專利名稱：表達免疫調(diào)節(jié)分子的重組呼吸道合胞病毒的制備的制作方法
背景技術(shù)：
人呼吸道合胞病毒(HRSV)是世界范圍內(nèi)嚴重兒科呼吸道疾病的首要病因(Collins等，F(xiàn)ields Virology 21313-1352，1996；在此引用作為參考)。RSV是超過所有其它病毒的誘發(fā)1歲以下幼兒肺炎和細支氣管炎的病原。幾乎所有的兒童在兩歲時都被感染，再次感染以可觀的頻率發(fā)生于較大的兒童和青年中(Chanock等，于ViralInfection of Humans，3rded.，A.S.Evans，ed.，Plenum Press，N.Y.，1989；在此引用作為參考)。因呼吸道疾病引起的兒科入院的五分之一是由RSV引起的，并且僅在美國每年造成10萬例入院和4,500例死亡(Heilman等，J.Infect.Dis.161402-6，1990；在此引用作為參考)。此外，有證據(jù)表明生命早期的嚴重呼吸道感染可以引發(fā)或惡化哮喘(Sigurs等，Pediatrics 95500-505，1995；在此引用作為參考)。
盡管RSV通常被認為感染兒童群體，也發(fā)現(xiàn)它是較老的人中嚴重疾病的重要誘因(Falsey等，J.Infect.Dis.172389-394，1995；在此引用作為參考)。RSV也在某些無免疫應(yīng)答的個體(如骨髓移植受體)中引起威脅到生命的疾病(Fouillard等，Bone Marrow Transplant 997-100，1992；在此引用作為參考)。
現(xiàn)在有一種化學(xué)治療試劑，病毒唑，可以治療RSV。但其療效和應(yīng)用是有爭議的。也有干擾RSV的已注冊的產(chǎn)品，由一個供體IgG池(Groothuis等，N.Engl.J.Med.3291524-1530，1993；在此引用作為參考)或人源化RSV特異的單克隆抗體組成。這些是作為被動免疫預(yù)防試劑給藥高危險個體。盡管這些產(chǎn)品有作用，其高成本和其它因素(如缺乏長期的有效性)使其不適合廣泛的使用。其它不利之處包括傳播由血液運載的病毒的可能性和制備和儲存的難度和花費。此外，對該感染性疾病控制的歷史，以及特別是病毒起源的疾病，表明疫苗的首要重要性。
盡管多年以來對發(fā)展抗RSV的有效疫苗制劑進行了研究，仍然沒有安全和有效的疫苗被認可，以預(yù)防與RSV感染相關(guān)的嚴重疾病和顯著的死亡率。難以發(fā)展成功的疫苗與這一事實部分相關(guān)，即，小的幼兒對RSV抗原的血清和分泌性抗體應(yīng)答較低。因此，RSV對這些個體的感染更嚴重，而累積性免疫似乎保護更年長的兒童和成人，以抗該病毒更嚴重的沖擊。
RSV感染中的免疫機制近來成為研究焦點。分泌性抗體在保護上呼吸道中似乎最重要，而高水平血清抗體被認為抗RSV在下呼吸道的感染中起主要作用。RSV特異的細胞毒T細胞，誘導(dǎo)免疫的另一個效應(yīng)方面，對解決RSV的感染也重要。不過，盡管后一個效應(yīng)物可因先前的免疫而增強，對病毒攻擊有增強的抗性，但這種效應(yīng)是短期的。F和G表面糖蛋白是RSV的兩個主要保護性抗原，也是RSV中僅有的誘導(dǎo)RSV中和抗體和對抗攻擊長效抗性的蛋白(Collins等，F(xiàn)ieldsVirology，F(xiàn)ields等，eds.，21313-1352，Lippincott-Raven，Philadelphia，1996；Connors等，J.Virol.65(3)1634-1637，1991；在此引用作為參考)。第三個RSV表面蛋白，SH，不誘導(dǎo)RSV中和抗體和對RSV攻擊的顯著抗性。
發(fā)展活RSV疫苗的一個阻礙是難以在減毒和免疫原性之間獲得一種適當(dāng)?shù)钠胶?。其它阻礙包括一些減毒病毒遺傳不穩(wěn)定、RSV在細胞培養(yǎng)時相對低的生長和病毒顆粒的不穩(wěn)定。此外，天然感染誘發(fā)的免疫不能充分抗后來的感染。許多因素可能引起這種現(xiàn)象，包括免疫系統(tǒng)對限制呼吸道腔表面病毒感染相對的低效，局部粘膜免疫的短期性，快速和廣泛的病毒復(fù)制，由于免疫不成熟而在幼兒中降低的免疫應(yīng)答，經(jīng)胎盤來源的母體血清抗體引起的免疫抑制，和病毒的某些特點，如G蛋白高水平的糖基化。RSV也作為兩個抗原亞型A和B出現(xiàn)，如下所述，抗一個亞型的免疫對于另一個的有效性下降。
盡管RSV在生命中可以多次感染，由于先前感染誘導(dǎo)的保護性免疫的存在，再次感染的嚴重性降低，因此免疫預(yù)防是可行的?？梢员莾?nèi)給藥一種活的減毒RSV疫苗以引發(fā)輕度的免疫性感染。與腸胃外給藥途徑相比，這種方式的優(yōu)點是簡單和安全。這也直接刺激在抵抗RSV中起主要作用的局部呼吸道免疫。這也消除了RSV-特異的母體來源的血清抗體的免疫抑制(典型的發(fā)現(xiàn)于幼兒中)效果。RSV抗原腸胃外給藥有時與免疫病理并發(fā)癥相關(guān)(Murphy等，Vaccine 8(5)497-502，1990；在此引用作為參考)，而用活病毒從未發(fā)現(xiàn)這種情況。
二十世紀六十年代中期，一種福爾馬林滅活的病毒疫苗被檢測為抗RSV，但不能抗RSV感染或疾病，事實上，在之后的病毒感染時癥狀更加惡化(Kim等，Am.J.Epidemiol.89422-434，1969；Chin等，Am.J.Epidemiol.89449-463，1969；Kapikian等，Am.J.Epidemiol.89405-421，1969，在此引用作為參考)。
更近一些的RSV的疫苗發(fā)展聚焦于減毒的RSV突變體。Friedewald等報道了一種冷傳代型RSV突變體(cpRSV)(J.Amer.Med.Assoc.204690-694，1968；在此引用作為參考)，其足夠地減毒從而可以作為疫苗使用。這種突變體與其野生型(wt)親本病毒相比，表現(xiàn)在26℃略微增加的生長效率，但其復(fù)制并非溫度敏感或顯著的冷適應(yīng)的。但這種冷傳代的突變體在成人中是減毒的。盡管其在先前感染了RSV的幼兒和兒童(即，血清反應(yīng)陽性個體)中具有滿意的減毒和免疫原性，這種cpRSV突變體在血清反應(yīng)為陰性的幼兒上呼吸道中保持低水平的毒性。
同樣的，Gharpure等報道分離出一種溫度敏感RSV突變體(tsRSV)(J.Virol.3414-421，1969；在此引用作為參考)，其也是有前途的候選疫苗。一個突變體，ts-1，被廣泛地在實驗室和志愿者中檢測。該突變體在成人志愿者中產(chǎn)生無病癥的感染，也賦予對免疫45天后野生型病毒攻擊的抗性。盡管血清反應(yīng)陽性的幼兒和兒童經(jīng)歷無病癥的感染，血清為陰性的幼兒卻發(fā)展出鼻炎和其它輕微癥狀。此外，也發(fā)現(xiàn)了這種ts表型的不穩(wěn)定性。盡管表現(xiàn)顯示部分或完全的溫度敏感性喪失的病毒代表從接種者可回收的病毒的一小部分，其除了輕微鼻炎外不引起其他疾病癥狀。
這些和其它研究表明某些冷傳代和溫度敏感RSV株減毒不足，因此可在一些受接種者，特別是血清反應(yīng)陰性幼兒中引發(fā)疾病的輕微癥狀，而另一些過分減毒，不能足量復(fù)制以誘導(dǎo)保護性免疫應(yīng)答(Wright等，Infect.Immun.37397-400，1982；在此引用作為參考)。此外，候選疫苗突變體的遺傳不穩(wěn)定性導(dǎo)致其溫度敏感表型的喪失，進一步阻礙了發(fā)展有效的RSV疫苗。一般參見(Hodes等，Proc.Soc.Exp.Biol.Med.1451158-1164，1974；McIntosh等，Pediatr.Res.8689-696，1974；Belshe等，J.Med.Virol.3101-110，1978；在此引用作為參考)。
作為活減毒RSV疫苗的替代，研究者還用純化的RSV包膜糖蛋白檢測了候選亞單位疫苗。這種糖蛋白在棉鼠肺中誘導(dǎo)對RSV感染的抗性(Walsh等，J.Infect.Dis.1551198-1204，1987；在此引用作為參考)，但抗體中和活性很弱，而且純化的亞單位疫苗對嚙齒類動物的免疫導(dǎo)致疾病的潛在可能(Murphy等，Vaccine 8497-502，1990；在此引用作為參考)。
也探索表達F或G包膜糖蛋白的重組痘苗病毒疫苗。這些重組體表達與天然病毒對應(yīng)物難以區(qū)分的RSV糖蛋白，皮下感染痘苗-RSVF和G重組體的嚙齒類動物產(chǎn)生高水平的特異性抗體，可中和病毒的感染性。事實上，痘苗-F重組體感染棉鼠在下呼吸道中刺激對RSV復(fù)制的幾乎完全的抗性和在上呼吸道中顯著的抗性(Olmsted等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 837462-7466，1986；在此引用作為參考)。但痘苗-F和-G重組體對猩猩的免疫在上呼吸道中幾乎不產(chǎn)生抗RSV攻擊的保護(Collins等，Vaccine 8164-168，1990，在此引用作為參考)，在下呼吸道中產(chǎn)生間斷的保護(Crowe等，Vaccine 111395-1404，1993；在此引用作為參考)。
盡管為發(fā)展有效RSV疫苗的進行了各種努力，仍然沒有許可的疫苗用于RSV。因先前的方法未能達到目標(biāo)，而強調(diào)了需要新方法發(fā)展RSV疫苗，需要特定的方法操作重組RSV，使其在活的減毒RSV重組體中包含產(chǎn)生新表型特征的遺傳改變。但對于RSV基因組RNA和其它非區(qū)段化負義RNA病毒的操作被證明是困難的。這方面主要的阻礙包括這些病毒裸露基因組RNA的無感染性，以及對于RSV而言，在組織培養(yǎng)中較差的生長、冗長的復(fù)制周期、毒粒的不穩(wěn)定性、基因組的復(fù)雜和基因產(chǎn)物的復(fù)雜組織結(jié)構(gòu)。
重組DNA技術(shù)使從cDNA獲得感染性非區(qū)段化負鏈RNA病毒成為可能，使遺傳操作病毒克隆以構(gòu)建新的候選疫苗成為可能，使快速檢測其減毒水平和表型穩(wěn)定性成為可能(綜述參見Conzelmann，J.Gen.Virol.77381-389，1996；Palese等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.9311354-11358，1996；在此引用作為參考)。文中報道了在必需病毒蛋白存在時，從cDNA編碼的反基因組RNA中獲得的一些重組病毒，這些病毒包括感染性呼吸道合胞病毒(RSV)、副流感病毒(PIV)、狂犬病病毒(RaV)、水泡性口膜炎病毒(VSV)、麻疹病毒(MeV)、牛瘟病毒和仙臺病毒(SeV)(參見，如，Garcin等，EMBO J.146087-6094，1995；Lawson等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.924477-4481，1995；Radecke等，EMBO J.145773-5784，1995；Schnell等，EMBO J.134195-4203，1994；Whelan等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.928388-8392，1995；Hoffman等，J.Virol.714272-4277，1997；Pecter等，J.Virol.735001-5009，1999；Kato等，Genes to Cells 1569-579，1996；Roberts等，Virology 247(1)1-6，1998；Baron等，J.Virol.711265-1271，1997；國際申請WO 97/06270；1995年9月27日的US臨時專利申請60/007,083；1996年9月27日的US專利申請08/720,132；1996年7月15日的60/021,773；1997年5月9日的US臨時專利申請60/046,141；1997年5月23日的US臨時專利申請60/047,634；1999年11月30日的US專利申請5,993,824(相應(yīng)于公布的國際申請WO 98/02530)；1999年4月13日的US臨時專利申請60/129,006；Collins等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.9211563-11567，1995；Bukreyev等，J.Virol.706634-6641，1996；Juhasz等，J.Virol.71(8)5814-5819，1997；Durbin等，Virology 235323-332，1997；He等，Virology 237249-260，1997；Baron等，J.Virol.711265-1271，1997；Whitehead等，Virology 247(2)232-239，1998a；Whitehead等，J.Virol.72(5)4467-4471，1998b；Jin等，Virology251206-214，1998；Whitehead等，J.Virol.73(4)3438-3442，1999；Bukreyev等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.962367-2372，1999；Bucholz等，J.Virol.73251-259，1999；Collins等，Virology 259251-255，1999，為各種目的在此分別全文引用作為參考)。
基于重組DNA技術(shù)的這些發(fā)展，現(xiàn)在可能從cDNA中獲得感染性RSV，并對RSV克隆設(shè)計和實施各種遺傳操作以構(gòu)建新的候選疫苗。因此，可以評價減毒和表型穩(wěn)定性，以及其它期望表型特征的水平。
發(fā)展重組疫苗的研究途徑之一是工程化病毒，使其表達一種或多中細胞因子或其它潛在的抗病毒分子。研究的大部分都包括野生型痘苗病毒的參與，其目標(biāo)在于增加對宿主免疫和病毒致病性的基本了解(參見，如Ramshaw等，Immunol.Rev.127157-182，1992；在此引用作為參考)。很早就考慮到細胞因子共表達以提高免疫應(yīng)答在疫苗發(fā)展中的潛在應(yīng)用(Ramshaw等，Trends Biotechol.10424-426，1992；在此引用作為參考)。但使用痘病毒作為研究客體降低了這一概念的實際應(yīng)用，因為天花已在人群體中被消滅，而且痘病毒疫苗已不在被使用。
這些利用細胞因子共表達發(fā)展疫苗的早期研究范例包括工程化地表達細胞因子白介素2(IL-2)的一個痘苗病毒。據(jù)報道這種重組病毒在免疫缺陷型無胸腺裸鼠中是減毒的(Flexner等，Nature 330259-262，1987；Ramshaw等，Nature 329545-546，1987在此引用作為參考)。對各種免疫效應(yīng)物在清除和回收中的作用也進行了研究(Karupiah等，J.Ex.Med.1721495-1503，1990；Karupiah等，J.Immunol.144290-298，1990；Karupiah等，J.Immunol.1474327-4332，1991；在此引用作為參考)。該痘苗病毒重組體表達的IL-2可極大地降低該疫苗病毒在靈長類引起的皮膚損傷，表明其顯著地減毒。盡管有這些初步的發(fā)現(xiàn)，在存在或不存在IL-2的情況下抗體的產(chǎn)生量被確定是相等的(Flexner等，Vaccine 817-21，1990；在此引用作為參考)。
重組痘苗病毒共表達其它細胞因子的例子包括白介素4(IL-4)，有報道其負調(diào)節(jié)抗病毒細胞因子的表達和細胞毒T細胞應(yīng)答，也惡化病毒感染(Sharma等，J.Virol.707103-7107，1996；在此引用作為參考)。另一個研究中，重組痘苗病毒表達氧化氮合成酶是高度減毒性的，顯示宿主防御機制對于控制痘苗病毒感染的重要性(Rolph等，J.Virol.707678-7685，1996；在此引用作為參考)。重組痘苗病毒共表達IL-5或IL-6使局部IgA產(chǎn)生4倍的增加(Ramsay等，Reprod.Fertil.Dev.6389-392，1994；在此引用作為參考)。重組痘苗病毒共表達的α腫瘤壞死因子(TNF)使小鼠控制感染能力增加，暗示該分子參與宿主對于該病毒的防御(Sambhi等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.884025-4029，1991；在此引用作為參考)。重組痘苗病毒表達的鼠IFNγ在正常或無免疫應(yīng)答的小鼠中極大地降低病毒的復(fù)制(Kohonen-Corish等，Eur.J.Immunol.20157-161，1990；在此引用作為參考)。
這些研究也擴展到逆轉(zhuǎn)錄病毒。最近，構(gòu)建了表達IL-2的猴免疫缺陷病毒(SIV)(Gundlach等，J.Virol.712225-2232，1997；在此引用作為參考)。感染這種表達IL-2的病毒的獼猴中，SIV特異的T細胞增殖應(yīng)答和抗體效價與對照病毒的相似。感染這種表達IL-2病毒的猴和4只對照動物中的兩只被發(fā)現(xiàn)存在SIV特異的CTL。另一項研究中，缺少nef基因但包含IFNγ基因的SIV重組體在體內(nèi)是減毒的，但該細胞因子基因在體內(nèi)復(fù)制幾周后不穩(wěn)定，此外，這種減毒伴隨著降低的免疫原性(Giavedoni等，J.Virol.71866-872，1997；在此引用作為參考)。
對大的雙鏈痘病毒(約有185個ORF，并且編碼許多干擾宿主防御的蛋白)或人免疫缺陷病毒(也干擾宿主防御)的研究不適用于非區(qū)段化負鏈RNA病毒。早已表明外源基因可以從重組呼吸道合胞病毒(RSV)的基因組中表達，并且可以穩(wěn)定維持(Bukreyev等，J.Virol.706634-6641，1996，在此引用作為參考)。這表明可以共表達蛋白，如細胞因子，趨化因子，配基和其它分子，其可以改變、增加或增強宿主對RSV的應(yīng)答。從重組RSV中表達免疫調(diào)節(jié)分子是期望的，因為其可以在RSV抗原產(chǎn)生的局部位點表達。此外，共表達不需要分別制備并給藥免疫調(diào)節(jié)物。從非逆轉(zhuǎn)錄病毒(即正義、雙鏈或反義RNA病毒)基因組中表達免疫調(diào)節(jié)物的策略先前沒有進行過探索。
因此需要增強和改變宿主對RSV的免疫應(yīng)答。因為RSV疫苗可以被給藥年幼的幼兒，已知該年齡組中累積免疫無效，并且在一些方面不同于成人。例如，對RSV的中和抗體應(yīng)答和細胞毒T細胞應(yīng)答在年幼者中降低(Kovarik和Siegrist，Immunol.Today 19150-152，1998；Kovarik和Siegrist，Immunol.Cell.Biol.76222-236，1998；Murphy等，J.Clin.Microbiol.24894-989，1986；Risdon等，Cell.Immunol.15414，1994；在此引用作為參考)。一般認為，新生兒的免疫系統(tǒng)傾向于Th-2型輔助T細胞應(yīng)答(即，IL-4分泌所限定的輔助T細胞亞群)(Early和Reen，Eur.J.Immunol.262885-2889，1996；在此引用作為參考)。新生兒的T細胞具有降低的對B細胞的輔助細胞活性，并產(chǎn)生低量的細胞因子，包括IL-2、γ干擾素(IFNγ)和IL-4(Splawski等，J.Clin.Invest.87454，1991；Hassan和Reen，Scand.J.Immunol.39597，1994；Wilson等，Pediatr.54118，1991；在此引用作為參考)。年幼的幼兒典型的也具有經(jīng)胎盤獲得的RSV特異性IgG，其可以干擾或改變免疫應(yīng)答(Murphy等，J.Clin.Microbiol.24894-989，1986和231009-1014，1986；Siegrist等，Eur.J.Immunol.284138-4148，1998；在此引用作為參考)。最后，某些RSV的免疫與免疫病理并發(fā)癥相關(guān)(Murphy等，Vaccine8497-502，1990；Waris等，J.Virol.716935-6939，1997；在此引用作為參考)。盡管典型地這在活減毒病毒感染中未觀察到，有證據(jù)表明單個的RSV抗原，最值得注意的是G蛋白，即使在由活病毒表達時，也具有誘導(dǎo)免疫病理學(xué)效應(yīng)的潛力(Johnson等，J.Virol.722871-2880，在此引用作為參考)。這些參與RSV免疫應(yīng)答、免疫介導(dǎo)的保護和免疫病理反應(yīng)的許多因素表明，需要發(fā)展調(diào)節(jié)對RSV疫苗的宿主應(yīng)答的方法。
總之，本領(lǐng)域迫切需要發(fā)展其它的工具和方法，以工程化制造安全有效的疫苗，減輕RSV導(dǎo)致的嚴重的健康問題。文中，需要發(fā)展一個廣泛而多樣的遺傳修飾的菜單，其可以單獨或組合地與其它類型遺傳操作一起使用，構(gòu)建可用于廣泛疫苗應(yīng)用的感染性減毒RSV候選疫苗。對活的減毒RSV疫苗病毒有用的操作可包括使重組RSV克隆共表達調(diào)節(jié)宿主免疫應(yīng)答和由免疫介導(dǎo)的保護的一種或更多因子。令人驚訝地，本發(fā)明提供了構(gòu)建感染性減毒RSV候選疫苗的其它工具，滿足了這些需要。
發(fā)明簡述本發(fā)明提供了被工程化表達一種或更多免疫調(diào)節(jié)分子的重組的RSV(rRSV)。該重組病毒具有包含編碼該免疫調(diào)節(jié)分子的多核苷酸的經(jīng)修飾的基因組或反基因組，該免疫調(diào)節(jié)分子由病毒在感染細胞中表達。優(yōu)選用于本發(fā)明的免疫調(diào)節(jié)分子包括細胞因子。但是包括趨化因子或細胞因子拮抗劑、表面或可溶性受體、附著分子、配基等在內(nèi)的其它多種免疫調(diào)節(jié)分子也可以改變病毒生物學(xué)和/或宿主對RSV的免疫應(yīng)答的一些方面。在更詳細的實施方案中，該免疫調(diào)節(jié)劑是細胞因子，選自白介素2(IL-2)、白介素4(IL-4)、γ干擾素(IFNγ)或粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)。
