專(zhuān)利名稱(chēng)：T－細(xì)胞受體r可變閱讀框架蛋白(TARP)及其應(yīng)用的制作方法
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關(guān)于聯(lián)邦資助研究和發(fā)展的發(fā)明的權(quán)利的聲明是不適用的。發(fā)明背景本發(fā)明涉及分子生物學(xué)以及醫(yī)學(xué)診斷學(xué)和治療學(xué)領(lǐng)域。前列腺癌是人類(lèi)最普遍的一種癌癥，是導(dǎo)致人的因癌癥死亡的第三大原因。此種疾病的早期檢測(cè)和治療的方法將降低前列腺癌患者的死亡率。由惡性腫瘤細(xì)胞表達(dá)而其它細(xì)胞很少表達(dá)的腫瘤相關(guān)蛋白，可被用作靶來(lái)用于檢測(cè)和干預(yù)。幾種與前列腺癌相關(guān)的蛋白已被鑒定，包括前列腺特異性抗原(PSA)。
免疫療法是一種用于抵抗癌癥的有效的新武器。免疫療法包括基于其靶抗原的產(chǎn)生來(lái)激發(fā)抵抗癌細(xì)胞的免疫應(yīng)答。當(dāng)使用人抵抗癌細(xì)胞的免疫應(yīng)答時(shí)，優(yōu)選用于激發(fā)細(xì)胞介導(dǎo)的抵抗癌細(xì)胞的免疫應(yīng)答?；诩?xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答的免疫療法包括對(duì)產(chǎn)生特定的表位的細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞介導(dǎo)的應(yīng)答。癌細(xì)胞產(chǎn)生不同的可成為免疫治療的靶的蛋白。某些癌產(chǎn)生新的蛋白，例如作為突變的結(jié)果，它們是免疫原性的。然而，研究者們也發(fā)現(xiàn)腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞可特異性地識(shí)別癌細(xì)胞的未突變蛋白。例如，Rosenberg等人已發(fā)現(xiàn)腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞靶向和識(shí)別正常黑素瘤細(xì)胞和惡性黑素瘤細(xì)胞均產(chǎn)生的蛋白MART-1的抗原決定基。此外，抗MART-1或其與MHC I類(lèi)分子(具體的，HLA A2的抗原決定基)結(jié)合的肽的主動(dòng)或被動(dòng)免疫治療導(dǎo)致產(chǎn)生MART-1的黑素瘤細(xì)胞以及正常細(xì)胞的破壞。Y.Kawakami等人，J.Immunol.21237(1998)。
新的癌抗原被期望能激發(fā)免疫反應(yīng)，因?yàn)槊庖呦到y(tǒng)將識(shí)別其為異己蛋白。然而，因?yàn)槊庖呦到y(tǒng)對(duì)自身蛋白具有耐受性，其激發(fā)抵抗非突變的自身蛋白的免疫應(yīng)答的能力是令人吃驚的。人們確信這種免疫應(yīng)答直接抵抗通常不以足夠的量暴露于免疫系統(tǒng)的來(lái)激發(fā)耐受性或免疫應(yīng)答的表位。然而在癌中，這些決定簇不再避開(kāi)免疫系統(tǒng)的檢測(cè)。這點(diǎn)可能由通過(guò)MHC I類(lèi)分子對(duì)表位增加的提呈產(chǎn)生的。
細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答涉及主要組織相容性復(fù)合物分子的活性。在人體中，復(fù)合物被稱(chēng)為“HLA”(“人白細(xì)胞抗原”)復(fù)合物。在小鼠中，其是指“H-2”復(fù)合物。主要組織相容性復(fù)合物包括3類(lèi)蛋白，MHC I類(lèi)、MHC II類(lèi)和MHC III類(lèi)。MHC I類(lèi)分子幾乎在所有有核細(xì)胞的表面上表達(dá)。其提呈抗原肽到Tc細(xì)胞(CD8+)。在人體中有3個(gè)MHC I類(lèi)基因位點(diǎn)，HLA A，HLA B和HLA C。每一位點(diǎn)為高度多態(tài)的。因此，一個(gè)人在其細(xì)胞的表面可能有六種不同類(lèi)型的HLA分子。MHC II類(lèi)蛋白主要在抗原提呈細(xì)胞例如巨噬細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞和B細(xì)胞上表達(dá)，其提呈被加工過(guò)的抗原肽到TH細(xì)胞。在人體中有3個(gè)MHC II類(lèi)基因位點(diǎn)，HLA DP，HLA DQ和HLA DR。MHC III類(lèi)蛋白與各種的免疫過(guò)程相關(guān)，包括可溶性血清蛋白，以及補(bǔ)體系統(tǒng)的組分和腫瘤壞死因子。J.Kuby，Chapter 9，IMMUNOLOGY，第三版W.H.Freeman and Company，New York(1997)。
在癌細(xì)胞和正常細(xì)胞中，MHC I類(lèi)分子將自身蛋白的表位提呈到Tc細(xì)胞。HLA A，HLA B和HLA C分子結(jié)合大約長(zhǎng)為8到10氨基酸的具有特殊錨定殘基的肽。HLA I類(lèi)分子識(shí)別的錨定殘基依賴(lài)于HLA分子的特定等位形式。CD8+T細(xì)胞帶有能識(shí)別當(dāng)被在細(xì)胞上的特定HLA分子提呈時(shí)細(xì)胞上的特異性表位的T細(xì)胞受體。當(dāng)能被抗原提呈細(xì)胞刺激變?yōu)榧?xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞的Tc細(xì)胞接觸帶有HLA-肽復(fù)合物的細(xì)胞時(shí)，CTL與此細(xì)胞形成結(jié)合物并將其破壞。
肽通過(guò)MHC I類(lèi)分子的提呈包括內(nèi)源產(chǎn)生的蛋白通過(guò)蛋白酶體裂解為肽，通過(guò)ER和高爾基體進(jìn)行加工，通過(guò)肽的錨定殘基結(jié)合到MHC I類(lèi)分子的裂口以及最終提呈到細(xì)胞的表面。除其它因素外，依據(jù)特定的錨定殘基，某些肽可更緊密的結(jié)合于特定的HLA分子。結(jié)合較好的肽指“顯性”表位，而結(jié)合較差的肽成為“亞顯性”或“陰性”表位，自身蛋白或外源蛋白的顯性表位激發(fā)強(qiáng)烈的耐受性或免疫應(yīng)答。亞顯性或陰性的表位產(chǎn)生弱的或根本不產(chǎn)生免疫應(yīng)答。假設(shè)顯性表位與HLA分子的緊密結(jié)合導(dǎo)致它們?cè)诩?xì)胞表面密集提呈，產(chǎn)生更多的與免疫細(xì)胞反應(yīng)的機(jī)會(huì)以及更多的激發(fā)免疫應(yīng)答或耐受性的可能性。
研究表明在自身蛋白MART-1蛋白存在的情況下，免疫系統(tǒng)產(chǎn)生最多的抵抗亞顯性或陰性表位的CTL應(yīng)答。Y.Kawakami等，1997Immunol.Res.16313?？赡茉诎┘?xì)胞中亞顯性或陰性表位比在正常細(xì)胞中提呈得密集或量更大；所以免疫系統(tǒng)遇見(jiàn)這些先前未檢測(cè)到的表位時(shí)，將其識(shí)別為外源的并產(chǎn)生抵抗它們的免疫應(yīng)答。無(wú)論什么原因，將免疫系統(tǒng)暴露于自身蛋白的大量的亞顯性或陰性表位，作為一種激發(fā)免疫應(yīng)答抵抗產(chǎn)生所述蛋白的細(xì)胞的方式是癌癥免疫治療的關(guān)鍵要素。當(dāng)然，啟動(dòng)抗自身蛋白的免疫應(yīng)答將對(duì)癌性細(xì)胞和健康細(xì)胞二者均產(chǎn)生破壞。因此，為使免疫治療獲得成功，健康細(xì)胞必須是維持生命不必需的或具有通過(guò)其它療法可取代的功能。在前列腺癌和乳房癌中，通常的治療手段是分別將前列腺或乳房手術(shù)切除。在此情況下，大多數(shù)或所有顯示出前列腺或乳房抗原的組織將成為腫瘤細(xì)胞。
發(fā)明概述我們已發(fā)現(xiàn)健康和癌性的上皮來(lái)源的前列腺細(xì)胞，轉(zhuǎn)錄未重排的TCRγ基因的一部分。而在體外，此轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生兩種蛋白，一種為T(mén)CRγ的截短形式，令人吃驚的是，我們的研究顯示，在體內(nèi)，表達(dá)的蛋白不是TCRγ蛋白，而是可變閱讀框架表達(dá)的蛋白。相應(yīng)地，此蛋白被稱(chēng)為T(mén)CRγ可變閱讀框架蛋白或“TARP”。
我們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)TARP在上皮來(lái)源的前列腺細(xì)胞和前列腺癌細(xì)胞中表達(dá)。令人吃驚的是，我們發(fā)現(xiàn)相同的蛋白表達(dá)在許多的乳房癌細(xì)胞中。TARP因此可作為前列腺癌和表達(dá)TARP(表達(dá)TARP的乳房癌)的乳房癌細(xì)胞的標(biāo)記，并作為免疫治療的基礎(chǔ)。本發(fā)明提供了分離的或重組形式的核酸和蛋白。雖然我們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)此種蛋白在許多乳房癌細(xì)胞中被表達(dá)，因其被首先在前列腺細(xì)胞中鑒定，在下面通常被稱(chēng)為前列腺特異性(“PS”)—TCRγ。
在一方面，本發(fā)明提供了分離的含有TCRγ可變閱讀框架蛋白(“TARP”)的氨基酸序列的多肽。本發(fā)明進(jìn)一步提供了TARP的免疫原性片段(此片段可產(chǎn)生能特異性識(shí)別和結(jié)合于全長(zhǎng)TARP的抗體或其激活識(shí)別表達(dá)TARP的細(xì)胞的T細(xì)胞)，與TARP至少有90％序列同一性且其被特異性識(shí)別TARP的抗體特異性識(shí)別的多肽，以及，與TARP至少有90％序列同一性且其當(dāng)被加工并在主要組織相容性復(fù)合物分子體系中被提呈后激活T淋巴細(xì)胞抵抗表達(dá)TARP的細(xì)胞的多肽。本發(fā)明進(jìn)一步提供了組合物，其含有TARP，其免疫原性片段，或具有至少90％序列同一性且滿足上述功能條件的肽，并含有可藥用載體。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了分離的重組核酸分子，其編碼具有TCRγ可變閱讀框架蛋白(“TARP”)的氨基酸序列的多肽，編碼其免疫原性片段，編碼與TARP至少有90％序列同一性且其被特異性識(shí)別TARP的抗體特異性識(shí)別的多肽，或者，編碼與TARP至少有90％序列同一性且其當(dāng)被加工并在主要組織相容性復(fù)合體分子體系中被提呈后激活T淋巴細(xì)胞抵抗表達(dá)TARP的細(xì)胞的多肽。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種方法，包括給藥于個(gè)體一種組合物，該組合物選自分離的具有TCRγ可變閱讀框架蛋白(“TARP”)的氨基酸序列的多肽，其免疫原性片段，與TARP至少有90％序列同一性且被特異性識(shí)別TARP的抗體特異性識(shí)別的多肽，以及，與TARP至少有90％序列同一性且其當(dāng)被加工并在主要組織相容性復(fù)合體分子體系中被提呈后激活T淋巴細(xì)胞抵抗表達(dá)TARP的細(xì)胞的多肽。
本發(fā)明進(jìn)一步提供了給藥于個(gè)體一種組合物的方法，其中的組合物選自編碼TARP、其免疫原性片段、與TARP至少有90％序列同一性且被特異性識(shí)別TARP的抗體特異性識(shí)別的多肽、以及與TARP至少有90％序列同一性且當(dāng)被加工并在主要組織相容性復(fù)合體分子體系中被提呈后激活T淋巴細(xì)胞抵抗表達(dá)TARP的細(xì)胞的多肽的分離的核酸。
本發(fā)明進(jìn)一步提供了將組合物給藥于個(gè)體的方法，其中的組合物含有用包含TARP表位的多肽刺激的抗原提呈細(xì)胞。另外，本發(fā)明提供了給藥于個(gè)體一種組合物的方法，其中的組合物含有在體外被TARP、與TARP至少有90％序列同一性且被特異性識(shí)別TARP的抗體特異性識(shí)別的多肽、或者與TARP至少有90％序列同一性且當(dāng)被加工并在主要組織相容性復(fù)合體分子體系中被提呈后激活T淋巴細(xì)胞抵抗表達(dá)TARP的細(xì)胞的多肽致敏的細(xì)胞。
上述方法中所述的組合物可被給藥于患前列腺癌的個(gè)體，患乳房癌的個(gè)體，或未進(jìn)行乳房癌診斷的雌性個(gè)體。
該方法還包括在體外致敏CD8+細(xì)胞使其對(duì)TARP蛋白的表位敏感并將這些致敏細(xì)胞給藥于個(gè)體。CD8+細(xì)胞可為T(mén)c細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，Tc細(xì)胞可為腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞。
此外，該方法可包括共同給藥于個(gè)體免疫佐劑，其選自非特異性的免疫佐劑，亞細(xì)胞微生物產(chǎn)物和成分，半抗原，免疫原性蛋白，免疫調(diào)節(jié)劑，干擾素，胸腺激素和集落刺激因子。
該方法也進(jìn)一步包括給藥一種用含有TARP表位的多肽刺激的抗原提呈細(xì)胞，或給藥編碼含有TARP的表位的多肽的核酸序列，其中的核酸存在于重組病毒中。該方法進(jìn)一步包括給藥編碼含有TARP蛋白的表位的多肽的核酸序列。
此外，該方法包括給藥一種表達(dá)載體，其表達(dá)含有TARP蛋白的表位的多肽，其中表達(dá)載體存在于在重組細(xì)菌細(xì)胞中。進(jìn)一步地，該方法包括用表達(dá)含有TARP蛋白表位的多肽的表達(dá)載體免疫個(gè)體，其中的表達(dá)載體包含在自體重組細(xì)胞中。
在另一方面，本發(fā)明提供了一種檢測(cè)方法，在雄性中為檢測(cè)上皮來(lái)源的前列腺細(xì)胞，雌性中為檢測(cè)乳房癌細(xì)胞，包括檢測(cè)細(xì)胞中的所述雄性或所述雌性的編碼TARP的核酸轉(zhuǎn)錄本，或檢測(cè)轉(zhuǎn)錄本的翻譯所產(chǎn)生的TARP，因此在所述的雄性細(xì)胞中檢測(cè)到所述的轉(zhuǎn)錄本或蛋白則該細(xì)胞為前列腺上皮細(xì)胞，而在所述雌性的細(xì)胞中檢測(cè)到所述的蛋白或轉(zhuǎn)錄本則該細(xì)胞為乳房癌細(xì)胞。該方法可包括將來(lái)自所述細(xì)胞的RNA與在雜交條件下特異性雜交于轉(zhuǎn)錄本的核酸探針接觸，并檢測(cè)雜交。此外，該方法包括破壞細(xì)胞并使一部分細(xì)胞內(nèi)容物與含有靶向部分和可檢測(cè)標(biāo)記的嵌合分子接觸，其中的靶向部分特異性地結(jié)合于所述的蛋白，檢測(cè)結(jié)合于蛋白的標(biāo)記。靶向部分本身也可被標(biāo)記(例如，抗體如scFv可具有放射性殘基)。
被檢測(cè)的細(xì)胞可取自淋巴結(jié)，或乳房活組織。
最后，本發(fā)明提供了特異性結(jié)合于TCRγ可變閱讀框架蛋白的表位的抗體。
附圖的簡(jiǎn)要描述附

圖1.PS-TCRγ轉(zhuǎn)錄本的核苷酸序列(SEQ ID NO13)。在體外翻譯系統(tǒng)中，此轉(zhuǎn)錄本產(chǎn)生兩種多肽。第一種多肽具有推導(dǎo)的氨基酸序列，開(kāi)始于MQM...(″PS-TCRγ-1″，現(xiàn)在稱(chēng)為″TARP，″SEQ ID NO14)。據(jù)估計(jì)此多肽的分子量為7.2 kD。其由與自然TCRγ閱讀框架不一致的閱讀框架翻譯。第二種多肽具有開(kāi)始為MKT…的推導(dǎo)氨基酸序列(″PS-TCRγ-2″，SEQ ID NO15)。據(jù)預(yù)測(cè)，其分子重為13 kD。其由與TCRγ相同的閱讀框架翻譯且表現(xiàn)為T(mén)CRγ的截短形式。圖中的單下劃線表示轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)和多聚腺苷酸位點(diǎn)。
附圖2.TCRγ mRNA表達(dá)的雜交分析。附圖2A)多種組織的點(diǎn)雜交印跡顯示人TCRγ的不同的表達(dá)。陽(yáng)性組織為前列腺(C7)，小腸(E3)，脾(E4)，胸腺(E5)，外周白細(xì)胞(E6)，淋巴結(jié)(E7)，骨髓(E8)以及肺(F2)。附圖2B，Northern印跡顯示正常組織中TCRγ轉(zhuǎn)錄本的大小。在前列腺中表達(dá)的TCRγ轉(zhuǎn)錄本為1.1kb和2.8kb，而在脾臟、胸腺和外周白細(xì)胞中的主要轉(zhuǎn)錄本為1.5 kb。底片被曝光20小時(shí)。
附圖3.TCRγδ表達(dá)的Northern印跡分析。附圖3A)TCRγ恒定區(qū)(TCR Cγ)cDNA探針顯示了1.1和2.8kb前列腺特異性轉(zhuǎn)錄本(與附圖2B比較)。底片被曝光20小時(shí)。附圖3B)TCRδ恒定區(qū)(TCR Cδ)cDNA探針顯示TCRδ mRNA不在前列腺中表達(dá)，而在脾臟、胸腺和外周白細(xì)胞中表達(dá)。底片被曝光50小時(shí)。附圖3C)TCR Cγ cDNA探針表明LNCaP細(xì)胞系表達(dá)TCRγ而PC-3細(xì)胞系不表達(dá)。底片被曝光20小時(shí)。人β-肌動(dòng)蛋白mRNA的表達(dá)被分析作為對(duì)照。
附圖4.石蠟包埋的組織通過(guò)TCRγ(Cγ1-3′UTR)反義、35S-標(biāo)記探針進(jìn)行的原位雜交。左邊照片來(lái)自暗視野顯微鏡檢查而相應(yīng)的右邊的照片來(lái)自明視野顯微鏡檢查。暗視野照片中所示的明亮顆粒是RNA雜交信號(hào)。4A)來(lái)自67歲男性的前列腺組織顯示了陽(yáng)性的腺泡上皮細(xì)胞和陰性基質(zhì)細(xì)胞，(5倍放大)。4B)4A的明視野。4C)高度放大(40x)，顯示在右下角的陽(yáng)性區(qū)。4D)4C的明視野。4E)腎組織顯示沒(méi)有RNA雜交，(5倍放大)。4F)4E的明視野。
附圖5.LNCaP mRNA的引物延伸。在TCRγ恒定區(qū)(從Cγ1的5’末端開(kāi)始的75個(gè)核苷酸)逆轉(zhuǎn)引退火。逆轉(zhuǎn)錄本終止于大約128核苷酸處，用箭頭表示，其表明轉(zhuǎn)錄本在Cγ1的上游大約53核苷酸處啟始。含有LNCaP的TCRγ逆轉(zhuǎn)錄本的泳道被曝光72小時(shí)而標(biāo)記泳道被曝光8小時(shí)。
附圖6.前列腺TCRγ轉(zhuǎn)錄本。其圖示了前列腺是如何被轉(zhuǎn)錄和剪接的。轉(zhuǎn)錄本包括Jγ1.2片段，Cγ1的3個(gè)外顯子，接著是非翻譯序列。
附圖7.前列腺TCRγ的體外轉(zhuǎn)錄偶聯(lián)的翻譯分析。兩個(gè)大約為8和13 kDa的蛋白被獲得(泳道1)。使用空載體的陰性對(duì)照反應(yīng)(泳道)沒(méi)有產(chǎn)生任何的蛋白產(chǎn)物。
附圖8.用于PS-TCRγ轉(zhuǎn)錄分析的引物(SEQ ID NOs1-12)。
附圖9.前列腺特異性TCRγ轉(zhuǎn)錄本體外翻譯的分析。前列腺特異性TCRγ轉(zhuǎn)錄本在體外編碼兩種蛋白。35S-Met體外標(biāo)記的翻譯蛋白被置于16.5％Tris-Tricene凝膠上進(jìn)行跑膠并通過(guò)放射自顯影法進(jìn)行分析。所用突變構(gòu)建體的圖示分析被顯示在右邊?？瞻卓虼淼谝婚喿x框架且可能的啟動(dòng)密碼子用粗體表示，第二閱讀框架用陰影框表示且可能的啟動(dòng)密碼子用斜體表示，“X”表示一個(gè)ATG密碼子突變?yōu)锳TA。以kDa表示的大小標(biāo)志被顯示于頂部。
附圖10.TARP為前列腺中表達(dá)的核蛋白。獲自LNCaP細(xì)胞、PC3細(xì)胞或前列腺腫瘤樣本(癌)的蛋白提取物的Western印跡。20μg的每種蛋白提取物被置于16.5％Tris-Tricene凝膠上電泳且用抗TARP(上圖)或TCRγ(下圖)的抗體進(jìn)行探測(cè)。作為陽(yáng)性對(duì)照，1μg的His-標(biāo)記的TARP(上圖)或100ng的His-標(biāo)記的TCRγ(下圖)被置于凝膠上電泳(重組)。以kDa表示的大小標(biāo)志被顯示于左邊。(B)LNCaP細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)部分(細(xì)胞質(zhì))，膜部分(膜)以及核部分(核)的Western印跡。每一部分40g被置于16.5％Tris-Tricene凝膠上電泳且用抗TARP的抗體進(jìn)行探測(cè)。作為陽(yáng)性對(duì)照，1μg His-標(biāo)記的TARP被置于凝膠上跑膠(重組)。以kDa表示的分子大小被顯示于左邊。
附圖11.TARP mRNA在乳房癌細(xì)胞中的表達(dá)。(A)用TARP(上圖)或肌動(dòng)蛋白(下圖)特異的引物對(duì)獲自下列細(xì)胞系的RNA進(jìn)行RT-PCR前列腺(LNCaP和PC3)，成神經(jīng)細(xì)胞瘤(A172)，結(jié)腸(COLO205)，胃(KATO III)以及乳房(MCF7，BT-474，Hs57Bst，SK-BR-3，CRL-1897和MDA-468)。沒(méi)有模板的RT-PCR反應(yīng)被顯示為dH2O。(B)用TARP(上圖)或肌動(dòng)蛋白(下圖)特異的引物對(duì)獲自12個(gè)人乳房癌組織樣本的cDNA(1-12泳道)進(jìn)行PCR。沒(méi)有模板的PCR反應(yīng)被顯示為dH2O。對(duì)于兩個(gè)圖，20％的PCR產(chǎn)物被置于1％瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳且用溴化乙錠染色進(jìn)行顯影。
附圖12.在乳房細(xì)胞系中發(fā)現(xiàn)的TARP轉(zhuǎn)錄本與前列腺特異形式的相同。(A)TCRγ座位的圖示以及TARP如何在前列腺細(xì)胞中被轉(zhuǎn)錄和剪接。用于在圖B中RT-PCR分析的引物被顯示了出來(lái)。(B)TARPmRNA表達(dá)的RT-PCR分析。利用獲自前列腺細(xì)胞系(LNCaP和PC3)和乳房細(xì)胞系(MCF7，BT-474，SK-BR-3和Hs578Bst)的cDNA，并利用引物1和3(上圖)，TARP引物2和3(中圖)或肌動(dòng)蛋白引物(下圖)進(jìn)行PCR反應(yīng)。進(jìn)行沒(méi)有模板的RT-PCR，并顯示為dH2O。20％的PCR產(chǎn)物被置于1％的瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳并用溴化乙錠染色觀察。(C)TARP轉(zhuǎn)錄本的Northern印跡分析。獲自前列腺細(xì)胞系(LNCaP和PC3)和乳房細(xì)胞系(MCF7，BT-474，SK-BR-3和Hs578Bst)的2ugpoly(A)mRNA利用恒定區(qū)片段作為探針進(jìn)行分析。24小時(shí)曝光產(chǎn)生放射自顯影(上圖)。用人β-肌動(dòng)蛋白R(shí)NA探針在同一濾膜上產(chǎn)生條帶并進(jìn)行分析以校驗(yàn)證明相同的上樣量。曝光1小時(shí)產(chǎn)生放射自顯影(下圖)。表示核苷酸大小的RNA大小標(biāo)志被顯示左邊。
