǎo)的凝集。凝集的缺失或減少表明用DES治療的個(gè)體具有降低的血小板反應(yīng)性。本發(fā)明還披露了一種試劑盒，所述試劑盒用于測(cè)量P2Y12受體拮抗劑對(duì)血小板聚集的抑制作用，所述試劑盒包含固定在顆粒上的GPIIb/IIIa受體配體、二磷酸腺苷(ADP)、前列腺素E1(PGE1)、抗凝劑和將抗凝化血液維持在適于血小板聚集的條件下的緩沖液。文檔編號(hào)G01N33/86GK101688871SQ200880022878公開日2010年3月31日申請(qǐng)日期2008年5月1日優(yōu)先權(quán)日2007年5月1日發(fā)明者丹尼斯·德賓,巴里·S·科勒申請(qǐng)人:阿庫(kù)米特里克斯股份有限公司