細胞因子和其它免疫調(diào)節(jié)分子可以被引入本發(fā)明重組RSV中，由病毒在感染細胞中表達，并改變病毒生物學(xué)的一個或多個方面。例如，免疫調(diào)節(jié)劑的引入和表達可能改變病毒感染性、復(fù)制和/或致病性，并能誘導(dǎo)或改變一種或多種宿主免疫應(yīng)答，例如抗RSV的中和抗體應(yīng)答、輔助T細胞應(yīng)答、細胞毒T細胞(CTL)應(yīng)答和/或自然殺傷(NK)細胞應(yīng)答。
本發(fā)明利用重組DNA技術(shù)提供從重組RSV中細胞內(nèi)共表達廣泛的天然或工程化蛋白。這些蛋白典型地影響造血細胞，或阻斷造血細胞之間的天然信號和相互作用。病毒基因組或反基因組被修飾，引入編碼細胞因子或其它免疫調(diào)節(jié)分子的多核苷酸，以構(gòu)建這些重組病毒。該核苷酸序列在該基因組或反基因組中添加或替代，典型地是作為單獨的基因，有自己的基因起始(GS)和終止(GE)信號。一般，編碼免疫調(diào)節(jié)分子的多核苷酸序列添加或替代到重組RSV基因組或反基因組的基因間隔區(qū)或其它非編碼區(qū)中，在任何適當(dāng)?shù)牟黄茐脑摶蚪M或反基因組中讀碼框的位點。
細胞因子或其它免疫調(diào)節(jié)分子的表達水平可通過改變該重組基因組或反基因組中編碼該細胞因子的多核苷酸的基因排序進行調(diào)整。例如，編碼該細胞因子的多核苷酸可以在RSV基因的任何基因間隔區(qū)或其它非編碼區(qū)中引入。引入的位點越上游或“接近啟動子”，該調(diào)節(jié)分子的表達水平就越高。
在RSV中插入編碼免疫調(diào)節(jié)因子的基因組或基因組區(qū)段的其它方法是，將cDNA置于如上所述的RSV基因起始和末端信號控制之下，插入該cDNA使其從反基因組而非從基因組中表達。理想的，外源基因放置于緊鄰反基因組3’末端啟動子下游，這種靠近啟動子的位置保證其高水平表達。
從RSV中表達細胞因子或其它免疫調(diào)節(jié)分子的其它方法是，將基因的ORF置于哺乳動物內(nèi)部核糖體進入位點的控制下，將該ORF插入任何一個或多個RSV基因非編碼區(qū)下游。
表達的另一種方法是通過構(gòu)建嵌合或融合蛋白。例如，希望表達于感染細胞和毒粒表面的蛋白胞外域可以添加于SH ORF或其它非必需基因的下游末端，從而其閱讀框不受干擾并產(chǎn)生嵌合蛋白。以這種方式，SH部分提供信號和膜錨點，C末端附著的結(jié)構(gòu)域被顯示于細胞外。
重組RSV表達一種或更多免疫調(diào)節(jié)分子是所希望的，因為其提供免疫調(diào)節(jié)分子于RSV抗原產(chǎn)生局部位點的表達。根據(jù)本發(fā)明的指導(dǎo)，共表達免疫調(diào)節(jié)分子不需要單獨制備和給藥免疫調(diào)節(jié)分子。此外，本發(fā)明重組RSV具有其它在發(fā)展疫苗中有用的特性。使該重組基因組或反基因組表達一種細胞因子的這種改變產(chǎn)生表現(xiàn)一個或更多如下新特征的候選疫苗，所述特征選自(i)在細胞培養(yǎng)中病毒生長的改變，(ii)在感染宿主的上和/或下呼吸道中病毒減毒的變化，(iii)病毒噬菌斑大小的改變，和/或(iv)免疫原性的改變，或另外具有，或同時伴隨有，與野生型或親本(即，不表達細胞因子的)RSV誘導(dǎo)的宿主應(yīng)答相比，誘導(dǎo)改變的宿主應(yīng)答的能力，如增加抗RSV中和抗體應(yīng)答、輔助T細胞應(yīng)答、細胞毒T細胞(CTL)應(yīng)答和/或自然殺傷(NK)細胞應(yīng)答。
本發(fā)明優(yōu)選的方面中，重組RSV高水平表達引入的細胞因子或其它免疫調(diào)節(jié)分子，如最高可達感染組織培養(yǎng)細胞培養(yǎng)基中2.5μg/ml。這種重組病毒在體內(nèi)和體外都減毒，同時也在接種個體中表現(xiàn)抗野生型RSV的高保護效率。其經(jīng)過工程化，表達的病毒抗原量未減少，典型的是增加，同時也表現(xiàn)減毒表型。由于未降低或被增加的mRNA轉(zhuǎn)錄和抗原表達，其保存了免疫原的潛能，且通過RNA復(fù)制和病毒生長的同時降低達到了減毒。這一套新的表型特點對于發(fā)展疫苗是非常有利的。在被工程化表達免疫調(diào)節(jié)分子的重組RSV中的其它有利的表型改變包括與野生型或突變親本RSV株相比，噬菌斑大小的改變和致細胞病變性改變。
與被修飾為表達細胞因子或其它免疫調(diào)節(jié)分子的重組RSV中提供的表型效果組合，經(jīng)常期望通過引入增加或降低該重組病毒減毒性的額外的突變，調(diào)整減毒表型。因此，候選疫苗株可因引入的至少一個，優(yōu)選兩個或多個不同的減毒突變(例如來源于已知的生物學(xué)來源的突變RSV株中的一組突變)而進一步減毒。優(yōu)選的人突變RSV株是冷傳代(cp)和/或溫度敏感(ts)突變體，例如命名如下的突變株cpts RSV 248(ATCC VR 2450)；cpts RSV 248/404(ATCC VR 2454)；cpts RSV 248/955(ATCC VR 2453)；cpts RSV 530(ATCC VR 2452)；cpts RSV 530/1009(ATCC VR 2451)；cpts RSV 530/1030(ATCC VR2455)；RSV B-1 cp52/2B5(ATCC VR 2542)；RSV B-1 cp23(ATCCVR 2579)；遵循布達佩斯條約，各材料保藏于美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)(10801 University Boulevard，Manassas，Virginia20110-2209，USA，并給出以上的保藏號)。從該生物學(xué)來源的突變體模式組中，獲得了一個減毒的“菜單”，每個都可以與該組中其它任何減毒突變組合，在本發(fā)明用于疫苗的重組RSV中調(diào)整減毒和其它所希望的表型的水平?？梢牖蜣D(zhuǎn)移到被修飾為表達細胞因子或其它免疫調(diào)節(jié)分子的RSV克隆中的其它突變，可以從各種溫度敏感(ts)、冷傳代(cp)、小噬菌斑(sp)、冷適應(yīng)(ca)或宿主范圍限制(hr)的突變RSV株中獲得。其中減毒突變可在非RSV負鏈RNA病毒中發(fā)現(xiàn)，并也可以引入本發(fā)明RSV突變體中，方法是將該突變定位到受體RSV基因組或反基因組相應(yīng)的同源位點處，將受體中現(xiàn)存序列突變?yōu)橥蛔兓蛐偷?通過等同或保守突變)，如1999年4月13日美國臨時專利申請60/129,006所述。其它有用的突變可以用上述引用參考文獻中所述的重組微基因組分析和感染性病毒，通過突變分析經(jīng)驗性地確定。
選擇用做疫苗的本發(fā)明重組RSV常具有至少兩個、有時三個或多個減毒突變，以獲得可廣泛地進行臨床應(yīng)用的滿意的減毒水平。一個實施方案中，至少一個減毒突變發(fā)生在RSV聚合酶L基因中(在供體或受體基因中)，涉及到?jīng)Q定該聚合酶蛋白的氨基酸改變的核苷酸替代，其特定導(dǎo)致產(chǎn)生減毒表型，可以包括或不包括一種溫度敏感表型(ts)。被修飾為表達細胞因子或其它免疫調(diào)節(jié)分子的重組RSV在除L之外的其它RSV基因中包含一個ts突變，如在M2基因中。但文中優(yōu)選的候選疫苗包含大聚合酶基因L內(nèi)的核苷酸替代，導(dǎo)致氨基酸位點Asn43、Cys319、Phe521、Gln831、Met1169、Tyr1321和/或His1690處的氨基酸改變，例如由Ile替代Asn43，由Leu替代Phe521，由Leu替代Gln831，由Val替代Met1169，由Asn替代Tyr1321。這些位置其它氨基酸改變，尤其是相對于所發(fā)現(xiàn)的突變殘基保守的改變，也可以產(chǎn)生，以得到與發(fā)現(xiàn)的突變替代相似的效果。引入本發(fā)明重組RSV的其它期望突變包括決定RSV N基因Val267、RSV F基因Glu218和/或Thr523的氨基酸替代的減毒突變，和M2基因起始序列內(nèi)的一個核苷酸替代。此處發(fā)現(xiàn)的減毒突變中一個或多個直至全部的任何組合，可以引入被修飾為表達免疫調(diào)節(jié)分子的RSV中，產(chǎn)生適當(dāng)減毒的重組病毒，用于選擇的群體或廣泛的疫苗受體群。
減毒突變可被選擇在重組RSV基因組或反基因組的編碼部分，或非編碼區(qū)，如順式調(diào)節(jié)序列。模式的非編碼區(qū)突變包括基因起始序列內(nèi)單個或多個堿基改變，以M2基因起始序列內(nèi)核苷酸7605處(在一個模式重組序列中是7606)單個或多個堿基替代為例。
除了上述突變，根據(jù)本發(fā)明修飾的感染性RSV還可包含來自任何RSV或RSV類病毒的異源的編碼或非編碼核苷酸序列，如人、牛、羊、鼠(小鼠肺炎病毒)或鳥肺病毒，或其它任何有包膜病毒，如副流感病毒(PIV)。模式的異源序列包括來自一種人RSV株的RSV序列，其與來自一種不同的人RSV株的序列組合在被修飾為表達細胞因子或其它免疫調(diào)節(jié)分子的RSV中。例如，本發(fā)明的重組RSV可能包括來自兩種或多種野生型或突變RSV株中的序列，例如選自cptsRSV 248、cpts RSV 248/404、cpts RSV 248/955、cpts RSV 530、cpts530/1009或cpts530/1030的突變株。這些新突變株也可包含來自兩個或更多野生型或突變?nèi)薘SV亞型的序列，例如人RSV亞型A和亞型B序列的組合(參見國際申請PCT/US/08802和相關(guān)的美國專利申請60/021,773；60/046,141；60/047,634；08/892,403；09/291,894；在此分別引用作為參考)。其它方面中，一個或更多人RSV編碼或非編碼多核苷酸被異源RSV或非RSV病毒的對應(yīng)序列所替代，單獨或與選擇的減毒突變(如cp和/或ts突變)組合，產(chǎn)生新的減毒疫苗株。
在本發(fā)明相關(guān)方面，有關(guān)引入細胞因子編碼序列的修飾被引入嵌合人-牛RSV中，其被工程化重組，同時包含了來自人和牛RSV株的核苷酸序列，產(chǎn)生感染性嵌合的病毒或亞病毒顆粒。本發(fā)明模式的人-牛嵌合RSV包含一個同時具有人和牛多核苷酸序列的嵌合RSV基因組或反基因組，以及主要核殼蛋白(N)、核殼磷蛋白(P)、大聚合酶蛋白(L)和RNA聚合酶延伸因子。其它的RSV蛋白可以各種組合包括在內(nèi)，產(chǎn)生從感染性亞病毒顆粒到完整的病毒顆?；蚓哂卸嘤嗟鞍?、抗原決定簇或其它附加成分的病毒顆粒。
本發(fā)明使用的嵌合人-牛RSV一般述于名為“減毒人-牛嵌合呼吸道合胞病毒疫苗的生產(chǎn)”的2000年6月23日Bucholz等的美國專利申請(案卷號015280-398100US)，和之前的美國臨時專利申請60/143,132(分別在此引用作為參考)。這些嵌合重組RSV包括部分或完整的“背景”RSV基因組或反基因組，其來源于，或其構(gòu)建依據(jù)與不同RSV株的一個或更多異源基因或基因組區(qū)段組合的人或牛RSV株或亞型病毒，以形成人-牛嵌合RSV基因組或反基因組。在本發(fā)明的某些方面，嵌合RSV包含與來自人RSV的一個或更多異源基因或基因組區(qū)段組合的部分或完整的牛背景RSV基因組或反基因組。本發(fā)明其它一些方面，被修飾為表達免疫調(diào)節(jié)分子的RSV包含與來自牛RSV的一個或更多異源基因或基因組區(qū)段組合的部分或完整的人背景RSV基因組或反基因組。
本發(fā)明其它一些方面包括改變基因的位置或改變基因的排序，以創(chuàng)造或改變被修飾為表達免疫調(diào)節(jié)分子的RSV。文中，前述許多引用文獻都集中于改變RSV和其它病毒的天然排序。例如，RSV中、NS1、NS2、SH和G基因被單個地缺失，以及NS1和NS2被一同缺失，由此改變各下游基因相對于啟動子的位置。例如當(dāng)NS1和NS2被一同缺失，N從3移至1，P從4移至2，等等?；蛘?，基因排序內(nèi)任何其它基因的缺失只會影響其更靠近下游基因的位置(相對于啟動子)。例如SH占據(jù)野生型病毒的位點6處，其缺失不會影響位點5處的M(或任何其它上游基因)，但將G從相對于啟動子的位置7移至6。應(yīng)該說明基因缺失也可在生物學(xué)來源的突變病毒中產(chǎn)生(但極少)。例如，在細胞培養(yǎng)中被多次傳代的亞型B RSV自發(fā)地缺失SH和G基因(Karron等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 9413961-13966，1997；在此引用作為參考)。注意“上游”和“下游”分別指“接近啟動子”和“遠離啟動子”方向(啟動子在反義基因組RNA 3’前導(dǎo)區(qū)末端)。
基因排序轉(zhuǎn)變性修飾(即，在重組病毒基因組中將基因移動到接近啟動子或遠離啟動子的位置)，創(chuàng)造或改變表達細胞因子的本發(fā)明RSV，產(chǎn)生具有改變的生物學(xué)性質(zhì)的病毒。例如，同時缺少NS1、NS2、SH和G，NS1和NS2，或者同時缺少SH和G的RSV表現(xiàn)在體內(nèi)減毒、體外減毒或體內(nèi)體外都減毒?？赡苓@種表型主要因為特定病毒蛋白表達的喪失。但改變的基因圖可能也賦予這種觀察到的表型。缺失SH的病毒充分說明了這一點，可能由于基因缺失，基因排序變化，以及可能由于基因組大小的變化，導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄、復(fù)制或二者的效率同時的增加，使其在一些細胞類型中比野生型更有效生長。其它一些病毒中，如NS1和/或NS2缺失的RSV，因基因排序改變而產(chǎn)生的生長變化，可能被因該RSV蛋白表達喪失而產(chǎn)生的更主導(dǎo)的表型所掩蓋。
也將引入其它變化，改變表達細胞因子的RSV的基因排序，以改善該重組病毒作為活的減毒疫苗的特性(參見，名為“從近啟動子基因表達保護性抗原的呼吸道合胞病毒疫苗”的2000年6月23日Krempl等的美國專利申請(案卷號015280-424000US)，在此引用作為參考)。特別的，G和F基因可被單獨或以串聯(lián)形式，移動到相對于其野生型座位更靠近啟動子的位置。這兩個蛋白通常占據(jù)RSV基因次序(NS1-NS2-N-P-M-SH-G-F-M2-L)中7(G)和8(F)處。在SH基因缺失的RSV中進行模式的移動突變，以增加成功回收的可能性(Whitehead等，J.Virol.733438-42，1999)。這促進回收，因為該病毒在體內(nèi)產(chǎn)生較大的噬斑。(Bukreyev等，J.Virol.718973-82，1997，在此引用作為參考)。然后將G和F基因單獨移動到位置1，或一同移動到位置1和2。令人驚訝地，當(dāng)G或F基因移動到位置1，或一同移動到位置1和2時，重組RSV可以很容易地回收。
在兩個高度減毒的候選疫苗(其中NS2基因自身缺失，或NS1和NS2基因被同時缺失)中也得到用于引入表達細胞因子的RSV中的相似廣泛的基因排序的修飾。這兩種候選疫苗中，G和F糖蛋白被一同移動，分別移動到位置1和2，而G、F和SH糖蛋白從其最初的下游位置處缺失。因此回收的病毒G1F2/ΔNS2ΔSH和G1F2/ΔNS1ΔNS2ΔSH除了G和F基因的移動外，分別有兩個和三個基因的缺失。為了表明參與改變的程度，可以比較野生型RSV(NS1-NS2-N-P-M-SH-G-F-M2-L)和G1F2/ΔNS2ΔSH(G-F-NS1-N-P-M-M2-L)或ΔNS1ΔNS2ΔSH(G-F-N-P-M-M2-L)的基因次序。這表明大多數(shù)或所有基因相對于啟動子的位置都發(fā)生了改變。這些高度減毒的衍生物仍保持其在細胞培養(yǎng)中生長的能力。
本發(fā)明其它更詳細的方面，被修飾為表達免疫調(diào)節(jié)分子的重組RSV被用做其它病原的保護性抗原的“載體”，特別是如副流感病毒(PIV)的呼吸道病原。例如，被修飾為編碼細胞因子的重組RSV可被工程化引入編碼來自PIV的保護性抗原的序列。PIV cDNA的克隆化和作為本發(fā)明補充的描述在以下文獻中表述名為“從克隆的核苷酸序列制備副流感病毒疫苗”的1998年5月22日的美國專利申請09/083,793(相應(yīng)于國際申請WO98/53078)，和其優(yōu)先權(quán)1997年5月23日的美國臨時專利申請60/047,575；名為“減毒人-牛嵌合副流感病毒疫苗”的1999年7月9日Bailly等的美國專利申請(案卷號015280-399000)，以及名為“通過缺失或消除非必需基因而減毒的人-牛嵌合副流感病毒疫苗”的1999年7月9日Durbin等的美國專利申請(案卷號015280-394000)，分別在此引用作為參考。這些公布包括對可用于產(chǎn)生感染性PIV病毒克隆或提供用于本發(fā)明的PIV基因或基因組區(qū)段來源的以下載體的描述p3/7(131)(ATCC97990)；p3/7(131)2G(ATCC97989)；p218(131)(ATCC97991)；遵循布達佩斯條約，各材料保藏于美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)(10801University Boulevard，Manassas，Virginia 20110-2209，USA，并給出以上的保藏號。
根據(jù)本發(fā)明這一方面，提供了這種被修飾為表達免疫調(diào)節(jié)分子的重組RSV，其包含至少一種PIV序列，例如一種包含來自PIV1和PIV2中任一或二者，或PIV1和PIV3中任一或二者的多核苷酸。RSV的單個基因可能被人PIV的對應(yīng)部分所替代，如PIV1，PIV2，或PIV3的F糖蛋白基因?；蛘撸粋€選擇的異源基因組區(qū)段(如，編碼一個免疫原蛋白的胞質(zhì)尾，跨膜結(jié)構(gòu)域或胞外域的基因組區(qū)段)可能替代例如RSV中同一基因的，或RSV中不同基因內(nèi)，或RSV基因組或反基因組非編碼序列內(nèi)對應(yīng)的基因組區(qū)段。一個實施方案中，HPIV3 F基因的一個基因組區(qū)段替代對應(yīng)的人RSV基因組區(qū)段，產(chǎn)生編碼嵌合蛋白的構(gòu)建體，這種嵌合蛋白如具有RSV胞質(zhì)尾和/或跨膜結(jié)構(gòu)域與PIV胞外域融合的融合蛋白，以產(chǎn)生新的減毒病毒，和/或同時抗PIV和RSV的多價疫苗?；蛘?，一個或更多PIV基因或基因組區(qū)段可以被添加到部分或完整的嵌合或非嵌合的RSV基因組或反基因組中。
異源基因可以被整體或部分地添加到該背景基因組或反基因組中，以構(gòu)建本發(fā)明使用的嵌合RSV。對于由替代產(chǎn)生的嵌合體，編碼人或牛RSV蛋白或蛋白區(qū)域(如胞質(zhì)尾，跨膜結(jié)構(gòu)域或胞外域，表位或區(qū)域，結(jié)合位點或區(qū)域，活性位點或具有活性位點的區(qū)域)的選擇的基因或基因組區(qū)段替代背景RSV基因組或反基因組中對應(yīng)的基因或基因組區(qū)段，產(chǎn)生與相應(yīng)的野生型(或突變親本)RSV株相比，具有所期望表型改變的新重組體。此處所述“對應(yīng)”基因或基因組區(qū)段指不同RSV來源的對應(yīng)的多核苷酸，其編碼同源或等同的蛋白或蛋白結(jié)構(gòu)域，表位，或氨基酸殘基，或其代表同源或等同的順式作用信號，順式作用信號包括但不限于不同RSV亞型或株中的種間和等位變體。
其它實施方案中，表達細胞因子的RSV被用做攜帶異源抗原決定簇的載體，其包含非RSV病原如人副流感病毒(HPIV)的一個或更多抗原決定簇。一個模式實施方案中，編碼一個或更多HN和/或F糖蛋白或其抗原結(jié)構(gòu)域、片段或表位的一個或更多HPIV1、HPIV2或HPIV3基因被添加或引入部分或完整的HRSV載體基因組或反基因組中。更詳細的實施方案中，一個具有HPIV1，HPIV2，或HPIV3 HN或F基因讀碼框(ORF)的轉(zhuǎn)錄單位被添加或引入該嵌合的HRSV載體基因組或反基因組中。
本發(fā)明cDNA、載體和病毒顆粒中引入的突變可以單獨引入，也可以組合引入被修飾為編碼細胞因子或其它免疫調(diào)節(jié)因子的RSV中，并且具有這些引入突變的被拯救病毒的表型可以很容易地確定。模式實施方案中，減毒的生物學(xué)來源的病毒與野生型RSV比較，其表現(xiàn)的氨基酸改變(如cpRSV和tsRSV顯示的改變)被組合地引入表達細胞因子的重組RSV中，以產(chǎn)生用于疫苗的期望的減毒水平。
本發(fā)明因此提供了修飾為表達細胞因子或其它免疫調(diào)節(jié)因子的重組RSV，以及新的載體和病毒顆粒，其具有以選擇的組合引入該重組基因組或反基因組中的多種表型特異性突變，獲得適當(dāng)減毒的感染性病毒或亞病毒顆粒。這一過程，與常規(guī)的表型檢測聯(lián)合，提供具有期望表型特征的重組RSV，如具有減毒，溫度敏感，改變的免疫原性，冷適應(yīng)，小噬菌斑，宿主范圍限制等。由此檢出的突變可集合成一個“菜單”，并以各種組合引入，使疫苗病毒調(diào)整到所選擇的減毒、免疫原性和穩(wěn)定性水平。
本發(fā)明其它方面，被修飾以表達細胞因子或其它免疫調(diào)節(jié)因子的RSV，有或無減毒突變，被構(gòu)建具有額外的核苷酸修飾，以產(chǎn)生期望的表型、結(jié)構(gòu)或功能的變化。典型的，這種選擇的核苷酸修飾將特定產(chǎn)生表型變化，如生長特性，減毒，溫度敏感，冷適應(yīng)，噬菌斑大小，宿主范圍限制或免疫原性的變化等。文中的結(jié)構(gòu)變化包括在編碼cDNA的RSV內(nèi)引入或消除限制性位點，以便于操作和檢測。