附圖13.TARP存在于乳房癌細(xì)胞的核中。(A)對(duì)獲自LNCaP，MCF7，BT-474，SK-BR-3和Hs578Bst細(xì)胞的核提取物進(jìn)行Western印跡分析。40μg的每種核提取物被置于16.5％的Tris-Tricene凝膠上電泳并用抗TARP(上圖)或TCRγ(下圖)的抗體進(jìn)行探測(cè)。作為陽(yáng)性對(duì)照，1μg的His-標(biāo)記的TARP(His-TARP)和100ng的His-標(biāo)記的TCRγ(His-TCRγ)在凝膠上跑電泳。大小標(biāo)志以kDa為單位顯示在左側(cè)。
附圖14.TARP的可能的功能區(qū)。(A)TARP含有一個(gè)可能的亮氨酸拉鏈基元和磷酸化位點(diǎn)。可能的亮氨酸拉鏈基元用亮氨酸加框表示，其后的堿性區(qū)加下劃線。cAMP-和cGMP-依賴(lài)的蛋白激酶磷酸化位點(diǎn)(氨基酸46-49和55-58)以及蛋白激酶C磷酸化位點(diǎn)(氨基酸19-21和20-22)用空心輪廓表示。(B)TARP與Tupl的蛋白序列比較。TARP(42-57)，Dictyostelium dicoideum Tupl(dTupl，521-536)以及Saccharomyces cerevisiae Tupl(yTupl，626-660)的氨基酸序列被顯示。保守的殘基被加框。
本發(fā)明的詳述I介紹令人驚訝地，人們已發(fā)現(xiàn)上皮來(lái)源的前列腺細(xì)胞以及很多乳房癌細(xì)胞表達(dá)T細(xì)胞受體γ鏈(″TCRγ″)的mRNA。前列腺中的主要TCRγ轉(zhuǎn)錄本與T淋巴細(xì)胞中表達(dá)的大小不同。前列腺上皮細(xì)胞和很多乳房癌高水平表達(dá)被認(rèn)為僅在T淋巴細(xì)胞中表達(dá)的基因的轉(zhuǎn)錄本的發(fā)現(xiàn)是出乎意料的。
因?yàn)門(mén)CRγ閱讀框架含有很好的Kozak序列(Kozak，M.Cell 44283-92(1986))，我們最初設(shè)想截短的TCRγ蛋白被編碼。因此，另一個(gè)意外的發(fā)現(xiàn)是在上皮前列腺細(xì)胞和乳房癌細(xì)胞中表達(dá)的TCRγ座位編碼一個(gè)7Kda的核蛋白。因?yàn)樵摰鞍资怯刹煌赥CRγ的閱讀框架所編碼的，我們將其命名為T(mén)CRγ可變閱讀框架蛋白，縮寫(xiě)為″TARP″。除了在TCRγ座位的一個(gè)內(nèi)含子中轉(zhuǎn)錄本來(lái)源的可變的閱讀框架被翻譯外，TARP具有另外兩種獨(dú)特的特征。首先，意外地在細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)這樣的一個(gè)小肽，因?yàn)榇蠖鄶?shù)是分泌型。另外，TARP缺少很好的Kozak序列。體外和體內(nèi)應(yīng)用在前列腺上皮細(xì)胞、前列腺癌細(xì)胞以及很多乳房癌的細(xì)胞中該種蛋白的存在為體內(nèi)和體外的應(yīng)用創(chuàng)造了大量的機(jī)會(huì)。首先抗該種蛋白的抗體能被用于體外測(cè)試來(lái)檢測(cè)樣品中表達(dá)TARP細(xì)胞的存在。例如下面描述的實(shí)施例中，在正常的乳房細(xì)胞中不存在TARP和TARP轉(zhuǎn)錄本，或者低水平存在，但是，在表達(dá)TARP的乳房癌細(xì)胞很容易被檢測(cè)到。在從個(gè)體取出的乳房細(xì)胞中檢測(cè)到高水平的TARP轉(zhuǎn)錄本或TARP，將表明個(gè)體存在表達(dá)TARP的乳房癌。鑒于前列腺細(xì)胞中TARP的表達(dá)，本領(lǐng)域的技術(shù)人員意識(shí)到在進(jìn)行性前列腺癌中去除前列腺是一種常見(jiàn)的手術(shù)干預(yù)。從一個(gè)已去除前列腺的個(gè)體的細(xì)胞中檢測(cè)到TARP則表明存在前列腺癌。(本領(lǐng)域的技術(shù)人員將意識(shí)到每年大約有1,000男人被診斷出患有乳房癌。因此，病人單一的患有乳房癌不是不可能的。假定事實(shí)上男性的前列腺癌患者超過(guò)正常人的200倍，且所關(guān)注的患者已被發(fā)現(xiàn)患有前列腺癌，則病人單獨(dú)患乳房癌的可能性很小。診斷可通過(guò)取樣位點(diǎn)的一些信息被證實(shí)，其中樣品被進(jìn)行組織學(xué)和細(xì)胞形態(tài)學(xué)以及其它常規(guī)診斷標(biāo)準(zhǔn)的研究。在任一情況中，由于任一病征的存在需要進(jìn)一步的鑒定和監(jiān)測(cè)，檢測(cè)到TARP表達(dá)細(xì)胞存在于前列腺已被切除的男性中是非常有用的，不管該個(gè)體是否已患上前列腺癌，乳房癌，或二者。在沒(méi)有前列腺癌的男性中檢測(cè)到TARP表達(dá)細(xì)胞是乳房癌的一個(gè)指標(biāo)。)TARP本身，TARP的免疫原性片段，以及編碼TARP或其免疫原性片段的核酸也可被用于在體外激活來(lái)自個(gè)體的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(″CTL″)，在灌輸給所述個(gè)體后用以攻擊前列腺癌和表達(dá)TARP的乳房癌。
可將TARP本身、TARP的免疫原性片段、編碼TARP或其免疫原性片段的核酸分子通常與可藥用載體一起對(duì)個(gè)體給藥，以刺激產(chǎn)生或加強(qiáng)對(duì)前列腺癌或表達(dá)TARP的乳房癌的免疫應(yīng)答。對(duì)已被確診患有前列腺癌或表達(dá)TARP的乳房癌的個(gè)體可治療性地給藥這一類(lèi)的組合物。
如下所討論的，TARP是一種具有調(diào)控轉(zhuǎn)錄的蛋白結(jié)構(gòu)特征的核蛋白。人們預(yù)料細(xì)胞中TARP水平的調(diào)節(jié)將影響細(xì)胞的生長(zhǎng)，細(xì)胞的復(fù)制，或二者。因此，TARP水平的調(diào)節(jié)在控制癌細(xì)胞的入侵方面可能是很重要的。細(xì)胞中的TARP的水平可以通過(guò)不同的減少RNA轉(zhuǎn)錄本被翻譯為蛋白例如核酶和反義分子的形式來(lái)降低。細(xì)胞中TARP的水平也可被增加。例如，含有編碼TARP的核酸的表達(dá)載體，由強(qiáng)組成型啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)，其可被導(dǎo)入到細(xì)胞中。核酸的組成型轉(zhuǎn)錄導(dǎo)致蛋白在細(xì)胞中高水平的表達(dá)。
此部分的余下內(nèi)容描述了TARP的不同結(jié)構(gòu)特征。接下來(lái)描述的是本文所用術(shù)語(yǔ)的定義，然后是有關(guān)TARP的免疫原性片段的選擇、TARP對(duì)個(gè)體的給藥、抗TARP抗體的形成、TARP轉(zhuǎn)錄本和蛋白的檢測(cè)以及藥物組合物的討論。TARP的結(jié)構(gòu)特征TARP在七體重復(fù)中含有五個(gè)亮氨酸，此表明TARP含有亮氨酸拉鏈二聚基元(附圖7A)。所以TARP必定含有一個(gè)兩親螺旋。一種表明TARP可含有一個(gè)兩性螺旋的跡象是絲氨酸和脯氨酸殘基(這些殘基被認(rèn)為是螺旋啟始位置的殘基)被發(fā)現(xiàn)緊挨在第一個(gè)亮氨酸重復(fù)的前面。第二，很多的帶電氨基酸被發(fā)現(xiàn)在七體重復(fù)中，因此螺旋有兩性特性且可能充當(dāng)與其它螺旋的鹽橋。盡管亮氨酸在七體重復(fù)中的存在是亮氨酸拉鏈基元的指示，有些被鑒定在七體重復(fù)中含有5個(gè)亮氨酸的蛋白并沒(méi)被認(rèn)為是亮氨酸拉鏈蛋白。例如，親核素(karyopherin)的晶體結(jié)構(gòu)(Chook，Y.M.等，Nature 399230-237(1999))，B.sterarothermophilus嘧啶核苷酸磷酸化酶(Pugmire，M.J.等，Structure 61467-1479(1998))以及T.thermophilus苯丙氨酰tRNA合成酶(Mosyak，L.等，Nat.Struct.Biol.2537-547(1995))表明這些蛋白在含有五個(gè)亮氨酸的七體重復(fù)序列中不含有α-螺旋結(jié)構(gòu)。需要用相互作用和結(jié)構(gòu)研究來(lái)測(cè)定在TARP中發(fā)現(xiàn)的亮氨酸重復(fù)的意義。
TARP氨基酸序列另一個(gè)獨(dú)特的特征是堿性氨基酸的區(qū)域緊接著可能的亮氨酸拉鏈基元(附圖7A)，此表明其可能的DNA結(jié)合基元。然而，其中堿性區(qū)域的方向是非常獨(dú)特的，其緊接著亮氨酸重復(fù)而不是在其前面。大多數(shù)結(jié)合DNA的亮氨酸拉鏈蛋白在亮氨酸重復(fù)前面具有堿性區(qū)域(參見(jiàn)(Chook，Y.M.等，Nature 399230-237(1999)))。TARP的堿性區(qū)域可能僅僅充當(dāng)核定位信號(hào)，但TARP是一種核蛋白的事實(shí)加強(qiáng)了TARP可結(jié)合DNA的假說(shuō)。
為了檢測(cè)TARP是否與任意已知的蛋白具有同源性，我們?cè)贕enBank中進(jìn)行了蛋白BLAST檢索。此檢索顯示TARP的氨基酸序列與Dictyostelium dicoideum Tupl(GenBank登錄號(hào)AAC29438)以及Saccharomyces cerevisiae Tupl(Williams，F(xiàn).E.等，Mol.Cell.Biol.106500-6511(1990))(附圖7C)有一些同源性。酵母Tupl通常在Cyc8(Ssn6)復(fù)合體發(fā)現(xiàn)且是被葡萄糖、氧和DNA損害所調(diào)控的基因的轉(zhuǎn)錄抑制所需要的(Tzamarias，D.等，Genes Dev.9821-831(1995))。Cyc8(Ssn6)和Tupl都不結(jié)合DNA，但是它們通過(guò)特異性DNA結(jié)合蛋白例如α2、Migl、Roxl和al作為共抑制劑復(fù)合物的一個(gè)部分而發(fā)揮作用(Tzamarias，D.等，Genes Dev.9821-831(1995))。Tup1的C′-末端部分含有富含天門(mén)冬氨酸和色氨酸的43個(gè)氨基酸序列的6個(gè)重復(fù)，已知為WD-40或β-轉(zhuǎn)導(dǎo)素重復(fù)子(Williams，F(xiàn).E.等，Mol.Cell.Biol.106500-6511(1990)；Fong，H.K.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA832162-2166(1986))。WD-40重復(fù)子已在很多蛋白中被鑒定出，在蛋白-蛋白的相互作用中起作用。值得注意的是，Tupl已被顯示通過(guò)2個(gè)WD-40重復(fù)子與α2相互作用(Komachi，K.等，Genes Dev.82857-2867(1994))。令人感興趣的是TARP與Tupl的第5個(gè)WD-40重復(fù)子具有同源性(附圖7C)。因?yàn)門(mén)ARP是一種核蛋白，其與Tupl同源則表明TARP是一種涉及轉(zhuǎn)錄調(diào)控的功能性核蛋白復(fù)合物的成員。
TARP抗體識(shí)別前列腺和乳房核提取物的雙重物質(zhì)(附圖6A)。最快的7 kDa條帶與His-TARP重組蛋白共移動(dòng)，而最弱的條帶為較大分子量。對(duì)于9kDa條帶的一個(gè)可能解釋則是存在翻譯后修飾。為了確定TARP是否含有任意已知的翻譯后修飾的位點(diǎn)，我們利用PROSITE程序分析TARP氨基酸序列，其中的PROSITE程序來(lái)自Swiss Institute of Bioinformatics ExPASy proteomics server(http//www.expasy.ch)(Appel，R.D.等，Trends Biochem.Sci.19248-260(1994)；Hofmann，K.等，Nucleic Acids Res.27215-219(1999))。如附圖7A所示，許多可能的磷酸化作用位點(diǎn)被發(fā)現(xiàn)，包括cAMP和cGMP-依賴(lài)性蛋白激酶磷酸化位點(diǎn)(RRAT和RRGT)以及蛋白激酶C磷酸化位點(diǎn)(SSR和SRR)。已在很多例子中表明在SDS PAGE凝膠上磷酸化作用引起蛋白顯示出較大分子量。如果也是這種情況，附圖6的結(jié)果表明未修飾的形式在LNCaP細(xì)胞中是普遍的，而且僅僅磷酸化形式存在于MCF7和SK-BR-3細(xì)胞中。因此，TARP可能在前列腺和乳房癌細(xì)胞中表達(dá)后進(jìn)行了翻譯后-修飾。
我們最初的對(duì)TARP轉(zhuǎn)錄本的研究沒(méi)有揭示TARP在乳房中表達(dá)(Essand，M.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 969287-9292(1999))。一種可能的解釋是TARP在正常乳房中表達(dá)的水平很低，因此是很難被檢測(cè)的。如在結(jié)果部分中所述的，與癌樣品中檢測(cè)到的強(qiáng)烈信號(hào)相比，在正常乳房樣品的PCR分析中檢測(cè)到非常弱的信號(hào)。因此，TARP在乳房癌細(xì)胞中的存在可表明在乳房細(xì)胞致癌轉(zhuǎn)化后TARP被誘導(dǎo)表達(dá)。此外，TARP在乳房癌細(xì)胞中的存在表明TARP被雌激素所調(diào)控。在TARP的內(nèi)含啟動(dòng)子中鑒定出的使雄激素應(yīng)答元件(ARE)與雌激素應(yīng)答元件(ERE)結(jié)合的元件加強(qiáng)了這一假說(shuō)。此雜交元件含有兩個(gè)半-位點(diǎn)，其在5’末端對(duì)ARE特異，在3’末端對(duì)ERE特異[(Zilliacus，J.等，Mol.Endocrinol.9389-400(1995))以及未公開(kāi)的數(shù)據(jù)]]。另外需要進(jìn)行一些實(shí)驗(yàn)來(lái)檢測(cè)是否雌激素調(diào)控TARP。然而有一些例子，其中的突變體ARE引起某些前列腺特異性基因在乳房腫瘤中表達(dá)。例如，前列腺特異性抗原(PSA)已被顯示在乳房腫瘤中表達(dá)(Majumdar，S.等，Br.J.Cancer 791594-1602(1999))。PSA異常表達(dá)的分子分析使得發(fā)現(xiàn)了在PSA啟動(dòng)子中發(fā)現(xiàn)的ARE中的單一位點(diǎn)突變。據(jù)信，該突變導(dǎo)致雄激素調(diào)控的PSA在乳房瘤中表達(dá)的喪失(Majumdar，S.等，Br.J.Cancer 791594-1602(1999))。此時(shí)是否在3個(gè)被檢測(cè)的乳房細(xì)胞系中在TARP啟動(dòng)子中發(fā)生了類(lèi)似的突變?nèi)圆坏枚?br> 前列腺依據(jù)雄激素來(lái)維持其結(jié)構(gòu)和功能。當(dāng)前列腺細(xì)胞變?yōu)閻盒约?xì)胞時(shí)，其失去了雄激素依賴(lài)性。在此研究中，我們使用兩種對(duì)用于生長(zhǎng)的雄激素具有不同依賴(lài)性的前列腺細(xì)胞系LNCaP和PC3細(xì)胞。雄激素受體存在于雄激素依賴(lài)的LNCaP細(xì)胞系中，但不存在于雄激素非依賴(lài)性的PC3細(xì)胞系中(Tilley，W.D.等，Cancer Res.505382-5386(1990))。如附圖3所示，TARP在LNCaP細(xì)胞而不在PC3細(xì)胞中表達(dá)。此結(jié)果表明TARP表達(dá)可通過(guò)雄激素刺激來(lái)調(diào)控。TARP啟動(dòng)子中的ARE樣元件的鑒定加強(qiáng)了TARP被雄激素誘導(dǎo)的觀點(diǎn)。在LNCaP細(xì)胞而不在PC3細(xì)胞中表達(dá)表明TARP在調(diào)控雄激素依賴(lài)的應(yīng)答中是重要的II.名詞定義除非另有定義，此處所用的技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)具有本領(lǐng)域技術(shù)人員通常理解的含義。下面引用的文獻(xiàn)提供了本發(fā)明所用的很多術(shù)語(yǔ)的基本定義Singleton等，微生物學(xué)和分子生物學(xué)詞典(DICTIONARY OFMICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY)(第二版，1994)；劍橋科技詞典(THE CAMBRIDGE DICTIONARY OF SCIENCE ANDTECHNOLOGY)(Walker ed.，1988)；遺傳學(xué)專(zhuān)業(yè)詞典(THEGLOSSARY OF GENETICS)，第5版.，R.Rieger等(編輯)，SpringerVerlag(1991)；和Hale & Marham，HARPER COLLINS生物學(xué)詞典(THE HARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY)(1991)。如此處所述的，下面的術(shù)語(yǔ)除非另有說(shuō)明，其具有上述詞典中的含義。
″T細(xì)胞受體″是指在含有一個(gè)α鏈和一個(gè)β鏈或一個(gè)γ鏈和一個(gè)δ鏈的T細(xì)胞表面發(fā)現(xiàn)的雜二聚體。T細(xì)胞受體識(shí)別與MHC分子結(jié)合的抗原。
″T-細(xì)胞受體γ可變閱讀框架蛋白″和″TARP″是指一種多肽，其序列如例如附圖14所描述的。此多肽由T細(xì)胞受體γ基因翻譯而來(lái)，所述基因轉(zhuǎn)錄本存在于上皮來(lái)源的前列腺細(xì)胞中，前列腺癌細(xì)胞中，以及在很多乳房癌中。由于″TARP″中的最后一個(gè)縮寫(xiě)字母代表單詞″蛋白″，所以″TARP蛋白″是多余的。
此處所用的從其可翻譯成TARP的核酸轉(zhuǎn)錄本是指″TARP核酸″或″編碼TARP的核酸″，從中轉(zhuǎn)錄TARP的基因在此處是指″TARP基因?！迦绱颂幩玫模琓ARP的″免疫原性片段″是指TARP的一部分，當(dāng)其在主要組織相容性復(fù)合物分子體系中被細(xì)胞提呈后，可以在T細(xì)胞活化測(cè)定中，激活T淋巴細(xì)胞抵抗表達(dá)TARP的細(xì)胞。盡管較長(zhǎng)的片段也可被使用，典型地，此種片段為T(mén)ARP的8到12個(gè)連續(xù)氨基酸。
在上下文中將一個(gè)與另一個(gè)多肽比較時(shí)，“序列同一性”通過(guò)比較作為參考序列的TARP序列與一個(gè)受試序列而被測(cè)定。典型地，兩個(gè)序列進(jìn)行最大和最佳比對(duì)。
″配體″是指一種特異性與靶分子結(jié)合的化合物。
″受體″是特異性與配體結(jié)合的化合物。
″細(xì)胞毒素T淋巴細(xì)胞″(″CTL″)在對(duì)腫瘤細(xì)胞的免疫應(yīng)答中是重要的。CTL識(shí)別被在幾乎所有有核細(xì)胞的細(xì)胞表面表達(dá)的HLA I類(lèi)分子提呈的肽的表位。
已知腫瘤特異性輔助T淋巴細(xì)胞(″HTL″)對(duì)維持有效的抗腫瘤免疫時(shí)是很重要的。其在抗腫瘤免疫中的作用也已在動(dòng)物模型中被證明，其中這些細(xì)胞不僅為CTL的誘導(dǎo)和抗體應(yīng)答提供幫助，而且提供效應(yīng)器功能，該功能通過(guò)直接細(xì)胞接觸和通過(guò)淋巴因子(例如IFNγ和IFN-α)的分泌來(lái)介導(dǎo)。
″抗體″是指特異性識(shí)別和結(jié)合表位(例如，抗原)的至少含有輕鏈或重鏈免疫球蛋白可變區(qū)的多肽配體。包括完整的免疫球蛋白和變體和本領(lǐng)域已知的它們的部分例如Fab′片段，F(xiàn)(ab)′2片段，單鏈Fv蛋白(″scFv″)，以及二硫化物穩(wěn)定的Fv蛋白(″dsFv″)。scFv蛋白是一種融合蛋白，其免疫球蛋白的輕鏈可變區(qū)和免疫球蛋白的重鏈可變區(qū)通過(guò)接頭結(jié)合。天然的免疫球蛋白由免疫球蛋白基因編碼。包括κ和λ輕鏈恒定區(qū)基因，α、γ、δ、ε和μ重鏈恒定區(qū)基因，以及無(wú)數(shù)的免疫球蛋白可變區(qū)基因。術(shù)語(yǔ)″抗體″包括多克隆抗體，單克隆抗體，嵌合抗體和人源化抗體，通過(guò)免疫產(chǎn)生的，從雜交瘤產(chǎn)生的，或重組的。
″表位″或″抗原決定基″是指B和/或T細(xì)胞對(duì)其產(chǎn)生應(yīng)答的抗原上的位點(diǎn)。表位可由抗原上的連續(xù)氨基酸形成或由非相鄰氨基酸通過(guò)蛋白質(zhì)的三級(jí)折疊形成。由連續(xù)氨基酸形成的表位典型地在變性溶劑中可保留而由非鄰接氨基酸形成的表位典型地在用變性溶劑的處理中會(huì)丟失。一個(gè)表位典型地在獨(dú)特空間構(gòu)象中包括至少3個(gè)，和通常更多，至少5個(gè)或8-10個(gè)氨基酸。測(cè)定表位的空間構(gòu)象的方法包括，例如，x-光衍射以及兩維核磁共振。參見(jiàn)，例如.，分子生物學(xué)方法，Vol.66，Glenn E.Morris，Ed(1996)中的表位繪圖手冊(cè)(Epitope MappingProctocols in Methods in Molecular Biology)。
當(dāng)配體或受體進(jìn)行結(jié)合反應(yīng)時(shí)，配體或受體“特異性地結(jié)合于”某一化合物，即“待分析物”，該結(jié)合是待分析物在異質(zhì)化合物樣品中存在的決定因素。因此，配體或受體優(yōu)選與特定的待分析物結(jié)合且不結(jié)合樣品中的有效量的其它物質(zhì)。例如，多核苷酸特異性地結(jié)合于含有一個(gè)互補(bǔ)序列的待分析多核苷酸而抗體在免疫測(cè)定條件下特異地與含有抗體所針對(duì)的表位的抗原待分析物結(jié)合。