優(yōu)選的實施方案中，表達細胞因子或其它免疫調(diào)節(jié)因子的RSV重組基因組或反基因組中核苷酸改變包括，基因部分或完全缺失，或基因表達被降低或消除(剔除)引起的病毒基因的修飾。文中突變的靶基因包括附著蛋白(G)，融合蛋白(F)，小疏水蛋白(SH)，RNA結(jié)合蛋白(N)，磷蛋白(P)，大聚合酶蛋白(L)，轉(zhuǎn)錄延伸因子(M2 ORF1產(chǎn)物)，轉(zhuǎn)錄/翻譯調(diào)節(jié)蛋白(M2 ORF2產(chǎn)物)，基質(zhì)蛋白(M)，和兩個非結(jié)構(gòu)蛋白NS1和NS2的編碼基因。這些蛋白中任何一個都可被整體或部分地，單獨或與其它期望的修飾組合，被缺失，替代或重排，以獲得新的RSV重組體。
本發(fā)明一個方面中，一個SH，NS1，NS2，或G基因或M2 ORF2在表達細胞因子或其它免疫調(diào)節(jié)因子的重組病毒中被修飾。例如，這些基因中任何一個都可被整體或部分地缺失，或其表達(因引入的終止密碼子或移碼突變，或轉(zhuǎn)錄、翻譯起始位點的改變)被降低或消除，改變所獲得的重組克隆表型，改善其生長，減毒，免疫原性或其它期望的表型特征。例如，在重組基因組或反基因組中缺失SH基因?qū)a(chǎn)生具有新表型特征的候選疫苗，如在體外生長增強，和/或在體內(nèi)減毒。相關(guān)方面中，SH基因的缺失，或其它選擇的非必需基因或基因組區(qū)段(如NS1或NS2基因)的缺失，被單獨或與一個或多個其它特定于減毒表型的突變(如直接來源于生物學(xué)來源的減毒RSV突變體中的點突變，或以修飾的形式，如在特定于該突變的密碼子內(nèi)引入多個核苷酸的變化)組合，構(gòu)建于表達免疫調(diào)節(jié)因子的病毒中。例如，SH，NS1，NS2，或M2-2基因缺失可以與源于cpts248/404，cpts530/1009，cpts530/1030或其他選定突變RSV株的一個或多個cp和/或ts突變組合，產(chǎn)生重組RSV，由于組合了不同突變的效果，其表現(xiàn)病毒產(chǎn)量增加、減毒增強、免疫原性提高和對減毒表型回復(fù)的遺傳抗性。
本發(fā)明重組RSV中的其它核苷酸修飾包括該重組基因組或反基因組中一個選定基因的順式作用調(diào)節(jié)序列的缺失、插入、添加或重排。一個例子中，一個RSV基因的順式作用調(diào)節(jié)序列被改為相應(yīng)的異源調(diào)節(jié)序列，其可以是不同RSV中相同基因的對應(yīng)順式作用調(diào)節(jié)序列，也可以是不同RSV基因的順式作用調(diào)節(jié)序列。例如，基因末端信號可以經(jīng)轉(zhuǎn)變或替代而修飾為相同RSV株不同基因的基因終止信號。其它實施方案中，核苷酸修飾可能包括該重組基因組或反基因組中一個翻譯起始位點的插入，缺失，替代或重排，如消除蛋白所選擇形式的其它翻譯起始位點。一個例子中，RSV G蛋白分泌形式的翻譯起始位點被消除，從而改變這種形式G蛋白的表達，因此在體內(nèi)產(chǎn)生了期望的效果。其它實施方案中，經(jīng)微復(fù)制子或感染病毒的經(jīng)驗性分析發(fā)現(xiàn)的突變也可以被引入(參見，如Kuo等，J.Viro.714944-4953，1997；Whitehead等，J.Viro.733438-3442，1999；在此引用作為參考)。
本發(fā)明的相關(guān)方面，提供了產(chǎn)生表達細胞因子或其它免疫調(diào)節(jié)分子的分離的感染性重組RSV的組合物(如具有RSV編碼cDNA的分離的多核苷酸或載體)和方法。本發(fā)明的這些方面中包括了包含具有修飾為編碼免疫調(diào)節(jié)分子的RSV基因組或反基因組的新的一個或更多分離的多核苷酸分子和載體。也提供了具有編碼N、P、L和RNA聚合酶延伸因子蛋白的分離的多核苷酸分子的相同或不同的表達載體。這些蛋白也可以直接由基因組或反基因組cDNA表達。載體優(yōu)選在細胞或無細胞裂解液中表達或共表達，從而產(chǎn)生感染性RSV病毒粒子或亞病毒顆粒。
由以上產(chǎn)生被修飾為表達細胞因子或其它免疫調(diào)節(jié)分子的RSV的方法和組合物可獲得感染性病毒粒子或亞病毒顆粒，或其衍生物。感染性病毒相當(dāng)于天然的RSV毒粒，并有同樣的感染性。可直接感染新鮮細胞。感染性亞病毒顆粒典型的是病毒粒子的一個亞成分，在適當(dāng)條件下可引發(fā)感染。例如，具有基因組或反基因組RNA和N、P、L和M2(ORF1)蛋白的核殼是亞病毒顆粒的一個范例，當(dāng)其進入細胞質(zhì)中，可以引發(fā)感染。本發(fā)明提供的亞病毒顆粒包括缺少一個或多個蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)區(qū)段或其它病毒成分的病毒粒子。
其它實施方案中，本發(fā)明提供了含有一種具有包含上述被修飾編碼免疫調(diào)節(jié)分子的RSV基因組或反基因組的經(jīng)分離的多核苷酸分子的表達載體，和具有包含編碼RSV N、P、L和RNA聚合酶延伸因子蛋白的分離的一個或更多多核苷酸分子的(與前一個相同或不同的)表達載體的細胞或無細胞裂解液。這些蛋白質(zhì)中的一個或更多個也可以從基因組或反基因組cDNA表達。表達后，基因組或反基因組和N、P、L和RNA聚合酶延伸因子蛋白組合產(chǎn)生感染性RSV病毒粒子或亞病毒顆粒。
本發(fā)明的重組RSV以各種組合物形式用于在對RSV敏感的宿主中產(chǎn)生期望的抗RSV免疫反應(yīng)。本發(fā)明減毒RSV能在感染的哺乳動物宿主中誘導(dǎo)保護性免疫應(yīng)答，且足夠地減毒，不會在免疫化宿主中引發(fā)不可接受的嚴重呼吸道疾病的癥狀。減毒的病毒或亞病毒顆?？赡艽嬖谟诩毎囵B(yǎng)物的上清中，從培養(yǎng)物中分離，或部分或完全純化。病毒也可以冷凍干燥，根據(jù)需要與多種其他成分組合以儲藏或給藥宿主。
本發(fā)明進一步提供了新疫苗，其包含一種生理上可接受的載體和/或佐劑，以及修飾為表達細胞因子的分離的RSV病毒粒子或亞病毒顆粒。優(yōu)選實施方案中，該疫苗包含具有至少一個，優(yōu)選兩或多個減毒突變或以上所述的其它核苷酸修飾的被修飾為編碼細胞因子的突變RSV，使減毒和免疫原性達到合適的平衡。疫苗配制為每劑103-106PFU或更多的減毒病毒。該疫苗病毒可能誘導(dǎo)抗單RSV株，或抗抗原亞型如A或B，或抗多RSV株或亞型的免疫應(yīng)答。這方面，本發(fā)明重組RSV在制劑中可與具有不同免疫原特性的其它PIV疫苗株或亞型組合，更有效地抗一種或多種RSV株或亞型。
在相關(guān)方面，本發(fā)明提供了在哺乳動物中刺激免疫系統(tǒng)，以誘導(dǎo)抗RSV免疫應(yīng)答的方法。該方法包含以足夠的免疫量，給藥存在于生理上可接受的載體和/或佐劑中的修飾為表達細胞因子或其它免疫調(diào)節(jié)分子的RSV制劑。一個實施方案中，免疫原組合物是包含具有至少一個，優(yōu)選兩或多個，減毒突變或以上所述的其它核苷酸修飾的，修飾為表達細胞因子的RSV疫苗。疫苗配制為每劑103-106PFU，或更多的減毒病毒。該疫苗病毒可能具有誘導(dǎo)抗單RSV株，或抗抗原亞型如A或B，或抗多RSV株或亞型的免疫應(yīng)答。本發(fā)明RSV重組體也與具有不同免疫原特征的RSV組合于疫苗混合物中，或在協(xié)同治療方案中分別給藥，誘導(dǎo)抗一種RSV株，或抗抗多RSV株或亞型更有效的保護。優(yōu)選的，免疫原組合物通過噴灑、滴入或氣霧劑給藥于上呼吸道。該組合物經(jīng)常給藥對RSV抗體血清反應(yīng)陰性的個體，或具有經(jīng)胎盤獲得的母體抗RSV抗體的個體。
附圖簡述

圖1顯示被修飾為表達鼠IFNγ的重組RSV干擾素γ(rRSV/mIFNγ)嵌合基因組的構(gòu)建。mIFNγ的cDNA(矩形陰影部分，用小寫字母顯示了兩端的起始和終止密碼子)的XmaI片段被修飾，側(cè)翼為RSV基因起始和末端信號。這個轉(zhuǎn)錄盒被插入預(yù)先插入了8個核苷酸的XmaI接頭(黑體斜體)的反基因組cDNA中G-F基因間隔區(qū)的唯一的StuI位點(StuI位點的兩半，AGG和CCT，被下劃線)，XmaI位點下劃線。
CCCGGGATGGGGAAATAATG(SEQ ID NO.5)；TGAAGTTATTAAAAATTCCCGGG(SEQ ID NO.6)；AGGCCCCGGGGCCT(SEQ ID NO.7)。
圖2顯示rRSV/mIFNγ，rRSV/CAT(包含一個氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因)，和wt RSV在HEp-2細胞中的生長動力學(xué)。細胞單層被以2PFU/每個細胞感染(每個病毒兩份重復(fù))，在指定的時間點取200μl的上清，調(diào)整使其包含100mM硫酸鎂和50mM HEPES緩沖液(pH7.5)，快速冷凍并儲存在-70℃直到測定效價。每份上清都替代以等量的新鮮培養(yǎng)基。每個單步生長曲線代表兩個感染細胞單層病毒效價的平均。感染wt RSV的單層細胞在感染后72小時有超過90％被破壞(*)，而rRSV/mIFNγ或rRSV/CAT感染的細胞幾乎無損，顯示嵌合病毒在體外的減毒。
圖3表明感染了rRSV/mIFNγ或rRSV/CAT的HEp-2細胞培養(yǎng)液體中累積mIFNγ的動力學(xué)。細胞單層被以2PFU/每個細胞感染(每個病毒兩份重復(fù))，在指定的時間點取樣品，使用Quantikine M小鼠IFNγ免疫分析(R&D系統(tǒng)，MN)，經(jīng)ELISA確定各樣品中mIFNγ的含量。
圖4表明病毒在鼻內(nèi)接種了106PFU rRSV/mIFNγ、rRSV/CAT或wt RSV的BALB/c小鼠上和下呼吸道中復(fù)制的動力學(xué)。各組中5只小鼠在指定日處死，取出鼻甲和肺組織，并勻漿，通過對單個組織樣品的噬菌斑分析確定感染性病毒的濃度。顯示了具有標(biāo)準偏差的每克組織的平均log10效價。并表示了病毒在上和下呼吸道中的檢測極限。
圖5顯示用核酶保護分析檢測肺mIFNγ、IL-2 p40和L-32(管家基因)mRNA的存在。小鼠(各組5只)分別被鼻內(nèi)接種單獨的培養(yǎng)基(模擬)或每只動物接種106PFU rRSV/mIFNγ或wt RSV。免疫后4天，取出肺，純化總RNA。RNA與放射性RNA探針(由mCK-2B模板系統(tǒng)合成，PharMingen RiboQuant Multi-Probe RNase ProtectionAssay System)雜交，用核酶A處理，純化，在5％變性丙烯酰胺凝膠中電泳。顯示了具有被保護種(相應(yīng)于指定的mRNA)的凝膠區(qū)域的放射自顯影圖。對三個mRNA各采取不同的暴光時間。正常鼠RNA和酵母被用做附加的陰性對照。
圖6顯示rRSV/mIFNγ或wt RSV初次感染，并且后來被wt RSV攻擊后，小鼠肺中細胞因子mRNA的水平。小鼠分別被鼻內(nèi)接種每只動物106PFU的rRSV/mIFNγ，wt RSV或單獨的培養(yǎng)基。免疫后1或4天，處死各組的5只動物，分離肺RNA。其它被免疫的動物在第28天接受106PFU wt RSV的攻擊，在第29或32天分別從各組的5只動物中分離總肺RNA。選定細胞因子mRNA的累積用圖5注解中的核酶保護分析(PharMingen，CA，模板組mCK-1和mCK-2B)檢測。各mRNA的放射活性用磷光成像分析量化，減去背景，各值以放射活性相對于L-32管家基因mRNA的百分比表示，顯示為5只動物的平均，并附加標(biāo)準偏差。沒有指定細胞因子可檢測的mRNA的樣品用星號表示。
圖7顯示了rRSV/mIL-2的基因組圖譜。mIL-2 ORF的cDNA，(其翻譯起始和終止位點以黑體表示)經(jīng)PCR修飾，側(cè)翼為RSV特異的基因起始和基因末端轉(zhuǎn)錄信號(框內(nèi))，以及XmaI位點(下劃線)。得到的mIL-2轉(zhuǎn)錄盒利用先前引入其中的XmaI位點，被插入G和F基因間隔區(qū)(Bukreyev等，J.Virol.706634-6641，1996，在此引用作為參考)。CCCGGGATGGGGCAAATATG(SEQ ID NO.9)；TAAAGTTATTAAAAATTCCCGGG(SEQ ID NO.10)。
圖8顯示表明rRSV/mIL-2、rRSV/CAT和wt RSV在BALB/c小鼠上(鼻甲)下(肺)呼吸道中的復(fù)制。動物分別在鼻內(nèi)接種106PFU指定的病毒。各組中5只小鼠在指定日處死，取出鼻甲和肺，通過噬菌斑分析確定病毒的效價。數(shù)據(jù)顯示了具有標(biāo)準偏差的病毒平均濃度(log10PFU/g組織)。斯氏t檢驗表明rRSV/mIL-2與wt RSV相比效價降低是統(tǒng)計學(xué)顯著的鼻甲第3天，P＜0.01，第4天，P＜0.02，第5天P＜0.1；肺第3天P＜0.05，第4天P＜0.05，第5天P＜0.001。
圖9顯示感染了每只動物106PFU的rRSV/mIL-2或wt RSV或僅接受到培養(yǎng)基(模擬)的小鼠中肺中IL-2，IFNγ，IL-4，IL-5，IL-6，IL-10，IL-13和IL-12 p40的mRNA累積。免疫后1和4天，處死4或5 只小鼠，分離肺的總RNA，用前述方法(Bukreyev等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.962367-2372，1999)進行RNA酶保護分析，并利用RiboQuant Multi-Probe RNAse Protection Assay System(PharMingen)和兩套不同的探針模板，即mCK-1和mCK-2B。分別對每只小鼠進行分析，聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測出的各被保護種進行磷光成像定量分析，以本樣品中L-32管家基因mRNA量的百分比表示，顯示了每組每天的平均值，并附加標(biāo)準偏差。注意各y軸有不同的刻度。
圖10是表達IL-4(IL4 PE)或IFNγ(IFNγ FITC)的CD4+淋巴細胞的流式細胞計數(shù)分析點狀圖。小鼠感染了106PFU wt RSV(左圖)，rRSV/mIL-2(中圖)或僅受模擬感染(右圖)。10天后處死動物，收集肺CD4+細胞，流式細胞計數(shù)分析。以每個圖顯示了CD4+細胞在三個象限中的百分比。各圖代表來自單個鼠的細胞。
圖11顯示了rRSV/mGMCSF的基因組圖譜。mGM-CSF的cDNA，(其翻譯起始和終止位點以黑體表示)經(jīng)前述的限制性片段替代所修飾，側(cè)翼為RSV特異的基因起始和基因末端轉(zhuǎn)錄信號(框內(nèi))以及XmaI位點(下劃線)。得到的mIL-2轉(zhuǎn)錄盒利用先前引入其中的XmaI位點，被插入G和F基因間隔區(qū)(Bukreyev等，J.Virol.706634-6641，1996；在此引用作為參考)。
AGTTACTTAAAAACATATTATCACAAAAGGCCCCGGGGCCTTGACCAAACTTAAACAGAATCAAAATAAACTCTGGGGCAAAT(SEQ ID NO.8)；CCCGGGATGGGGCAAATATG(SEQ ID NO.9)；TAAAGTTATTAAAAATTCCCGGG(SEQ ID NO.10)。
圖12顯示rRSV/mGMCSF、rRSV/CAT和wt RSV在HEp-2細胞中的生長動力學(xué)。細胞單層被以2PFU/每個細胞感染(每個病毒兩份重復(fù))，在指定的時間點取出200μl的培養(yǎng)基并替換。樣品快速冷凍，以后利用噬菌斑分析測定感染性病毒的效價。顯示了各時間點兩個細胞單層的平均。
具體實施方案的說明本發(fā)明提供了被工程化表達一個或更多免疫調(diào)節(jié)分子的分離的感染性重組RSV(rRSV)，以改善該重組RSV候選疫苗治療或預(yù)防RSV感染的作用。該重組病毒具有包含編碼一個或更多免疫調(diào)節(jié)分子的多核苷酸序列的修飾的基因組或反基因組。
各種細胞因子和其它免疫調(diào)節(jié)分子可引入本發(fā)明重組RSV中，以使其在感染細胞中被表達，并改變病毒生物性狀的一個或多個方面，如感染性、復(fù)制、病原性和/或改變一種或多種宿主免疫應(yīng)答，如抗RSV中和抗體應(yīng)答、輔助T細胞應(yīng)答、細胞毒T細胞(CTL)應(yīng)答和/或自然殺傷(NK)細胞應(yīng)答。該免疫調(diào)節(jié)分子包括細胞因子，或其它任何免疫調(diào)節(jié)分子，如趨化因子或細胞因子拮抗劑，酶(如氧化氮)，表面或可溶性受體，附著分子，配基等。當(dāng)引入并在本發(fā)明重組病毒中表達時，該細胞因子，或其編碼多核苷酸可以改變，即增加、降低，或增強病毒生物性狀的方面和/或宿主對RSV的免疫應(yīng)答。
本發(fā)明基本的方面中，提供了從重組RSV中細胞內(nèi)共表達多種免疫調(diào)節(jié)蛋白(天然存在或由重組DNA技術(shù)工程化)中任何一種。這些調(diào)節(jié)分子典型地影響造血細胞，或阻斷造血細胞與其環(huán)境(包括感染的病毒)間的信號和相互作用。許多分子適用于以這種方式表達。例如，作為可溶信使的蛋白，或作為拮抗或隔絕可溶信使的蛋白，或與免疫系統(tǒng)的細胞相互作用的蛋白。分子包括細胞因子/趨化因子的各成員，包括白介素、干擾素和趨化因子的各個亞族、集落刺激因子(CSF)、某些分子如Flt3配基以及其它調(diào)節(jié)造血細胞的分子?？捎糜诒景l(fā)明的細胞因子和趨化因子可在以下參考文獻中找到細胞因子手冊(The Cytokine Handbook)，A.Thomson(ed.)，學(xué)術(shù)出版社，SanDiego，1998；和細胞因子(Cytokiness)，A.Mire-Sluis和R.Thorpe(eds)，學(xué)術(shù)出版社，San Diego，1998，在此引用作為參考。
本發(fā)明使用的合適的細胞因子和趨化因子包括但不局限于IL-1α和β、IL-2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17和18。也包括γ干擾素(IFNγ)和其它干擾素，如干擾素α、β、ω。本發(fā)明重組病毒中使用的其它分子包括腫瘤壞死因子(TNF)和其相關(guān)的配基和受體，包括Fas配基(CD95)、CD40配基，以及近來報道的B細胞刺激BlyS蛋白(Moore等，Science 285260-263，1999)。其它分子包括Flt3配基。文中指出，如Flt3和CD40的配基應(yīng)在感染細胞的表面表達，可改變或增強感染細胞的免疫識別。如Flt3的配基可被工程化引入重組RSV粒子的包膜中，可改變病毒的趨向性，在該例中靶向樹狀細胞。
本發(fā)明重組RSV病毒中使用的其它免疫調(diào)節(jié)分子包括集落刺激因子(CSF)，如粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)和干細胞因子。模式趨化因子包括CXC組(其包括IL-8、γ-INF誘導(dǎo)的單核因子(Mig)、細胞因子應(yīng)答基因2(Crg-2))(Mahalingam等，J.Virol.731479-1491，1999)、血小板因子-4(PF-4)、嗜中性白細胞活化蛋白-2(NAP-2)、黑體瘤生長刺激活性(GRO)α、β和γ、上皮細胞衍生的嗜中性白細胞吸引劑-78(ENA-78)、粒細胞趨化蛋白-2(GCP-2)、誘導(dǎo)IFNγ的蛋白10(IP-10、基質(zhì)細胞衍生因子1(SDF-1)α和β。第二組趨化因子，C趨化因子，包括淋巴趨化因子(lymphotactin)。近來了解的第三組，CC趨化因子，包括eotaxin、單核趨化蛋白(MCP)1、2、3、4和5、RANTES(regulated on activation，normal T-cell expressed and secreted)、巨噬細胞炎性蛋白(MIP)1α和β以及胸腺和激活調(diào)節(jié)趨化因子(TARC)。
其它有用的免疫調(diào)節(jié)分子包括細胞因子拮抗劑，如天然存在的分泌型IL-1受體拮抗劑(Aredn等，Ad.Immunol.54167-227，1993，在此引用作為參考)，其結(jié)合受體因此封閉它而不激活。其它例子包括腫瘤壞死因子(TNF)受體胞外結(jié)構(gòu)域和IgG的恒定區(qū)之間遺傳工程化的融合蛋白，其可結(jié)合并隔絕可溶性TNF(Fisher等，N.Eng.J.Med.3341697-1702，1996)。第三例是隔絕IL-1的重組IL-1受體(Takebe等，J.Interferon Cytokine Res.18321-326，1998，在此引用作為參考)。其它適合在rRSV中表達的細胞因子/趨化因子拮抗劑包括，如衍生自完整分子的肽，如針對IL-1的(Palaszynski等，Biochem.Biophys.Res.Commun.14724-209，1987，在此引用作為參考)，或?qū)δ鼙匦璧臍埢c誘變后產(chǎn)生的滅活形式，如針對TNF的(von Feldt等，Immunol.Res.1396-109，1994，在此引用作為參考)。其它分子包括各種源于病毒的類似物和調(diào)節(jié)分子。因此，顯示大量的多肽免疫調(diào)節(jié)分子，均可用于在本發(fā)明重組RSV中插入以進行表達，并在嚙齒類或靈長類動物和臨床實驗中直接檢測其對免疫原性，療效和疾病的效果。