″免疫測(cè)定″是指檢測(cè)樣品中待分析物的方法，其中待分析物的特異性是抗體和配體之間的特異性結(jié)合所賦予的。包括通過(guò)抗體和配體之間的特異性結(jié)合來(lái)檢測(cè)抗體待分析物。參見(jiàn)Harlow和Lane(1988)抗體，實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)，冷泉港出版社，New York，描述了可被用來(lái)檢測(cè)特異性免疫活性的免疫測(cè)定形式和條件。
″疫苗″是指含有有效賦予生物體僅引起較低發(fā)病率和致死率的生物免疫治療水平的藥劑或組合物。當(dāng)然，制備疫苗的方法在免疫系統(tǒng)的的研究并預(yù)防和治療動(dòng)物和人類(lèi)疾病方面是有用的。
“免疫有效量”是有效地在個(gè)體中引起免疫應(yīng)答的量″多肽″是指由氨基酸殘基、相關(guān)的天然存在的其結(jié)構(gòu)變體和合成的通過(guò)肽鍵連接的非天然存在的類(lèi)似物、相關(guān)的天然存在的結(jié)構(gòu)變體，以及合成的非天然產(chǎn)生的類(lèi)似物組成的聚合物。合成多肽可被例如利用自動(dòng)多肽合成儀來(lái)合成。術(shù)語(yǔ)“蛋白質(zhì)”典型地是指大的多肽。術(shù)語(yǔ)“肽”典型地是指短的多肽。
在此使用常規(guī)的符號(hào)來(lái)描述多肽序列多肽序列的左手端為氨基末端，多肽序列的右手端為羧基末端″融合蛋白″是指由兩個(gè)或多個(gè)多肽通過(guò)肽鍵連接形成的多肽，其中的肽鍵是由一個(gè)多肽的氨基末端和另一個(gè)多肽的羧基末端形成的。融合蛋白可典型地被表達(dá)為單一連續(xù)的融合蛋白的核酸序列所編碼。然而，融合蛋白也可由組成型多肽的化學(xué)偶聯(lián)來(lái)形成。
″保守替代″是指多肽中的氨基酸用功能類(lèi)似的氨基酸來(lái)替代。下列6組中均包括作為另一個(gè)氨基酸保守替代的氨基酸1)丙氨酸(A)，絲氨酸(S)，蘇氨酸(T)；2)天門(mén)冬氨酸(D)，谷氨酸(E)；3)天冬酰胺(N)，谷氨酰胺(Q)；4)精氨酸(R)，賴(lài)氨酸(K)；
5)異亮氨酸(I)，亮氨酸(L)，甲硫氨酸(M)，纈氨酸(V)；和6)苯丙氨酸(F)，酪氨酸(Y)，色氨酸(W)。
兩個(gè)蛋白如存在于不同的種中且具有共同的遺傳祖先和70％的氨基酸序列同一性則彼此是″同源物″。
″大體上純的″或″分離的″是指目的物質(zhì)是主要存在的物質(zhì)(例如，以摩爾計(jì)算，在組合物中比其它任意的大分子物質(zhì)含量更多)，而基本上純化的部分是一種其中含有在所有存在的大分子物質(zhì)中至少50％(以摩爾計(jì)算)為目的物質(zhì)的組分。通常，大體上純的組分是指組分中的大約80％到90％或以上的大分子物質(zhì)是純化的目的物質(zhì)。如果組分主要含有一種單一的大分子物質(zhì)，則目的物質(zhì)被純化到基本上同質(zhì)(通過(guò)常規(guī)的檢測(cè)方法在組分中檢測(cè)不到污染物)。為了定義，溶劑、小分子(＜500道爾頓)、穩(wěn)定劑(例如，BSA)，以及元素離子在此不被認(rèn)為是大分子。
″核酸″是指由通過(guò)磷酸二酯鍵連接的核苷酸(核糖核苷酸，脫氧核糖核苷酸，其相關(guān)的天然存在的結(jié)構(gòu)變體，及合成的非天然存在的其類(lèi)似物)單元、相關(guān)的天然存在的其結(jié)構(gòu)變體及合成的非天然存在的其類(lèi)似物組成的聚合物。因此，此術(shù)語(yǔ)包括核苷酸聚合物，其中的核苷酸及其之間的鍵，包括非天然存在的合成類(lèi)似物，例如(但不限制于)，硫代磷酸酯，氨基磷酸酯，甲基磷酸鹽，手性-甲基磷酸鹽，2-O-甲基核糖核苷酸，肽-核酸(PNA)，等等。此種多核苷酸可以利用例如自動(dòng)DNA合成儀來(lái)合成。術(shù)語(yǔ)“寡核苷酸”典型地是指短的多核苷酸，通常不長(zhǎng)于50個(gè)核苷酸。當(dāng)通過(guò)DNA來(lái)表示核苷酸序列時(shí)(例如，A，T，G，C)，可以理解的是其也包括RNA序列(例如，A，U，G，C)，其中的″U″替代″T″。
此處所用的描述核苷酸序列的常規(guī)表示是單鏈核苷酸的左手邊為5’末端；雙鏈核苷酸序列的左手方向作為5’方向。產(chǎn)生RNA轉(zhuǎn)錄本的核苷酸5’到3’的增加的方向作為轉(zhuǎn)錄的方向。與mRNA具有相同序列的DNA鏈被稱(chēng)為“編碼鏈”；與轉(zhuǎn)錄自DNA的mRNA具有相同序列的且位于RNA轉(zhuǎn)錄本的5’末端的5’的DNA鏈的序列為″上游序列″；與轉(zhuǎn)錄自DNA的mRNA具有相同序列的且位于編碼RNA轉(zhuǎn)錄本的3’末端的3’的DNA鏈的序列為″下游序列″；″cDNA″是指互補(bǔ)于或等同于mRNA的DNA，其為單鏈或雙鏈的形式。
″編碼″是例如基因、cDNA或mRNA充當(dāng)模板來(lái)合成其它聚合物的多核苷酸和在生物學(xué)的過(guò)程中具有所定義的核苷酸序列(例如，rRNA，tRNA和mRNA)或所定義的氨基酸序列大分子中的特定核苷酸序列固有的特性以及由其產(chǎn)生的生物學(xué)特性。因此，如果由基因產(chǎn)生的mRNA的轉(zhuǎn)錄和翻譯在細(xì)胞或其它的生物系統(tǒng)中產(chǎn)生蛋白質(zhì)則此基因編碼了蛋白?；蚧騝DNA的編碼鏈(等同于mRNA序列且通常被顯示在序列表中的核苷酸序列)，以及被用作轉(zhuǎn)錄模板的非編碼鏈可被稱(chēng)為編碼蛋白或基因或cDNA的其它產(chǎn)物。除非另有說(shuō)明，“編碼氨基酸序列的核苷酸序列”包括所有的編碼相同氨基酸序列的核苷酸序列簡(jiǎn)并形式。編碼蛋白的核苷酸序列和RNA可包括內(nèi)含子。
″重組核酸″是指具有非天然連接在一起的核苷酸序列的核酸。其包括含有擴(kuò)增的或裝配的可用于轉(zhuǎn)化合適宿主細(xì)胞的核酸的核酸載體。含有重組核酸的宿主細(xì)胞稱(chēng)為“重組宿主細(xì)胞”。然后基因在重組宿主中表達(dá)來(lái)產(chǎn)生，例如，“重組多肽”。重組核酸也可行使非編碼的功能(例如，啟動(dòng)子，復(fù)制區(qū)，核糖體結(jié)合位點(diǎn)等)。
″表達(dá)調(diào)控序列″是指多核苷酸中的調(diào)控與其可操作地連接的核苷酸序列的表達(dá)(轉(zhuǎn)錄和/或翻譯)的核苷酸序列。“可操作地連接”是指兩個(gè)部分的功能關(guān)系，其中一個(gè)部分的活性(例如，調(diào)控轉(zhuǎn)錄的能力)是另一個(gè)部分作用的結(jié)果(例如，序列的轉(zhuǎn)錄)。表達(dá)調(diào)控序列可包括，例如，用于舉例而并非限制，啟動(dòng)子的序列(例如，誘導(dǎo)型的或組成型的)，增強(qiáng)子，轉(zhuǎn)錄終止子，起始密碼子(例如，ATG)，內(nèi)含子的剪接信號(hào)，以及終止密碼子。
″表達(dá)盒″是指含有與可表達(dá)的核苷酸序列可操作相連的表達(dá)調(diào)控序列的重組核酸構(gòu)建體。表達(dá)盒通常含有足夠用于表達(dá)的順式作用元件，其它用于表達(dá)的元件可由宿主細(xì)胞或體外表達(dá)系統(tǒng)提供。
″表達(dá)載體″是指含有一個(gè)表達(dá)盒的載體。表達(dá)載體包括所有本領(lǐng)域已知的載體，例如，粘粒，質(zhì)粒(例如，裸露的或包含在脂質(zhì)體中的)以及包含表達(dá)盒的病毒。
如果多核苷酸的序列是與其序列是第二序列的多核苷酸特異地雜交的第一序列，則相對(duì)于第二序列，第一序列是“反義序列”。
用于描述兩個(gè)或多個(gè)核苷酸序列或氨基酸序列之間的關(guān)系的術(shù)語(yǔ)包括″參考序列″，″選自″，″對(duì)比窗″，″同一性″，″序列同一性的百分比″，″基本上相同″，″互補(bǔ)″和″基本互補(bǔ)″。
為了核酸序列的序列比較，典型地，一個(gè)序列充當(dāng)參考序列，來(lái)與待測(cè)序列進(jìn)行比較。當(dāng)使用序列比較算法時(shí)，測(cè)試序列和參考序列被輸入到計(jì)算機(jī)中，指定亞序列坐標(biāo)系，如果需要，還要設(shè)定序列算法程序的參數(shù)。使用默認(rèn)的程序參數(shù)。序列比較的比對(duì)方法是本領(lǐng)域公知的?？蛇M(jìn)行序列比較的最佳比對(duì)通過(guò)如下方法進(jìn)行例如Smith和Waterman，Adv.Appl.Math.2482(1981)的局部同源性算法，Needleman和Wunsch，J.Mol.Biol.48443(1970)的同源性比對(duì)算法，Pearson&Lipman，Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA 852444(1988)的相似性檢索法，這些算法的計(jì)算機(jī)處理(GAP，BESTFIT，F(xiàn)ASTA，和TFASTA，Wisconsin Genetics Software Package，Genetics ComputerGroup，575 Science Dr.，Madison，WI)，或通過(guò)人工比對(duì)和肉眼檢察(參見(jiàn)，例如現(xiàn)代分子生物學(xué)手冊(cè)(Current Proctocols in Molecular Biology)(Ausubel等編輯，1995增補(bǔ)本))。
一個(gè)有用算法的例子是PILEUP。PILEUP利用Feng & Doolittle，J.Mol.Evol.35351-360(1987)的改進(jìn)比對(duì)法的簡(jiǎn)化方法。該方法類(lèi)似于Higgins & Sharp，CABIOS 5151-153(1989)所描述的方法。利用PILEUP，比較參考序列與其它的測(cè)試序列來(lái)測(cè)定序列同一性的百分比，使用下面的參數(shù)默認(rèn)缺口權(quán)值(3.00)，默認(rèn)缺口長(zhǎng)度權(quán)值(0.10)，以及加權(quán)的末端缺口。PILEUP可從GCG序列分析軟件包中獲得，例如，7.0版本(Devereaux等，Nuc.Acids Res.12387-395(1984)。
另一個(gè)適于測(cè)定百分序列同一性和相似性的算法的例子是BLAST和BLAST 2.0算法，其被描述在Altschul等，J.Mol.Biol.215403-410(1990)和Altschul等，Nucleic Acids Res.253389-3402(1977))中。進(jìn)行BLAST分析的軟件可通過(guò)國(guó)家生物工程信息中心(http//www.ncbi.nlm.nih.gov/)獲得。BLASTN程序(用于核苷酸程序)使用默認(rèn)的字節(jié)長(zhǎng)(W)為11，校驗(yàn)值(B)為50，期望值(E)為10，M＝5，N＝-4，和兩個(gè)鏈的比較。BLASTP程序(用于氨基酸序列)使用默認(rèn)的字節(jié)(W)長(zhǎng)為3，期望值(E)為10，以及BLOSUM62得分矩陣(參見(jiàn)Henikoff & Henikoff，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 8910915(1989))。
″嚴(yán)格雜交條件″是指50％甲酰胺，5×SSC和1％SDS在42℃下溫育或5×SSC和1％SDS 65℃下溫育，并用0.2×SSC和0.1％SDS在65℃下洗滌。
″自然產(chǎn)生的″這一術(shù)語(yǔ)，對(duì)研究對(duì)象而言是指研究對(duì)象可在自然中找到。例如，可從天然源中分離得到并沒(méi)有經(jīng)過(guò)人在實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行的有意的改造的存在于生物體(包括病毒)中的氨基酸或核苷酸序列。就可稱(chēng)其為“天然產(chǎn)生的”。
“接頭”是指通過(guò)共價(jià)鍵或離子鍵、范德華力或氫鍵將兩個(gè)分子連接在一起的分子，例如，與一互補(bǔ)序列在5’末端雜交并與另一互補(bǔ)序列在3’末端雜交的核酸分子由此將兩個(gè)非互補(bǔ)的序列連接起來(lái)。
“藥物組合物”是指適于在哺乳動(dòng)物中使用的組合物。藥物組合物含有藥學(xué)有效量的活性劑及可藥用載體。
“藥學(xué)有效量的”是能產(chǎn)生所希望的藥學(xué)結(jié)果的有效藥劑的量。
“可藥用載體”是指任何標(biāo)準(zhǔn)的藥物載體、緩沖劑和賦形劑如磷酸鹽緩沖液、5％葡萄糖水溶液、乳液如油/水乳液或水/油乳液和各種類(lèi)型的濕潤(rùn)劑和/或佐劑。合適的藥物載體和制劑被描述于Remington’sPharmaceutical Sciences，第19版，Mack Publishing Co.，Easton，1995中。優(yōu)選的藥物載體取決于所希望的活性藥物的給藥方式。給藥的典型方式包括腸內(nèi)(例如，口服)或腸胃外(例如，皮下、肌肉內(nèi)、靜脈內(nèi)或腹膜內(nèi)注射)或局部、經(jīng)皮或經(jīng)粘膜給藥。“可藥用鹽”是可配制成可藥用化合物的鹽，例如，金屬鹽(鈉、鉀、鎂、鈣鹽等)，以及銨或有機(jī)胺的鹽。
用于診斷或治療的″個(gè)體″是人或非人的哺乳動(dòng)物。
組合物的″給藥″是指通過(guò)一個(gè)選擇的途徑將組合物導(dǎo)入到個(gè)體中，例如，如果所選的途徑是靜脈內(nèi)施用，則組合物被通過(guò)導(dǎo)入組合物到個(gè)體的血管中來(lái)給藥。
″治療″是指預(yù)防性治療或治療性治療。
″預(yù)防性″治療是給藥于沒(méi)有顯示疾病癥狀或顯示早期癥狀的個(gè)體來(lái)減少病癥發(fā)展的危險(xiǎn)。
″治療性″治療是一種給藥于表現(xiàn)出病癥的個(gè)體進(jìn)行的治療，目的是減小或消除這些癥狀。
″診斷″是指鑒定病癥狀況的存在或特性。診斷的方法根據(jù)其敏感性和特異性而不同。診斷方法的“敏感性”是指進(jìn)行試驗(yàn)呈陽(yáng)性的患病個(gè)體的百分?jǐn)?shù)(真陽(yáng)性的百分?jǐn)?shù))。診斷方法的“特異性”是指1減去假陽(yáng)性率，其中的假陽(yáng)性率是指那些試驗(yàn)呈陽(yáng)性但是卻沒(méi)有患病的比例。而一種特定的診斷方法有可能不能提供出一種病況的確定性診斷，如果該方法提供了有助于診斷的陽(yáng)性顯示，其就足夠了。
″預(yù)診″是指對(duì)一種病癥可能性進(jìn)展(例如，嚴(yán)重性)的預(yù)測(cè)。III.TARP本發(fā)明提供分離的重組的TARP。因?yàn)槲覀兪紫劝l(fā)現(xiàn)了分離的前列腺特異性TCRγ轉(zhuǎn)錄本，我們最初使用術(shù)語(yǔ)“PS-TCRγ蛋白”和“PS-TCRγ多肽”來(lái)代表能夠從約1.1kb PS-TCRγ轉(zhuǎn)錄本開(kāi)始的任何閱讀框架中翻譯的任何多肽。具體地講，該術(shù)語(yǔ)是指兩種在體外翻譯系統(tǒng)中翻譯的蛋白PS-TCRγ-1(SEQ ID NO14)和PS-TCRγ-2(SEQ IDNO15)。我們現(xiàn)在已知道只有這些閱讀框架的第一個(gè)在前列腺細(xì)胞中被翻譯。因?yàn)檫@個(gè)閱讀框架不是產(chǎn)生TCRγ鏈的閱讀框架，該蛋白目前被稱(chēng)為“T細(xì)胞受體可變閱讀框架蛋白”。全長(zhǎng)TARP是一個(gè)58氨基酸的蛋白，其序列被描述于SEQ ID NO14和附圖14中。
在某些的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了含有包含從TARP的至少5到至少15個(gè)保守氨基酸的表位的多肽。這樣的蛋白與抗全長(zhǎng)TARP的抗體結(jié)合(在此部分，除非上下文的其它需要，“TARP”是指全長(zhǎng)蛋白)。其它的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了含有第一和第二多肽部分的融合蛋白，其中一個(gè)蛋白部分含有被鑒定為T(mén)ARP表位的至少5個(gè)氨基酸的氨基酸序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，TARP部分是指TARP的全部或基本上全部的TARP。另外一部分可以是一個(gè)例如免疫原性蛋白。這樣的融合子也可以被用于激發(fā)抗TARP的免疫反應(yīng)。在本發(fā)明其它的實(shí)施方案中提供了TARP樣肽(“TARP類(lèi)似物”)，其氨基酸序列至少90％相同于TARP(雖然它們可能具有相對(duì)于TARP91％，92％，93％，94％，95％，或更高的序列同一性)且其被與TARP特異性結(jié)合的抗體特異性地結(jié)合。在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了TARP樣肽(有時(shí)此處也稱(chēng)為“TARP類(lèi)似物”)，其氨基酸序列至少90％相同于TARP(雖然它們可能具有相對(duì)于TARP 91％，92％，93％，94％，95％，或更高的序列同一性)且激活T淋巴細(xì)胞抵抗表達(dá)TARP的細(xì)胞。這樣的蛋白也可用作免疫原以阻斷對(duì)PS-TCRγ蛋白的耐受。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述多肽含有結(jié)合于MHC分子例如HLA分子或DR分子的表位。這些分子結(jié)合于具有由大約8或9個(gè)氨基酸所間隔的校正錨氨基酸的多肽。這些肽可通過(guò)檢測(cè)TARP的氨基酸序列或者通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的有關(guān)MHC結(jié)合基元的知識(shí)進(jìn)行鑒定。
TARP、其免疫原性片段和TARP類(lèi)似物，可被重組合成。TARP的免疫原性片段和TARP自身的58個(gè)殘基也可通過(guò)常規(guī)的方法化學(xué)合成。如果需要，多肽也可通過(guò)已有技術(shù)來(lái)化學(xué)合成。一種這樣的方法被描述于W.Lu等，F(xiàn)ederation of European Biochemical SocietiesLetters.42931-35(1998)。IV.TARP核酸本發(fā)明的一個(gè)方面提供了含有編碼TARP多肽的核苷酸序列的分離的重組核酸分子(參見(jiàn)，例如附圖14)。該核酸可被用于表達(dá)TARP，然后所表達(dá)的TARP可被用于例如產(chǎn)生用于治療目的的抗體。如上所述，該核酸分子具有3個(gè)閱讀框架，每一個(gè)編碼由不同可讀框所定義的多肽。
在此處所述的實(shí)施方案中，目的閱讀框架就是編碼TARP的閱讀框架。
如上所述，兩個(gè)閱讀框架在體外翻譯系統(tǒng)中被翻譯。獲自LNCaPcDNA的約1.1 kb PS-TCRγ轉(zhuǎn)錄本(SEQ ID NO13)的核苷酸序列和當(dāng)轉(zhuǎn)錄本在核苷酸位置74(PS-TCRγ-1，SEQ ID NO14)以及核苷酸位置247(PS-TCRγ-2，SEQ ID NO15)的起始密碼子開(kāi)始被翻譯的推導(dǎo)的氨基酸序列被描述在附圖1中。轉(zhuǎn)錄的起始點(diǎn)(加下劃線)在Jγ1.2區(qū)段的前10個(gè)核苷酸內(nèi)。序列的數(shù)據(jù)可獲自EMBL/GenBank/DDBJ，其登錄號(hào)為AF151103。應(yīng)說(shuō)明的是現(xiàn)在已證實(shí)真正的″+1″位置是附圖1所示的序列的第6個(gè)核苷酸。
研究者可以利用這個(gè)序列制備PCR引物，用于分離本發(fā)明的核苷酸序列。LNCaP細(xì)胞是約1.1 kb轉(zhuǎn)錄本序列cDNA的有用的來(lái)源。來(lái)自尚未進(jìn)行TCRγ基因重排的人細(xì)胞(例如，除了T-淋巴細(xì)胞前體之外的細(xì)胞)的基因組DNA，可用作在轉(zhuǎn)錄后被加工成為約1.1 kb轉(zhuǎn)錄本的長(zhǎng)序列。該序列可利用公知技術(shù)被修飾成為一個(gè)編碼本發(fā)明相關(guān)分子的核酸。
含有本發(fā)明序列的核酸分子可用體外的方法被克隆或擴(kuò)增，例如聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)，連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(LCR)，以轉(zhuǎn)錄為基礎(chǔ)的擴(kuò)增系統(tǒng)(TAS)，自我維持的序列復(fù)制系統(tǒng)(3SR)和Qβ復(fù)制酶擴(kuò)增系統(tǒng)(QB)。例如，編碼所述蛋白的多核苷酸可利用以該分子的DNA序列為基礎(chǔ)的引物通過(guò)cDNA的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)被分離。
眾多的克隆和體外擴(kuò)增方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的。PCR方法被描述在，例如，U.S.專(zhuān)利.No.4,683,195；Mullis等(1987)ColdSpring Harbor Symp.Quant.Biol.51263；和Erlich，ed.，PCRTECHNOLOGY，(Stockton Press，NY，1989)。多核苷酸也可通過(guò)在嚴(yán)格雜交條件下用選自目的多核苷酸序列的探針篩選基因組或cDNA文庫(kù)進(jìn)行分離。
核酸的工程化形式可通過(guò)編碼所述蛋白的多核苷酸的定點(diǎn)誘變來(lái)進(jìn)行，或通過(guò)加入0.1mM MnCl2和不平衡濃度的核苷酸增加PCR反應(yīng)中原始多核苷酸中錯(cuò)誤率導(dǎo)致的隨機(jī)突變來(lái)進(jìn)行。1.表達(dá)載體本發(fā)明也提供了用于表達(dá)由TARP轉(zhuǎn)錄本編碼的多肽的表達(dá)載體。表達(dá)載體可通過(guò)包含用于轉(zhuǎn)錄和mRNA的翻譯的適宜的啟動(dòng)子、復(fù)制序列、標(biāo)記物等來(lái)使其適用于真核和原核表達(dá)系統(tǒng)。表達(dá)載體的構(gòu)建和在轉(zhuǎn)染細(xì)胞中基因的表達(dá)涉及本領(lǐng)域公知的分子克隆技術(shù)的應(yīng)用。Sambrook等，MOLECULAR CLONING--A LABORATORYMANUAL，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，NY，(1989)和CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY，F(xiàn).M.Ausubel等編輯，(Current Protocols，a joint venture between GreenePublishing Associates，Inc.以及John Wiley & Sons，Inc.)。用于這樣目的的有用啟動(dòng)子包括金屬硫蛋白啟動(dòng)子，組成型腺病毒主要后期啟動(dòng)子，地塞米松誘導(dǎo)型MMTV啟動(dòng)子，SV40啟動(dòng)子，MRP polIII啟動(dòng)子，組成型MPSV啟動(dòng)子，四環(huán)素誘導(dǎo)型CMV啟動(dòng)子(例如，人早早期CMV啟動(dòng)子)，以及組成型CMV啟動(dòng)子。用于基因治療的質(zhì)粒可能包括其它的功能元件，例如可選擇的標(biāo)記、鑒別區(qū)和其它的基因。
用于本發(fā)明的表達(dá)載體依賴(lài)于其目的用途。當(dāng)然這樣的表達(dá)載體必須含有與宿主細(xì)胞相容的表達(dá)和復(fù)制信號(hào)。用于表達(dá)生物活性結(jié)合物的表達(dá)載體包括病毒載體，例如逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒和腺相關(guān)病毒，質(zhì)粒載體，粘粒，等等。病毒和質(zhì)粒載體優(yōu)選轉(zhuǎn)染哺乳動(dòng)物細(xì)胞。其中表達(dá)控制序列含有CMV啟動(dòng)子的表達(dá)載體pcDNA1(Invitrogen，SanDiego，CA)，提供了較好的轉(zhuǎn)染和表達(dá)率。腺相關(guān)病毒載體在本發(fā)明中適用于基因治療的方法。
很多的方法適用于將多核苷酸傳遞到細(xì)胞，包括，例如由細(xì)胞從溶液中直接攝取分子，通過(guò)脂質(zhì)轉(zhuǎn)染法(例如脂質(zhì)體或免疫脂質(zhì)體)協(xié)助攝取，顆粒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染，以及從具有可操作連接于編碼抑制性多核苷酸的核苷酸序列的表達(dá)調(diào)控序列的表達(dá)盒進(jìn)行胞內(nèi)表達(dá)。參見(jiàn)U.S.專(zhuān)利5,272,065(Inouye等)；酶學(xué)方法，vol.185，Academic Press，Inc.，San Diego，CA(D.V.Goeddel，ed.)(1990)或M.Krieger，GENETRANSFER AND EXPRESSION-A LABORATORY MANUAL，Stockton出版社，New York，NY，(1990)。雖然通過(guò)體外化學(xué)合成法制備短的寡核苷酸更經(jīng)濟(jì)，重組DNA表達(dá)質(zhì)粒也被用于制備本發(fā)明的多核苷酸，用于通過(guò)除基因治療以外的方法進(jìn)行傳遞。
構(gòu)建體也可以含有一個(gè)標(biāo)記物從而簡(jiǎn)化蛋白的分離程序。例如，一個(gè)多組氨酸標(biāo)記，例如，六個(gè)組氨酸殘基可在蛋白的氨基末端被引入。多組氨酸標(biāo)志使得蛋白僅通過(guò)鎳-螯合層析法一步即可提取。2.重組細(xì)胞本發(fā)明也提供了含有用于表達(dá)本發(fā)明核苷酸序列的表達(dá)載體的重組細(xì)胞。可選擇高水平表達(dá)的宿主細(xì)胞來(lái)純化蛋白。細(xì)胞可以是原核生物細(xì)胞，例如E.coli，或真核細(xì)胞。有用的真核細(xì)胞包括酵母和哺乳動(dòng)物細(xì)胞。該細(xì)胞可以是例如，在培養(yǎng)物中的重組細(xì)胞或體內(nèi)細(xì)胞。
表達(dá)TARP的細(xì)胞適用于使個(gè)體抵抗表達(dá)這些肽的細(xì)胞的主動(dòng)或被動(dòng)免疫。在特定的實(shí)施方案中，這些細(xì)胞是細(xì)菌細(xì)胞。在主動(dòng)免疫的情況下，重組細(xì)胞是個(gè)體的自身固有的細(xì)胞，其可以與HLA分子聯(lián)合提呈多肽。例如抗原提呈細(xì)胞就適用于該目的。在此情況下，其優(yōu)選利用“自身固有的細(xì)胞”，也即這些細(xì)胞來(lái)源于個(gè)體。這樣的細(xì)胞是MHC相容性的。編碼TARP的核苷酸序列在這樣的細(xì)胞中應(yīng)該被一個(gè)組成型啟動(dòng)子控制，因?yàn)橐粋€(gè)目的就是在細(xì)胞表面表達(dá)高密度的蛋白，優(yōu)選的，表達(dá)比健康前列腺上皮細(xì)胞具有更大密度的多肽。V.激發(fā)抗表達(dá)TARP細(xì)胞的細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)的方法TARP由上皮來(lái)源的前列腺癌細(xì)胞和很多乳房癌細(xì)胞表達(dá)。因此，TARP可被用作干預(yù)治療前列腺癌和表達(dá)TARP的乳房癌的靶，也可被用作分別從前列腺或乳房轉(zhuǎn)移的癌細(xì)胞的標(biāo)志物。本發(fā)明提供了免疫治療學(xué)的方法用于治療前列腺癌和表達(dá)TARP的乳房癌。本發(fā)明涉及對(duì)個(gè)體進(jìn)行免疫，使之抗TARP，即激發(fā)抗表達(dá)TARP細(xì)胞的細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)。免疫可以是主動(dòng)的或被動(dòng)的。在主動(dòng)免疫中，免疫反應(yīng)在個(gè)體體內(nèi)被激發(fā)。在被動(dòng)免疫中，被激活的抗多肽的Tc細(xì)胞在體外培養(yǎng)并給藥于個(gè)體。預(yù)料這樣的方法導(dǎo)致表達(dá)TARP的健康上皮前列腺組織被破壞。然而，前列腺并非重要的器官，其損傷必然抵消個(gè)體由于前列腺癌導(dǎo)致的壽命的減少，且前列腺實(shí)際上可在建立TARP免疫治療前通過(guò)外科手術(shù)去除。因?yàn)檎５娜榉拷M織尚未發(fā)現(xiàn)表達(dá)大量的TARP，抗表達(dá)TARP細(xì)胞的免疫反應(yīng)并未表現(xiàn)出導(dǎo)致女性正常細(xì)胞的損傷。因此TARP組合物可預(yù)防給藥于女性來(lái)提供免疫，防止表達(dá)TARP的乳房癌發(fā)育到后期。
免疫劑可以是全長(zhǎng)的TARP，含有TARP的抗原決定基的肽，例如，TARP的免疫原性片段，或基本上等同于TARP的蛋白或肽。當(dāng)激發(fā)抗TARP的細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)時(shí)含有抗原決定基的優(yōu)選肽是帶有個(gè)體的HLA分子的結(jié)合基元的肽。這些基元是本領(lǐng)域公知的。例如HLA-A2是人類(lèi)的一個(gè)普遍的等位基因。此分子的結(jié)合包括具有在第二位具有亮氨酸或甲硫氨酸且在最后位置為纈氨酸或亮氨酸的9或10個(gè)氨基酸的多肽?；赥ARP的多肽序列，可鑒定含有任意特定的HLA分子的基元的氨基酸序列?？赏ㄟ^(guò)任一典型的方法(例如，重組法，化學(xué)法，等等)制備含有這些基元的肽。因?yàn)門(mén)ARP是一種自身蛋白，優(yōu)選的含有HLA結(jié)合基元的氨基酸序列為那些編碼亞顯性的或陰性的表位的氨基酸序列。這些表位可通過(guò)HLA分子的與分子中的其它表位相比的較低的結(jié)合親合力或與其它的結(jié)合于HLA分子的分子比較來(lái)鑒定。
含有來(lái)自包括HLA結(jié)合基元的TARP的氨基酸序列的多肽也適用于激發(fā)免疫應(yīng)答。在一定程定上，因?yàn)?，這樣的蛋白將被細(xì)胞加工為可結(jié)合于HLA分子且具有TARP表位的肽。
HLA分子和肽抗原的復(fù)合物充當(dāng)被HLA限制性T細(xì)胞識(shí)別的配體(Buus，S.等，Cell 471071，1986；Babbitt，B.P.等，Nature 317359，1985；Townsend，A.和Bodmer，H.，Annu.Rev.Immunol.7601，1989；Germain，R.N.，Annu.Rev.Immunol.11403，1993)。通過(guò)單氨基酸替代的抗原類(lèi)似物的研究和內(nèi)源結(jié)合的自然加工的肽的測(cè)序，與特異性結(jié)合于HLA抗原分子所必需的基元相對(duì)應(yīng)的關(guān)鍵殘基已被鑒定(參見(jiàn)，例如.，Southwood，等，J.Immunol.1603363，1998；Rammensee，等，Immunogenetics 41178，1995；Rammensee等，Sette，A.和Sidney，J.Curr.Opin.Immunol.10478，1998；Engelhard，V.H.，Curr.Opin.Immunol.613，1994；Sette，A.和Grey，H.M.，Curr.Opin.Immunol.479，1992)。
此外，HLA-肽復(fù)合物的x-射線晶體學(xué)分析顯示在HLA分子的肽結(jié)合性裂口中的口袋(蛋白質(zhì)的立體結(jié)構(gòu))以等位基因的方式容納通過(guò)肽配體含有的殘基；這些殘基反過(guò)來(lái)決定了含有這些殘基的肽與HLA結(jié)合的能力。(參見(jiàn)，例如.，Madden，D.R.Annu.Rev.Immunol.13587，1995；Smith，等，Immunity 4203，1996；Fremont等，Immunity 8305，1998；Stern等，Structure 2245，1994；Jones，E.Y.Curr.Opin.Immunol.975，1997；Brown，J.H.等，Nature 36433，1993)。
相應(yīng)地，I類(lèi)和II類(lèi)等位基因特異性的HLA結(jié)合基元或I類(lèi)和II類(lèi)超級(jí)基元的定義，涵蓋具有結(jié)合特定的HLA分子的可能性的TARP的區(qū)域。
與TARP有高度序列同一性的分子對(duì)于激發(fā)免疫反應(yīng)也是有用的。此種分子可以被免疫系統(tǒng)識(shí)別為“外源的”，產(chǎn)生抗體或與TARP發(fā)生交叉反應(yīng)的CTL。與TARP具有高度序列同一性的分子包括非人源的TCRγ同源物，特別是來(lái)自靈長(zhǎng)目的。氨基酸序列至少與TARP有90％(雖然其可為91％，92％，93％，94％，95％，或甚至與TARP有更高的序列同一性)相同且其特異性地結(jié)合于與TARP特異性結(jié)合的抗體的TARP類(lèi)似物可以被使用。此外，在此方面被認(rèn)為有用的還有TARP類(lèi)似物，也即，其氨基酸序列與TARP至少90％(雖然其可為91％，92％，93％，94％，95％，或甚至與TARP有更高的序列同一性)相同且激活T-淋巴細(xì)胞使之抵抗表達(dá)TARP的細(xì)胞的肽。
另一個(gè)與TARP抗原決定基基本上同源的分子可通過(guò)修飾天然TARP表位的序列使其以較大的親合力結(jié)合于HLA分子來(lái)制備。
鑒定編碼抗原決定基的基因的方法如下獲自患有轉(zhuǎn)移性癌癥的個(gè)體的TIL被培養(yǎng)并測(cè)試其在體外識(shí)別自體固有癌的能力。將這些TIL給藥到個(gè)體中以識(shí)別導(dǎo)致腫瘤消退的TIL。這些TIL被用于篩選表達(dá)被TIL識(shí)別的表位的基因的表達(dá)文庫(kù)。然后用這些基因免疫個(gè)體。可選擇地，在體外致敏淋巴細(xì)胞來(lái)抵抗這些基因編碼的抗原，然后致敏的淋巴細(xì)胞被轉(zhuǎn)移到個(gè)體體內(nèi)并測(cè)試其導(dǎo)致腫瘤消退的能力。Rosenberg，等，(1997)Immunol.Today 1997 18175。
這些分子的應(yīng)用現(xiàn)在已被描述。這些方法也被描述在Rosenberg等.(1997)Immunol.Today 18175和Restifo等.(1999)Oncology 1150。
一種引起免疫應(yīng)答的方法包括單獨(dú)地用含有來(lái)自TARP的抗原決定基的多肽免疫個(gè)體，或者更優(yōu)選地與佐劑結(jié)合，例如弗氏不完全佐劑，類(lèi)脂或脂質(zhì)體，gp96，Hsp70或Hsp90。多肽可以為T(mén)ARP，TARP的抗原片段，含有抗原決定基的融合蛋白，或含有與這樣的抗原決定基大體上相同的序列的肽。
另一個(gè)方法包括將含有來(lái)自TARP的表位的肽結(jié)合到抗原提呈細(xì)胞上并將細(xì)胞給藥于個(gè)體。
在另一個(gè)方法中，將在表達(dá)盒中含有編碼具有來(lái)自TARP抗原決定基的多肽的核酸序列的重組病毒給藥于個(gè)體。所述病毒選擇性地也可編碼細(xì)胞因子(例如，IL-2)、共刺激分子或其它的增強(qiáng)免疫應(yīng)答的基因。病毒可以是，例如，腺病毒、鳥(niǎo)痘病毒或牛痘病毒。通過(guò)感染，感染的細(xì)胞將表達(dá)TARP肽并在與具有和抗原決定基相同基元的肽結(jié)合的HLA分子結(jié)合的情況下在細(xì)胞表面表達(dá)表位。這些細(xì)胞然后激活能識(shí)別被提呈的抗原的CTL，導(dǎo)致含有決定基的癌細(xì)胞的破壞。
在另一個(gè)方法中，通過(guò)，例如，肌內(nèi)、biolistic注射或與脂類(lèi)連接，個(gè)體用編碼含有來(lái)自TARP的抗原決定基的多肽的裸DNA致免疫。此方法顯示產(chǎn)生了對(duì)細(xì)胞介導(dǎo)的抵抗表達(dá)所述編碼多肽的細(xì)胞的應(yīng)答的刺激。
在另一種方法中，表達(dá)表位的重組細(xì)菌例如Bacillus Calmette-Guerin(BCG)，Salmonella或Listera給藥于個(gè)體，可選擇地，重組細(xì)菌也編碼細(xì)胞因子、共刺激分子或其它增強(qiáng)免疫應(yīng)答的基因。
在另一種方法中，表達(dá)抗原的細(xì)胞被給藥于個(gè)體。包括，例如，用TARP表位刺激的樹(shù)突狀細(xì)胞，用含有TARP抗原決定基的多肽、HLA和B7基因轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。多重轉(zhuǎn)染導(dǎo)致產(chǎn)生了一些對(duì)于將抗原決定基提呈到細(xì)胞表面上所必需的幾個(gè)組分。在一個(gè)實(shí)施方案中，分子為一種融合蛋白，含有抗原決定基的多肽被融合于HLA分子(通常通過(guò)接頭)來(lái)提高肽與HLA分子的結(jié)合。在一個(gè)實(shí)施方案中，細(xì)胞為抗原提呈細(xì)胞。優(yōu)選的，細(xì)胞為真核細(xì)胞，較優(yōu)選的為哺乳動(dòng)物細(xì)胞，更優(yōu)選的為人細(xì)胞，最優(yōu)選的為獲自所述個(gè)體的自體固有的人細(xì)胞。
在另一種方法中，抗原提呈細(xì)胞(APC)在體外被刺激或與含有來(lái)自TARP的表位的肽共溫育。這些細(xì)胞被用于致敏CD8細(xì)胞，如來(lái)自前列腺癌腫瘤或外周血淋巴細(xì)胞的腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞。TIL或PBL優(yōu)選來(lái)自所述個(gè)體。然而，它們至少為在個(gè)體具有的HLA型所限制的MHC I類(lèi)細(xì)胞。這些致敏細(xì)胞然后給藥于個(gè)體。
在補(bǔ)充的方法中，任意的這些免疫療法通過(guò)給藥細(xì)胞因子被加強(qiáng)，例如IL-2，IL-3，IL-6，IL-10，IL-12，IL-15，GM-CSF，干擾素。
除了上述評(píng)價(jià)肽的免疫原性的方法外，免疫原性也可以通過(guò)評(píng)價(jià)來(lái)自正常個(gè)體的初級(jí)T細(xì)胞培養(yǎng)物來(lái)進(jìn)行(參見(jiàn)，例如，Wentworth，P.A.等，Mol.Immunol.32603，1995；Celis，E.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 912105，1994；Tsai，V.等，J.Immunol.1581796，1997；Kawashima，I.等，Human Immunol.591，1998)； 通過(guò)HLA轉(zhuǎn)基因鼠的免疫來(lái)進(jìn)行(參見(jiàn)，例如，Wentworth，P.A.等，J.Immunol.2697，1996；Wentworth，P.A.等，Int.Immunol.8651，1996；Alexander，J.等，J.Immunol.1594753，1997)，以及通過(guò)證實(shí)已被有效接種或具有腫瘤的患者的記憶T細(xì)胞應(yīng)答來(lái)進(jìn)行(參見(jiàn)，例如，Rehermann，B.等，J.Exp.Med.1811047，1995；Doolan，D.L.等，Immunity 797，1997；Bertoni，R.等，J.Clin.Invest.100503，1997；Threlkeld，S.C.等，J.Immunol.1591648，1997；Diepolder，H.M.等，J.Virol.716011，1997)。
在選擇用于疫苗組合物的CTL誘導(dǎo)性目的肽時(shí)，與I類(lèi)HLA分子有較高結(jié)合力的肽是優(yōu)選的。肽的結(jié)合被通過(guò)測(cè)試候選肽與純化的HLA分子在體外結(jié)合的能力來(lái)進(jìn)行評(píng)價(jià)。
為確保TARP類(lèi)似物當(dāng)用作疫苗時(shí)能在體內(nèi)引起CTL對(duì)TARP的應(yīng)答(或者，為II類(lèi)表位時(shí)激發(fā)與野生型肽交叉反應(yīng)的輔助T細(xì)胞)，TARP類(lèi)似物可被用于在體外免疫來(lái)自含適當(dāng)HLA等位基因的個(gè)體的T細(xì)胞。其后，評(píng)價(jià)免疫細(xì)胞誘導(dǎo)TARP致敏靶細(xì)胞的溶解的能力。
通常，來(lái)自TARP的肽或其類(lèi)似物(本發(fā)明的肽)被合成，并測(cè)定其結(jié)合HLA蛋白和激活HTL或CTL應(yīng)答或二者的能力。
常規(guī)的用于檢測(cè)T細(xì)胞應(yīng)答的試驗(yàn)包括增殖試驗(yàn)，淋巴因子分泌試驗(yàn)，直接細(xì)胞毒性試驗(yàn)，以及有限稀釋試驗(yàn)。例如，與肽溫育的抗原提呈細(xì)胞被檢測(cè)其在效應(yīng)器細(xì)胞群中誘導(dǎo)CTL應(yīng)答的能力。
PBMC可被用作CTL前體的效應(yīng)器細(xì)胞來(lái)源。合適的抗原提呈細(xì)胞被與肽溫育，然后負(fù)載肽的抗原提呈細(xì)胞在最適培養(yǎng)條件下與效應(yīng)器細(xì)胞溫育。陽(yáng)性CTL激活可通過(guò)在培養(yǎng)物中測(cè)定殺死放射性標(biāo)記靶細(xì)胞的CTL的存在，特異性肽刺激的靶以及表達(dá)由其獲得肽序列的抗原的內(nèi)源被加工形式的靶細(xì)胞來(lái)檢測(cè)。
抗原特異性T細(xì)胞的直接定量檢測(cè)的方法是用熒光素標(biāo)記的HLA四聚體復(fù)合物染色法(Altman等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 9010330(1993)；Altman等，Science 27494(1996))?？蛇x擇的，胞內(nèi)淋巴因子的染色，γ干擾素釋放分析或ELISPOT試驗(yàn)，可被用于評(píng)價(jià)T-細(xì)胞應(yīng)答。
HTL活化可通過(guò)本領(lǐng)域公知的技術(shù)來(lái)評(píng)價(jià)，例如T細(xì)胞增殖和淋巴因子例如IL-2的分泌(參見(jiàn)，例如Alexander等，Immunity 1751-761(1994))。VI.抗TARP的抗體本發(fā)明的一個(gè)方面提供了一種含有特異性結(jié)合TARP的抗體的組合物。抗體優(yōu)選具有至少106M-1，107M-1，108M-1，或109M-1親和性。本發(fā)明包括多克隆和單克隆抗體組合物。
很多免疫原可被用來(lái)產(chǎn)生特異性與TARP結(jié)合的抗體。全長(zhǎng)TARP是合適的免疫原，典型地，目的免疫原為至少大約3個(gè)氨基酸的肽，更典型地，肽至少為5個(gè)氨基酸，優(yōu)選的該片段至少為10個(gè)氨基酸長(zhǎng)，更優(yōu)選的片段的長(zhǎng)度為15個(gè)氨基酸。所述肽可與載體蛋白偶聯(lián)(例如，作為融合蛋白)，或在免疫載體中進(jìn)行重組表達(dá)。抗體與之結(jié)合的肽上抗原決定基通長(zhǎng)為3-10個(gè)氨基酸。天然存在的多肽可以純凈的或未純化的形式使用。
在原核或真核細(xì)胞中表達(dá)重組的多肽并采用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)進(jìn)行純化。將該多肽或其合成的形式注射到能產(chǎn)生抗體的動(dòng)物中，可產(chǎn)生單克隆或多克隆抗體，它們隨后可用于免疫測(cè)定以定性和安量地測(cè)量所述的多肽。
生產(chǎn)多克隆抗體的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。簡(jiǎn)言之，將免疫原(優(yōu)選純凈形式的多肽、與合適的載體(如GST、鍉孔血藍(lán)蛋白等)偶聯(lián)的多肽或摻入到致免疫載體的重組牛痘病毒(參見(jiàn)US專(zhuān)利No.4722848)中的多肽)與佐劑混合并用混合物免疫動(dòng)物。動(dòng)物對(duì)免疫原制劑的免疫應(yīng)答被通過(guò)取待測(cè)血液，并測(cè)定對(duì)目的多肽反應(yīng)的滴度來(lái)監(jiān)測(cè)。當(dāng)獲得對(duì)免疫原的合適的高滴度的抗體時(shí)，從動(dòng)物中收集血液并制備抗血清。如需要，進(jìn)一步分級(jí)分離抗血清使其富含與多肽反應(yīng)的抗體，參見(jiàn)，例如，Coligan(1991)CURRENT PROTOCOLS INIMMUNOLOGY Wiley/Greene，NY；以及Harlow和Lane(1989)ANTIBODIESA LABORATORY MANUAL Cold Spring Harbor Press，NY。