病毒基因組或反基因組被修飾，引入編碼細胞因子或其它免疫調(diào)節(jié)分子的多核苷酸，以構(gòu)建工程化表達免疫分子的重組RSV，該多核苷酸一般作為具有自身基因起始(GS)和終止(GE)信號的單獨的基因被添加。一般，編碼免疫調(diào)節(jié)分子的多核苷酸序列添加或替代入重組RSV基因組或反基因組中的基因間隔區(qū)或其它非編碼區(qū)，在任何適當(dāng)?shù)牟黄茐脑摶蚪M或反基因組中讀碼框的位點。典型的，編碼免疫調(diào)節(jié)分子的多核苷酸序列作為額外的基因引入重組基因組或反基因組，盡管也可能該基因組或反基因組中的非編碼元件被去除，且編碼細胞因子的多核苷酸替代其缺失的位置處。
典型的，構(gòu)建被修飾為編碼細胞因子或其它免疫調(diào)節(jié)分子的本發(fā)明重組RSV需要將編碼細胞因子的多核苷酸添加或替代在該基因組或反基因組中選擇的位置。細胞因子或其它免疫調(diào)節(jié)分子的表達水平可以通過改變編碼細胞因子的多核苷酸在該基因組或反基因組中的排列位置進行調(diào)整。例如，編碼細胞因子的多核苷酸可被引入任何RSV基因的基因間隔區(qū)或非編碼區(qū)。編碼細胞因子的多核苷酸的引入可以選擇在相對于這些基因或ORF更接近或遠離啟動子的位置，分別增強或降低該細胞因子或其它免疫調(diào)節(jié)分子的表達。
此處所述“RSV基因”一般指RSV基因組編碼mRNA的部分，典型的在上游末端以10核苷酸的基因起始(GS)信號開始，在下游末端以12-13核苷酸的基因末端(GE)信號終止。本發(fā)明中使用的RSV的10個這種基因是NS1、NS2、N、P、M、SH、G、F、M2和L。術(shù)語“基因”，在此也用做“翻譯讀碼框(ORF)”。ORF更具體的定義是編碼重要RSV蛋白的翻譯讀碼框，現(xiàn)在已發(fā)現(xiàn)11個NS1、NS2、N、P、M、SH、G、F、M2-1(或M2(ORF1))、M2-2(或M2(ORF2))和L。因此術(shù)語“基因”可互換地指編碼亞基因組RNA的基因組RNA序列，指一個ORF(后者特別用于RSV M2基因的情況，其中一個單mRNA含有編碼不同的蛋白的兩個重疊ORF)(Collins等，J.Gen.Virol.713015-3020，1990；Bermingham和Collins，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.9611259-11264，1990；Ahmadian等，EMBO J.192681-2689，2000；Jin等，J.Virol.7474-82，2000；分別在此引用作為參考)。術(shù)語“基因”在文中確定基因相對于啟動子位置時，該術(shù)語一般局限于指以轉(zhuǎn)錄基因起始和基因末端信號基元為邊界的mRNA編碼序列(Collins等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.834594-4598，1986；Kuo等，J.Virol.706892-6901，1996；分別在此引用作為參考)。
“基因組區(qū)段”指來自RSV基因組的任意長度的連續(xù)核苷酸，可能是ORF的一部分，基因或一個基因外區(qū)域或其組合。
在RSV中插入異源基因，包括編碼免疫調(diào)節(jié)因子的基因的其它方法是，將cDNA置于如上所述的RSV基因起始和末端信號控制之下，插入該cDNA使基因從反基因組而非從基因組中表達。優(yōu)選的，外源基因放置于緊鄰反基因組3’末端啟動子下游，這種靠近啟動子的位置保證其高水平表達。這種方式在狂犬病病毒中有過說明，異源氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因被放置于反基因組的鏈中，此外該反基因組的啟動子被基因組的所替代(Finke和Conzelmann，J.Virol.717281-7288，1997，在此引用作為參考)。但RSV反基因組的啟動子可有效地指導(dǎo)轉(zhuǎn)錄，所以一般不需要替換反基因組的啟動子。事實上，我們構(gòu)建了其中異源基因由反基因組表達的微復(fù)制子。
表達異源基因的其它方法是，將基因的ORF置于哺乳動物內(nèi)部核糖體進入位點的控制下，將該ORF插入任何一個或多個RSV基因非編碼區(qū)下游。這種方式在流感病毒中有過說明(Garcia-Sastre等，J.Virol.686254-6261，1994，在此引用作為參考)。這導(dǎo)致mRNA的表達，其中mRNA 5’末端的真正的病毒ORF未受干擾，下游非編碼區(qū)具有因內(nèi)部核糖體進入而表達的異源ORF?；蛘?，下游ORF可放置于可被核糖體終止-重新開始所接觸到的位置(Horvath等，EMBOJ.92639-2674，1990，在此引用作為參考)。
表達的其它方法是通過構(gòu)建嵌合或融合蛋白。例如，期望將表達于感染細胞和毒粒表面的蛋白胞外域可以添加于SH ORF的下游，從而閱讀框不受干擾并產(chǎn)生嵌合蛋白。以這種方式，SH部分提供信號和膜錨點，該C末端附著的結(jié)構(gòu)域被顯示于細胞外。這種方式是基于發(fā)現(xiàn)SH在免疫預(yù)防中并非重要抗原，在體外和體內(nèi)的有效復(fù)制中非必需。這種方式特別適合這種情況當(dāng)如Flt3之類的配基在毒粒表面表達，以使病毒靶向表達Flt3的細胞，即樹狀細胞。不過其它病毒基因也可以用于構(gòu)建嵌合蛋白。例如，G蛋白的C末端可容易地缺失或插入，因此可以容納異源多肽成分。此外，任何RSV基因都可以第二拷貝插入，由此在構(gòu)建嵌合蛋白時的蛋白功能失活變得可以忍受。
本發(fā)明其它實施方案中，重組病毒修飾為編碼多于一種的免疫調(diào)節(jié)分子，如多種細胞因子或者一種細胞因子和一種趨化因子，以提供更好的表型特征。其它方面中，多于一種的RSV被工程化，分別表達一種不同的細胞因子，如一種細胞因子增強CTL應(yīng)答，另一種細胞因子增強NK應(yīng)答，這些不同種的病毒可以同時或在協(xié)調(diào)的治療方案中給藥，以增強疫苗的有效性。
RSV一般定義為副粘病毒科中的有包膜的非區(qū)段化負鏈RNA病毒(Collins等，F(xiàn)ields Virology 21313-1352，1996，在此引用作為參考)。其基因組，在常見的A2株中為15,222個核苷酸，轉(zhuǎn)錄出10個先前顯示為編碼10個蛋白的信使RNA(Collins等，F(xiàn)ields Virology 21313-1352，1996；Atria等，J.Virol.721452-1461，1998；Bukreyev等，J.Virol.718973-8982，1997；Collins等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.9381-85，1996；Ten和Collins，J.Virol.725707-5716，1998；Ten和Collins，J.Virol.73466-473，1999Whitehead等，J.Virol.733438-3442，1999，分別在此引用作為參考)。
近來發(fā)現(xiàn)的4個RSV蛋白是核殼/聚合酶蛋白，即，主要核殼蛋白N、磷蛋白P、聚合酶蛋白L和轉(zhuǎn)錄抗終止蛋白M2-1(M2基因第一個讀碼框(ORF)編碼的)。這些蛋白中3個是表面糖蛋白，即附著G蛋白，在穿透和形成合胞中作用的融合F糖蛋白，以及未知功能的小疏水蛋白SH?；|(zhì)蛋白M是參與毒粒形成的內(nèi)在毒粒蛋白。非結(jié)構(gòu)蛋白NS1和NS2未知功能。G和F蛋白是主要的中和和保護性抗原(Collins等，F(xiàn)ields Virology 21313-1352，1996；Connors等，J.Virol.661277-1281，1992)。對RSV再次感染的抗性主要由特定抗這些蛋白的血清和粘膜抗體介導(dǎo)。RSV感染也誘導(dǎo)RSV特異的細胞毒T細胞，并可以導(dǎo)向多種不同蛋白，但沒有證據(jù)表明該效應(yīng)物主要作用是賦予對再次感染的長期抗性。但CD8+和CD4+細胞可以在調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答中有重要作用，都參與病毒的致病性(Johnson等，J.Virol.722871-2880，1998；Srikiatkhachorn和Braciale，J.Exp.Med.186421-432，1997)。因此F和G是最重要的抗原決定簇，但其它蛋白也參與免疫應(yīng)答。
最后，M2 mRNA第二個ORF編碼一種RNA調(diào)節(jié)分子M2-2。這種在其它副粘病毒和rhabdovirus中未發(fā)現(xiàn)的M2-2 mRNA包含兩個重疊的各表達一種蛋白的翻譯讀碼框(ORFs)(圖1A)(Collins等，J.Gen.Virol.713015-20，1990，在此引用作為參考)。上游ORF1編碼作為毒粒成分的194個氨基酸的M2-1蛋白(Peeples等，Virology 95137-45，1979，在此引用作為參考)，也是促進轉(zhuǎn)錄鏈延伸并增加在基因連接處通讀頻率的抗終止因子(Collins等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.9381-5，1996；Fearns和Collins，J.Virol.735852-5864，1999；Collins等，Virology 259251-255，1999；Hardy等，J.Virol.72520-6，1998；分別在此引用作為參考)。A2株的ORF2在密碼子1、3、7處有三個潛在的起始位點，三者都和ORF1重疊(圖1A)。其中第一位點的引發(fā)產(chǎn)生90個氨基酸的M2-2蛋白。M2 ORF2存在于目前已知的所有肺病毒中(Collins等，J.Gen.Virol.713015-20，1990；Ling等，J.Gen.Virol.731709-15，1992；Zamora等，J.Gen.Virol.73737-41，1992，分別在此引用作為參考)。M2 mRNA在無細胞體系中翻譯出M2-1蛋白和一個分子大小與M2-2蛋白近似的11kDa蛋白(Collins等，J.Gen.Virol.713015-20，1990)。M2-2在模式的微復(fù)制子系統(tǒng)中的共表達對RNA的合成有強效的負調(diào)節(jié)效果(Collins等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.9381-5，1996；Hardy等，J.Virol.72520-6，1998)。目前，在RSV感染細胞中發(fā)現(xiàn)作為非主要類別的RSV M2-2蛋白。因此，一些證據(jù)表明M2-2 ORF是第11個RSV基因。但對于ORF編碼重要病毒的確定的證據(jù)包括，發(fā)現(xiàn)在感染性病毒中的該ORF的表達介導(dǎo)一種生物學(xué)效應(yīng)。根據(jù)本發(fā)明的方法證明了M2-2的這一作用，即消除或缺失M2-2ORF的部分或全部，其后發(fā)現(xiàn)表型改變，包括對于RNA轉(zhuǎn)錄和復(fù)制間平衡的移動。盡管先前的研究暗示M2-2蛋白通常負調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄和RNA復(fù)制，現(xiàn)在已知M2-2可以將RNA合成的平衡從轉(zhuǎn)錄移向復(fù)制(參見Collins等2000年7月9日的美國專利申請“包含M2 ORF2修飾的減毒呼吸道合胞病毒疫苗的產(chǎn)生”，案卷號015280-403100US，以及優(yōu)先權(quán)美國臨時申請60/143,097；Bermingham等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.9611259-11264，1999；Jin等，J.Virol.7474-82，2000，分別在此引用作為參考)相應(yīng)的，本發(fā)明其它方面，表達免疫調(diào)節(jié)分子的重組RSV中M2ORF2的表達被降低或消除。使M2 ORF2整體或部分缺失，或降低或消除M2 ORF2的表達的修飾，在得到的病毒或亞病毒顆粒中特定產(chǎn)生多種期望的表型變化。優(yōu)選的實施方案中，M2 ORF2缺失和剔除突變體，與相應(yīng)的野生型或親本突變RSV株的生長相比，表現(xiàn)減弱的生長。例如在細胞培養(yǎng)時的生長，與相應(yīng)的野生型或親本突變RSV株相比，可以降低約2倍，經(jīng)常是約5倍，優(yōu)選約10倍或更高(如培養(yǎng)7-8天后測量)。更詳細的方面，本發(fā)明重組RSV表現(xiàn)病毒生長延遲的動力學(xué)，與相應(yīng)的野生型或親本突變RSV株的生長動力學(xué)相比，其在最初2-5天時生長降低約100倍和多至1000倍或更多。這些期望的效果是M2 ORF2的表達降低或消除所賦予的。M2 ORF2蛋白合成的降低產(chǎn)生介于其間的效果。此外，因M2-2是調(diào)節(jié)蛋白，也可通過增加而非降低M2 ORF2的表達，使病毒生長和基因表達發(fā)生改變。如上所述，這可通過將M2 ORF2作為單獨的基因表達，如需要，可將其移動到接近或遠離啟動子的位置表達，而容易地實現(xiàn)。
優(yōu)選修飾該重組RSV基因組或反基因組，使M2 ORF2中有一個移碼突變，或一個或更多終止密碼子，從而降低或消除M2 ORF2的表達。本發(fā)明更詳細的方面，誘導(dǎo)M2 ORF2產(chǎn)生特定的移碼突變，即上述引用文獻中的NdeI突變。NdeI突變中ORF2內(nèi)的限制性位點在基因組8299處，該移碼突變(加入兩個核苷酸)位于預(yù)期90個氨基酸的蛋白的密碼子47處。相應(yīng)的，NdeI突變株(實例是重組的rA2-NdeI)編碼與該移碼突變所編碼的18個異源氨基酸融合的M2-2N末端46個氨基酸。產(chǎn)生M2 ORF2剔除突變株的任選的移碼突變可以容易地鑒定。
本發(fā)明其它更詳細的方面，M2 ORF2剔除突變的第二個實例，K5突變，被引入表達細胞因子的RSV中，其通過將M2 ORF2中三個潛在的起始密碼子改為ACG終止子，消除了M2 ORF2的表達。也可以在ORF1終止子后的每個寄存器(register)內(nèi)加入一個終止子，使M2ORF2在密碼子13處終止，以降低回復(fù)突變或非AUG起始的可能。文中M2 ORF2剔除突變株的實例是rA2-K5重組株(也稱為rA2ΔM2-2)，在以上引用文獻中有詳細描述。破壞M2 ORF2表達或M2蛋白的表達或功能以產(chǎn)生減毒RSV候選疫苗的其它改變包括部分或完全缺失M2 ORF2編碼序列整體或部分，以使M2蛋白部分或完全地喪失功能，或終止其表達。改變M2 ORF2表達水平的其它方法是改變其翻譯起始位點或相對于上游ORF1的間隔。例如，M2 ORF2可作為單獨的基因在基因組或反基因組的任何座位上表達，如將帶有其自身基因起始和末端信號的M2 ORF2插入基因組或反基因組的基因間隔區(qū)或其它非編碼區(qū)。這些有關(guān)M2 ORF2的操作范例可以被應(yīng)用，以改變或消除本發(fā)明重組候選疫苗中其它RSV基因的表達。
如上所述，工程改造為表達免疫調(diào)節(jié)分子的本發(fā)明重組RSV具有發(fā)展疫苗所期望的表型特征。模式實施方案中，表達免疫調(diào)節(jié)分子的重組基因組或反基因組變化也產(chǎn)生具有一個或更多以下新特征的候選疫苗，選自(i)在細胞培養(yǎng)中病毒生長的改變，(ii)在感染宿主的上和/或下呼吸道中病毒減毒的變化，(iii)病毒噬菌斑大小的改變，和/或(iv)免疫原性的改變，或另外具有，或同時伴隨有，與野生型或突變親本RSV相比，誘導(dǎo)改變的宿主應(yīng)答的能力，如增加抗RSV中和抗體應(yīng)答、輔助T細胞應(yīng)答、細胞毒T細胞(CTL)應(yīng)答和/或自然殺傷(NK)細胞應(yīng)答。
本發(fā)明優(yōu)選的方面中，重組RSV高水平表達引入的細胞因子或其它免疫調(diào)節(jié)分子，如最高可達如感染組織培養(yǎng)細胞培養(yǎng)基中所測得的2.5μg/ml。這種重組病毒在體內(nèi)和體外都減毒，同時也在接種個體中表現(xiàn)抗野生型RSV的高保護效率。其經(jīng)過工程化，表達的病毒抗原量未減少，典型的是增加，同時也表現(xiàn)減毒表型。由于未降低或被增加的mRNA轉(zhuǎn)錄和抗原表達，其保存了免疫原的潛能，且通過RNA復(fù)制和病毒生長的同時降低達到了減毒。這一套新的表型特點對于發(fā)展疫苗是非常有利的。在被工程化表達免疫調(diào)節(jié)分子的重組RSV中的其它有利的表型改變包括與野生型或突變親本RSV株相比，噬菌斑大小的改變和致細胞病變性改變。
其它優(yōu)選的實施方案中，工程化表達免疫調(diào)節(jié)分子的重組RSV，與相應(yīng)的野生型或親本突變RSV株的生長相比，表現(xiàn)細胞培養(yǎng)時的病毒生長減弱和體內(nèi)減毒。例如在細胞培養(yǎng)中的生長，與相應(yīng)的野生型或親本突變RSV株的生長和復(fù)制相比，可以降低約2倍，經(jīng)常是約5倍，優(yōu)選約10倍-約20倍或更高(如培養(yǎng)7-8天后所測得的)，并且在體內(nèi)的復(fù)制也有相當(dāng)程度的減弱。更詳細的方面，本發(fā)明重組RSV表現(xiàn)病毒生長延遲的動力學(xué)，與相應(yīng)的野生型或親本突變RSV株的生長動力學(xué)相比，其在最初2-5天時生長降低約100-1000倍或更多。其它方面，該重組病毒的抗原表達增加。本發(fā)明最優(yōu)選的實施方案中，工程化表達免疫調(diào)節(jié)分子的重組RSV顯著減毒，同時具有高的免疫原性，可在接種宿主的體內(nèi)誘導(dǎo)對RSV的高度保護性免疫應(yīng)答。
本發(fā)明是用于開發(fā)表達免疫調(diào)節(jié)分子的活減毒RSV候選疫苗。這些重組病毒以cDNA中間體和基于cDNA的回收系統(tǒng)介導(dǎo)構(gòu)建。從cDNA獲得的重組病毒獨立復(fù)制并以與生物學(xué)來源病毒相似的方式繁殖。本發(fā)明重組RSV可被進一步修飾，引入額外的減毒突變，以及多種其它突變和核苷酸修飾，以產(chǎn)生期望的結(jié)構(gòu)和表型效果。
用于從cDNA獲得重組RSV以及制造和檢測此處作為本發(fā)明附加方面所述的全部突變和核苷酸修飾的材料和方法的詳細描述，在以下文獻中有詳細說明1995年9月27日美國臨時專利申請60/007,083；1996年9月27日美國臨時專利申請08/720,132；1996年7月15日美國臨時專利申請60/021,773；1997年5月9日美國臨時專利申請60/046,141；1997年5月23日美國臨時專利申請60/047,634；1999年11月30日美國專利5,993,824(相應(yīng)于國際申請WO98/02530)；1999年4月13日Collins等的美國專利申請09/291,894；1999年4月13日Murphy等的美國臨時專利申請60/129,006；Crowe等，Vaccine12691-699，1994；Crowe等，Vaccine 12783-790，1994；Collins等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.9211563-11567，1995；Bukrevev等，J.Virol.706634-6641，1996；Juhasz等，J.Virol.71(8)5814-5819，1997；Durbin，Virology 235323-332，1997；Karron等，J.Infect.Dis.1761428-1436，1997；He等，Virology 237249-260，1997；Baron等，J.Virol.711265-1271，1997；Whitehead等，Virology 247(2)232-239，1998a；Whitehead等，J.Virol.72(5)4467-4471，1998b；Jin等，Virology 251206-214，1998；Bukreyev等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.962367-2372，1999；Bermingham和Collins，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.9611259-11264，1999；Juhasz等，Vaccine 171416-1424，1999；Juhasz等，J.Virol.735176-5180，1999；Teng和Collins，J.Virol.73466-473，1999；Whitehead等，J.Virol.739773-9780，1999；Whitehead等，J.Virol.73871-877，1999；Whitehead等，J.Virol.733438-3442，1999；為各種目的分別在此全文引用作為參考。
從cDNA獲得重組RSV的模式方法包括細胞內(nèi)共表達，典型的是從共轉(zhuǎn)染到組織培養(yǎng)細胞中的質(zhì)粒共表達RSV反基因組RNA和RSV N、P、M2-1和L蛋白。這引發(fā)有效感染，產(chǎn)生感染性cDNA來源的病毒，即重組病毒，一旦產(chǎn)生，重組RSV可容易地以與生物學(xué)來源的病毒相似的方式增殖，并且重組病毒和對應(yīng)的生物學(xué)來源的病毒不易區(qū)分，除非前者被修飾為包含作為標(biāo)記被引入的一種或多種變化。