針對(duì)TARP預(yù)定片段的抗體，包括結(jié)合性片段及其單鏈重組變體，可通過(guò)用例如與上述載體蛋白結(jié)合的片段的結(jié)合物免疫動(dòng)物來(lái)產(chǎn)生。
單克隆抗體由分泌目的抗體的細(xì)胞制備。這些抗體被篩選用于結(jié)合正常的或修飾的多肽，或用于激動(dòng)或拮抗活性的篩選。在一些情況下，從不同的哺乳動(dòng)物宿主例如小鼠、嚙齒動(dòng)物、靈長(zhǎng)目、人等宿主中制備單克隆抗體是可行的。制備這樣的單克隆抗體的技術(shù)被描述在例如，Stites等(編輯)BASIC AND CLINICAL IMMUNOLOGY(4th ed.)Lange Medical Publications，Los Altos，CA，此處引入作為參考；Harlow和Lane，同上；Goding(1986)Monoclonal AntibodiesPrinciples andPractice(2d ed.)Academic Press，New York，NY；以及，Kohler和Milstein(1975)Nature 256495-497。
其它合適的技術(shù)涉及篩選噬菌體或類(lèi)似載體中重組抗體文庫(kù)的技術(shù)。參見(jiàn)，Huse等.(1989)Science 2461275-1281；以及Ward，等.(1989)Nature 341544-546。
同樣，重組免疫球蛋白可被生產(chǎn)。參見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利No.4,816,567(Cabilly)和Queen等.(1989)Proc.Nat′l Acad.Sci.USA 8610029-10033。
通常，多肽和抗體通過(guò)共價(jià)或非共價(jià)連接提供可檢測(cè)信號(hào)的物質(zhì)而被標(biāo)記。大量的標(biāo)記物和連接技術(shù)是已知的且被廣泛公開(kāi)在科學(xué)和專(zhuān)利文獻(xiàn)上。因此用于檢測(cè)待分析物的抗體可被可檢測(cè)的部分直接標(biāo)記，或例如通過(guò)將所述抗體與被直接或間接標(biāo)記的第二抗體結(jié)合而進(jìn)行間接標(biāo)記。
本發(fā)明的抗體也被用于在TARP分離中的親和層析。例如，制備帶有與固體支持物例如顆粒如瓊脂糖、交聯(lián)葡聚糖凝膠等連接的抗體的柱子，使細(xì)胞溶解產(chǎn)物通過(guò)此柱，洗滌，用濃度遞增的溫和變性劑處理，由此純化的TARP被釋放出來(lái)。
一種可選擇的方法是通過(guò)重組DNA技術(shù)將非人源抗體的CDR區(qū)連接到人保守區(qū)產(chǎn)生人源化的免疫球蛋白。參見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利5,585,089(Queen等)。
另一個(gè)分離編碼人單克隆抗體或其結(jié)合性片段的DNA序列的方法是通過(guò)從人B細(xì)胞中篩選DNA文庫(kù)，其相應(yīng)的常規(guī)操作參見(jiàn)Huse等，Science 2461275-1281(1989)，然后克隆和擴(kuò)增編碼具有所需特異性的抗體(或結(jié)合性片段)的序列。Huse所描述的操作與噬菌體展示技術(shù)結(jié)合會(huì)更有效，參見(jiàn)，例如WO 91/17271(Dower等)和WO92/01047(McCafferty等)。噬菌體展示技術(shù)也可被用于誘變先前顯示對(duì)TARP有親合力的抗體的CDR區(qū)。結(jié)合親和性得以改善的抗體被選擇出來(lái)。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了抗TARP或蛋白類(lèi)似物的抗體的片段。典型地，這些片段表現(xiàn)出類(lèi)似于完整免疫球蛋白的與TARP結(jié)合的特異性。這些抗體片段包括分離的重鏈，輕鏈Fab，F(xiàn)ab′F(ab′)2和Fv。片段通過(guò)重組DNA技術(shù)，或通過(guò)完整免疫球蛋白的酶解或化學(xué)分離產(chǎn)生。VII.靶向TARP的嵌合分子本發(fā)明提供了靶向TARP的嵌合分子。嵌合分子含有一個(gè)靶向部分和一個(gè)效應(yīng)器部分。嵌合蛋白對(duì)于所述多肽和含有它的細(xì)胞的檢測(cè)是有用的。A.靶向部分本發(fā)明的嵌合分子含有一個(gè)靶向部分，該靶向部分含有一個(gè)特異性結(jié)合TARP的配體。優(yōu)選的配體為抗體，此處所用的該術(shù)語(yǔ)包括抗體的結(jié)合性片段。然而，其它的這些分子的天然配體也可被使用。B.效應(yīng)器部分效應(yīng)器部分可為另一個(gè)特異性結(jié)合部分例如抗體、生長(zhǎng)因子或配體。嵌合分子充當(dāng)一個(gè)高度特異的雙功能接頭。此接頭可連接和增強(qiáng)融合蛋白所結(jié)合的細(xì)胞或細(xì)胞組分之間的相互作用。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，效應(yīng)器分子可以是藥劑(例如，藥物)或含有藥劑的載體。因此，特異性結(jié)合于TARP的部分可與藥物例如長(zhǎng)春堿、阿霉素、金雀異黃素(酪氨酸激酶抑制劑)，反義分子以及其它的本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的藥劑軛合，由此特異性地使藥劑靶向腫瘤細(xì)胞。
可選擇地，靶向分子可結(jié)合于含有治療組合物的載體。這樣的載體包括但不限于脂質(zhì)體，膠束，各種合成的珠子等。
本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以理解本發(fā)明的嵌合分子可包括結(jié)合一個(gè)效應(yīng)器的多個(gè)靶向部分或相反結(jié)合一個(gè)靶向部分的多個(gè)效應(yīng)器。在另一個(gè)實(shí)施方案中，嵌合分子也可同時(shí)包括多個(gè)靶向部分和多個(gè)效應(yīng)器的分子。適于作為本發(fā)明的嵌合分子的效應(yīng)器分子組分的可檢測(cè)的標(biāo)記包括通過(guò)光鏡、光化學(xué)的、生物化學(xué)的、免疫化學(xué)的、電學(xué)的、目測(cè)的或上述所有化學(xué)方式可檢測(cè)的任意組分。
本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解靶向分子和效應(yīng)器分子可以以任意的順序連接。因此，當(dāng)其中的靶向分子為多肽，效應(yīng)器分子可被連接于靶向分子的氨基端或羧基端。靶向分子也可被連接到效應(yīng)器分子的中間區(qū)域，或相反，效應(yīng)器分子被連接到靶向分子的中間區(qū)域，只要這種連接不影響各自分子的活性。
靶向分子和效應(yīng)器分子可通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的任意方式連接。典型地，效應(yīng)器分子被直接或通過(guò)接頭(間隔區(qū))連接于靶向分子。然而，當(dāng)效應(yīng)器分子和靶向分子都是多肽時(shí)，優(yōu)選重組表達(dá)嵌合分子作為單鏈融合蛋白。
在一個(gè)實(shí)施方案中，靶向分子被化學(xué)結(jié)合于效應(yīng)器分子(例如細(xì)胞毒素，標(biāo)記物，配體，或藥物或脂質(zhì)體)?；瘜W(xué)結(jié)合分子的方法是本領(lǐng)域公知的。將試劑結(jié)合到抗體或其它多肽靶向分子的方法可依據(jù)試劑的化學(xué)結(jié)構(gòu)而變化。多肽典型地含有不同的功能基團(tuán)，例如，羧酸(COOH)或自由胺(-NH2)基團(tuán)，其可通過(guò)與合適的功能團(tuán)在效應(yīng)器分子上反應(yīng)來(lái)與效應(yīng)器結(jié)合?？蛇x擇地，靶向分子和/或效應(yīng)器分子可被衍生化以暴露或連接其它的反應(yīng)功能基團(tuán)。衍生化反應(yīng)可包括連接任意的接頭分子，例如獲自Pierce化學(xué)藥品公司(RockfordIllinois)的那些。
具有一個(gè)與特定試劑的基團(tuán)反應(yīng)的功能性基團(tuán)以及另一個(gè)與抗體反應(yīng)的基團(tuán)的雙功能接頭，可被用來(lái)形成目的免疫結(jié)合物?？蛇x擇地，衍生化反應(yīng)包括靶向分子的化學(xué)處理，例如，糖蛋白抗體的糖部分用高碘酸鹽進(jìn)行乙二醇裂解來(lái)產(chǎn)生自由醛基團(tuán)?？贵w上的自由醛基團(tuán)可與試劑上的自由胺或肼基團(tuán)反應(yīng)來(lái)與試劑結(jié)合。(參見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利4,671,958)。在多肽例如抗體或抗體片段上產(chǎn)生自由巰基基團(tuán)的方法是已知的(參見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利4,659,839)。
不同的化合物包括放射性核素金屬蝥合物、毒素和藥物連接到蛋白例如抗體上的多種方法和接頭分子是已知的，參見(jiàn)，例如歐洲專(zhuān)利申請(qǐng)No.188,256；美國(guó)專(zhuān)利4,671,958；4,659,839；4,414,148；4,699,784；4,680,338；4,569,789；以及Borlinghaus等，Cancer Res.474071-4075(1987)。具體地講，各種免疫毒素的生產(chǎn)在本領(lǐng)域是已知的且可在″Monoclonal Antibody-Toxin ConjugatesAiming the MagicBullet″，Thorpe等，MONOCLONAL ANTIBODIES IN CLINICALMEDICINE，Academic Press，第168-190頁(yè)(1982)，Waldmann，Science，2521657(1991)，美國(guó)專(zhuān)利4,545,985和4,894,443中找到。
當(dāng)靶向分子和/或效應(yīng)器分子相對(duì)比較短(例如不到50個(gè)氨基酸)時(shí)，它們可通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)的化學(xué)肽合成技術(shù)來(lái)合成。當(dāng)兩個(gè)分子都相對(duì)比較短時(shí)，嵌合分子作為一個(gè)單獨(dú)的連續(xù)的多肽可被合成?？蛇x擇的，靶向分子和效應(yīng)器分子可被分別合成然后通過(guò)一個(gè)分子的氨基末端與另一個(gè)分子的羧基末端的縮合反應(yīng)形成肽鍵而被融合?？蛇x擇的，靶向分子和效應(yīng)器分子可與肽間隔分子的一個(gè)末端縮合來(lái)形成無(wú)間隔的融合蛋白。
一序列的C-末端氨基酸被連接于一個(gè)不溶性支持物然后在序列中能夠依次增加氨基酸的固相合成是本發(fā)明的肽的化學(xué)合成的優(yōu)選的方法。固相合成的技術(shù)被描述于Barany和Merrifield，Solid-PhasePeptide Synthesis；第3-284頁(yè)。The PeptidesAnalysis，Synthesis，Biology.Vol.2Special Methods in Peptide Synthesis，Part A.，Merrifield等，J.Am.Chem.Soc.，852149-2156(1963)，和Stewart等，Solid PhasePeptide Synthesis，第二版，Pierce Chem.Co.，Rockford，Ill.(1984)。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，嵌合融合蛋白通過(guò)重組DNA技術(shù)來(lái)合成。通常，該技術(shù)包括生成編碼融合蛋白的DNA序列，在特定啟動(dòng)子的調(diào)控下將DNA置于表達(dá)盒中，在宿主中表達(dá)蛋白，分離表達(dá)的蛋白以及，如需要的話，讓蛋白復(fù)性。
本發(fā)明的編碼融合蛋白的DNA可通過(guò)合適的方法被制備，包括，例如，克隆和適當(dāng)序列的限制性酶切或通過(guò)下列的方法直接化學(xué)合成，例如Narang等，Meth.Enzymol.6890-99(1979)中所述的磷酸三酯法；Brown等，Meth.Enzymol.68109-151(1979)中所述的磷酸二酯法；Beaucage等，Tetra.Lett.，221859-1862(1981)中所述的二乙基亞磷酰胺法；以及美國(guó)專(zhuān)利No.4,458,066中的固相支持體法。
當(dāng)兩個(gè)分子優(yōu)選地基本上直接相連接時(shí)，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以理解，分子可被含有一個(gè)或更多個(gè)氨基酸的肽間隔區(qū)隔開(kāi)。通常，間隔區(qū)除了連接蛋白或保留最小的距離或其它的空間聯(lián)系外沒(méi)有特異的生物活性。然而，間隔區(qū)的組成性氨基酸可被選擇來(lái)改變分子的一些特性例如折疊、凈電荷或疏水性。
編碼融合蛋白的核酸序列可在不同的宿主細(xì)胞中表達(dá)，包括E.coli，其它的細(xì)菌宿主，酵母，以及各種高等的真核細(xì)胞例如COS，CHO和HeLa細(xì)胞系和骨髓瘤細(xì)胞系。重組蛋白的基因被可操作地連接于對(duì)每一宿主而言適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)調(diào)控序列。對(duì)E.coli而言包括啟動(dòng)子例如T7、trp、或λ啟動(dòng)子、核糖體結(jié)合位點(diǎn)，并優(yōu)選地包含轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)。對(duì)真核細(xì)胞而言，調(diào)控序列包括啟動(dòng)子和優(yōu)選的來(lái)自免疫球蛋白基因的增強(qiáng)子，SV40，巨細(xì)胞病毒，等等，以及多聚腺苷酸化序列，也可包括剪接供體和受體的序列。本發(fā)明的質(zhì)粒和載體可通過(guò)公知的方法被轉(zhuǎn)移到所選擇的宿主細(xì)胞中，例如氯化鈣轉(zhuǎn)化E.coli和磷酸鈣處理或電穿孔處理哺乳動(dòng)物細(xì)胞。
重組融合蛋白一旦被表達(dá)，其可通過(guò)本領(lǐng)域的常規(guī)方法進(jìn)行純化，包括硫酸銨沉淀，親和柱層析，層析法，凝膠電泳等(參見(jiàn)，R.Scopes，PROTEIN PURIFICATION，Springer--Verlag，N.Y.(1982)，Deutscher，METHOD S IN ENZYMOLOGY Vol.182Guide to ProteinPurification.，Academic Press，Inc.N.Y.(1990))。用于藥物的大體上純化的組分優(yōu)選至少含有90％到95％的同質(zhì)物，含有98到99％或更多的同質(zhì)物為最優(yōu)選的。純化后，部分均質(zhì)或達(dá)到所需同質(zhì)性的多肽被用于治療。VIII.檢測(cè)表達(dá)TARP的細(xì)胞的方法在本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了檢測(cè)表達(dá)TARP的細(xì)胞的方法。該方法包括檢測(cè)TARP轉(zhuǎn)錄本或多肽。因?yàn)樯掀?lái)源的前列腺癌細(xì)胞和很多的乳房癌細(xì)胞表達(dá)TARP，檢測(cè)方法對(duì)于前列腺癌和表達(dá)TARP的乳房癌的檢測(cè)是有用的。具體地，前列腺癌細(xì)胞和很多的乳房癌細(xì)胞可通過(guò)TARP的表達(dá)來(lái)區(qū)別于其它的細(xì)胞。
組織樣本可分別地選自原位的或轉(zhuǎn)移性癌的任一可能的位置包括前列腺或乳房，以及末梢位置例如淋巴結(jié)和其它的器官。本領(lǐng)域的技術(shù)人員知道男性和女性一樣患乳房癌。乳房癌在男性中比較少，僅占所有乳房癌患者的1％。因?yàn)槠洳怀Ｒ?jiàn)，所以通常在晚期才被診斷，這樣就影響了生存的機(jī)會(huì)。因此，改進(jìn)對(duì)男性乳房癌的診斷是可取的。
在一個(gè)方法中，對(duì)個(gè)體進(jìn)行活體組織檢查并在體外測(cè)試收集的組織。典型地，通過(guò)溶解、超聲波破壞、滲透壓、冷凍和融化、酶處理或其它的本領(lǐng)域常規(guī)的方式破壞細(xì)胞來(lái)提取沒(méi)有變性的核蛋白。細(xì)胞的內(nèi)容物(或核內(nèi)容物，如果內(nèi)容物被分級(jí)分離了的話)然后被與例如抗-TARP抗體接觸。產(chǎn)生的任意免疫復(fù)合物指示TARP在活體組織檢查樣本中的存在。為了有助于檢測(cè)，抗體可以被放射性標(biāo)記或與被放射性標(biāo)記的效應(yīng)器分子偶聯(lián)。在另一個(gè)方法中，通過(guò)典型地顯像系統(tǒng)細(xì)胞可被在體內(nèi)檢測(cè)。例如，該方法可包括給藥于個(gè)體能夠到達(dá)細(xì)胞核的標(biāo)記組分。然后通過(guò)任意的已知檢測(cè)標(biāo)記的方法來(lái)測(cè)定標(biāo)記的位置。任意的顯像診斷的常規(guī)方法可以被使用。例如，順磁同位素可被用于MRI。TARP的檢測(cè)TARP可通過(guò)本領(lǐng)域公知的任意方法來(lái)鑒定。在一個(gè)實(shí)施方案中，該方法包括檢測(cè)帶有能特異性識(shí)別多肽的配體的多肽(例如，免疫測(cè)定)。本發(fā)明的抗體特別適用于TARP的特異性檢測(cè)。各種基于抗體的檢測(cè)方法是本領(lǐng)域已知。它們包括，例如，放射免疫測(cè)定，夾心免疫檢測(cè)(包括ELISA)，免疫熒光檢測(cè)，Western印跡，親和層析法(親和性配體與固相結(jié)合)，以及帶有標(biāo)記的抗體的原位檢測(cè)。另一個(gè)檢測(cè)TARP的方法包括通過(guò)其質(zhì)量鑒定多肽，例如，通過(guò)凝膠電泳，質(zhì)譜分析或HPLC。個(gè)體的樣本可取自各種適宜的來(lái)源，例如唾液、腹液、血或血產(chǎn)物(例如，血清)、尿、活組織檢查組織(例如，淋巴結(jié)組織)，等等。
TARP可在細(xì)胞中、在體外、在取自活組織檢查的樣本中以及在體內(nèi)使用上述的顯像系統(tǒng)來(lái)檢測(cè)。編碼TARP的轉(zhuǎn)錄本的檢測(cè)表達(dá)TARP轉(zhuǎn)錄本的細(xì)胞的檢測(cè)可被通過(guò)使之接觸帶有與轉(zhuǎn)錄本特異性雜交的核酸探針的樣本并檢測(cè)雜交來(lái)進(jìn)行。包括，例如，原位雜交法，其中的被標(biāo)記的探針與樣本接觸并通過(guò)檢測(cè)結(jié)合了的標(biāo)記來(lái)檢測(cè)雜交。然而，轉(zhuǎn)錄本在樣本存在的量可能很少，因此，其它的方法被用來(lái)擴(kuò)增，例如RT-PCR。在這些方法中，選擇探針，其起到從mRNA特異性擴(kuò)增TARP序列的擴(kuò)增引物的作用。然后，擴(kuò)增的序列被通過(guò)典型的方法來(lái)檢測(cè)。
探針被選擇以特異性地與TARP轉(zhuǎn)錄本雜交。通常，使用互補(bǔ)探針。然而，探針不需要完全的互補(bǔ)，只要其具有足夠的序列同源性和長(zhǎng)度來(lái)在嚴(yán)格條件下雜交即可。IX.藥物組合物在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種藥物組合物，其含有可藥用的載體以及本發(fā)明的組分。
在一個(gè)實(shí)施方案中，藥物組合物含有有效量的能在個(gè)體中激發(fā)細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)或體液應(yīng)答的TARP，其免疫原性片段例如含有TARP表位的多肽，或TARP類(lèi)似物，例如含有MHC結(jié)合基元的多肽。這樣的藥物組合物可用作本發(fā)明治療方法中的疫苗和制備抗體。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，藥物組合物含有包含編碼以有效量來(lái)在個(gè)體中引發(fā)抗表達(dá)TARP的細(xì)胞的免疫反應(yīng)的TARP多肽的核苷酸的核酸分子。這樣的組合物在本發(fā)明的治療方法中也是有用的。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述藥物組合物含有可以特異性裂解編碼TARP的核苷酸序列的核酶，一種可與此核酸結(jié)合的反義分子，或含有編碼TARP的核酸的表達(dá)盒，來(lái)調(diào)整TARP在目的細(xì)胞中的表達(dá)。
在另外一個(gè)實(shí)施方案中，所述藥物組合物可含有包含靶向分子和指示分子的嵌合分子以檢測(cè)表達(dá)TARP的細(xì)胞。如指示分子是能夠特異性與編碼TARP的核酸結(jié)合的分子(例如能特異性地與編碼TARP的DNA結(jié)合的DNA結(jié)合蛋白)，則組合物可被用于檢測(cè)表達(dá)此核酸的細(xì)抱。
本發(fā)明的藥物組合物可被制備成單位劑量的形式來(lái)給藥于個(gè)體。給藥的量和時(shí)間取決于醫(yī)師欲達(dá)到的治療目的。
實(shí)施例實(shí)施例1.前列腺細(xì)胞中T-細(xì)胞受體γ-鏈的檢測(cè)我們發(fā)現(xiàn)T-細(xì)胞受體γ鏈(TCRγ)mRNA在人前列腺中表達(dá)，并顯示其最初來(lái)自前列腺上皮細(xì)胞而不是浸潤(rùn)的T-淋巴細(xì)胞。相反，T-細(xì)胞受體δ鏈(TCRγδ)基因在人前列腺中是沉默的。前列腺中的大部分TCRγ轉(zhuǎn)錄本與在胸腺、脾臟和白細(xì)胞中表達(dá)的轉(zhuǎn)錄本大小不同。其在正常的前列腺上皮中、前列腺的腺癌以及前列腺腺癌細(xì)胞系LNCaP中表達(dá)。RNA來(lái)源于未重排的TCRγ座位且在緊挨Jγ1.2基因區(qū)段上游的內(nèi)含子序列中啟始。含有Jγ1.2和Cγ1基因區(qū)段的前列腺特異性TCRγ轉(zhuǎn)錄本，其具有在3’末端包括聚腺苷酸化信號(hào)和poly(A)序列的非翻譯序列。前列腺上皮細(xì)胞表達(dá)了被認(rèn)為僅由T淋巴細(xì)胞表達(dá)的高水平的來(lái)自基因的轉(zhuǎn)錄本，此發(fā)現(xiàn)是新穎的并大大地出乎意料。1.材料和方法RNA點(diǎn)印跡和Northern印跡雜交對(duì)各種人的組織進(jìn)行RNA點(diǎn)印跡(RNA master blot，Clontech，Palo Alto，CA)和Northern印跡(MTN，Clontech，Palo Alto，CA)。