從cDNA中獲得感染性RSV的能力提供了通過cDNA中間體在感染性病毒中引入預(yù)先確定的改變的方法。顯示這種方法可以產(chǎn)生多種感染性、減毒的RSV衍生物，例如那些候選重組疫苗，其具有病毒蛋白內(nèi)一個或更多氨基酸替代，一個或更多基因的缺失或基因表達的消除，和/或順式作用RNA信號中一個或更多核苷酸替代，對病毒表型產(chǎn)生期望的效果(參見Bukreyev等，J.Virol.718973-8982，1997；Whitehead等，J.Virol.724467-4471，1998；Whitehead等，Virology247232-239，1998；Bermingham和Collins，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.9211259-11264，1999；Juhasz等，Vaccine.171416-1424，1999；Juhasz等，J.Virol.735176-5180，1999；Teng和Collins，J.Virol.73466-473，1999；Whitehead等，J.Virol.73871-877，1999；Whitehead等，J.Virol.733438-3442，1999；Collins等，Adv.Virus Res.54423-451，1999；分別在此引用作為參考)。
上面的內(nèi)容說明了可用于本發(fā)明的誘變、分離和定性PIV以獲得減毒突變株(如溫度敏感(ts)、冷傳代(cp)、冷適應(yīng)(ca)、小噬斑(sp)和宿主范圍限制(hr)突變株)的方法和步驟，以及鑒別特定產(chǎn)生該減毒表型的遺傳變化的方法和步驟。與這些方法一致，前述文件詳細說明了，在認可的模型系統(tǒng)中(包括鼠和非人靈長類動物模型系統(tǒng))，確定生物學(xué)來源的和重組產(chǎn)生的減毒人RSV(包括人RSVA和B亞型)的復(fù)制、免疫原性、遺傳穩(wěn)定性和有效保護性的方法。此外，這些文件說明發(fā)展和檢測用于預(yù)防和治療RSV感染的免疫原組合物(包括單價和二價疫苗)的一般方法。
以上引用的文件中也說明了產(chǎn)生感染性重組RSV的方法，即，構(gòu)建和表達編碼RSV基因組或反基因組的cDNA并與必需的RSV蛋白基因共表達(參見1995年9月27日的美國臨時專利申請60/007,083；1996年9月27日的美國專利申請08/720,132；1996年7月15日的美國臨時專利申請60/021,773；1997年5月9日的美國臨時專利申請60/046,141；1997年5月23日的美國專利申請60/047,634；1997年7月15日的美國專利申請08/892,403(相應(yīng)于國際申請WO98/02530)；分別在此引用作為參考)。
也公布了構(gòu)建和檢測感染性重組RSV的方法，其被修飾以引入生物學(xué)來源RSV突變體中發(fā)現(xiàn)的表型特異性突變，如來自如下生物學(xué)來源RSV突變體中并引入重組RSV的cp和ts突變，所述生物學(xué)來源突變體命名如下cpts RSV 248(ATCC VR 2450)；cpts RSV 248/404(ATCC VR 2454)；cpts RSV 248/955(ATCC VR 2453)；cpts RSV 530(ATCC VR 2452)；cpts RSV 530/1009(ATCC VR 2451)；cpts RSV530/1030(ATCC VR 2455)；RSV B-1 cp52/2B5(ATCC VR 2542)；RSV B-1 cp-23(ATCC VR 2579)。由此產(chǎn)生的重組RSV可能包含一個，兩個或多個來自相同或不同生物學(xué)來源RSV突變體(例如248/404，530/1009，或530/1030生物突變體中的一個或多個)的ts突變。后文中，多重減毒重組體可能具有來自兩個，三個，或多個生物突變體中的減毒突變的組合，如來自RSV突變體530/1009/404，248/404/1009，248/404/1030，或248/404/1009/1030突變株的減毒突變的組合。模式實施方案中，一個或更多減毒突變特定產(chǎn)生在RSV聚合酶基因中氨基酸Phe521，Gln831，Met1169，或Tyr1321處的溫度敏感替代，或在M2基因起始序列的溫度敏感核苷酸替代。模式實施方案中，這些突變涉及到與生物學(xué)來源突變RSV的L基因中發(fā)現(xiàn)的一個或多個以下改變等同或保守的改變Ile替代Asn43，Leu替代Phe521，Leu替代Gln831，Val替代Met1169，Asn替代Tyr1321。
本發(fā)明近來發(fā)展的一個實施方案中，確定了除基因組前29個核苷酸(基因組3’末端)和后33個核苷酸(5’末端)外的RSV突變體cpts248/955的序列。將該序列與親本cpts248的比較。突變病毒cpts248/955具有cpts248中發(fā)現(xiàn)的所有突變，還包含以下突變1.P基因末端信號核苷酸3236處插入A殘基。這使多聚A序列由7個A增加到8個A。同樣的插入在重組RSV rA2的病毒制備物中也出現(xiàn)，在小鼠體內(nèi)不影響復(fù)制水平。2.因cpRSV核苷酸(nt)8626處由A改為U產(chǎn)生了L聚合酶蛋白氨基酸43處由Asn改為Ile。因此認為cpts248/955的表型由nt8626處錯義突變所賦予。該結(jié)果與先前在RSV530，1030，1009和248突變中的結(jié)果一致。
其它可引入工程化表達免疫調(diào)節(jié)分子的重組RSV中的突變是在異源RSV或其它更遠源的負鏈RNA病毒中發(fā)現(xiàn)的突變，如減毒突變。特別的，一個負鏈RNA病毒中發(fā)現(xiàn)的減毒或其它表型突變可以“轉(zhuǎn)移”，如拷貝，到M2 ORF2缺失和剔除突變體基因組或反基因組內(nèi)的相應(yīng)位置。簡述如下，一個異源負鏈RNA病毒中期望的突變被轉(zhuǎn)移到RSV受體(例如人或牛RSV)。這包括在異源病毒中定位該突變，通過序列對比鑒別受體RSV中相應(yīng)位點，將RSV受體的天然序列突變?yōu)樵撏蛔兓蛐?等同或保守突變)，在以下文獻中進行了表述2000年4月12日的國際申請PCT/US00/09695，以及相應(yīng)的優(yōu)先權(quán)美國臨時專利申請60/129,006，分別在此引用作為參考。如這些文獻所述，優(yōu)選修飾受體基因組或反基因組以使其在突變位點編碼一種變化，其保守地相應(yīng)于異源突變病毒中的變化。例如，如果突變病毒中相對于野生型序列的氨基酸替代標(biāo)志突變的位點，則重組病毒相應(yīng)殘基處可工程化產(chǎn)生相似的替代。優(yōu)選，該替代應(yīng)包括與突變病毒蛋白中替代殘基相同或保守的氨基酸。但對于突變蛋白中的替代殘基，也可能非保守地改變突變位點的天然氨基酸(如利用任何其它氨基酸破壞或消弱野生型殘基的功能)。在其中發(fā)現(xiàn)模式突變并將該突變轉(zhuǎn)移于本發(fā)明重組RSV中的負鏈RNA病毒包括其它RSV(如鼠)、PIV、仙臺病毒(SeV)、新城疫病毒(NDV)、猿猴病毒5(SV5)、麻疹病毒(MeV)、牛瘟病毒、犬瘟熱病毒(CDV)、狂犬病病毒(RaV)、水泡性口膜炎病毒(VSV)等。本發(fā)明使用的多種突變范例已經(jīng)公開，包括但不限于RSV L蛋白521處苯丙氨酸的替代(相應(yīng)于HPIV3 L蛋白456處苯丙氨酸替代)。在標(biāo)志為缺失或插入的突變中，這些突變可以作為相應(yīng)的缺失或插入，引入到重組病毒中。缺失或插入蛋白片段的大小和氨基酸序列可不一。
在前述引用的文獻中表述了多種其它類型的突變，其可以容易地工程化引入本發(fā)明重組RSV中，調(diào)節(jié)減毒、免疫原性、和/或提供其它有利的結(jié)構(gòu)和/或表型效果。例如，限制性位點標(biāo)記可常規(guī)地引入重組反基因組或基因組中，以利于cDNA的構(gòu)建和操作。前述引用的文獻中也表述了除用于本發(fā)明的點突變或位點特異性突變外的多種核苷酸修飾。例如，公布了產(chǎn)生表達額外異源基因(如氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(CAT)或熒光素酶基因)的重組RSV的方法和組合物。這種重組體一般表現(xiàn)與插入基因相關(guān)的生長降低。減毒隨插入基因長度的增加而增加。異源基因插入重組RSV可降低其復(fù)制水平并在體外傳代時穩(wěn)定的這一發(fā)現(xiàn)，提供了使RSV減毒用于疫苗的另一有效方法。
前述引用的文獻中表述的引入本發(fā)明重組RSV的其它核苷酸改變，包括一個或多個非必需(如對于復(fù)制和/或感染性而言)RSV基因或基因組區(qū)段部分或完全地缺失或消除。RSV基因或基因組區(qū)段可被缺失，包括RSV NS1，NS2，N，P，M，G，F(xiàn)，SH，M2 ORF1，M2 ORF2和/或L基因讀碼框和/或順式作用調(diào)節(jié)序列的部分或完全地缺失。本發(fā)明這一方面中，可工程化核苷酸修飾，以使選擇的基因缺失或沉默，獲得在體外良好復(fù)制但在體內(nèi)的復(fù)制降低的重組候選疫苗(Bukreyev等，J.Virol.718973-8982，1997；23]Teng等，J.Virol.73466-473，1999；分別在此引用作為參考)。例如，缺失SH導(dǎo)致病毒，即rA2ΔSH，在體外復(fù)制的效率與野生型rRSV(rA2)相當(dāng)或略高，在小鼠和猩猩中略有減毒(Bukreyev等，J.Virol.718973-8982，1997；Whitehead等，J.Virol.733438-3442，1999；分別在此引用作為參考)。命名為rA2ΔNS2的缺失NS2基因的重組RSV在體外表現(xiàn)出降低的生長動力學(xué)和降低的感染性病毒產(chǎn)量，其在小鼠和猩猩中是顯著減毒的(Teng等，J.Virol.73466-473，1999；Whitehead等，J.Virol.733438-3442，1999；分別在此引用作為參考)。相似的體外特性在NS2基因缺失的重組牛RSV中也有發(fā)現(xiàn)(Buchholz等，J.Virol.73251-259，1999；分別在此引用作為參考)。
一個例子中，重組RSV中SH基因表達的消除是因編碼SH mRNA和蛋白的多核苷酸的去除。SH基因的缺失不僅產(chǎn)生可回收的感染性RSV，其也表現(xiàn)在組織培養(yǎng)中顯著增加的生長，表現(xiàn)為感染性病毒產(chǎn)量和噬菌斑大小的改善。SH基因的缺失導(dǎo)致在組織培養(yǎng)中顯著增加的生長，證明是發(fā)展工程化表達免疫調(diào)節(jié)分子的RSV疫苗病毒的有用工具，例如克服了RSV培養(yǎng)時產(chǎn)量低的問題。此外，這些缺失是高度穩(wěn)定地抗遺傳回復(fù)，使此來源的RSV克隆特別使用于疫苗制劑。
SH-負型(SH-minus)RSV重組體也在小鼠上呼吸道表現(xiàn)位點特異性減毒，這是發(fā)展疫苗的又一優(yōu)勢。某些正被檢測用于活病毒疫苗的RSV株，如cp突變體，在組織培養(yǎng)中不表現(xiàn)顯著改變的生長。這些是宿主范圍突變，限制在猩猩和人呼吸道中的復(fù)制，在下呼吸道大約降低100倍。另一減毒突變的類型，ts突變，由于體溫在呼吸道中從上到下的增加，傾向于優(yōu)先限制在下呼吸道中的病毒復(fù)制。與cp和ts突變體相反，SH-負型突變RSV區(qū)別性的表型是在上呼吸道中更大的限制。這特別適合發(fā)展給藥幼兒的疫苗病毒，因為在上呼吸道中復(fù)制的限制對于確保在脆弱年齡段人群的給藥安全是必要的，該年齡段成員主要通過鼻呼吸。此外，任何年齡段中，病毒在上呼吸道中復(fù)制的限制可大大降低中耳炎的發(fā)病率。除了這些優(yōu)點，SH缺失突變(涉及近400個核苷酸和全部mRNA的消失)的性質(zhì)代表了非常難以回復(fù)的一類突變。
有關(guān)SH基因修飾的研究中還討論了不同RSV(包括人和牛RSV)，以及其它肺病毒中SH基因的比較，以提供其他產(chǎn)生有用RSV重組疫苗的方法和工具。例如RSV的兩個抗原亞型，A和B，在某些SH結(jié)構(gòu)域表現(xiàn)非常高的保守性。兩個這種結(jié)構(gòu)域中，RSV A和B的N末端區(qū)域和可能的跨膜結(jié)構(gòu)域在氨基酸水平表現(xiàn)84％的同一性，而C末端可能的胞外域差異較大(約50％的同一性)。對人RSV B亞型的兩個不同株，即8/60和18537的SH基因比較僅發(fā)現(xiàn)一個氨基酸的差異(Anderson等，同上)。人和牛RSV SH蛋白有40％的同一性，并都具有以下主要結(jié)構(gòu)特點(i)保守殘基不對稱分布；(ii)極相似的疏水結(jié)構(gòu)；(iii)疏水區(qū)的兩邊均有一個N連接的糖基化位點；(iv)SH蛋白中心疏水區(qū)的C末端有一個單獨的半胱氨酸殘基(Anderson等，同上)。通過檢測這些以及其它序列的相似和差異，可以選擇能夠替代或插入到例如感染性M2 ORF2缺失和剔除突變RSV克隆中的異源序列，例如產(chǎn)生具有多特異性免疫原效果和/或如減毒之類的其它期望效果的疫苗病毒。
在對基因缺失的描述中也公布了改變基因位置的效果。例如SH基因的缺失使下游基因位點移動到更接近啟動子的位置。這可能伴隨著重組病毒中下游基因轉(zhuǎn)錄的增加?；蛘撸魏位虻奈恢枚伎梢岳缤ㄟ^該基因插入或轉(zhuǎn)位到上游或下游的基因間隔區(qū)或其它非編碼區(qū)而改變，從而改變表達。因此，提供了通過改變基因在該基因組或反基因組中的次序或位置，使RSV基因表達水平改變的方法。下游基因表達水平的降低在許可宿主(如猩猩和人)中導(dǎo)致減毒表型，而表達水平的增加對重組RSV有相反的效果。
以上引用文獻中說明的另一范例中，NS2基因的表達因其讀碼框(ORF)中引入的一個終止密碼子而被消除。與野生型相比，這種NS2剔除突變體釋放感染性病毒的速率降低。此外，對于該突變體和野生型病毒噬菌斑的比較發(fā)現(xiàn)，NS2剔除病毒的噬菌斑尺寸顯著減小。因此，這種類型的突變可以引入工程化表達細胞因子或其它免疫調(diào)節(jié)分子的活的重組RSV中，以獲得改變的表型，在此例中，是在體外病毒生長率和噬菌斑尺寸的降低。因此，基于體外噬菌斑尺寸的降低和體內(nèi)減毒的相關(guān)性，這些和其它剔除方法和突變體提供了另外的重組RSV疫苗制劑。NS2基因的表達也因NS2基因完全去除而消除，產(chǎn)生的病毒具有相似表型。
其它被成功缺失的RSV基因包括NS1和G基因。前者的缺失通過其編碼多核苷酸序列的去除而實現(xiàn)，后者是通過引入移碼或改變翻譯起始位點并引入終止密碼子而實現(xiàn)。特別的，NS1基因是通過反基因組cDNA的122-630位核苷酸的去除而缺失的，因此將NS1上游非翻譯區(qū)與NS2翻譯起始密碼子連接。該病毒rA2ΔNS1，表現(xiàn)RNA復(fù)制、噬菌斑尺寸、生長動力學(xué)的降低，以及在體外感染性病毒產(chǎn)量降低約10倍。有趣的是，回收的NS1-負型病毒在組織培養(yǎng)中產(chǎn)生小噬菌斑，但比缺失NS2的病毒稍大。NS1-負型病毒可以生長(盡管速率降低)的事實說明NS1是一個對于病毒生長非必需的附屬蛋白。NS1-負型的病毒噬菌斑尺寸與NS2剔除突變體(NS2蛋白的表達因在其編碼區(qū)中引入的翻譯終止子而消除)的相似。小噬菌斑表型通常與減毒突變相關(guān)。因此，這種類型的突變可以引入活的重組RSV中，以獲得改變的表型。因此，基于體外噬菌斑尺寸和體內(nèi)減毒的相關(guān)性，這些和其它剔除方法和突變體提供了另外的本發(fā)明重組RSV疫苗制劑。年幼的猩猩中，NS2剔除突變體在其上呼吸道略有減毒，而在其下呼吸道表現(xiàn)高度減毒表型。這種突變體可極大地誘導(dǎo)猩猩中疾病癥狀的降低，并刺激對野生型攻擊病毒的顯著抗性(Whitehead等，J.Virol733438-3442，1999，在此引用作為參考)。
如上所述，另一可以引入表達免疫調(diào)節(jié)分子的本發(fā)明重組RSV中的剔除突變涉及到M2 ORF2的缺失或消除，M2 ORF2近來被確認為編碼一個轉(zhuǎn)錄/復(fù)制調(diào)節(jié)因子M2-2(參見，Collins等，2000年7月9日美國專利申請“制備包含M2 ORF2修飾的減毒的呼吸道合胞病毒”案卷號015280-403100US和優(yōu)先權(quán)美國臨時專利申請60/143,097；Bermingham等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 9611259-11264，1999；Jin等，J.Virol.7474-82，2000，分別在此引用作為參考)。本發(fā)明的這方面，優(yōu)選地通過修飾重組RSV基因組或反基因組，引入一個移碼突變，或在M2 ORF2中引入一個或更多終止子，或改變起始密碼子，使M2ORF2的表達降低或消除。其它破壞M2 ORF2的表達或M2-2蛋白的表達或功能以產(chǎn)生減毒RSV候選疫苗的改變包括，部分或完全M2ORF2編碼序列整體或部分地缺失，使M2-2蛋白部分或完全地喪失功能，或終止其表達?；蛘撸ㄟ^將M2-2 ORF2放置于該重組基因組或反基因組更加接近或遠離啟動子的位置上，分別正或負調(diào)節(jié)M2-2在重組RSV中的表達。構(gòu)建該基因組或反基因組，使之包含M2-2 ORF與其自身基因起始信號和終止信號一同作為一個獨立的基因，這可以正調(diào)節(jié)M2-2。優(yōu)選的實施方案中，M2 ORF2缺失和剔除突變體與相應(yīng)野生型或突變親本RSV株相比，表現(xiàn)減弱的病毒生長。此外，這些重組體表現(xiàn)病毒生長延遲的動力學(xué)。由于M2-2是一個調(diào)節(jié)蛋白，通過增加(而非降低)M2 ORF2的表達，也可以使病毒生長和表達方式改變。如上所述，這可以將M2 ORF2作為獨立基因表達，如需要，也可以放置于更加接近或遠離啟動子的位置上，因此容易地實現(xiàn)。具有M2 ORF2缺失和剔除突變的重組疫苗病毒優(yōu)選地表現(xiàn)在mRNA轉(zhuǎn)錄的改變。這種改變的一個方面是，與相應(yīng)野生型或突變親本RSV株mRNA合成的動力學(xué)相比，該病毒mRNA合成延遲的動力學(xué)。但一段時間之后(如感染后24小時)M2 ORF2缺失和剔除突變體表現(xiàn)mRNA合成累積量的增加。這種mRNA合成累積量的增加比相應(yīng)野生型或突變親本RSV株mRNA的累積高約50-100％，100-200％，200-300％或更高。
本發(fā)明也提供了具有M2 ORF2缺失和剔除突變的表達免疫調(diào)節(jié)分子的RSV，與相應(yīng)野生型或突變親本RSV株RNA的復(fù)制(基因組或反基因組的合成)相比，其病毒RNA的復(fù)制降低。因此，這種基因組RNA的累積量比相應(yīng)野生型或突變親本RSV株基因組RNA的累積(如感染后24小時)低約25-30％，15-25％，10-15％或更低。優(yōu)選的方面，其mRNA與基因組RNA的累積摩爾比率比觀察到的相應(yīng)野生型或突變親本RSV株mRNA與基因組RNA的累積摩爾比率增加2-5，5-10，10-20倍或更高。
除了有利的表型變化外，與相應(yīng)野生型或突變親本RSV株感染細胞中病毒蛋白的累積相比，M2 ORF2缺失或剔除突變引入本發(fā)明重組RSV，賦予并增加了感染細胞中病毒蛋白的累積。病毒蛋白水平的增加(如感染后36小時)可達到50-100％，100-200％，200-300％或更高。這是特別有用的，因為與相應(yīng)野生型或突變親本RSV株中抗原的表達相比，病毒抗原表達的增加導(dǎo)致免疫原性的增加，抵消了因重組病毒中期望的減毒表型所產(chǎn)生的抗原表達和免疫原性的降低。候選疫苗在不喪失免疫原潛力，甚至表現(xiàn)免疫原活性的增加的情況下，可以被適當(dāng)?shù)臏p毒，這種令人驚訝的表型特征非常有利于疫苗發(fā)展。
引用的文獻中提供的在本發(fā)明中有用的其它方法和組合物涉及到被修飾為表達免疫調(diào)節(jié)分子的RSV重組體中不同的核苷酸修飾，其改變該重組基因組或反基因組中不同的順式作用序列。如RSV G糖蛋白分泌形式的一個翻譯起始位點可以被缺失，破壞這種形式G糖蛋白的表達。RSV G蛋白以兩種形式合成一種錨定類型II整合膜蛋白和一種在N末端重切分的缺乏所有膜錨定點的分泌型(Hendricks等，J.Virol.622228-2233，1988)。這兩種形式來源于兩個不同位點的翻譯起始長型的在G ORF第一個AUG位點起始，第二中從ORF密碼子48處的第二個AUG位點起始，并進一步由蛋白酶解加工(Roberts等，J.Virol.684538-4546，1994)。第二個起始位點是非常保守的，在目前測序的所有人，牛和羊RSV株中都存在。這暗示G蛋白的這種可溶形式通過捕獲中和抗體，使宿主免疫減弱。可溶G對于優(yōu)先刺激偏向Th2的應(yīng)答也有作用，而偏向Th2的應(yīng)答似乎又與RSV以后入侵時免疫病理學(xué)增強相關(guān)。對于RSV疫苗病毒，降低抗體的捕獲或免疫系統(tǒng)不平衡的刺激是需要的，因此希望消除G蛋白這種分泌形式的表達。這在該重組病毒中得以實現(xiàn)。因此，該突變特別適用于在數(shù)量和/或質(zhì)量上改變重組病毒誘導(dǎo)的宿主免疫應(yīng)答，而非直接使病毒減毒。G蛋白基因也可一同被缺失。產(chǎn)生的病毒顯示宿主范圍效果，在HEp-2細胞中生長率低但在Vero細胞中的生長和野生型一樣有效?？赡芷渌鞍滓蔡峁└街δ?，或附著功能隨之去除。因此，本發(fā)明也提供了缺乏G蛋白并表達免疫調(diào)節(jié)分子以增強免疫原性的活的減毒RSV疫苗病毒。
引用的文獻還描述了通過改變其它模式基因(如NS1和NS2)的順式作用轉(zhuǎn)錄信號調(diào)節(jié)重組RSV表型的方法。這些核苷酸修飾的結(jié)果與通過改變順式作用元件(如降低通讀mRNA的水平和增加下游基因蛋白的表達)使蛋白表達的改變一致。產(chǎn)生的重組病毒優(yōu)選地表現(xiàn)增加的生長動力學(xué)和噬菌斑尺寸的增加。順式作用調(diào)節(jié)序列的模式修飾包括修飾與RSV基因相關(guān)的基因起始(GE)和終止(GS)信號。文中，模式改變包括NS1和NS2基因GS信號的改變，使這些信號與RSV N基因天然的GE信號相同。產(chǎn)生的重組病毒表現(xiàn)增加的生長動力學(xué)和噬菌斑尺寸的增加，因此提供了有利地改變表達免疫調(diào)節(jié)分子的RSV候選疫苗的表型的其它方法。
引用文獻中所述在本發(fā)明中有用的方法和組合物，可產(chǎn)生表達免疫調(diào)節(jié)分子的減毒RSV，其具有來自RSV亞型A和B的序列，例如，以產(chǎn)生一個RSV A或B疫苗或一個二價的RSV A/B疫苗。因此，引用文獻提供了可產(chǎn)生表達細胞因子的減毒RSV疫苗病毒的方法和組合物，所述病毒具有來自RSV亞型A和B的序列，例如，以產(chǎn)生一個RSV A或B疫苗或一個二價的RSV A/B疫苗(參見如Collins等1999年4月13日的美國專利申請09/291,894，在此引用作為參考)。一個例子中，提供了特異于RSV亞型B的疫苗病毒，其中，使用減毒的亞型A病毒表達RSV亞型B的F和/或G糖蛋白。因為F和G蛋白是主要的保護性抗原，并提供RSV亞型特異性中的多數(shù)部分，該嵌合病毒刺激抗亞型B的強的免疫應(yīng)答?？梢杂闷渌鼉煞N方式實施該方法。一是將亞型B的G糖蛋白作為額外的基因插入亞型A背景中(或反之)。但由于F蛋白也表現(xiàn)顯著的亞型特異性，優(yōu)選在特異于RSV亞型B的疫苗中同時表達二者。此外，優(yōu)選進一步改變亞型B病毒，以獲得適當(dāng)?shù)臏p毒和免疫原性。因此，第二種，也是獲得RSV亞型B疫苗的更好的方式，是從亞型A重組cDNA背景基因組或反基因組中去除G和F基因，替代以RSV亞型B的G和F基因。產(chǎn)生的A/B嵌合RSV具有亞型A的內(nèi)在蛋白和亞型B的保護性抗原。這種病毒可通過系統(tǒng)地引入上述減毒突變而使減毒達到理想的水平。例如，引入嵌合RSV A/B病毒的特定減毒突變包括(i)5個cp突變中的3個，即N中的突變(V267I)和L中的兩個(C319Y和H1690Y)，但不包括F中的兩個，因其被B1 F基因替代所去除了；(ii)減毒的A2株中發(fā)現(xiàn)的248(Q831L)，1030(Y1321N)，和任選的，404-L(D1183E)；(iii)M2基因起始信號位置9處的單核苷酸替代；以及(iv)SH基因的缺失。其它嵌合RSV A/B中可得的突變包括，但不局限于，NS1，NS2，SH，或G基因的缺失，以及530和1009突變的單獨或組合形式。
如上所述，本發(fā)明也包含在嵌合人-牛重組病毒內(nèi)表達免疫調(diào)節(jié)分子的重組RSV的構(gòu)建和應(yīng)用。本發(fā)明這方面使用的嵌合人-牛RSV一般見于Bucholz等2000年6月23日美國專利申請“減毒的人-牛嵌合呼吸道合胞病毒的生產(chǎn)”(案卷號015280-398100US)及其優(yōu)先權(quán)美國臨時申請60/143,132，分別在此引用作為參考。這些嵌合重組RSV包括一個部分或完全的“背景”RSV基因組反基因組，其來自或其構(gòu)建依據(jù)組合有另一RSV株或亞型病毒的一個或更多異源基因或基因組區(qū)段的人或牛RSV株或亞型病毒，形成人-牛嵌合RSV基因組或反基因組。本發(fā)明的某些方面，嵌合RSV含有組合了一個或多個異源的人RSV基因或基因組區(qū)段的牛RSV的背景基因組或反基因組。本發(fā)明的另一些方面，嵌合RSV含有組合了來自牛RSV一個或多個異源基因或基因組區(qū)段的人RSV的背景基因組或反基因組。
在模式實施方案中，本發(fā)明公布了感染性的表達細胞因子的RSV，其含有一個主要核殼蛋白(N)，核殼磷蛋白(P)，大聚合酶蛋白(L)，RNA聚合酶延伸因子，和組合有另一RSV株或亞型病毒的一個或更多異源基因或基因組區(qū)段的部分或完整的人或牛RSV的RSV背景基因組或反基因組，形成人-牛嵌合RSV基因組或反基因組?？捎糜诒景l(fā)明的異源基因和/或基因組區(qū)段包括RSV NS1，NS2，N，P，M，SH，M2(ORF1)，M2(ORF2)，L，F(xiàn)，或G基因或基因組區(qū)段中一種或多種。或者，引入本發(fā)明人-牛嵌合RSV的異源基因和基因組區(qū)段可能包括RSV基因組的前導(dǎo)區(qū)、非轉(zhuǎn)錄尾區(qū)或基因間隔區(qū)或其片段。有許多編碼一個或更多細胞因子的核苷酸可引入該嵌合基因組或反基因組。
更詳細的實施方案中，本發(fā)明重組RSV包含編碼RSV F、G和/或SH糖蛋白或其免疫原結(jié)構(gòu)域或表位的一個或多個異源基因和/或基因組區(qū)段?；蛘撸撝亟MRSV可能具有同時包含人和牛糖蛋白結(jié)構(gòu)域或免疫原性表位的嵌合糖蛋白。例如，后一類型的嵌合體通過在牛背景基因組或反基因組中以合適的閱讀框引入編碼糖蛋白胞外域的異源基因組片段和編碼牛背景基因組或反基因組中相應(yīng)糖蛋白其余功能部分的基因組區(qū)段，產(chǎn)生的嵌合病毒表達具有功能的嵌合糖蛋白。
本發(fā)明其它實施方案中，提供被修飾為表達免疫調(diào)節(jié)分子的人-牛嵌合RSV，其中一個人RSV“背景”因引入選擇的牛基因，或基因組區(qū)段，或多個基因或基因組區(qū)段而減毒。某些實施方案中，選擇的異源BRSV基因協(xié)同地轉(zhuǎn)移到HRSV背景基因組或反基因組中。單獨或協(xié)同轉(zhuǎn)移的牛RSV基因包括RSV N，P，NS1，NS2，M2-1和M基因，在人RSV背景基因組或反基因組中，可以被牛RSV的一個或多個異源基因或基因組區(qū)段單獨或組合地替代，產(chǎn)生減毒的嵌合衍生物。更詳細的方面中，人RSV的N和P基因都可以被牛RSV的對應(yīng)N和P基因協(xié)同地替代。RSV基因組中某些基因功能的協(xié)作性(如基因組中臨近的基因?qū)?使這種協(xié)同的基因替代更加便利。因此其它實施方案中，人RSV的NS1和NS2基因都可以被牛RSV的對應(yīng)NS1和NS2基因協(xié)同地替代。其它實施方案中，HRSV的M2-1、M2-2和L基因中的兩個或更多被牛RSV的對應(yīng)基因協(xié)同地替代。對于希望具有高的宿主范圍限制的本發(fā)明候選疫苗，人RSV的N、P、NS1、NS2、M2-1和M基因都可以被牛RSV的對應(yīng)N、P、NS1、NS2、M2-1和M基因替代。各種構(gòu)建體中，任何與此處所述細胞因子表達有關(guān)的選定的修飾都可以引入嵌合基因組或反基因組中。
本發(fā)明一個不同方面中，構(gòu)建表達此處所述細胞因子的人-牛嵌合RSV，其中嵌合基因組或反基因組含有組合了人RSV的一個或更多異源基因和/或基因組區(qū)段的部分或完整的牛RSV背景基因組或反基因組。某些實施方案中，選自F、G和SH中的一個或更多人RSV糖蛋白基因，或編碼F、G或/和SH胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域、胞外域或免疫原性表位的一個或更多基因組區(qū)段，被添加或替代于部分或完整的牛RSV的背景基因組或反基因組內(nèi)。例如，人RSV糖蛋白基因F和G中任一，或同時，用于替代部分牛RSV的背景基因組或反基因組內(nèi)的F和G糖蛋白基因中任一，或同時替代。這些以及相關(guān)的實施方案中，人-牛嵌合RSV基因組或反基因組可以具有人RSV亞型A和B之一或二者的抗原決定簇。更詳細的方面，人RSV糖蛋白基因F和G可以同時替代牛RSV的背景基因組或反基因組內(nèi)的對應(yīng)F和G糖蛋白基因。具有以上引用文獻中描述的特征的人-牛嵌合RSV是rBRSV/A2。與在這種嵌合病毒中的一種或多種修飾組合，該候選疫苗將具有定向?qū)е录毎蜃颖磉_的修飾。
本發(fā)明其它具有定向免疫調(diào)節(jié)分子表達的修飾的人-牛嵌合RSV，包含人RSV的F，G，和SH之一或更多，其在部分或完整牛RSV背景基因組或反基因組中，在相對于其相應(yīng)基因或基因組區(qū)段的野生型基因次序，離啟動子更近的位置被加入或替代。一個這種實施方案中，人RSV糖蛋白基因G和F可以在部分牛RSV的背景基因組或反基因組內(nèi)替代于位置1和2處，分別代替了野生型位置7和8處缺失的G和F糖蛋白。具有以上引用文獻中描述的特征的模式人-牛嵌合RSV是rBRSV/A2-G1F2。
人-牛嵌合RSV內(nèi)協(xié)同的基因轉(zhuǎn)移也涉及在牛背景基因組或反基因組中引入人的抗原基因。某些實施方案中，選自F，G，SH和M的一個或多個人RSV包膜相關(guān)基因被添加或替代到部分或完整牛RSV背景基因組或反基因組中。例如，選自F，G，SH和M的一個或多個人RSV包膜相關(guān)基因可以被添加或替代于缺失了選自F，G，SH和M的一個或多個包膜相關(guān)基因的部分牛RSV背景基因組或反基因組內(nèi)。更詳細的方面中，人RSV包膜相關(guān)基因F，G，和M中的一個或多個被添加到缺失了膜相關(guān)基因F，G，SH和M的部分牛RSV背景基因組或反基因組內(nèi)。具有以上引用文獻中描述的特征的模式人-牛嵌合RSV是rBRSV/A2-MGF。與在這種嵌合病毒中的修飾組合，該候選疫苗將具有定向?qū)е录毎蜃颖磉_的選定的修飾。
引入異源免疫原蛋白、結(jié)構(gòu)域和表位，產(chǎn)生同時表達免疫調(diào)節(jié)分子的嵌合RSV，尤其適用于在免疫化宿主中產(chǎn)生新的免疫應(yīng)答。來自一個供體RSV的免疫原基因或基因組區(qū)段，對不同亞型或株的RSV受體基因組或反基因組的添加或替代，產(chǎn)生的免疫應(yīng)答導(dǎo)向供體亞型或株、受體亞型或株、或針對二者。為達到這一目的，可構(gòu)建表達嵌合蛋白的表達免疫調(diào)節(jié)分子的重組RSV，如表達特異于一種RSV的免疫原蛋白的細胞質(zhì)尾和/或跨膜區(qū)與特異于另一種RSV胞外域融合產(chǎn)生的人-牛融合蛋白，或具有兩種不同人RSV亞型或毒株的結(jié)構(gòu)域的融合蛋白。優(yōu)選實施方案中，表達免疫調(diào)節(jié)分子的RSV的基因組或反基因組在重組病毒顆?；騺啿《绢w粒中編碼同時具有人和牛二者的糖蛋白結(jié)構(gòu)域或免疫原性表位的嵌合糖蛋白。例如，編碼人RSV F，SH或G糖蛋白的糖蛋白胞外域的異源基因組區(qū)段，可以與編碼相應(yīng)牛RSV F，SH或G糖蛋白的胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域或胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的多核苷酸序列(即，基因組區(qū)段)相連，形成人-牛嵌合RSV基因組或反基因組。
其它一些實施方案中，用于疫苗制劑中的重組RSV可容易地被修飾，以適應(yīng)循環(huán)病毒的抗原漂移。典型的，修飾發(fā)生在G和/或F蛋白中。這可能包括一種RSV株的完整G或F基因，或編碼其特定免疫原區(qū)的基因組區(qū)段，通過替代不同RSV株或亞型受體克隆的相應(yīng)區(qū)段，或通過添加該基因的一個或更多拷貝，引入嵌合RSV基因組或反基因組cDNA，產(chǎn)生多種抗原形式。修飾后的RSV克隆的子代病毒可以用于抗新興RSV株的疫苗制劑。
本發(fā)明其它的方面，被修飾為表達免疫調(diào)節(jié)分子的重組RSV被容易地設(shè)計為具有不同病原的抗原決定簇的“載體”，所述病原包括多種RSV株或組(如人RSV A和B亞型)，人副流感病毒(HPIV)(包括HPIV1，HPIV2，HPIV3)，麻疹病毒以及其它病原(參見美國臨時專利申請60/170,195；美國專利申請09/458,813；美國專利申請09/459,062，分別在此引用作為參考)。多種實施方案中，該重組基因組或反基因組包含部分或完全的RSV“載體基因組或反基因組”，組合了編碼一個或多個異源病原的一個或多個抗原決定簇的一個或多個異源基因或基因組區(qū)段。該異源病原可能是異源RSV(即不同株或亞型的RSV)，該異源基因或基因組區(qū)段可能編碼RSV NS1，NS2，N，P，M，SH，M2(ORF1)，M2(ORF2)，L，F(xiàn)，或G蛋白或蛋白片段(如其免疫原結(jié)構(gòu)域或表位)。例如，該載體基因組或反基因組可能是部分或完全的RSV A基因組或反基因組，該異源基因或基因組區(qū)段可能編碼RSV B亞型病毒的抗原決定簇。
其它實施方案中，RSV載體基因組或反基因組是部分或完全的牛RSV(BRSV)基因組或反基因組，編碼抗原決定簇的異源基因或基因組區(qū)段是一個或多個人RSV(HRSV)的基因或基因組區(qū)段。例如，部分或完全的BRSV基因組或反基因組包含編碼選自F、G和SH的一個或多個HRSV糖蛋白基因的一個或多個基因或基因組區(qū)段，或編碼HRSV F、G和/或SH的胞質(zhì)尾，跨膜區(qū)，胞外域或其免疫原性表位部分的一個或多個基因組區(qū)段。
其它實施方案中，作為攜帶異源抗原決定簇的“載體”的被修飾為表達免疫調(diào)節(jié)分子的RSV，包含非RSV病原(如人副流感病毒(HPIV))的一個或多個抗原決定簇。一個實施方案中，編碼一個或多個HN和/或F糖蛋白或其免疫原結(jié)構(gòu)域，片段或表位的一個或多個HPIV1，HPIV2，或HPIV3基因或基因組區(qū)段，被添加于或引入部分或完全的HRSV載體基因組或反基因組內(nèi)。更詳細的實施方案中，包含HPIV1，HPIV2，或HPIV3 HN或F基因讀碼框(ORF)的一個轉(zhuǎn)錄單位被添加或引入嵌合的HRSV載體基因組或反基因組內(nèi)。
其它實施方案中，被修飾為表達免疫調(diào)節(jié)分子的RSV的重組基因組或反基因組包含部分或完全的HRSV或BRSV基因組或反基因組和異源病原，其選自麻疹病毒、呼吸道合胞病毒的亞型A和B、腮腺炎病毒、人乳頭瘤病毒、人免疫缺陷病毒1型和2型、單純皰疹病毒、巨細胞病毒、狂犬病病毒、EB病毒、線狀病毒、布尼亞病毒、黃病毒、甲病毒和流感病毒。基于這些模式候選病原，異源抗原決定簇選自麻疹病毒HA和F蛋白、呼吸道合胞病毒的亞型A和B的F、G、SH和M2蛋白、腮腺炎病毒HN和F蛋白、人乳頭瘤病毒L1蛋白、人免疫缺陷病毒1型或2型的gp160蛋白、單純皰疹病毒和巨細胞病毒的gB、gC、gD、gE、gG、gH、gI、gJ、gK、gL和gM蛋白、狂犬病病毒G蛋白、EB病毒gp350蛋白、線狀病毒G蛋白、布尼亞病毒G蛋白、黃病毒E和NS1蛋白、和甲病毒E蛋白，以及其抗原結(jié)構(gòu)域、片段和表位。一個實施方案中，該異源病原是麻疹病毒，異源抗原決定簇選自麻疹病毒HA和F蛋白，以及其抗原結(jié)構(gòu)域、片段和表位。包含麻疹病毒HA基因讀碼框(ORF)的一個轉(zhuǎn)錄單位被添加或引入嵌合的HRSV載體基因組或反基因組內(nèi)，以獲得這種嵌合構(gòu)建體。
本發(fā)明所有包括構(gòu)建嵌合RSV的實施方案中，異源或“供體”多核苷酸對受體或“背景”基因組或反基因組的添加或替代，可能僅涉及供體目的基因的一部分。一般，如順式作用調(diào)節(jié)元件和基因間隔區(qū)這樣的非編碼核苷酸不需要和供體基因編碼區(qū)一起轉(zhuǎn)移。因此特定基因的編碼序列(如部分或完全的讀碼框(ORF))可被添加或替代于部分或完全的背景基因組或反基因組中，受與供體序列對應(yīng)的或不同的基因異源啟動子(如背景基因組或反基因組中存在的啟動子)控制之下。多種其它基因組區(qū)段提供了有用的供體多核苷酸，可引入嵌合基因組或反基因組內(nèi)，表達具有新的有用性狀的嵌合RSV。例如異源基因組區(qū)段可編碼來自人或牛RSV選定蛋白的部分或全部的糖蛋白胞質(zhì)尾區(qū)，跨膜結(jié)構(gòu)域或胞外域，表位或區(qū)域，結(jié)合位點或具有結(jié)合位點的區(qū)域，活性位點或具有活性位點的區(qū)域等。這些或其它基因組區(qū)段可以添加到完全的背景基因組或反基因組中，或替代其對應(yīng)的基因組區(qū)段，產(chǎn)生新的嵌合RSV重組體。某些重組體將表達一種嵌合蛋白，如具有一種RSV胞質(zhì)尾區(qū)和/或跨膜結(jié)構(gòu)域與另一種RSV胞外域融合的嵌合蛋白。
本發(fā)明其它詳細的方面，重組RSV基因組或反基因組中，改變一個或多個基因或基因組區(qū)段的相對基因次序或空間位置，創(chuàng)造或改變了被修飾為表達免疫調(diào)節(jié)分子的RSV，以產(chǎn)生在人和其它哺乳動物中具感染性，減毒并具有免疫原性的重組疫苗病毒(Krempl等2000年6月23日的美國臨時專利申請“從近啟動子基因表達保護性抗原的呼吸道合胞病毒”，案卷號015280-424000US，在此引用作為參考)。本發(fā)明這些重組RSV典型地包含主要核殼蛋白(N)，核殼磷蛋白(P)，大聚合酶蛋白(L)，RNA聚合酶延伸因子，以及部分或完整的重組RSV基因組或反基因組，其在重組基因組或反基因組中具有一個或多個位置移動了的RSV基因或基因組區(qū)段。本發(fā)明的某些方面，該重組RSV的特征是位置移動的一個或多個基因或基因組區(qū)段，可能因移位的一個或多個多核苷酸在部分或完整的重組RSV基因組或反基因組中的插入、缺失或重排，被移動到遠離或靠近啟動子的位置。替位多核苷酸可能插入或重排到重組基因組或反基因組非編碼區(qū)(NCR)內(nèi)，或作為一個獨立的基因單位(GU)引入重組RSV基因組或反基因組中。
本發(fā)明模式實施方案中，分離的感染性重組RSV通過一個或多個替位多核苷酸的添加、缺失或重排構(gòu)建，替位多核苷酸選自以下一個或多個RSV基因或基因組區(qū)段，其選自RSV NS1、NS2、N、P、M、SH、M2(ORF1)、M2(ORF2)、L、F和G基因或基因組區(qū)段，以及RSV基因組和其片段的前導(dǎo)、非轉(zhuǎn)錄尾和基因間隔區(qū)域。其它更詳細的實施方案中，重組RSV基因組或反基因組中多核苷酸的添加，缺失或重排的元件選自一個或多個牛RSV(BRSV)或人RSV(HRSV)的基因或基因組區(qū)段，選自RSV NS1、NS2、N、P、M、SH、M2(ORF1)、M2(ORF2)、L、F和G基因或基因組區(qū)段，以及RSV基因組或其片段的前導(dǎo)、非轉(zhuǎn)錄尾和基因間隔區(qū)域。
本發(fā)明某些方面，替位的多核苷酸被插入，以形成重組RSV基因組或反基因組，創(chuàng)造或添加引入編碼細胞因子的該核苷酸中的突變。以這種方式插入的替位多核苷酸，使重組基因組或反基因組內(nèi)一個或多個“已經(jīng)被移動的”RSV基因或基因組區(qū)段移向，與野生型RSV(如HRSV A2或BRSV kansas株)基因組或反基因組相應(yīng)基因或基因組區(qū)段的位置相比，更加接近啟動子的位置。
或者，替位多核苷酸可在本發(fā)明重組RSV內(nèi)缺失，形成重組RSV基因組或反基因組，以容納或補充編碼細胞因子的基因的引入。文中重組基因組或反基因組內(nèi)替位多核苷酸的缺失使一個或多個“已經(jīng)被移動的”RSV基因或基因組區(qū)段，與野生型RSV內(nèi)相應(yīng)基因或基因組區(qū)段的位置相比，移向更加接近啟動子的位置。從編碼細胞因子的重組RSV中缺失的替位多核苷酸選自RSV NS1，NS2，SH，M2(ORF2)或G基因中的一種或多種或其基因組區(qū)段。
本發(fā)明更詳細的實施方案中，包含RSV NS1基因的替位多核苷酸被缺失，形成重組RSV基因組或反基因組?；蛘撸琑SV NS2基因的替位多核苷酸被缺失，形成重組RSV基因組或反基因組?；蛘撸琑SV SH基因的替位多核苷酸被缺失，形成重組RSV基因組或反基因組?；蛘撸琑SV M2(ORF2)基因的替位多核苷酸被缺失，形成重組RSV基因組或反基因組?；蛘?，包含RSV G基因的替位多核苷酸被缺失，形成重組RSV基因組或反基因組。
其它實施方案中，包含RSV基因或基因組區(qū)段的多種替位多核苷酸，在表達細胞因子的突變RSV中缺失。例如，RSV F和G可同時缺失，使具有編碼免疫調(diào)節(jié)分子的基因插入序列的重組RSV基因組或反基因組進一步被修飾?；蛘逺SV NS1和NS2可同時在重組RSV基因組或反基因組中缺失?；蛘逺SV SH和NS2可同時在重組RSV基因組或反基因組中缺失。或者，RSV SH，NS1和NS2可同時在重組RSV基因組或反基因組中缺失。
本發(fā)明不同的實施方案中，提供編碼細胞因子或其它免疫調(diào)節(jié)分子的分離的感染性重組RSV，其中，一個或多個替位多核苷酸在重組RSV基因組或反基因組內(nèi)的添加、缺失或重排，引起已被移動的一個或多個RSV基因或基因組區(qū)段的位置移動。這些修飾中，基因和基因組區(qū)段的插入和重排，與相應(yīng)(人或牛)的野生型RSV基因組或反基因組內(nèi)客體(被插入或重排)基因或基因組區(qū)段的相應(yīng)位置相比，使客體基因或基因組區(qū)段引入或重排于更靠近或更遠離啟動子的位置?？稍谥亟MRSV基因組或反基因組中添加，替代或重排的移位多核苷酸選自RSV NS1，NS2，SH，M2(ORF2)，F(xiàn)和/或G基因中的一種或多種或基因組區(qū)段。
更詳細的實施方案中，選擇在重組基因組或反基因組中插入或重排的替位多核苷酸，包括編碼一個或多個RSV糖蛋白，或RSV糖蛋白免疫原結(jié)構(gòu)域，或表位的一個或多個RSV基因或基因組區(qū)段。模式實施方案中，替位多核苷酸選自編碼RSV F、G和/或SH糖蛋白中的一個或多個或其免疫原結(jié)構(gòu)域或表位。例如，選自F、G和SH的一個或多個RSV糖蛋白基因，可在重組RSV基因組或反基因組中，被添加、替代或重排到與該基因在野生型中的基因排列位置相比，更加接近或遠離啟動子的位置。