對(duì)來(lái)自前列腺癌細(xì)胞系，LNCaP和PC-3(ATCC，Rockville，MD)的mRNA進(jìn)行Northern印跡。poly(A)RNA的分離使用FastTrack試劑盒(InVitrogen，Carlsbad，CA)來(lái)進(jìn)行。按照現(xiàn)行的做法，將RNA在1％的瓊脂糖凝膠上跑電泳并被轉(zhuǎn)到尼龍基膜(GeneScreen Plus，DuPont，Wilmington，DE)上。Ausubel，同上。由EST質(zhì)粒ng79dl1(Genome Systems，St.Louis，MO)制備對(duì)TCRγ轉(zhuǎn)錄本的非翻譯3’末端(3’UTR)特異的cDNA探針。對(duì)TCRγ轉(zhuǎn)錄本(TCR Cγ)恒定區(qū)特異的探針由LNCaP cDNA制備而成，對(duì)TCRδ轉(zhuǎn)錄本(TCR Cδ)的恒定區(qū)特異的探針由TCRδ質(zhì)粒制備而成。人β-肌動(dòng)蛋白探針被用作mRNA制備物的定量對(duì)照。探針被用32P標(biāo)記(Lofstrand Labs Limited，Gaithersburg，MD)通過(guò)隨機(jī)引物延伸到1μCi/ng的比活性。RNA膜被在含有50％甲酰胺的雜交溶液中45℃封閉2個(gè)小時(shí)(Hybrisol I，Oncor，Gaithersburg，MD)然后在20ml雜交溶液中用20μCi cDNA探測(cè)15小時(shí)。膜在室溫下用2×SSC/0.1％SDS洗滌兩次，每次15分鐘，以及55-65℃在0.1％SSC/0.1％SDS中洗滌兩次，每次20分鐘，膜在顯影前被在-80℃下給底片成像顯影(X-OMAT，Kodak，Rochester，NY)。RNA原位雜交TCRγ恒定區(qū)和TCRγ的非翻譯3’末端核苷酸序列通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄酶PCR(RT-PCR)從LNCaP mRNA來(lái)擴(kuò)增，克隆到pBluescript II SK(Stratagene，La Jolla，CA)中并通過(guò)DNA測(cè)序來(lái)證實(shí)。反義和有義TCRγ35S-核苷酸探針?lè)謩e通過(guò)T7和T3 RNA聚合酶來(lái)制備。來(lái)自NCI的8個(gè)存檔的前列腺經(jīng)尿道切除的樣本的石蠟塊被恢復(fù)。所述的病例包括惡性和良性前列腺導(dǎo)管的病例兩種。這些病例的平均年齡為69歲，且腫瘤的Gleason評(píng)分為3+3＝6/10到4+5＝9/10。在玻片上進(jìn)行石醋塊的處理且使用核苷酸探針雜交(Molecular Histology，Gaithersburg，MD)。然后，雜交的玻片用蘇木紫和酸性曙紅復(fù)染色并利用配備能提供明視野和暗視野的可變聚光器的Zeiss Axiophot顯微鏡進(jìn)行鏡檢。RT-PCR分析從150-250ng的LNCaP和PC-3 poly(A)mRNA利用oligo-dT引發(fā)分別制備單鏈cDNA(Pharmacia-Biotech，Piscataway，NJ)。PCR引物被設(shè)計(jì)來(lái)擴(kuò)增TCRγ轉(zhuǎn)錄本的不同部分。為了僅擴(kuò)增cDNA而不擴(kuò)增可能存在于mRNA制備物中的痕量的基因組DNA，引物對(duì)總是結(jié)合使用來(lái)產(chǎn)生跨兩個(gè)或更多外顯子的PCR產(chǎn)物。一個(gè)完整的PCR用來(lái)擴(kuò)增兩個(gè)TCRγ恒定區(qū)基因中的一個(gè)(Cγ1或Cγ2)，在外顯子CI(TCRCγ.F)中使用正向的引物和在外顯子CIII(TCRCγ.R4)中使用反向的引物，附圖8。利用正向的特異于TCRγ可變基因區(qū)段的四個(gè)亞型(TCRVγI.F，TCRVγII.F，TCRVγIII.F，TCRVγIV.F)的引物與TCRγ恒定基因區(qū)段(TCRCγ.R1)中的反向引物結(jié)合，進(jìn)行跨恒定區(qū)的PCR的變動(dòng)，附圖8。利用高保真的PCR組分，蠟-介導(dǎo)的熱啟動(dòng)PCR被進(jìn)行30個(gè)循環(huán)(Expand，Boehringer-Mannheim，Indianapolis，IN)。在含有0.5μg/mlEtBr的1.2％瓊脂糖凝膠上分析PCR產(chǎn)物，特定的PCR產(chǎn)物被凝膠純化(Qiagen，Valencia，CA)，進(jìn)行T/A克隆(In Vitrogen，Carlsbad，CA)以及在自動(dòng)毛細(xì)管測(cè)序儀(Perkin Elmer Applied Systems，F(xiàn)oster City，CA)上測(cè)序，使用Perkin-Elmer′s dRhodamine終止子循環(huán)測(cè)序試劑盒。TCRγVJ基因重排的分析由5×107LNCaP細(xì)胞通過(guò)既定操作步驟制備基因組DNA。Ausubel，同上。一系列12個(gè)PCR被進(jìn)行，每個(gè)使用來(lái)自Vγ基因區(qū)段的四個(gè)亞型(TCRVγI.F，TCRVγII.F，TCRVγIII.F，TCRVγIV.F)之一的正向引物，并結(jié)合來(lái)自三個(gè)Jγ1基因區(qū)段(TCRJγ1.1.R，TCRJγ1.2.R，TCRJγ1.3.R)之一的反向引物，附圖8。熱啟動(dòng)的PCR被進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，使用500ng的基因組DNA并在1.2％瓊脂糖凝膠上用0.5μg/ml的EtBr進(jìn)行檢查PCR產(chǎn)物。人胎盤(pán)DNA(Clontech，Palo Alto，CA)被用作引物的陰性對(duì)照J(rèn)γ1.1至Jγ1.2的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增以用作模板的陽(yáng)性對(duì)照。RNA的引物延伸分析通過(guò)LNCaP mRNA的引物延伸分析來(lái)測(cè)定前列腺TCRγ轉(zhuǎn)錄本的啟始位點(diǎn)。將5μg的mRNA與0.08pmol32P-末端標(biāo)記的TCRCγ.R2引物混合，與Cγ1的5’未端的48-75個(gè)核苷酸退火。使用20U的MMLV-逆轉(zhuǎn)錄酶(Superscript，Gibco-BRL，Gaithersburg，MD)根據(jù)既定的步驟進(jìn)行分析。C.P.George等/(1996)″Primer-extension analysis of RNA″In ALABORATORY GUIDE To RNA，ISOLATION，ANALYSIS ANDSYNTHESIS.，P.A.Krieg編輯(Wiley-Liss，Inc.，New York，NY)，第133-139頁(yè)。樣本與32P-末端標(biāo)記的分子量標(biāo)記物(MspI digested pBR322，Lofstand Labs Limited，Gaithersburg，MD)一起在6％聚丙烯酰胺-脲DNA測(cè)序凝膠上電泳。電泳結(jié)束后將凝膠印跡到Whatman紙上，干燥并放射自顯影。5′-RACE PCR分析通過(guò)利用Marathon cDNA擴(kuò)增試劑盒(Clontech，Palo Alto，CA)和25pmole的TCRγ基因特異性引物(TCRCγ.R3)由500 ng的LNCaPpoly(A)mRNA制備雙鏈cDNA，附圖8。Marathon-連接物然后被結(jié)合到合成的cDNA的末端。使用基因特異性引物(TCRCγ.R2)進(jìn)行5′-cDNA末端(5′-RACE)PCR的快速擴(kuò)增，附圖8。用于逆轉(zhuǎn)錄的引物的上游與連接物特異性引物退火。熱啟動(dòng)條件被應(yīng)用(Advantage，Clontech，Palo Alto，CA)并且PCR產(chǎn)物如RT-PCR所述被分析和克隆。來(lái)自5′-RACE PCR分析凝膠的DNA被轉(zhuǎn)到尼龍膜上并且與上游序列雜交的32P-末端標(biāo)記的引物(TCRCγ.R1)，附圖8所示，被應(yīng)用來(lái)檢測(cè)EtBr/UV沒(méi)有檢測(cè)到的可能的條帶。體外轉(zhuǎn)錄與翻譯通過(guò)RT-PCR和5′RACE PCR獲得的完整的前列腺TCRγ轉(zhuǎn)錄本，被使用T7 RNA聚合酶和小麥胚芽提取物(TNT，Promega，Madison，WI)通過(guò)RT-PCR擴(kuò)增，克隆到pBluescript II SK(Stratagene，La Jolla，CA)中，進(jìn)行測(cè)序并在體外轉(zhuǎn)錄翻譯偶聯(lián)的系統(tǒng)中檢測(cè)。35S-Met(ICN，Costa Mesa，CA)被加到反應(yīng)中用于翻譯產(chǎn)物的顯影。反應(yīng)在還原條件下在聚丙烯酰胺凝膠(16.5％Tris/Tricine，BioRad，Hercules，CA)上與預(yù)染色的標(biāo)記物(Gibco-BRL，Gaithersburg，MD)一起被分析。凝膠被干燥并用于放射自顯影。結(jié)果A.通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)分析鑒定存在的TCRγ的前列腺EST
我們從20個(gè)來(lái)自6個(gè)腫瘤和2個(gè)正常前列腺cDNA文庫(kù)的cDNA克隆中鑒定了23個(gè)TCRγESTs。由前列腺EST裝配成的TCRγ復(fù)合序列由具有76個(gè)核苷酸的TCRγ恒定區(qū)序列、448個(gè)核苷酸的非翻譯3’區(qū)序列和poly(A)序列。通過(guò)前列腺EST與外周血T-淋巴細(xì)胞細(xì)胞系的成熟TCRγ轉(zhuǎn)錄本(GenBank Acc.No.M16768，M16804和M30894)的比對(duì)，我們發(fā)現(xiàn)前列腺EST復(fù)合序列等同于來(lái)自外周血T-淋巴細(xì)胞的TCRγ轉(zhuǎn)錄本。dbEST數(shù)據(jù)庫(kù)分析顯示TCRγ基因在人前列腺中是高度轉(zhuǎn)錄的。B.通過(guò)RNA點(diǎn)印跡驗(yàn)證TCRγ(3′UTR)在人前列腺中的表達(dá)為了分析人前列腺中有轉(zhuǎn)錄活性的TCRγ，來(lái)自TCRγ轉(zhuǎn)錄本的非翻譯3’末端(3’UTR)的cDNA探針被用于檢測(cè)來(lái)自50個(gè)不同人組織的mRNA，附圖2A。我們確證正常的前列腺(C7位置)表達(dá)TCRγmRNA并且我們進(jìn)一步觀察到在所有在點(diǎn)印跡上顯示的組織中前列腺具有最強(qiáng)的表達(dá)。TCRγ基因表達(dá)也被發(fā)現(xiàn)在小腸(E3)，脾臟(E4)，胸腺(E5)，外周白細(xì)胞(E6)，淋巴結(jié)(E7)，骨髓(E8)，以及肺(F2)中。C.Northern顯示人前列腺中的兩種大小特異性的TCRγ轉(zhuǎn)錄本利用3′UTR探針的Northern印跡雜交顯示前列腺具有兩種大約1.1和2.8kb的TCRγ轉(zhuǎn)錄本，附圖2B(泳道3)，而脾臟，胸腺，小腸和白細(xì)胞中的主要轉(zhuǎn)錄本為1.5kb。1.5kb大小的轉(zhuǎn)錄本與來(lái)自γδT-淋巴細(xì)胞的TCRγmRNA(GenBank Acc.No.M16768，M16804，(Krangel等，Science 237，64-67(1987))；M30894，(Littman等.Nature 326，85-88(1987))一致。由于數(shù)據(jù)庫(kù)分析表明了TCRγ的恒定區(qū)是前列腺轉(zhuǎn)錄本的一部分，所以我們也使用TCRγ恒定區(qū)探針(TCR Cγ)。我們也在前列腺中發(fā)現(xiàn)了同樣的1.1 kb和2.8 kb條帶，附圖3A(泳道3)。D.表達(dá)TCRγ的前列腺細(xì)胞不表達(dá)TCRδ或CD3轉(zhuǎn)錄本TCRγ-鏈蛋白通常與TCRδ鏈蛋白共表達(dá)。由于TCRγ基因在人前列腺中是轉(zhuǎn)錄活性的，我們繼續(xù)分析TCRδ基因的轉(zhuǎn)錄活性。使用TCRδ轉(zhuǎn)錄本核苷酸序列進(jìn)行dbEST分析(http//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)。來(lái)自前列腺cDNA文庫(kù)的EST與TCRδ-鏈轉(zhuǎn)錄本的任一部分都不匹配。此外，Northern印跡分析沒(méi)有檢測(cè)到任何TCRδmRNA的前列腺表達(dá)，附圖3B(泳道3)。我們得出結(jié)論TCRδ基因在前列腺中是沉默的。如所預(yù)料的，TCRδ在脾臟，胸腺和血液白細(xì)胞中表達(dá)，附圖3B。E.LNCaP細(xì)胞，而不是PC-3細(xì)胞，表達(dá)前列腺-特異性TCRγ轉(zhuǎn)錄本假定TCRγmRNA在正常的前列腺中表達(dá)，我們接下來(lái)分析是否其也在前列腺癌中表達(dá)。前列腺-特異性1.1 kb轉(zhuǎn)錄本被發(fā)現(xiàn)在來(lái)自LNCaP的mRNA制備物中，但不在來(lái)自PC-3的mRNA制備物中，附圖3C。在正常的前列腺中表達(dá)的前列腺-特異性2.8 kb轉(zhuǎn)錄本，也存在于LNCaP中，盡管其濃度較低。F.RNA原位雜交顯TCRγ在前列腺上皮細(xì)胞中表達(dá)前列腺由腺泡組織和可變混合的初級(jí)導(dǎo)管襯上皮細(xì)胞群組成，所述上皮細(xì)胞在腺隔室內(nèi)排成復(fù)雜的增生導(dǎo)管。這些隔室被緊緊地連接于光滑的肌肉細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和前列腺基質(zhì)的其它細(xì)胞類(lèi)型。為了測(cè)定人前列腺TCRγ表達(dá)的細(xì)胞內(nèi)位置，用TCR(Cγ-3′UTR)有義和反義核苷酸探針進(jìn)行RNA原位雜交。我們發(fā)現(xiàn)TCRγmRNA在前列腺腺泡導(dǎo)管的上皮細(xì)胞中高度表達(dá)而在前列腺基質(zhì)細(xì)胞和其它類(lèi)型的細(xì)胞中為陰性，附圖4A，4C。前列腺的增生和瘤形成的區(qū)域也被檢測(cè)到TCRγ的表達(dá)。在良性的和腫瘤的腺泡上皮中的表達(dá)是相當(dāng)?shù)?。在人腎組織中或在人大腦中沒(méi)有觀察到TCRγ的表達(dá)，附圖4E。G.前列腺TCRγ轉(zhuǎn)錄本含有Cγ1但不含有任何VJγ基因在已經(jīng)確定前列腺的TCRγδ表達(dá)概況后，我們繼續(xù)鑒定主要的1.1kb前列腺特異的TCRγ轉(zhuǎn)錄本的特性。LNCaP細(xì)胞系被用于特性分析，因?yàn)槿藗儾荒芘懦齺?lái)自從大量前列腺組織獲得的mRNA制備物中有浸潤(rùn)T-細(xì)胞mRNA污染的可能性。我們從數(shù)據(jù)庫(kù)分析可知前列腺TCRγ轉(zhuǎn)錄本的3’末端序列等同于來(lái)自外周血液白細(xì)胞的TCRγ轉(zhuǎn)錄本的3’末端序列，且聚腺苷酸化信號(hào)的位置是相同的。因此，前列腺和白細(xì)胞之間的轉(zhuǎn)錄本大小的不同取決于通過(guò)前列腺EST鑒定的上游序列的不同。用RT-PCR擴(kuò)增TCRγ轉(zhuǎn)錄本的恒定區(qū)部分來(lái)鑒定TCRCγ1基因。較大的TCRCγ2不在LNCaP中表達(dá)?？缭娇勺儏^(qū)(Vγ)到恒定區(qū)(Cγ)的RT-PCR沒(méi)有產(chǎn)生任何的產(chǎn)物，表明Vγ不是前列腺特異的TCRγ轉(zhuǎn)錄本的一部分。H.LNCaP在TCRγ座位沒(méi)有發(fā)生VJ基因重排。
由于RT-PCR擴(kuò)增TCRγ的可變區(qū)沒(méi)有產(chǎn)生任何產(chǎn)物，我們接來(lái)下分析TCRγ座位。在γδT-細(xì)胞發(fā)育的過(guò)程中，TCR座位發(fā)生V(D)J基因重排來(lái)使得基因區(qū)段連接在一起，形成受體的可變區(qū)。為了說(shuō)明LNCaP細(xì)胞是否發(fā)生TCRγVJ基因重排，聯(lián)合使用TCRVγ和TCRJγ引物對(duì)基因組DNA進(jìn)行PCR，來(lái)涵蓋每一種可能的重排(參見(jiàn)材料和方法部分)。引物聯(lián)合沒(méi)有產(chǎn)生任何的PCR產(chǎn)物，此說(shuō)明了LNCaP細(xì)胞沒(méi)有發(fā)生TCRγ座位的VJ基因的重排。TCRγ VJ的重排沒(méi)有在前列腺上皮細(xì)胞中發(fā)生說(shuō)明了前列腺表達(dá)不同于成熟的γδT-淋巴細(xì)胞的表達(dá)。I.前列腺上皮細(xì)胞表達(dá)TCR(JC)γ轉(zhuǎn)錄本既然確定了前列腺TCRγ轉(zhuǎn)錄本含有Cγ但不含有任何Vγ基因區(qū)段，我們下面分析Cγ1的上游序列是什么。進(jìn)行RNA引物延伸和5′RACE PCR來(lái)獲得轉(zhuǎn)錄的起始點(diǎn)。LNCaP mRNA的引物延伸試驗(yàn)，顯示大約128個(gè)核苷酸的大量的帶和130-135個(gè)核苷酸的少量的帶，附圖5。從Cγ1的5’末端堿基75處開(kāi)始逆轉(zhuǎn)錄(參見(jiàn)材料和方法)，轉(zhuǎn)錄本具有大約Cγ1上游序列的53個(gè)核苷酸。LNCaP cDNA的5′RACE PCR發(fā)現(xiàn)了一個(gè)特異性PCR產(chǎn)物。擴(kuò)增的產(chǎn)物被發(fā)現(xiàn)含有恰當(dāng)?shù)嘏cCγ1基因區(qū)段剪接的Jγ1.2基因區(qū)段。大量通過(guò)RACE PCR分離的克隆被測(cè)序。它們從引物延伸試驗(yàn)所定義的起始位點(diǎn)附近啟動(dòng)。轉(zhuǎn)錄本的可變的起始點(diǎn)與在引物延伸試驗(yàn)中鑒定的少量的帶比大量的帶稍長(zhǎng)的結(jié)果一致。前列腺TCRγ如何轉(zhuǎn)錄和剪接的圖示見(jiàn)附圖6。獲自LNCaP的TCRγ轉(zhuǎn)錄本的核苷酸序列被顯示于表1中。該復(fù)合序列是1020±3個(gè)核苷酸長(zhǎng)。其含有來(lái)自Jγ1.2基因區(qū)段的53個(gè)堿基，Cγ1的519個(gè)堿基，接著是含有聚核苷酸化信號(hào)的非翻譯序列以及在3’末端poly(A)序列的448個(gè)堿基。J.前列腺特異性TCRγ轉(zhuǎn)錄本在體外的翻譯前列腺轉(zhuǎn)錄本在原始TCRγ閱讀框架中具有4個(gè)翻譯起始密碼子(ATG)，表1中加雙下劃線表示。由4種不同起始點(diǎn)計(jì)算的蛋白大小分別為12.8，12.0，7.2和3.2 kDa。為了分析前列腺轉(zhuǎn)錄本的翻譯活性，利用全長(zhǎng)前列腺TCRγcDNA進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄偶聯(lián)的翻譯。結(jié)果獲得兩個(gè)大約8和13 kDa的蛋白，附圖7(泳道1)。陰性對(duì)照沒(méi)有產(chǎn)生任何蛋白產(chǎn)物。討論前列腺上皮細(xì)胞中TCRγ轉(zhuǎn)錄本的特異性表達(dá)細(xì)胞我們?cè)谌饲傲邢僦需b定到T-細(xì)胞受體γ鏈(TCRγ)mRNA的表達(dá)，表明其來(lái)源于前列腺上皮細(xì)胞而不是來(lái)源于浸潤(rùn)γδ T-淋巴細(xì)胞。我們也闡明了T-細(xì)胞受體δ鏈(TCRδ)基因在前列腺中是沉默的。TCRγmRNA在前列腺腺泡管的上皮細(xì)胞中表達(dá)，也在前列腺癌的上皮細(xì)胞中表達(dá)。2個(gè)存在于人前列腺中的TCRγ轉(zhuǎn)錄本的大小分別為1.1 kb和2.8 kb。與在脾臟，胸腺和外周白細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的1.5kb的TCRγ轉(zhuǎn)錄本相比有著大小的不同。通常TCRγδ mRNA的表達(dá)圖譜表明其在前列腺中的轉(zhuǎn)錄與γδT-淋巴細(xì)胞的途徑不同。前列腺TCRγ表達(dá)最初的發(fā)現(xiàn)是通過(guò)分析公開(kāi)EST數(shù)據(jù)庫(kù)來(lái)進(jìn)行的。我們的結(jié)果表明EST庫(kù)是鑒定新的和未知基因表達(dá)的強(qiáng)大工具。代表TCRγ轉(zhuǎn)錄本的前列腺EST均來(lái)自由激光捕捉顯微解剖所獲得的細(xì)胞建立的cDNA文庫(kù)(Emmert-Buck等，Science 274，998-1001(1996))。TCRγ轉(zhuǎn)錄本被證明來(lái)源于前列腺上皮細(xì)胞而不是來(lái)源于浸潤(rùn)γδT-淋巴細(xì)胞的事實(shí)證實(shí)顯微解剖是一種有用的技術(shù)來(lái)從組織特異性顯微區(qū)獲得純化的細(xì)胞亞群。前列腺TCR(JC)γ轉(zhuǎn)錄本前列腺腺癌細(xì)胞系，LNCaP，其分離自表達(dá)易于檢測(cè)水平的1.1kb前列腺特異性TCRγ轉(zhuǎn)錄本的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(Horoszewicz等，Cancer Res.43，1809-1818(1983))。在LNCaP細(xì)胞中表達(dá)顯示轉(zhuǎn)錄本來(lái)源于上皮細(xì)胞并且其可在前列腺惡性腫瘤的發(fā)育中表達(dá)。LNCaP轉(zhuǎn)錄本含有約53個(gè)堿基的Jγ1.2基因區(qū)段，3個(gè)Cγ1外顯子，非翻譯序列，然后是poly(A)序列。前列腺轉(zhuǎn)錄本不同于成熟的T-淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)錄本，因?yàn)槠淙鄙僖粋€(gè)Vγ基因區(qū)段并且其起始于緊挨Jγ1.2上游區(qū)的內(nèi)含子序列中(數(shù)據(jù)沒(méi)有顯示)。啟動(dòng)子啟動(dòng)前列腺TCRγ轉(zhuǎn)錄且其在前列腺上皮細(xì)胞中的活化機(jī)制正在研究之中。2.8kb的前列腺特異性TCRγ轉(zhuǎn)錄本在LNCaP非常微弱且在5′RACE PCR實(shí)驗(yàn)中并沒(méi)有獲得任何含有2.8kb轉(zhuǎn)錄本的產(chǎn)物，因此2.8kb轉(zhuǎn)錄本需要進(jìn)一步的研究。