模式實施方案中，RSV糖蛋白基因G，在重組RSV基因組或反基因組中重排到與G在野生型中的基因排列位置相比，更加接近啟動子的位置。更詳細的方面，RSV糖蛋白基因G被移動到所述重組RSV基因組或反基因組中基因排列位置1處。其它模式實施方案中，RSV糖蛋白基因F，在重組RSV基因組或反基因組中重排到更加接近啟動子的位置，例如F基因被移動到重組RSV基因組或反基因組中基因排列位置1處。另一些模式實施方案中，RSV糖蛋白基因G和F，在重組RSV基因組或反基因組中同時重排，與其在野生型中的基因排列位置相比，更加接近啟動子的位置。更詳細的方面，RSV糖蛋白基因G被移動基因排列位置1處，RSV糖蛋白基因F被移動到基因排列位置2處。
其它以糖蛋白基因移動為特點的構(gòu)建體中，產(chǎn)生重組的M2 ORF2缺失和剔除RSV，其具有選自F、G和SH的一個或多個RSV糖蛋白基因或其基因組區(qū)段，其添加，替代或重排到重組RSV基因組或反基因組中，其中RSV NS1、NS2、SH、M2(ORF2)或G基因中的一個或多個或其基因組區(qū)段缺失。因此，RSV F、G或SH的基因或基因組區(qū)段可被添加，替代或重排于這種背景中其中缺失了包含RSV NS1基因的替位多核苷酸，形成重組RSV基因組或反基因組?；蛘?，RSV F、G或SH的基因或基因組區(qū)段可被添加，替代或重排于這種背景中其中缺失了包含RSV NS2基因的替位多核苷酸，形成重組RSV基因組或反基因組?；蛘?，RSV F、G或SH的基因或基因組區(qū)段可被添加，替代或重排于這種背景中其缺失了包含RSV SH基因的替位多核苷酸，形成重組RSV基因組或反基因組。
一個實施方案中，RSV糖蛋白基因G，在缺失SH基因的重組RSV基因組或反基因組中，重排到與G在野生型中的基因排列位置相比，更加接近啟動子的位置。更詳細的方面，RSV糖蛋白基因G被移動到所述重組RSV基因組或反基因組中基因排列位置1處，其范例是以上引用文獻中的重組候選疫苗G1/ΔSH。其它實施方案中，RSV糖蛋白基因F，在缺失SH基因的重組RSV基因組或反基因組中，重排到與F在野生型中的基因排列位置相比，更加接近啟動子的位置。更詳細的方面，RSV糖蛋白基因F被移動到所述重組RSV基因組或反基因組中基因排列位置1處，其范例是以上引用文獻中的重組候選疫苗F1/ΔSH。另一模式實施方案中，RSV糖蛋白基因G和F，在缺失SH基因的重組RSV基因組或反基因組中同時重排，與G和F在野生型中的基因排列位置相比，更加接近啟動子的位置。更詳細的方面，RSV糖蛋白基因G被移動基因排列位置1處，RSV糖蛋白基因F被移動到基因排列位置1處，其范例是以上引用文獻中的重組候選疫苗G1F1/ΔSH。
提供了其它以選自F、G和SH的糖蛋白基因移動為特點的本發(fā)明中使用的基因移位RSV的例子，其產(chǎn)生于具有多個基因或基因組區(qū)段(選自RSV NS1，NS2，SH，M2(ORF2)，和G基因或基因組區(qū)段)缺失的重組RSV基因組或反基因組中(Krempl等2000年6月23日的美國臨時專利申請“從近啟動子基因表達保護性抗原的呼吸道合胞病毒”，案卷號015280-424000US，在此引用作為參考)。一個例子中，RSV SH和NS2基因都缺失，形成重組RSV基因組或反基因組，RSV糖蛋白基因G和F同時或其一，在重組RSV基因組或反基因組中重排到更加接近啟動子的位置。更詳細的方面，G被移動到基因排列位置1處，F(xiàn)被移動到基因排列位置2，其范例是以上引用文獻中的重組候選疫苗G1F1/ΔNS2ΔSH。另一個例子中，RSV SH，NS1和NS2基因都缺失，形成重組RSV基因組或反基因組，RSV糖蛋白基因G和F同時或其一，在重組RSV基因組或反基因組中重排到更加接近啟動子的位置，其范例是以上引用文獻中的重組候選疫苗G1F1/ΔNS1ΔNS2ΔSH。
##本發(fā)明其它方面中，被修飾表達細胞因子或其它免疫調(diào)節(jié)分子的基因移位RSV與人-牛嵌合RSV組合，或引入其中(Bucholz等2000年6月23日的美國專利申請“減毒的人-牛嵌合呼吸道合胞病毒的生產(chǎn)”，案卷號015280-398100US，和其優(yōu)先權(quán)美國臨時專利申請60/143,132，分別在此引用作為參考)。在這些方面中，該重組基因組或反基因組具有部分或完全的人RSV(HRSV)或牛RSV(BRSV)背景基因組或反基因組，其組合了來自不同RSV的一個或多個異源基因或基因組區(qū)段，形成人-牛嵌合RSV基因組或反基因組。來自不同HRSV或BRSV的異源基因或基因組區(qū)段在部分或完整HRSV或BRSV背景基因組或反基因組內(nèi)，被添加，替代或重排到與該基因或基因組區(qū)段在野生型中的基因排列位置相比，更加接近或遠離啟動子的位置。一個例子中，人RSV糖蛋白基因G和F分別在部分或完整BRSV背景基因組或反基因組內(nèi)基因排列位置1和2處，替代了在野生型中的基因排列位置7和8缺失的對應(yīng)G和F基因，其范例是重組病毒rBRSV/A2-G1F2。其它實施方案中，人RSV包膜相關(guān)基因(選自F，G，SH，M)被添加或替代到部分或完全的牛RSV背景基因組或反基因組內(nèi)。更詳細的方面，一個或多個人RSV包膜相關(guān)基因(選自F，G，SH，M)，被添加或替代到缺失了選自F，G，SH和M的包膜相關(guān)基因的部分牛RSV背景基因組或反基因組內(nèi)。一個實施方案中，人RSV包膜相關(guān)基因F，G和M被添加到缺失了所有的包膜相關(guān)基因F，G，SH，和M的部分或完全的牛RSV背景基因組或反基因組內(nèi)，其范例是重組病毒rBRSV/A2-MGF。
工程化引入本發(fā)明重組RSV的期望的表型改變包括，但不局限于，細胞培養(yǎng)時或選擇的宿主環(huán)境中減毒，對減毒表型回復(fù)的抗性，增強的免疫原性(如通過所誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的增強或降低確定)，選擇的病毒產(chǎn)物轉(zhuǎn)錄和/或翻譯的正調(diào)節(jié)或負調(diào)節(jié)等。本發(fā)明優(yōu)選的方面，產(chǎn)生工程化表達免疫調(diào)節(jié)分子的RSV，其中重組基因組或反基因組被進一步修飾，包含特定產(chǎn)生減毒表型或使進一步減毒表型的一個或多個突變。這些突變可重新產(chǎn)生，根據(jù)以上引用文獻所述的合理設(shè)計的誘變步驟，檢測其減毒效果?；蛘?，可從生物學(xué)來源的突變RSV中發(fā)現(xiàn)這些減毒突變，并引入本發(fā)明重組RSV。
表達一種或多種免疫調(diào)節(jié)分子的RSV疫苗株中引入的生物學(xué)來源RSV的減毒突變，可以天然存在，也可通過已知的誘變方法引入野生型RSV株。例如減毒RSV株可通過化學(xué)誘變產(chǎn)生，在細胞培養(yǎng)的病毒生長時加入化學(xué)誘變劑，選擇在低于最適溫度時傳代的病毒，以引入生長限制突變，或選擇在細胞培養(yǎng)中產(chǎn)生小噬菌斑或溫度敏感表型的突變病毒，方法一般見USSN08/327,263，在此引用作為參考。
“生物學(xué)來源的RSV”是指任何不通過重組方式產(chǎn)生的RSV。因此生物學(xué)來源RSV包括所有天然產(chǎn)生的RSV亞型和毒株，包括如具有野生型基因組序列的天然存在的RSV，和具有與參照野生型RSV序列有基因組差異的RSV，例如具有特異產(chǎn)生減毒表型的突變的RSV。同樣，生物學(xué)來源的RSV包括親本RSV經(jīng)非重組誘變和選擇方法獲得的RSV突變株(一般見國際申請WO93/21310，在此引用作為參考)。
在本發(fā)明使用的模式減毒RSV中，復(fù)制的溫度敏感水平，是通過比較其在許可溫度和在幾種限制性溫度時的復(fù)制來確定。將與其在許可溫度時相比，復(fù)制下降100倍或更多倍的最低溫度作為其截止溫度。在實驗動物和人中，RSV的復(fù)制和毒性都與該突變體截止溫度相關(guān)。截止溫度為39℃的突變體復(fù)制略有限制，而截止溫度為38℃的突變體的復(fù)制較低，疾病癥狀主要局限在上呼吸道。截止溫度為35℃到37℃的突變體典型地在猩猩中充分減毒，在人中顯著減毒。因此本發(fā)明ts型減毒RSV截止溫度范圍是約35℃到39℃，優(yōu)選35℃到38℃。ts突變添加到部分減毒株中產(chǎn)生適用于本發(fā)明疫苗組合物的多倍減毒的病毒。
利用多循環(huán)化學(xué)誘發(fā)突變向在冷傳代中已經(jīng)減毒的病毒中引入多個突變，發(fā)展了許多適合作為候選疫苗鼻內(nèi)給藥的減毒RSV株(如Connors等，Virology 208478-484，1995；Crowe等，Vaccine 12691-699，1994；Crowe等，Vaccine 12783-790，1994，在此引用作為參考)。在嚙齒類、猩猩、成人和幼兒中的檢測顯示，這些候選疫苗株的某些是相對遺傳穩(wěn)定、高免疫原性和滿意地減毒的。對這些減毒病毒中的一些進行的核苷酸序列分析顯示，減毒增加的每個水平都與特定核苷酸和氨基酸替代相關(guān)。上述引用文獻也公布了如何常規(guī)地區(qū)分沉默的偶發(fā)突變和產(chǎn)生因感染性RSV克隆基因組或反基因組中引入獨立或組合形式突變所產(chǎn)生的表型差異的突變。該過程還包括對親本和衍生病毒的表型特征進行評估，檢測出導(dǎo)致如減毒、溫度敏感、冷適應(yīng)、小噬菌斑和宿主范圍限制等這些期望性狀的突變。
這樣鑒定的突變被集結(jié)成一個“菜單”，可以按需要以單獨或組合形式引入，以調(diào)整表達細胞因子的重組RSV的相關(guān)性狀，如減毒、免疫原性、對減毒表型回復(fù)突變的遺傳抗性等。優(yōu)選的，本發(fā)明重組RSV通過至少一個、優(yōu)選兩個或多個此菜單中鑒別的減毒突變的引入而減毒，所述突變可被定義為生物學(xué)來源突變RSV株中一組已知突變，所述的突變RSV株優(yōu)選冷傳代(cp)和/或溫度敏感(ts)突變株，例如cpts RSV 248(ATCC VR 2450)；cpts RSV 248/404(ATCC VR2454)；cpts RSV 248/955(ATCC VR 2453)；cpts RSV 530(ATCC VR2452)；cpts RSV 530/1009(ATCC VR 2451)；cpts RSV 530/1030(ATCCVR 2455)；RSV B-1 cp52/2B5(ATCC VR 2542)；RSV B-1 cp23(ATCCVR 2579)(遵循布達佩斯條約，各材料保藏于美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)(10801 University Boulevard，Manassas，Virginia20110-2209，USA，并給出以上的保藏號)。
從該生物學(xué)來源的突變體模式組中，獲得了一個減毒突變的菜單，其中每個都可以與該組中其它任何減毒突變組合，在用于疫苗的表達免疫調(diào)節(jié)分子的重組RSV中調(diào)整減毒和其它期望表型的水平。其它突變可來自具有非ts和非cp減毒突變的RSV，如在小噬菌斑(sp)，冷適應(yīng)(ca)，或宿主范圍限制(hr)的突變株中所鑒定的。減毒突變可選擇在供體或受體RSV基因的編碼區(qū)或如順式調(diào)節(jié)序列的非編碼區(qū)。例如，減毒突變可能包括基因起始位點中一個或多個堿基突變，如M2基因起始序列中核苷酸7605處一個或多個堿基替代。
設(shè)計并選擇用做疫苗的本發(fā)明表達免疫調(diào)節(jié)分子的RSV常具有至少兩個，有時三個或更多個減毒突變，以獲得可廣泛地進行臨床應(yīng)用的滿意的減毒水平。一個實施方案中，至少一個減毒突變發(fā)生在RSV聚合酶基因中，涉及特定于該聚合酶蛋白的氨基酸改變的核苷酸替代，其特定產(chǎn)生溫度敏感表型(ts)。文中的重組體還包含大聚合酶基因L內(nèi)的核苷酸替代，導(dǎo)致氨基酸位點Asn43、Phe521、Gln831、Met1169或Tyr1321處的氨基酸改變，例如由Ile替代Asn43，由Leu替代Phe521，由Leu替代Gln831，由Val替代Met1169，由Asn替代Tyr1321。此外，本發(fā)明的重組RSV可能具有另一個RSV基因中的ts突變，如M2基因。優(yōu)選的，在特定于減毒突變的密碼子(如特定于ts突變的密碼子)內(nèi)引入兩個或多個核苷酸改變，由此降低減毒表型回復(fù)的可能。
與本發(fā)明的方法一致，可以容易地構(gòu)建和定性表達免疫調(diào)節(jié)分子的重組RSV，其包含至少一個到全部的生物學(xué)來源突變RSV株中發(fā)現(xiàn)的減毒突變。因此，突變可匯集成選定突變株中的突變組合，所述突變株如cpts RSV 248(ATCC VR 2450)；cpts RSV 248/404(ATCC VR2454)；cpts RSV 248/955(ATCC VR 2453)；cpts RSV 530(ATCC VR2452)；cpts RSV 530/1009(ATCC VR 2451)；cpts RSV 530/1030(ATCCVR 2455)；RSV B-1 cp52/2B5(ATCC VR 2542)；RSV B-1 cp23(ATCCVR 2579)。以這種方式，候選疫苗的減毒可以適當(dāng)?shù)卣{(diào)整用于一類或幾類患者，包括血清反應(yīng)陰性幼兒。
更具體的實施方案中，本發(fā)明選用做疫苗的重組RSV包含至少一個到全部的減毒突變，其特定產(chǎn)生溫度敏感或其它在RSV聚合酶基因L的Asn43、Phe521、Gln831、Met1169或Tyr1321處減毒的氨基酸替代，或在M2基因起始位點處溫度敏感性核苷酸替代?；蛘?，或附加性的，本發(fā)明重組RSV可能包含至少一個到全部的來自冷傳代減毒RSV的減毒突變，例如特定產(chǎn)生RSV N基因Val267、RSV F基因Glu218和/或Thr523、RSV聚合酶基因L Cys319或His1690處氨基酸替代的一個或多個突變。
其它更詳細的實施方案中，本發(fā)明重組RSV被進一步修飾，包含選自以下的突變(i)特定產(chǎn)生RSV聚合酶基因L的Gln831到Leu，和Tyr1321到Asn的溫度敏感的氨基酸替代的突變；(ii)M2基因起始序列中溫度敏感的核苷酸替代；(iii)特定產(chǎn)生來自冷傳代RSV中RSV N基因Val267到Ile，RSV聚合酶基因L Cys319到Tyr和His1690到Tyr的氨基酸替代的一組減毒突變；(iv)RSV SH、NS1、NS2、G、和M2-2基因中一個或多個的表達的缺失或消除。優(yōu)選，這些和其它表達免疫調(diào)節(jié)分子的RSV至少包含兩個來自生物學(xué)來源突變RSV的減毒突變，其可能源于相同或不同的生物學(xué)來源突變RSV株。也優(yōu)選，這些突變株具有經(jīng)特定針對突變的密碼子中的多個核苷酸改變使其穩(wěn)定的一個或多個減毒突變。
與以上說明一致，從cDNA中產(chǎn)生感染性RSV的能力使可以在表達細胞因子或其它免疫調(diào)節(jié)分子的RSV重組體中引入特定工程化的改變。特別的，使用感染性重組RSV鑒別生物學(xué)來源減毒RSV株中的特定突變，如特定產(chǎn)生ts、cp、att和其它表型的突變。因此檢測出期望的突變，引入重組RSV疫苗株中。從cDNA中產(chǎn)生病毒的能力許可將突變，單獨或以各種選擇的組合，常規(guī)地引入全長cDNA克隆中，隨后具有這些引入突變的拯救重組病毒的表型可被容易地確定。
通過檢測并向感染性RSV克隆中引入與期望表型(如cp或ts表型)相關(guān)的特定生物學(xué)來源的突變，本發(fā)明提供其它位于該檢出的突變處或位于其附近的位點特異性修飾。盡管生物學(xué)來源RSV產(chǎn)生的大多減毒突變是單核苷酸改變，其它“位點特異性”突變也可以通過重組技術(shù)引入生物學(xué)來源的或重組RSV中。此處所述位點特異性突變包括從1-3，直至約5-15或更多的改變的核苷酸(如改自野生型RSV序列，選定的突變RSV株的序列或接受誘變的親本重組RSV克隆)的插入，替代，缺失或重排。這些位點特異性突變可被引入選擇的生物學(xué)來源突變處或其區(qū)域內(nèi)?；蛘?，突變可被引入RSV克隆的各種其它序列中，如順式作用調(diào)節(jié)序列處或其附近，編碼蛋白活性位點、結(jié)合位點、免疫原性表位等的核苷酸序列處或其附近。使用微復(fù)制子系統(tǒng)可以促進有用突變的檢測。
位點特異性RSV突變體典型地保持其中期望的減毒表型，但也可能還有與減毒無關(guān)的改變的表型特征，如增強或擴大的免疫原性，和/或改善的生長。期望的位點特異性突變體的其他實例包括在特定于減毒突變的密碼子內(nèi)設(shè)計引入額外的穩(wěn)定核苷酸突變的重組RSV。如可能，在特定于減毒氨基酸變化的密碼子內(nèi)引入兩個或多個核苷酸替代，改變親本突變體或重組RSV克隆，產(chǎn)生對減毒表型的回復(fù)具有遺傳抗性的生物學(xué)來源的或重組的RSV。其它實施方案中，位點特異性核苷酸替代、添加、缺失或重排可引入相對于靶核苷酸位置的上游(N末端方向)或下游(C末端方向)例如從1-3、5-10直到15個核苷酸處或更接近5’和3’末端的位置，例如，以構(gòu)建或消除現(xiàn)存的順式作用調(diào)節(jié)元件。
除了單點和多點突變以及位點特異性突變外，表達免疫調(diào)節(jié)分子的重組RSV的改變包括整個基因或基因組區(qū)段的缺失，插入，替代或重排。基于變化的特點(即，少量堿基可能被改變以插入或消除免疫原性表位或改變一個小基因區(qū)段，而大片段的堿基參與基因或大的基因組區(qū)段的添加、替代、缺失或重排)，這些突變可以改動供體或受體基因組或反基因組中少量堿基(如，從15-30堿基，到35-50堿基或更多)，大段的核苷酸(如，50-100，100-300，300-500，500-1000堿基或更多)，或幾乎全部或全部基因(如，1000-1500，1500-2500，2500-5000核苷酸，500-65000個核苷酸或更多)。
本發(fā)明其它方面中，表達免疫調(diào)節(jié)分子的重組RSV被用做呼吸道瞬時基因治療的載體。根據(jù)這種實施方案，重組RSV基因組或反基因組被進一步修飾，包含編碼目的基因產(chǎn)物的多核苷酸。該目的基因產(chǎn)物的啟動子可以與控制RSV表達的相同或不同。由重組RSV基因組或反基因組與N，P，L，M2(ORF1)蛋白共表達產(chǎn)生并具有編碼目的基因產(chǎn)物的序列的感染性RSV被給藥患者。這可以是具有完全感染性的重組RSV(即，能夠感染培養(yǎng)細胞并產(chǎn)生感染性子代)，也可以是一種重組RSV，例如，其缺少G，F(xiàn)，和SH表面糖蛋白基因中一個或多個，可以在由穩(wěn)定或瞬時表達反式補充這些蛋白中一個或多個的細胞中增殖。這種情況時產(chǎn)生的重組病毒可有效感染，但不能有效地產(chǎn)生感染性顆粒。缺乏被表達的細胞表面糖蛋白也降低宿主免疫系統(tǒng)對排除感染細胞的效率。這些特點增加了外源基因表達的持續(xù)性和安全性。
在其它方面，本發(fā)明用于將來自生物學(xué)來源RSV的突變(如cp和ts突變)附加于重組RSV克隆中，在這進一步修飾的RSV克隆中伴隨有涉及相同或不同基因的其它類型突變。RSV編碼10個mRNA和11個蛋白。其中3個是跨膜表面蛋白，即，附著蛋白G，參與穿透的融合蛋白F，以及小疏水蛋白SH。G和F是病毒的主要中和和保護抗原。4種其它蛋白與病毒核殼有關(guān)，即，RNA結(jié)合蛋白N，磷蛋白P，大聚合酶蛋白L，和轉(zhuǎn)錄延伸因子M2 ORF1。M2 ORF也編碼M2-2蛋白，其是轉(zhuǎn)錄/翻譯調(diào)節(jié)因子?；|(zhì)蛋白M是內(nèi)毒粒的一部分，可能介導(dǎo)核殼和包膜間的相關(guān)性。最后是兩個非結(jié)構(gòu)蛋白NS1和NS2，功能未知。各蛋白都可選擇性地在表達水平被改變，或可整體或部分，單獨或與其它期望的修飾組合地添加，缺失，替代或重排于表達免疫調(diào)節(jié)分子的重組RSV中，以產(chǎn)生新的候選疫苗。
因此，除了來自生物學(xué)來源RSV突變體的減毒突變外，或與之組合，本發(fā)明也提供了減毒或改變工程化表達免疫調(diào)節(jié)分子的重組RSV的表型的方法—基于感染性RSV克隆的重組工程。編碼供體基因或基因組區(qū)段的分離的多核苷酸序列，或背景基因或反基因組上可產(chǎn)生多種改變，以引入感染性克隆。更特定的，本發(fā)明為了在重組RSV中獲得期望的結(jié)構(gòu)和表型改變，許可引入使來自親本基因組或反基因組中的一個選定核苷酸或多個核苷酸的缺失、替代、引入或重排的修飾，以及缺失、替代、引入或重排工程化表達免疫調(diào)節(jié)分子的重組RSV內(nèi)整個基因或基因組區(qū)段的突變。
根據(jù)本發(fā)明，期望的感染性RSV的修飾典型地被選擇為特定導(dǎo)致期望的表型改變，如病毒生長，溫度敏感，誘導(dǎo)宿主免疫應(yīng)答能力，減毒等的改變。這些改變可通過例如對親本RSV克隆誘發(fā)突變，以使特定基因或基因組區(qū)段(如編碼蛋白結(jié)構(gòu)域如胞質(zhì)、跨膜或胞外結(jié)構(gòu)域、免疫原性表位、結(jié)合位點、活性位點等或順式作用信號的基因組區(qū)段)消除、引入或重排，產(chǎn)生在供體或受體基因組或反基因組內(nèi)。這類目的基因包括RSV基因組的所有基因3’-NS1-NS2-N-P-M-SH-G-F-M21/M2-2-L-5’，以及其它RSV、其它病毒和此處所述多種其它非RSV來源的異源基因。