T淋巴細(xì)胞中TCR(JC)γ轉(zhuǎn)錄本的比較很多的研究表明可能在造血細(xì)胞中發(fā)生V(D)J重排之前或重排時(shí)能檢索到TCR基因的轉(zhuǎn)錄(Wang等，Mol.Immunol.33，957-964(1996)；Shimamura，M.，和Ohta，S.，Eur.J.Immunol.25，1541-1546(1995)；Villey等，Eur.J.Immunol.27，1619-1625(1997)；Sikes等，J.Immunol.161，1399-1405(1998))。已有報(bào)道TCRγ基因在帶有未重排的γ座位的鼠骨髓T淋巴細(xì)胞前體細(xì)胞中具有轉(zhuǎn)錄活性，產(chǎn)生純粹的TCR Cγ轉(zhuǎn)錄本(Wang等，Mol.Immunol.33，957-964(1996))。此外，未重排TCR Vγ轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)也在個(gè)體發(fā)育中有報(bào)道(Goldman等.J.Exp.Med.177，729-739(1993))。TCR的非翻譯轉(zhuǎn)錄本和免疫球蛋白基因區(qū)段在很大程度上被限制于來(lái)自淋巴細(xì)胞系的細(xì)胞中(Lauzurica，P.，和Krangel，M.S.，J.Exp.Med.179，1913-1921(1994))。此外，幾乎所有TCR和免疫球蛋白的座位的種系轉(zhuǎn)錄的激活均暫行性地與座位重組的激活相關(guān)(Sikes等，J.Immunol.161，1399-1405(1998)；Goldman等.J.Exp.Med.177，729-739(1993)；Lauzurica，P.，and Krangel，M.S.，J.Exp.Med.179，1913-1921(1994)；Sleckman等，Annu.Rev.Immunol.14，459-481(1996))。我們已經(jīng)闡明，通過(guò)基因組DNA和cDNA的獨(dú)立性試驗(yàn)，前列腺上皮細(xì)胞并未在TCRγ座位發(fā)生基因重排。因此在前列腺上皮細(xì)胞中TCR(JC)γ轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)并不與重排相關(guān)，并且與T-淋巴前體細(xì)胞中觀察到的非翻譯轉(zhuǎn)錄本相比可能具有不同的功能。TCRγ座位的新的前列腺特異性蛋白的可能性的最初假說(shuō)前列腺TCRγ轉(zhuǎn)錄本是高度表達(dá)的，我們?cè)O(shè)想其必定具有生物學(xué)上的重要原因。VJ基因重排并未發(fā)生在前列腺上皮細(xì)胞的TCRγ座位的事實(shí)排除了成熟TCRγ鏈蛋白產(chǎn)生的可能性。因?yàn)樵贑γ上游并沒(méi)有發(fā)現(xiàn)翻譯起始密碼子(ATG)，我們還排除了沒(méi)有TCRγ可變區(qū)的TCRγ恒定區(qū)蛋白產(chǎn)生的可能性。在TCRγ鏈蛋白中，Jγ區(qū)段編碼16-20個(gè)氨基酸的可變區(qū)，而可變區(qū)的絕大部分由Vγ區(qū)段編碼。除非由Jγ區(qū)段編碼的氨基酸與由Vγ基因區(qū)段編碼的氨基酸結(jié)合，它們便不能在MHC識(shí)別中作為T(mén)CR發(fā)揮作用。這增加了由Cγ編碼的新的前列腺特異性蛋白的可能性。我們的最初假設(shè)就是，從原始TCRγ閱讀框架的一個(gè)ATG密碼子處開(kāi)始翻譯，雖然也可使用其它不同的閱讀框架或較少使用的啟始密碼子。
利用前列腺TCRγcDNA進(jìn)行的體外轉(zhuǎn)錄偶聯(lián)翻譯試驗(yàn)顯示該轉(zhuǎn)錄本具有全部的功能。共得到了2個(gè)蛋白。13KDa的蛋白最可能啟始于附圖1所示第一個(gè)加雙下劃線ATG，其產(chǎn)生一個(gè)12.8KDa大小的蛋白(PS-TCRγ-1)。8KDa的蛋白最可能來(lái)自第二個(gè)雙下劃線ATG，計(jì)算的蛋白大小約7.2 kDa(PS-TCRγ-2)。在下一個(gè)實(shí)施例中進(jìn)一步討論對(duì)這兩個(gè)蛋白的研究報(bào)道?？傊?，前列腺上皮細(xì)胞，或非淋巴來(lái)源的細(xì)胞類(lèi)型表達(dá)高水平的被認(rèn)為僅由淋巴細(xì)胞系所表達(dá)的基因的轉(zhuǎn)錄本的事實(shí)是一個(gè)非常出乎意料的發(fā)現(xiàn)。實(shí)施例2.TCRγ可變閱讀框架蛋白的發(fā)現(xiàn)上一個(gè)實(shí)施例闡述了意外發(fā)現(xiàn)了在前列腺和前列腺癌細(xì)胞中的TCRγ轉(zhuǎn)錄本，這些轉(zhuǎn)錄本的體外翻譯，并且最初假這一轉(zhuǎn)錄本導(dǎo)致細(xì)胞中存在TCRγ鏈的截短形式。本實(shí)施例闡述另一個(gè)意外的發(fā)現(xiàn)，即該轉(zhuǎn)錄本產(chǎn)生以前未知的由可變閱讀框架表達(dá)的蛋白，現(xiàn)命名為“TARP”。更出乎意料的是，下面的研究顯示TARP是一個(gè)核蛋白，存在于很多乳房癌細(xì)胞中。材料和方法引物TCRγ-upATGmut#1(5’-TTACAGATAAACAACTTGATACAGATGTTTCCCCCAAGCCC-3’)；TCRγ-upATGmut#2(5’-GGGCTTGGGGGAAACATCTGTATCAAGTTGTTTATCTGTAA-3’)；TCRγ-upATGmut#3(5’-GATAAACAACTTGATGCAGATATTTCCCCCAAGCCC-3’)；TCRγ-upATGmut#4(5’-GGGCTTGGGGGAAATATCTGCATCAAGTTGTTTATC-3’)；TCRγ-upATGmut#5(5’-GATAAACAACTTGATACAGATATTTCCCCCAAGCCC-3’)；TCRγ-upATGmut#6(5’-GGGCTTGGGGGAAATATCTGTATCAAGTTGTTTATC-3’)；TCRγ-downATGmut#1(5’-CCCAGGAGGGGAACACCATAAAGACTAACGACACATAC-3’)；TCRγ-downATGmut#2(5’-GTATGTGTCGTTAGTCTTTATGGTGTTCCCCTCCTGGG-3’)；TCR5.1(5’-GATAAACAACTTGATGCAGATGTTTCC-3’)；TCR3.1(5’-TTATGATTTCTCTCCATTGCAGCAG-3’)；TCRJγ1.2R(5’-AAGCTTTGTTCCGGGACCAAATAC)；B-肌動(dòng)蛋白正向引物(5’-ATCTGGCACCACACCTTCTACAATGAGCTGCG-3’)；B-肌動(dòng)蛋白反向引物(5’-CTTCATACTCCTGCTTGCTGATCCACATCTGC-3’).通過(guò)Sigma-Genosys(The Woodlands，TX)和Lofstrand Labs Limited(Gaithersburg，MD)合成引物。
構(gòu)建體如前面所述進(jìn)行構(gòu)建被克隆到pBluescript II SK(+)(Stratagene，LaJolla，CA)中的TARP轉(zhuǎn)錄本(Essand，M.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA969287-9292(1999))。在該過(guò)程中，該質(zhì)粒被稱(chēng)為pBSSK-TCRγ。核苷酸位置69處的ATG被變異為ATA的pBSSK-TCRγmutATGup1，通過(guò)Quickchange Site-Directed Mutagenesis試劑盒(Stratagene)構(gòu)建。利用TCRγ-upATGmut#1和TCRγ-upATGmut#2作為引物并以pBSSK-TCRγ為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)。在核苷酸位置73處的ATG突變?yōu)锳TA的pBSSK-TCRγmutATGup2，如上所述采用TCRγ-upATGmut#3和TCRγ-upATGmut#4為引物并以pBSSK-TCRγ為模板來(lái)構(gòu)建。在核苷酸位置69和73處的兩個(gè)ATG都突變?yōu)锳TA的pBSSK-TCRγmutATGup-both，如上所述通過(guò)用TCRγupATGmut#5和TCRγ-upATGmut#6作為引物并以pBSSK-TCRγmutATGup1為模板來(lái)構(gòu)建。在位置242處的ATG突變?yōu)锳TA的pBSSK-TCRγmutATGdown，如上所述通過(guò)用TCRγ-downATGmut#1和TCRγ-downATGmut#2作為引物并以pBSSK-TCRγ為模板來(lái)構(gòu)建。pET-TCRγ含有被亞克隆到pET23a載體(Novagen，Madison，WI)中的TARP轉(zhuǎn)錄本(Essand，M.等，Proc.Natl.Acad Sci.USA 969287-9292(1999))的242-469位核苷酸。pET-TARP含有被亞克隆到pET23a載體中的TARP轉(zhuǎn)錄本(Essand，M.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 969287-9292(1999))的56-242位核苷酸。pVC4D-TARP含有被亞克隆到pVC4D載體(Bruggemann，E.P.等，BioTechniques 10202-209(1991))的TARP轉(zhuǎn)錄本(Essand，M.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 969287-9292(1999))中的69-242位核苷酸。逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)根據(jù)生產(chǎn)商的操作說(shuō)明利用Micro-FastTrackTM2.0試劑盒(Invitrogen，Carlsbad，CA)進(jìn)行分離poly(A)RNA。500 ng的poly(A)RNA或5μg的總RNA在50 pmol oligo-dT引物(Invitrogen)存在的條件下70℃變性2分鐘。在10μl含有250 uM dNTPs，2 mM DTT，8 URNasin(Roche Molecular Biochemicals，Indianapolis，IN)，50 USuperscript IITMRT(Life Technologies，Rockville，MD)的反應(yīng)混合物中制備單鏈cDNA并42℃溫育90分鐘。樣本然后用75μl 10mM的Tris-HCl[pH 7.5]稀釋并72℃溫育10分鐘。3μl的cDNA用于含有250μMdNTPs、25 pmol的各種引物、1單位的AmpliTaqDNA聚合酶(Roche)的PCR并擴(kuò)增35個(gè)循環(huán)。相似的PCR條件用于人乳房RAPID-SCANTM基因表達(dá)部分(OriGene Technologies，Rockville，MD)。引物TCRγJ 1.2R，TCR5.1和TCR3.1被用于檢測(cè)TARP轉(zhuǎn)錄本，而正向引物B-肌動(dòng)蛋白和反向B-肌動(dòng)蛋白引物被用于肌動(dòng)蛋白轉(zhuǎn)錄本的檢測(cè)。Northern印跡雜交如前所述利用2μg的poly(A)RNA進(jìn)行Northern印跡雜交(Essand，M.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 969287-9292(1999))。體外轉(zhuǎn)錄偶聯(lián)的翻譯在體外偶聯(lián)的翻譯反應(yīng)已被在前面描述(Essand，M.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 969287-9292(1999))。pBSSK-TCRγ，pBSSK-TCRγmutATGdown，pBSSK-TCRγmutATGup1，pBSSK-TCRγmutATGup2和pBSSK-TCRγmutATGup-both被用作模板。細(xì)胞培養(yǎng)LNCaP，PC3，MCF7，BT-474和SK-BR-3細(xì)胞于37℃在5％CO2條件下培養(yǎng)在RPMI-1640培養(yǎng)基(Quality Biological，Inc.，Gaithersburg，MD)中。培養(yǎng)基含10％的胎牛血清(FBS，Quality Biological，Inc.)，2 mML-谷氨酰胺，1 mM丙酮酸鈉和青霉素/鏈霉素。Hs57Bst細(xì)胞于37℃用5％CO2溫孵培養(yǎng)在RPMI-1640培養(yǎng)基中。該培養(yǎng)基含有10％FBS，30 ng/ml表皮生長(zhǎng)因子(EGF，Harlan，Cincinnati，OH)，2 mM L-谷氨酰胺，1 mM丙酮酸鈉和青霉素/鏈霉素?？贵w產(chǎn)物.
多克隆ΔPE-TARP抗體的制備如下。含有與假單胞菌外毒素(ΔPE)(Bruggemann，E.P.等，BioTechniques 10202-209(1991))的催化性失活形式的C’末端融合的完整TARP可讀框的pVC4D-TARP，在EpicurianColiBL21-CodonPlusTM(DE3)-RIL細(xì)胞(Stratagene)中表達(dá)。包涵體的制備以及兔免疫如前面所述(Brinkmann，U.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 888616-8620(1991))。依據(jù)制造商(Pierce，Rockford，IL)的說(shuō)明用ImmunoPureIgG(Protein A)純化試劑盒純化抗血清。
利用pET-TCRγ如前面所述的進(jìn)行制備TCRγ抗體，pET-TCRγ是一個(gè)含有與C’末端6個(gè)組氨酸標(biāo)記融合的TCRγ細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的表達(dá)質(zhì)粒。在免疫前，利用Ni-NTA瓊脂糖柱按照制造商(QIAGEN，Valencin，CA)的說(shuō)明純化該組氨酸標(biāo)記的TCRγ蛋白。細(xì)胞提取物的制備如下制備全細(xì)胞蛋白提取物。收獲來(lái)自各細(xì)胞系的5×106個(gè)培養(yǎng)的細(xì)胞并將其懸浮在含有蛋白酶抑制劑的1×RIPA緩沖液(50mMTris-HCl[pH7.5]，150nM NaCl，1mM EDTA，0.1％Triton X-100，1mMPMSF，1μg/ml aprotinin，1μg/ml亮抑酶)中。提取物直接用超聲破碎，并進(jìn)行離心分離。根據(jù)制造商(Pierce)的說(shuō)明利用CoomassiePlus蛋白試驗(yàn)試劑來(lái)測(cè)定蛋白濃度。通過(guò)用冷的研缽和研棒將-80℃冰凍的0.5g前列腺癌組織研磨成粉末來(lái)制備前列腺組織的蛋白提取物。收集粉末狀組織，懸浮于1X RIPA中如上所述進(jìn)行處理。
前列腺和乳房細(xì)胞中的核、膜以及細(xì)胞質(zhì)提取物的制備如目前已公開(kāi)的方法進(jìn)行(Dignam，J.D.等，Nucleic Acids Res.111475-1489(1983)；Sladek，F(xiàn).M.等，Genes Dev.42353-2365(1990)).Western印跡分析。
20或40μg的蛋白提取物，1μg的重組His-TARP或100ng的重組His-TCRγ在16.5％Tris Tricene凝膠上電泳(BIO-RAD，Hercules，CA)然后在轉(zhuǎn)移緩沖液(25 mM Tris，192 mM甘氨酸，20％(v/v)甲醇，pH 8.3)4℃和30 V下4小時(shí)轉(zhuǎn)移到0.2μm Immun-BlotTMPVDF膜(BIO-RAD)上。用10μg/ml ΔPE-TARP抗血清或1μg/ml TCRγ抗血清來(lái)對(duì)濾膜進(jìn)行探測(cè)，依據(jù)制造商(Roche)的說(shuō)明，用化學(xué)螢光western印跡試劑盒檢測(cè)各自的信號(hào)。TARP是在前列腺癌細(xì)胞中表達(dá)的核蛋白。
為了證實(shí)TARP或TCRγ是否存在于前列腺癌細(xì)胞中，我們制備抗兩種蛋白的抗體并在不同的前列腺癌細(xì)胞提取物中進(jìn)行western印跡反應(yīng)。如附圖3A(上圖所示)，在前列腺癌LNCaP細(xì)胞系和一個(gè)前列腺癌腫瘤提取物中檢測(cè)到TARP。與重組物His-TARP共遷移的7kDa大小的片段表明在LNCaP和癌提取物中檢測(cè)到的產(chǎn)物是TARP。以前，我們證實(shí)了前列腺特異性TCRγ轉(zhuǎn)錄本在前列腺癌細(xì)胞系PC3中并不表達(dá)(Essand，M.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 969287-9292(1999))。因此我們使用PC3細(xì)胞提取物作為陰性對(duì)照從而證實(shí)7kDa片段在這些提取物中并不存在(附圖3A，上圖)。重要的是，當(dāng)利用取血前抗血清和抗假單胞菌外毒素(PE，參見(jiàn)材料和方法)的抗血清時(shí)，沒(méi)有檢測(cè)到7kDa片段(數(shù)據(jù)未顯示)。在這些提取物中沒(méi)有檢測(cè)到TCRγ，雖然重組蛋白與所用抗體表現(xiàn)很強(qiáng)的信號(hào)(附圖3A，下圖)。這些結(jié)果表明前列腺特異性TCR轉(zhuǎn)錄本編碼TARP。
為了鑒定TARP在細(xì)胞中的位置，我們從LNCaP細(xì)胞中制備核、細(xì)胞質(zhì)和膜部分。如附圖3B所示，在核部分而非細(xì)胞質(zhì)或膜中檢測(cè)到TARP。通過(guò)蔗糖墊進(jìn)行的細(xì)胞提取物分級(jí)分離純化的核中我們得到了相似的結(jié)果(Sladek，F(xiàn).M.等，Genes Dev.42353-2365(1990))(數(shù)據(jù)沒(méi)有顯示)。TARP轉(zhuǎn)錄本在乳房細(xì)胞中表達(dá)。
我們?cè)谝郧耙延袌?bào)道TCRγEST庫(kù)也包括一些來(lái)自腦文庫(kù)的EST(Vasmatzis，G.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95300-304(1998))。在這些最初的報(bào)道之后，其它的EST亦被存放到這個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)中，目前這個(gè)庫(kù)包括來(lái)自乳房，結(jié)腸，腎以及胃的文庫(kù)的EST。為了鑒定這些EST的出現(xiàn)是否說(shuō)明TARP轉(zhuǎn)錄本在這些細(xì)胞中就表達(dá)或者當(dāng)這些文庫(kù)建成時(shí)是否就歸因于浸潤(rùn)γBT-淋巴細(xì)胞的存在，我們對(duì)不同的細(xì)胞系進(jìn)行RT-PCR來(lái)檢測(cè)TARP轉(zhuǎn)錄本的存在。如附圖4A所示，在乳房細(xì)胞系MCF7，BT-474，SK-BR-3和CRL-1897中檢測(cè)到TARP的表達(dá)。在成纖維細(xì)胞瘤細(xì)胞系A(chǔ)172，成膠質(zhì)細(xì)胞瘤細(xì)胞系IMR32，結(jié)腸細(xì)胞系COLO 205，胃細(xì)胞系KATO III或腎細(xì)胞系COS7和293中沒(méi)有檢測(cè)到信號(hào)(附圖4A，數(shù)據(jù)未顯示)。為了鑒定TARP轉(zhuǎn)錄本是否在除上述細(xì)胞系以外的人乳房組織中表達(dá)，我們利用RAPID-SCANTM(OriGeneTechnologies，Rockville，MD)檢測(cè)了12個(gè)不同的乳房癌細(xì)胞的cDNA。顯示出TARP mRNA在一些乳房樣品中是大量存在的(附圖4B，上圖)，而正常乳房中的TARP mRNA在35個(gè)PCR循環(huán)后只達(dá)到可檢測(cè)的水平(結(jié)果未顯示)。值得注意的是，在缺少cDNA的反應(yīng)中未檢測(cè)到信號(hào)。用于顯示相同cDNA量的肌動(dòng)蛋白存在于每一個(gè)泳道(下圖)。在正常乳房樣品中的微弱信號(hào)與附圖4A和5的Hs57Bst細(xì)胞系所顯示的TARP信號(hào)的缺乏相關(guān)，Hs57Bst細(xì)胞系來(lái)自正常的乳房組織。這些結(jié)果表明乳房發(fā)生致癌性轉(zhuǎn)化后TARP轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)提高。但是在做出任何最后的結(jié)論前必須進(jìn)行更多的研究。
為了確定在乳房細(xì)胞系中觀察到的TARP轉(zhuǎn)錄本與前列腺細(xì)胞系中發(fā)現(xiàn)的轉(zhuǎn)錄本是否相同，我們利用抗不同TARP轉(zhuǎn)錄本區(qū)域的引物進(jìn)行PT-PCR。如附圖5A所示，前列腺中的TARP轉(zhuǎn)錄本含有Jγ1.2基因區(qū)段部分，3個(gè)Cγ1外顯子以及跟隨一個(gè)poly(A)尾(7)的一些非翻譯序列。引物組1和3擴(kuò)增了全部TARP轉(zhuǎn)錄本(附圖5B，上圖)而引物組2和3僅擴(kuò)增了Cγ1區(qū)域(附圖5B，中間部分)。如附圖5B所示，與利用任一個(gè)引物組的前列腺細(xì)胞系(LNCaP)相比在三個(gè)乳房細(xì)胞系(MCR7，BT-474和SK-BR-3)中檢測(cè)到相似大小的條帶。重要地，在缺少cDNA(dH2O)的反應(yīng)中沒(méi)有檢測(cè)到信號(hào)，且使用了肌動(dòng)蛋白對(duì)照所示的相同量的cDNA(附圖5B，下圖)。這些數(shù)據(jù)表明在乳房細(xì)胞系中發(fā)現(xiàn)的TARP轉(zhuǎn)錄本與在前列腺細(xì)胞系中發(fā)現(xiàn)的轉(zhuǎn)錄本相同。為了進(jìn)一步證明這個(gè)結(jié)論，我們用Northern印跡分析了來(lái)自每個(gè)細(xì)胞系的TARP轉(zhuǎn)錄本的大小。如上所述，1100和2800個(gè)核苷酸轉(zhuǎn)錄本存在于LNCaP細(xì)胞系中，其中1100個(gè)核苷酸的轉(zhuǎn)錄本是主要的形式(Essand，M.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 969287-9292(1999))。如附圖5C所示，與前列腺細(xì)胞系LNCaP相比，在3個(gè)乳房細(xì)胞系(MCF7，BT-474和SK-BR-3)中都發(fā)現(xiàn)了相似大小的TARP轉(zhuǎn)錄本，盡管強(qiáng)度較弱。因此我們得出結(jié)論TARP在前列腺和乳房癌細(xì)胞中表達(dá)。
為了確定TARP蛋白是否存在于乳房癌細(xì)胞系中，我們用抗TARP的抗體和乳房癌細(xì)胞核提取物進(jìn)行Western印跡。如附圖6(上圖)所示，在MCF7，BT-474和SK-BR-3細(xì)胞中檢測(cè)到TARP反應(yīng)條帶。在這些乳房癌細(xì)胞學(xué)中的膜或細(xì)胞質(zhì)部分沒(méi)有檢測(cè)到TARP(數(shù)據(jù)未列出)。重要地，TARP是乳房細(xì)胞系的TARP轉(zhuǎn)錄本所編碼的蛋白產(chǎn)物的一部分，因?yàn)樵谌我贿@些核提取物中都未檢測(cè)到TCRγ，即使重組蛋白與所用抗體表現(xiàn)出很強(qiáng)的信號(hào)(附圖6，下圖)。這些數(shù)據(jù)表明TARP也存在于乳房癌細(xì)胞中。
我們報(bào)道了鑒定到一個(gè)來(lái)自TCRγ座位由特異性轉(zhuǎn)錄本編碼的在前列腺和乳房癌細(xì)胞中表達(dá)的7KDa的核蛋白。因?yàn)樵摰鞍子刹煌赥CRγ的讀框編碼，我們把TCRγ可變閱讀框架蛋白稱(chēng)之為T(mén)ARP。除了從起始于TCRγ一個(gè)內(nèi)含子內(nèi)的位點(diǎn)可變閱讀框架被翻譯外，TARP還有其它的兩個(gè)特征。首先，令人意外的發(fā)現(xiàn)這樣的小肽存在于細(xì)胞中，因?yàn)榇蠖鄶?shù)是分泌型的。其次，TARP缺少一個(gè)較好的Kozak序列(Kozak，M.Cell 44283-92(1986))。由于TCRγ閱讀框架含有好的Kozak序列，我們最初設(shè)想的截短的TCRγ蛋白被編碼。但是，如附圖3所示，我們最初的設(shè)想是錯(cuò)誤的，有趣的是體外翻譯結(jié)果表明TARP蛋白的偏好和TARP閱讀框架中的兩個(gè)ATG之一可被用于起始蛋白的合成。蛋白應(yīng)被測(cè)序來(lái)鑒定哪個(gè)ATG被用于啟動(dòng)TARP蛋白的合成。
TARP蛋白序列的有趣之處在于七體重復(fù)序列中有五個(gè)亮氨酸，這表明TARP可能含有一個(gè)二聚化亮氨酸的拉鏈基元(附圖7A。)如果是這樣，TARP必須含有一個(gè)兩親螺旋。其一暗示TARP可能含有一個(gè)兩親螺旋，據(jù)信其中絲氨酸和脯氨酸殘基作為螺旋的起點(diǎn)，這些殘基被發(fā)現(xiàn)恰好在第一個(gè)亮氨酸重復(fù)之前。第二，很多帶電的氨基酸被發(fā)現(xiàn)存在于七體重復(fù)中，即為螺旋提供了兩親特征并可能充當(dāng)與其它的螺旋鹽橋。即使亮氨酸存在于七體重復(fù)中是亮氨酸拉鏈基元的好的指示，但是也存在被鑒定的在七體重復(fù)中含有5個(gè)亮氨酸的蛋白其并非亮氨酸拉鏈蛋白的情況。例如karyopherin的晶體結(jié)構(gòu)(Chook，Y.M.等，Nature 399230-237(1999))，嗜熱脂肪芽孢桿菌(B.sterarothermophilus)嘧啶核苷磷酸化酶(Pugmire，M.J.等，Structure 61467-1479(1998))以及嗜熱柄熱菌(T.Thermophilus)苯丙氨酰-tRNA合成酶(Mosyak，L.等，Nat.Struct.Biol.2537-547(1995))表明這些蛋白在七體重復(fù)中含有5個(gè)亮氨酸的區(qū)域并不含有螺旋結(jié)構(gòu)。需要研究相互作用和結(jié)構(gòu)來(lái)探索TARP中發(fā)現(xiàn)的亮氨酸重復(fù)的意義。
TARP氨基酸序列的另一個(gè)獨(dú)特的特征是堿性氨基酸區(qū)連接了一個(gè)可能的亮氨酸拉鏈基元(圖7A)，此表明可能是一個(gè)DNA結(jié)合元。但是堿性區(qū)的定位是獨(dú)特的，其在亮氨酸重復(fù)的后面而不是在前面。大多數(shù)結(jié)合DNA的亮氨酸拉鏈蛋白在亮氨酸重復(fù)的前面具有堿性區(qū)域(參見(jiàn)(Chook，Y.M.等，Nature 399230-237(1999)))。TARP的堿性區(qū)域可能僅僅行使核定位信號(hào)的功能，但是TARP是一種核蛋白的事實(shí)加強(qiáng)了TARP可能結(jié)合DNA的假說(shuō)。在作出最后的結(jié)論之前有必要進(jìn)行功能的研究。
為了測(cè)定TARP與任何已知的蛋白是否具有同源性，我們?cè)贕enBank中進(jìn)行了蛋白質(zhì)的BLAST檢索。檢索的結(jié)果顯示TARP的氨基酸序列與Dictyostelium dicoideum Tupl(GenBank入藏號(hào)AAC29438)和Saccharomyces cerevisiae Tupl(Williams，F(xiàn).E.等，Mol.Cell.Biol.106500-6511(1990))具有一些同源性(附圖7C)。酵母Tupl通常被發(fā)現(xiàn)與Cyc8(Ssn6)結(jié)合且由葡萄糖、氧和DNA損傷調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)所需要的(Tzamarias，D.等，Genes Dev.9821-831(1995))。既不是Cyc8(Ssn6)也不是Tupl結(jié)合DNA，而是通過(guò)與特異性結(jié)合DNA的蛋白例如a2，Migl，Roxl等蛋白相互作用，各自充當(dāng)共表達(dá)復(fù)合物的一部分(Tzamarias，D.等，Genes Dev.9821-831(1995))。Tupl的C｀末端部分含有六個(gè)富含門(mén)冬氨酸鹽和色氨酸的43氨基酸序列的重復(fù)，已知為WD-40或β-轉(zhuǎn)導(dǎo)素重復(fù)(Williams，F(xiàn).E.等，Mol.Cell.Biol.106500-6511(1990)；Fong，H.K.等，Proc.NatlAcad.Sci.USA 832162-2166(1986))。WD-40重復(fù)已在很多的蛋白中被鑒定出，且在蛋白與蛋白之間的相互作用中起作用。重要的是，Tupl已被顯示通過(guò)其兩個(gè)WD-40重復(fù)與a2相互作用(Komachi，K.等，Genes Dev.82857-2867(1994))。有趣的是，TARP與Tupl的第5個(gè)WD-40重復(fù)有同源性(附圖7C)。因?yàn)門(mén)ARP是一種核蛋白，其與Tupl的同源性表明TARP可能是一個(gè)與轉(zhuǎn)錄調(diào)控有關(guān)的功能性核蛋白復(fù)合物。因此，鑒定TARP相互作用蛋白來(lái)檢測(cè)其功能是必要的。
TARP抗體識(shí)別前列腺和乳房細(xì)胞核提取物中的雙聯(lián)體(附圖6A)。最快的7kDa條帶與His-TARP重組蛋白共遷移，而最弱的條帶為分子量較大的分子。一種可能的解釋是9kDa的條帶是翻譯后修飾的。為了檢測(cè)TARP是否含有任何已知的翻譯后的修飾位點(diǎn)，我們利用瑞士生物信息學(xué)研究所ExPASy蛋白組學(xué)服務(wù)器(Swiss Institute ofBioinformatics ExPASy proteomics server)(http//www.expasv.ch)的PROSITE分析程序來(lái)分析TARP氨基酸序列(Appel，R.D.等，TrendsBiochem.Sci.19248-260(1994)；Hofmann，K.等，Nucleic Acids Res.27215-219(1999))。如附圖7A所示，發(fā)現(xiàn)很多可能的磷酸化作用位點(diǎn)包括cAMP和cGMP-依賴(lài)的蛋白激酶磷酶化位點(diǎn)(RRAT和RRGT)以及蛋白激酶C磷酸化位點(diǎn)(SSR和SRR)。磷酸化作用被顯示在很多的情況下來(lái)引起蛋白質(zhì)在SDS PAGE凝膠上以較大分子量運(yùn)行。如果這種情況屬實(shí)，附圖6的結(jié)果表明未修飾的形式在LNCaP細(xì)胞中是普遍的且磷酸化的形式僅存在于MCF7和SK-BR-3細(xì)胞中。需要進(jìn)行另一個(gè)試驗(yàn)來(lái)檢測(cè)9kDa條帶的特性以及當(dāng)在前列腺和乳房癌細(xì)胞中表達(dá)時(shí)TARP是否是翻譯后修飾的。
我們?cè)诖藞?bào)道了TARP mRNA和蛋白在乳房癌細(xì)胞中的表達(dá)。我們最初的對(duì)TARP轉(zhuǎn)錄本的研究并沒(méi)有揭示TARP在乳房中的表達(dá)(Essand，M.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 969287-9292(1999))。一種可能的解釋是TARP在正常的乳房中低水平表達(dá)且很難去檢測(cè)。如結(jié)果部分所述的，與癌樣本中檢測(cè)到的強(qiáng)烈信號(hào)相比正常乳房樣本的PCR分析檢測(cè)到非常弱的信號(hào)。因此，TARP在乳房癌細(xì)胞中的存在說(shuō)明TARP的表達(dá)是在乳房細(xì)胞被致癌轉(zhuǎn)化后被誘導(dǎo)的。此外，TARP在乳房癌細(xì)胞中的存在可以表明TARP由雌激素調(diào)控。這種假說(shuō)通過(guò)鑒定結(jié)合雄激素應(yīng)答元件(ARE)和雌激素應(yīng)答元件(ERE)的TARP的內(nèi)含啟動(dòng)子的元件得以加強(qiáng)。此種雜合的元件由兩個(gè)半位點(diǎn)組成，它們對(duì)ARE在5’末端特異且對(duì)ERE在3’末端特異[(Zilliacus，J.等，Mol.Endocrinol.9389-400(1995))以及未公開(kāi)的數(shù)據(jù)]]。需要進(jìn)行另一個(gè)實(shí)驗(yàn)，來(lái)檢測(cè)是否雌激素調(diào)控TARP。然則，有一些例子，其中的突變體ARE引起某些前列腺特異的基因在乳房腫瘤中的表達(dá)。例如，前列腺特異性抗原(PSA)已顯示在乳房腫瘤中表達(dá)(Majumdar，S.等，Br.J.Cancer 791594-1602(1999))。PSA異常表達(dá)的分子分析導(dǎo)致發(fā)現(xiàn)了在PSA啟動(dòng)子中發(fā)現(xiàn)的ARE中的單一位點(diǎn)突變。突變導(dǎo)致雄激素調(diào)控的PSA在乳房瘤中的表達(dá)的丟失是可信的(Majumdar，S.等，Br.J.Cancer 791594-1602(1999))。此時(shí)TARP啟動(dòng)子中的類(lèi)似突變是否發(fā)生在3個(gè)被檢測(cè)的乳房細(xì)胞系中仍不得而知。
前列腺依賴(lài)雄激素來(lái)維持其結(jié)構(gòu)和功能。當(dāng)前列腺細(xì)胞變?yōu)閻盒约?xì)胞時(shí)，其經(jīng)常失去了雄激素依賴(lài)。在此研究中，我們使用兩種對(duì)雄激素具有不同依賴(lài)性的前列腺細(xì)胞系LNCaP和PC3細(xì)胞。雄激素受體存在于雄激素非依賴(lài)的LNCaP細(xì)胞系中，但不存在于雄激素依賴(lài)性的PC3細(xì)胞系中(Tilley，W.D.等，Cancer Res.505382-5386(1990))。如附圖3所示，TARP在LNCaP細(xì)胞而不在PC3細(xì)胞中表達(dá)。此結(jié)果表明TARP表達(dá)可通過(guò)雄激素刺激來(lái)調(diào)控。TARP啟動(dòng)子中的ARE類(lèi)元件的鑒定加強(qiáng)了TARP被雄激素誘導(dǎo)的觀點(diǎn)。確定雄激素是否誘導(dǎo)TARP mRNA表達(dá)的實(shí)驗(yàn)正在進(jìn)行中。在LNCaP細(xì)胞而不在PC3細(xì)胞中表達(dá)表明TARP在調(diào)控雄激素依賴(lài)的應(yīng)答中是重要的。
本發(fā)明提供了新的涉及前列腺細(xì)胞，前列腺癌，以及乳房細(xì)胞和乳房癌的材料和方法。特異性的樣本已被提供，上面所述的是例證且非限制的。在本發(fā)明說(shuō)明書(shū)基礎(chǔ)上的許多變化對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是顯而易見(jiàn)的。本發(fā)明的保護(hù)范圍，因此，不應(yīng)局限于上面的具體描述而應(yīng)參照后附的權(quán)利要求書(shū)及其等同物的全部含義來(lái)確定。
本申請(qǐng)中所引證的所有出版物和專(zhuān)利文獻(xiàn)以其全文引入本文做參考，就各種目的而言，其引用程度就如同每一出版物或?qū)＠墨I(xiàn)被單個(gè)地整個(gè)引入一樣。在本專(zhuān)利申請(qǐng)中所引入的任何文獻(xiàn)不應(yīng)看成是本發(fā)明的現(xiàn)有技術(shù)。
權(quán)利要求
1.一種分離的多肽，其含有的氨基酸序列選自TCRγ可變閱讀框架蛋白(TARP)，其免疫原性片段，與TARP有至少90％序列同一性且被特異性識(shí)別TARP的抗體特異性識(shí)別的多肽，以及，與TARP有至少90％序列同一性且當(dāng)被加工并在主要組織相容性復(fù)合物分子體系中被提呈后，激活T淋巴細(xì)胞抵抗表達(dá)TARP的細(xì)胞的多肽。
2.權(quán)利要求1所述的分離的多肽，其中的多肽含有TARP的序列。
3.權(quán)利要求1所述的分離的多肽，其中的多肽含有TARP的免疫原性片段的序列。
4.權(quán)利要求1所述的分離的多肽，其中的多肽與TARP至少有90％的序列同一性且被特異性識(shí)別TARP的抗體特異性識(shí)別。
5.權(quán)利要求1所述的分離的多肽，其中的多肽與TARP至少有90％的序列同一性，并且，當(dāng)被加工并在主要組織相容性復(fù)合物分子體系中提呈后，激活T淋巴細(xì)胞抵抗表達(dá)TARP的細(xì)胞。
6.一種含有權(quán)利要求2的多肽和一種可藥用載體的組合物。
7.一種含有權(quán)利要求3的多肽和一種可藥用載體的組合物。
8.一種含有權(quán)利要求4的多肽和一種可藥用載體的組合物。
9.一種含有權(quán)利要求5的多肽和一種可藥用載體的組合物。
10.一種分離的重組核酸分子，其含有編碼具有TCRγ可變閱讀框架蛋白(“TARP”)的氨基酸序列的多肽，其免疫原性片段，與TARP至少有90％序列同一性且被特異性識(shí)別TARP的抗體特異性識(shí)別的多肽，以及，與TARP至少有90％序列同一性且其當(dāng)被加工并在主要組織相容性復(fù)合物分子體系中被提呈后激活T淋巴細(xì)胞抵抗表達(dá)TARP的細(xì)胞的多肽的核苷酸序列。
11.如權(quán)利要求10所述的分離的重組核酸分子，含有TARP的序列。
12.如權(quán)利要求10所述的分離的重組核酸分子，其中的多肽是TARP的免疫原性片段。
13.如權(quán)利要求10所述的分離的重組核酸分子，其中的多肽與TARP至少有90％序列同一性且被特異性識(shí)別TARP的抗體特異性識(shí)別。
14.如權(quán)利要求10所述的分離的重組核酸分子，其中的多肽與TARP至少有90％序列同一性且其當(dāng)被加工并在主要組織相容性復(fù)合物分子體系中被提呈后激活T淋巴細(xì)胞抵抗表達(dá)TARP的細(xì)胞。
15.如權(quán)利要求10所述的分離的重組核酸分子是一個(gè)含有可操作地連接于核苷酸序列的啟動(dòng)子的表達(dá)載體。
16.如權(quán)利要求15所述的分離的重組核酸分子，其中所述的核苷酸編碼具有TCRγ可變閱讀框架蛋白(″TARP″)的氨基酸序列的多肽。
17.如權(quán)利要求15所述的分離的重組核酸分子，其中所述的核苷酸序列編碼具有TARP的免疫原性片段的氨基酸序列的多肽。
18.如權(quán)利要求12所述的分離的重組核酸分子，其中所述的核苷酸序列編碼與TARP至少有90％序列同一性且被特異性識(shí)別TARP的抗體特異性識(shí)別的多肽。
19.如權(quán)利要求12所述的分離的重組核酸分子，其中所述的核苷酸序列編碼與TARP至少有90％序列同一性且當(dāng)被加工并在主要組織相容性復(fù)合物分子體系中被提呈后激活T淋巴細(xì)胞抵抗表達(dá)TARP的細(xì)胞的多肽。
20.一種包括將一種組合物給藥于個(gè)體的方法，其中的組合物選自以下成員組成的組分離的具有TCRγ可變閱讀框架蛋白(“TARP”)的氨基酸序列的多肽，其免疫原性片段，與TARP至少有90％序列同一性且被特異性識(shí)別TARP的抗體特異性識(shí)別的多肽，與TARP至少有90％序列同一性且當(dāng)被加工并在主要組織相容性復(fù)合物分子體系中被提呈后激活T淋巴細(xì)胞抵抗表達(dá)TARP的細(xì)胞的多肽，一種分離的編碼這些多肽之一的核酸，一種用含有TARP的表位的多肽刺激的抗原提呈細(xì)胞，以及，體外被TARP、其免疫原性片段、與TARP有至少90％序列同一性且被特異性識(shí)別TARP的抗體特異性識(shí)別的多肽或與TARP有至少90％序列同一性且當(dāng)被加工并在主要組織相容性復(fù)合物分子體系中被提呈后激活T淋巴細(xì)胞抵抗表達(dá)TARP的細(xì)胞的多肽致敏的細(xì)胞。
21.權(quán)利要求20的方法，包括給藥于個(gè)體TARP或其免疫原性片段。
22.權(quán)利要求20的方法，其中的多肽與TARP有至少90％序列同一性且被特異性識(shí)別TARP的抗體特異性識(shí)別。
23.權(quán)利要求20的方法，其中的多肽與TARP至少有90％的序列同一性且當(dāng)被加工并被結(jié)合有MHC分子的抗原提呈細(xì)胞提呈后激活T淋巴細(xì)胞抵抗表達(dá)TARP的細(xì)胞。
24.權(quán)利要求20的方法，其中給藥于患前列腺癌的個(gè)體。
25.權(quán)利要求20的方法，其中給藥于患乳房癌的個(gè)體。
26.權(quán)利要求20的方法，其中給藥于沒(méi)有進(jìn)行過(guò)乳房癌診斷的雌性個(gè)體。
27.權(quán)利要求20的方法，其中給藥包括在體外使CD8+細(xì)胞對(duì)TARP蛋白的表位敏化并將致敏細(xì)胞給藥于個(gè)體。
28.權(quán)利要求20的方法，進(jìn)一步包括共同給藥于個(gè)體選自下列的免疫佐劑非特異性的免疫佐劑，亞細(xì)胞微生物產(chǎn)物和成分，半抗原，免疫原性蛋白，免疫調(diào)節(jié)劑，干擾素，胸腺激素和集落刺激因子。
29.權(quán)利要求20的方法，包括給藥用含有TARP表位的多肽脈沖的抗原提呈細(xì)胞。
30.權(quán)利要求20的方法，包括給藥編碼含有TARP表位的多肽的核酸序列，其中的核酸包含在重組病毒中。
31.權(quán)利要求20的方法，包括給藥編碼含有TARP蛋白的表位的多肽的核酸序列。
32.權(quán)利要求20的方法，包括給藥表達(dá)含有TARP蛋白的表位的多肽的表達(dá)載體，其中的表達(dá)載體是在重組細(xì)菌細(xì)胞中。
33.權(quán)利要求20的方法，包括用表達(dá)含有TARP蛋白的表位的多肽的表達(dá)載體免疫個(gè)體，其中的表達(dá)載體在自體重組細(xì)胞中。
34.權(quán)利要求27的方法，其中的CD8+細(xì)胞為T(mén)c細(xì)胞。
35.權(quán)利要求34的方法，其中的Tc細(xì)胞為腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞。
36.一種在雄性中檢測(cè)上皮來(lái)源的前列腺細(xì)胞或在雌性中檢測(cè)乳房癌細(xì)胞的方法，包括檢測(cè)來(lái)自所述雄性或所述雌性的細(xì)胞中的編碼TARP的核酸轉(zhuǎn)錄本，或檢測(cè)通過(guò)轉(zhuǎn)錄本的翻譯產(chǎn)生的TARP，其中在來(lái)自所述的男性的細(xì)胞中檢測(cè)到所述的轉(zhuǎn)錄本或蛋白則該細(xì)胞被鑒定為前列腺上皮細(xì)胞，在來(lái)自所述的女性的細(xì)胞中檢測(cè)到所述的轉(zhuǎn)錄本或蛋白則該細(xì)胞被鑒定為乳房癌細(xì)胞。
37.如權(quán)利要求36所述的方法，包括檢測(cè)所述的轉(zhuǎn)錄本。
38.如權(quán)利要求36所述的方法，包括檢測(cè)所述的蛋白。
39.如權(quán)利要求36所述的方法，包括用在雜交條件下特異性雜交于轉(zhuǎn)錄本的核酸探針接觸來(lái)自所述細(xì)胞的RNA，并檢測(cè)雜交。
40.如權(quán)利要求36所述的方法，包括裂解所述細(xì)胞并用含有靶向元件和可檢測(cè)標(biāo)記的嵌合分子接觸細(xì)胞內(nèi)容物的部分，其中的靶向元件特異性結(jié)合于所述蛋白，并檢測(cè)結(jié)合于蛋白的標(biāo)記物。
41.如權(quán)利要求36所述的方法，其中的細(xì)胞取自淋巴結(jié)。
42.如權(quán)利要求36所述的方法，其中的細(xì)胞取自乳房活組織。
43.一種特異性結(jié)合于TCRγ可變閱讀框架蛋白的抗體。
44.一種在細(xì)胞中調(diào)節(jié)TARP水平的方法，包括向所述細(xì)胞導(dǎo)入一種選自由以下成員組成的組中的組合物特異性裂解編碼TARP的核酸的核酶，特異性結(jié)合于編碼TARP的核酸的反義寡核苷酸，特異性結(jié)合于與編碼TARP的核酸結(jié)合的蛋白的DNA，以及可操作地連接于啟動(dòng)子的編碼TARP的核酸。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種含有來(lái)自前列腺上皮細(xì)胞和很多乳房腫瘤細(xì)胞的TCRγ轉(zhuǎn)錄本的序列的核酸以及由這些序列翻譯表達(dá)的T－細(xì)胞受體γ可變閱讀框架蛋白(“TARP”)。從TARP制備而來(lái)的疫苗對(duì)于增加對(duì)其中該蛋白被表達(dá)的細(xì)胞(包括前列腺癌細(xì)胞和很多乳房癌的細(xì)胞)的免疫應(yīng)答是有用的。本發(fā)明提供了診斷前列腺癌和表達(dá)TARP的乳房癌細(xì)胞存在的方法,以及將TARP和編碼TARP的核酸給藥于個(gè)體的方法。
文檔編號(hào)A61K48/00GK1378594SQ00810302
公開(kāi)日2002年11月6日 申請(qǐng)日期2000年7月12日 優(yōu)先權(quán)日1999年7月13日
發(fā)明者艾拉·帕斯坦, 馬格努斯·埃森德, 比揚(yáng)庫(kù)克·李, 喬治·瓦斯馬茨斯, 庫(kù)爾特·沃爾夫?qū)? 烏爾里希·布林克曼 申請(qǐng)人:美國(guó)政府健康及人類(lèi)服務(wù)部