還提供了在工程化表達免疫調(diào)節(jié)分子的重組RSV內(nèi)引入的改變選擇基因表達的修飾，如，在選定RSV的編碼序列中引入終止子，改變RSV基因與可操作連接啟動子的相對位置，引入或去除上游起始密碼子以改變其表達速率，修飾翻譯起始位點，修飾(如，通過改變位置、變動現(xiàn)有序列或用一個異源序列替代現(xiàn)有序列)GS和/或GE轉(zhuǎn)錄信號以改變其表型(如生長和轉(zhuǎn)錄時的溫度限制等)，和其它特異導(dǎo)致如病毒復(fù)制、選定基因的轉(zhuǎn)錄或選定蛋白的翻譯在程度或性質(zhì)上改變的缺失、替代、添加和重排。
在工程化表達免疫調(diào)節(jié)分子的重組RSV內(nèi)分析和引入其它類型減毒突變以發(fā)展疫苗的能力，延伸到在RSV克隆中廣泛的靶改變。例如，SH基因的缺失產(chǎn)生了具有新表型特征的重組RSV，包括增強的生長。本發(fā)明中，SH，NS1，NS2或G基因(或任何其它被選擇的非必需基因或基因組區(qū)段)在重組RSV中缺失，其可能也包括其它特定導(dǎo)致產(chǎn)生減毒表型的突變，如生物學(xué)來源減毒RSV突變體中的一個或更多突變。模式實施方案中，SH，NS1，NS2或G基因缺失與來自cpts248/404，cpts530/1009，cpts530/1030或其它選擇的重組RSV株的一個或多個cp和/或ts突變組合，或與其它經(jīng)驗性確定的改變組合，由于不同突變的組合效果，產(chǎn)生的重組RSV病毒產(chǎn)量增加，減毒性增強，并抗表型回復(fù)。
任何在生長中不必需的RSV基因，如SH，NS1，NS2或G基因，可以在重組RSV中被消除或修飾，以產(chǎn)生期望的效果，如毒性，病原性，免疫原性，和其它表型特征。例如，非必需基因(如SH)的缺失導(dǎo)致病毒在培養(yǎng)中生長增強。不希望受理論的束縛，該效果可能部分因為病毒基因組核苷酸長度的減少。以一個SH-負型克隆為例，修飾的病毒基因組長為14,825nt，比野生型短398個核苷酸。在RSV基因組其它編碼或非編碼區(qū)內(nèi)工程改造那些降低基因組大小的相似突變，如在P，M，F(xiàn)，和M2基因內(nèi)，本發(fā)明提供了改善RSV生長的幾種易得的方法和材料。
此外，RSV基因組或反基因組中可產(chǎn)生多種其它遺傳改變，單獨或與來自生物學(xué)來源突變RSV中的一個或多個減毒突變組合，引入工程化表達免疫調(diào)節(jié)分子的重組RSV內(nèi)。其它的異源基因和基因組區(qū)段(如來自不同RSV基因，不同RSV株或型，或非RSV來源)可以整體或部分插入，基因排序被改變，基因重疊被消除，RSV基因組啟動子由其反基因組的對應(yīng)物替代，基因的部分被消除或替代，甚至整個基因被缺失。可在序列中制造不同或額外的修飾，以使操作更便利，如在各種基因間隔區(qū)域或其它地方插入唯一的限制性位點。可消除不翻譯的基因序列，以增加插入外源基因的能力。
本發(fā)明還提供了在工程化表達免疫調(diào)節(jié)分子的重組RSV內(nèi)的遺傳修飾，其改變或消除選定基因或基因組區(qū)段的表達，但未從RSV克隆中消除該基因或基因組區(qū)段。例如，可通過引入移碼突變，或在選擇的編碼序列引入終止密碼子，改變基因的位置，或引入上游起始密碼子以改變其表達速率，或改變GS和/或GE轉(zhuǎn)錄信號以改變表型(如生長，轉(zhuǎn)錄的溫度限制)。本發(fā)明更詳細的方面，提供了工程化表達免疫調(diào)節(jié)分子的重組RSV，其中在翻譯水平消除了NS2基因的表達，但基因或其區(qū)段未被去除，如通過在翻譯讀碼框(ORF)中引入兩個串聯(lián)翻譯終止子。這產(chǎn)生其中選定的基因在翻譯水平沉默但未缺失的活的病毒。這種形式的剔除病毒在組織培養(yǎng)時表現(xiàn)生長速率降低和噬菌斑尺寸減小。因此，這些方法提供了其它新型的減毒突變，消除非主要病毒保護抗原之一的病毒基因表達。文中，在未缺失基因或基因組區(qū)段情況下產(chǎn)生的剔除突變表型，也可通過此處所述的缺失誘變產(chǎn)生，有效地排除可能恢復(fù)靶蛋白合成的糾正性突變。引入工程化表達免疫調(diào)節(jié)分子的重組RSV內(nèi)的幾種其它基因剔除突變，使用本領(lǐng)域內(nèi)熟知的設(shè)計方案和方法進行(參見，如，Kretschmer等，Virology216309-316，1996；Radicle等，Virology 217418-412，1996；Kato等，EMBOSS J.16178-587，1987；Sckhneider等，Virology 277314-322，1996，分別在此引用作為參考)。
可用于本發(fā)明重組RSV中的其它突變包括針對順式作用信號的突變，這可以例如利用RSV微基因組突變分析檢測出。例如對前導(dǎo)序列、非轉(zhuǎn)錄尾序列和側(cè)翼序列的插入和缺失分析檢測出病毒的啟動子和轉(zhuǎn)錄信號，并提供了一系列與RNA復(fù)制或轉(zhuǎn)錄下降的各種水平相關(guān)的突變。該順式作用信號的飽和誘變(每個位點輪流改為各種核苷酸)也檢測出許多降低(或者，在一例中為增加)RNA復(fù)制或轉(zhuǎn)錄的突變。任何這些突變都可插入此處所述的基因組或反基因組中，使工程化表達免疫調(diào)節(jié)分子的重組RSV被進一步修飾。利用RSV微基因組，可輔助完整的反基因組cDNA對反式作用蛋白和順式作用RNA序列的評價和操作(參見，如，Grosfeld等，J.Virol.695677-5686，1995，在此引用作為參考)，這種依賴輔助的狀態(tài)對于過于抑制而在非復(fù)制依賴性的感染性病毒中難以回收的突變的定性是有用的。
可引入工程化表達免疫調(diào)節(jié)分子的重組RSV內(nèi)的其它突變包括基因組3’末端被其反基因組的對應(yīng)部分替代，隨之改變了RNA復(fù)制和轉(zhuǎn)錄。此外，利用此處所述方法，可以將基因間隔區(qū)縮短或延長，或改變序列內(nèi)容(Collins等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.834594-4598，1986，分別在此引用作為參考)，自然存在的基因重疊可以被去除，或改變?yōu)椴煌幕蜷g隔區(qū)(Collins等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.845134-5138，1987，分別在此引用作為參考)。一個模式實施方案中，特定RSV蛋白(如保護性F和G抗原)的表達水平可因其天然序列被合成并設(shè)計的符合有效翻譯的序列替代而增加。文中顯示，密碼子的使用是哺乳動物病毒蛋白翻譯水平的主要影響因素(Haas等，CurrentBiol.6315-324，1996，在此引用作為參考)。對編碼RSV F和G蛋白(二者是主要保護性抗原)的mRNA中使用的密碼子的檢測發(fā)現(xiàn)，這種密碼子使用導(dǎo)致低效的表達。因此，通過本發(fā)明的重組方法，使用最適的密碼子，可使所選擇基因的表達增加。其它模式實施方案中，選定的RSV基因翻譯起始位點周圍的序列(優(yōu)選包括-3位置的核苷酸)被單獨或與引入的上游起始密碼子組合，通過對翻譯的正或負調(diào)節(jié)，調(diào)節(jié)RSV基因的表達。
作為一種選擇，或與此處所述的其它RSV改變相組合，通過改變該病毒一個選定基因的轉(zhuǎn)錄GS信號可以調(diào)節(jié)被工程改造為表達免疫調(diào)節(jié)分子的重組RSV。一個模式實施方案中，改變了NS2的GS信號，在其中引入一個確定的突變(如此處所述的404(M2)突變)，對于病毒的復(fù)制添加一個ts限制。
其它實施方案中，工程化表達免疫調(diào)節(jié)分子的重組RSV的基因表達調(diào)節(jié)發(fā)生在轉(zhuǎn)錄水平。一個方面中，可將RSV基因圖譜中選定基因的位置改為更為接近或遠離啟動子，從而該基因的表達將分別更高效或更低效。根據(jù)這方面，特定基因的表達得以調(diào)節(jié)，產(chǎn)生比野生型水平降低或增加2倍，更典型的是4倍，上至10倍或更高的基因表達，同時其交互地位置替代基因的表達水平有相當(dāng)量的下降。一個實例中，NS2(RSV基因圖譜中排序為2)替代了SH基因(第6位)的座位，產(chǎn)生了可預(yù)期的NS2表達的降低。其它模式實施方案中，F(xiàn)和G基因單獨或同時轉(zhuǎn)移到RSV基因圖譜中更為接近或遠離啟動子的位置，分別使基因表達增加和降低。這些和其它移位變化產(chǎn)生具有減毒表型(如因參與RNA復(fù)制的選定病毒蛋白表達的降低)或其它期望表型(如抗原表達增加)的新的表達免疫調(diào)節(jié)分子的重組RSV。
本發(fā)明工程化表達免疫調(diào)節(jié)分子的感染性重組RSV也可根據(jù)這里公布的方法和組合物進行工程化，增強免疫原性并誘導(dǎo)比野生型RSV或親本RSV感染所提供的更強的保護。例如，來自RSV異源株或型或如PIV的非RSV來源的免疫原性表位可通過在編碼基因組或反基因組的多核苷酸序列上適當(dāng)?shù)暮塑账嶙兓患尤胫亟M克隆。另外，RSV可被工程化地加入或消除(如通過氨基酸插入、替代或缺失)免疫原蛋白、蛋白結(jié)構(gòu)域或與期望或不期望免疫反應(yīng)相關(guān)的特殊蛋白形式(如G蛋白分泌形式)。
本發(fā)明方法中，額外的基因或基因組區(qū)段可能被插入重組RSV基因組或反基因組中，或其附近。這些基因可與接受基因受相同的調(diào)控，或受一套獨立轉(zhuǎn)錄信號的調(diào)控。目的基因包括以上說明的RSV基因和非RSV基因。這能夠在數(shù)量和質(zhì)量上改變和提高抗RSV的免疫應(yīng)答。本發(fā)明一個模式實施方案中，異源基因或基因組區(qū)段，或非編碼的核苷酸序列，插入重組RSV基因組或反基因組中，導(dǎo)致基因組長度的期望的增加，引起額外的期望的表型效果?；蚪M長度的增加導(dǎo)致產(chǎn)生的RSV減毒，這部分取決于插入的長度。
工程化表達免疫調(diào)節(jié)分子的重組RSV內(nèi)缺失、插入、替代和其它涉及全部病毒基因或基因組區(qū)段改變的突變，產(chǎn)生非常穩(wěn)定的候選疫苗，這在免疫抑制個體中尤其重要。這些改變多數(shù)導(dǎo)致疫苗株的減毒，其它則特定導(dǎo)致不同類型的期望表型改變。例如，附屬(非體外生長所必需的)基因編碼特異地干擾宿主免疫的蛋白，是良好的候選疫苗(參見Kato等，EMBO J.16578-87，1997，在此引用作為參考)。疫苗病毒中消除這類基因?qū)⒔档投拘院椭虏⌒?，?或提高免疫原性。
本發(fā)明其它方面，從表達cDNA的基因組或反基因組中產(chǎn)生的表達免疫調(diào)節(jié)分子的感染性RSV，可能是任何RSV或類RSV毒株，如人，牛，或鼠等RSV，或是任何肺病毒，如小鼠的肺炎病毒、鳥類肺病毒(原名火雞鼻氣管炎病毒)。為了創(chuàng)造保護性免疫應(yīng)答，RSV株可能是對被免疫個體而言的內(nèi)源物質(zhì)，如用于免疫人的人RSV。但內(nèi)源RSV的基因組或反基因組也可被改變，以表達不同來源RSV基因或基因組區(qū)段的組合，如不同RSV種，亞型，或株的基因或基因組區(qū)段的組合，或一個RSV和另一個呼吸道病原(如PIV)的組合。
本發(fā)明的某些實施方案，提供了工程化表達免疫調(diào)節(jié)分子的重組RSV，其中人或牛RSV(如人RSV背景基因組或反基因組)內(nèi)的基因或基因組區(qū)段被來自非人、非牛的RSV(如鼠RSV)的對應(yīng)異源基因或基因組區(qū)段所替代。其中RSV基因或基因組區(qū)段的替代，缺失或添加包括NS1，NS2，N，P，M，SH，M2(ORF1)，M2(ORF2)，和L基因中一種或多種的部分或全部，或G和F基因的部分或全部，優(yōu)選其不包含主要中和和保護性表位。人或牛RSV順式作用序列，如啟動子或轉(zhuǎn)錄信號，也可被非人非牛的對應(yīng)序列所替代。因此，除牛RSV之外，將給藥于人的感染性重組RSV可以是被修飾的人RSV，其包含來自鼠RSV的基因。
人RSV的編碼序列(如NS1、NS2、SH或G的編碼序列)或非編碼序列(如啟動子，基因末端，基因起始，基因間隔區(qū)或其它順式作用元件)用對應(yīng)的牛RSV序列替代，產(chǎn)生具有多種可能的減毒和其它表型效果的嵌合RSV。特別的，宿主范圍和其它期望的表型效果來源于用在人RSV背景中替代的牛RSV基因，其中牛RSV基因在人細胞中不能有效發(fā)揮功能，如，因為異源序列或蛋白與生物相互作用的人RSV序列或蛋白(即，通常與被替代序列或蛋白協(xié)同作用于病毒的轉(zhuǎn)錄，翻譯，裝配等)的不相容性，或更典型的，在宿主范圍限制中，與細胞內(nèi)蛋白或細胞環(huán)境(這種環(huán)境在許可和許可度較低的宿主中是不相同的)的其它一些方面的不相容性。一個這種實施方案中，嵌合的牛-人RSV包含人RSV NP基因或基因組區(qū)段用對應(yīng)的牛NP基因或基因組區(qū)段替代，該嵌合體可任選地構(gòu)建為具有額外遺傳變化，如點突變或基因缺失。模式實施方案中，基于牛RSV結(jié)構(gòu)和功能的已知方面，選擇牛RSV序列引入人RSV中(Pastey等，J.Gen.Virol.76193-197，1993；Pastey等，Virus Res.29195-202，1993；Zamora等，J.Gen.Virol.73737-741，1992；Mallipeddi等，J.Gen.Virol.742001-2004，1993；Mallipeddi等，J.Gen.Virol.732441-2444，1992；Zamora等，VirusRes.24115-121，1992，分別在此引用作為參考，并于此處所述一致)。
本發(fā)明其它實施方案中，引入工程化表達免疫調(diào)節(jié)分子的重組RSV的目的突變，來自適應(yīng)組織培養(yǎng)的非病原性鼠肺病毒株(人RSV的鼠對應(yīng)物，其缺乏G蛋白的細胞質(zhì)尾區(qū))(Randhawa等，Virology207240-245，1995)。相應(yīng)的，本發(fā)明的一個方面，嵌合RSV內(nèi)的人RSV糖蛋白F，G和SH中的一個或多個的胞質(zhì)和/或跨膜結(jié)構(gòu)域可被添加，缺失，修飾，或被異源的對應(yīng)序列(如?；蚴驲SV F，G或SH蛋白的胞質(zhì)或跨膜結(jié)構(gòu)域)替代，以獲得期望的減毒。另一個例子，F(xiàn)蛋白剪切位點處或其附近的核苷酸序列，或G蛋白可能的附著區(qū)，可因點突變，位點特異性改變，或涉及整個基因或基因組區(qū)段的改變所修飾，使病毒在組織培養(yǎng)中的生長和/或感染性和病原性有新的效果。
本發(fā)明更詳細的方面，工程化表達免疫調(diào)節(jié)分子的重組RSV被用做其它病原的保護性抗原的“載體”，所述病原特別是如副流感病毒(PIV)的呼吸道病原。例如，重組RSV可被工程化引入編碼來自PIV的保護性抗原的序列，以產(chǎn)生感染性減毒疫苗病毒。PIV cDNA的克隆化和作為本發(fā)明補充的其它描述在以下文獻中表述名為“從克隆的核苷酸序列制備副流感病毒疫苗”的1998年5月22日的美國專利申請09/083,793(相應(yīng)于國際申請WO98/53078)，和其優(yōu)先權(quán)1997年5月23日的美國臨時專利申請60/047,575；名為“減毒人-牛嵌合副流感病毒疫苗”的1999年7月9日Bailly等的美國專利申請(案卷號15280-399000)，以及名為“通過缺失或消除非必需基因而減毒的人-牛嵌合副流感病毒疫苗”的1999年7月9日Durbin等的美國專利申請(案卷號15280-394000)，分別在此引用作為參考。這些公布包括對可用于產(chǎn)生感染性PIV病毒克隆，或提供用于本發(fā)明的PIV基因或基因組區(qū)段來源的載體p3/7(131)(ATCC97990)；p3/7(131)2G(ATCC97989)；p218(131)(ATCC97991)；遵循布達佩斯條約，各材料保藏于美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)(10801 UniversityBoulevard，Manassas，Virginia 20110-2209，USA，并給出以上的保藏號。
根據(jù)本發(fā)明這一方面，提供了這種工程化表達免疫調(diào)節(jié)分子的重組RSV，其包含至少一種PIV序列，例如包含來自PIV1和PIV2中任一或二者，或PIV1和PIV3中任一或二者的多核苷酸。RSV的單個基因可能被人PIV的對應(yīng)部分所替代，如PIV1，PIV2，或PIV3的F糖蛋白基因。或者，選擇的異源基因組區(qū)段(如，編碼胞質(zhì)尾，跨膜結(jié)構(gòu)域或胞外域的基因組區(qū)段)可能替代如RSV中同一基因的或RSV中不同基因的對應(yīng)基因組區(qū)段，或替代到RSV基因組或反基因組非編碼序列內(nèi)。一個實施方案中，HPIV3 F基因的一個基因組區(qū)段替代對應(yīng)的人RSV基因組區(qū)段，產(chǎn)生編碼嵌合蛋白的構(gòu)建體，這種嵌合蛋白如具有RSV胞質(zhì)尾和/或跨膜結(jié)構(gòu)域與PIV胞外域融合的融合蛋白，以產(chǎn)生新的減毒病毒，和/或同時抗PIV和RSV的多價疫苗?；蛘?，一個或多個PIV基因或基因組區(qū)段可以被添加到部分或完整的嵌合或非嵌合的RSV基因組或反基因組中。
除了上述對于工程化表達免疫調(diào)節(jié)分子的重組RSV的修飾外，可在RSV克隆中制造不同的或額外的修飾，以利于操作，如在各基因間隔區(qū)域或別處，插入唯一的限制性位點(如G和F基因間插入唯一的StuI位點)。不翻譯的基因序列可以被去除已增加容納外源基因的能力。
本發(fā)明其它方面中，提供了產(chǎn)生分離的感染性RSV疫苗病毒的組合物(如具有編碼工程化表達免疫調(diào)節(jié)分子的重組RSV的一個或多個cDNA的分離的多核苷酸和載體)。利用該組合物和方法，感染性RSV來自RSV基因組或反基因組，核殼蛋白(N)，核殼磷蛋白(P)，大的聚合酶蛋白(L)和RNA聚合酶延伸因子。本發(fā)明相關(guān)方面中，提供了將前述結(jié)構(gòu)和表型改變引入重組RSV中以產(chǎn)生感染性減毒的疫苗病毒的方法和組合物。
可利用多種已知方法，將之前定義的突變引入工程化表達免疫調(diào)節(jié)分子的重組RSV的感染性克隆中。關(guān)于DNA的“感染性克隆”，是指合成或其它來源的cDNA或其產(chǎn)物，其可轉(zhuǎn)錄出作為產(chǎn)生感染性病毒或亞病毒顆粒基因組的模板的基因組或反基因組RNA。因此，可以利用傳統(tǒng)方式(如定點誘變)將定義的突變引入基因組或反基因組的cDNA拷貝。使用基因組或反基因組cDNA的亞片段裝配此處所述的完整基因組或反基因組cDNA的優(yōu)勢是，每個區(qū)域都可以分別操作(越小的cDNA越易裝配)，因此易于裝配出完整cDNA。因此，該完整基因組或反基因組cDNA，或其任何亞片段可用作寡核苷酸定向誘變的模板。這可通過以下方式完成通過單鏈噬菌粒形式介導(dǎo)(如使用伯樂實驗室(Richmond，CA)的Muta-gene試劑盒)，或通過直接用雙鏈噬菌粒做模板(如使用Strategene(La Jolla，CA)的Chameleon誘變試劑盒)的方法，或通過用包含目的突變的寡核苷酸引物或模板中任何的一個進行聚合酶鏈式反應(yīng)。然后可以將一個突變的亞片段裝配于該完整基因組或反基因組cDNA中。還有許多已知并可得的產(chǎn)生突變的技術(shù)，可用于在RSV基因組或反基因組cDNA中產(chǎn)生目的突變。突變范圍不一，可以從單核苷酸改變到包含一個或多個基因或基因組區(qū)段的大cDNA片段的替代。
因此，在一個作為范例的實施方案中，利用伯樂的Muta-gene噬菌粒體外誘變試劑盒引入突變。簡述如下，編碼RSV基因組或反基因組一部分的cDNA克隆進質(zhì)粒pTZ18U中，并轉(zhuǎn)化CJ236細胞(LifeTechnologies)。按生產(chǎn)商的建議制備噬菌粒制劑。通過在該基因組或反基因組的需要位點引入一個改變的核苷酸，設(shè)計出用于誘發(fā)突變的寡核苷酸。擴增帶有遺傳改變的基因組或反基因組的質(zhì)粒，確認其序列，然后突變片段被重新引入該全長基因組或反基因組克隆。
在感染性RSV中引入確定的突變有多種應(yīng)用，包括RSV分子生物學(xué)和病原性分析。例如，引入消除或降低其表達水平的突變，或引入產(chǎn)生突變蛋白的突變，可以研究和操縱RSV蛋白的功能。以下的一個模式實施方案中，構(gòu)建了重組RSV，其中一個病毒基因(即SH基因)的表達因mRNA編碼序列和側(cè)翼轉(zhuǎn)錄信號的缺失而消除。令人驚訝的是，不僅該病毒可以回收，也可以在組織培養(yǎng)中有效生長。事實上，根據(jù)感染性病毒產(chǎn)量和噬菌斑大小，發(fā)現(xiàn)其生長顯著高于野生型的生長。本發(fā)明SH缺失和其它RSV衍生物在組織培養(yǎng)中增加的生長提供了發(fā)展RSV疫苗的有用工具，其克服了RSV病毒在組織培養(yǎng)中產(chǎn)量低的問題(在其它系統(tǒng)中疫苗病毒的生產(chǎn)較為棘手)。這種缺失高度穩(wěn)定地抗遺傳回復(fù)，使由此獲得的RSV克隆特別適合用做疫苗制劑。
本發(fā)明也提供了從分離的一種或多種多核苷酸分子(如一種或多種cDNA)產(chǎn)生工程化表達免疫調(diào)節(jié)分子的重組RSV。根據(jù)本發(fā)明，構(gòu)建編碼RSV基因組或反基因組的cDNA，使其與必需的病毒蛋白在細胞內(nèi)或體外共表達以形成感染性RSV?！癛SV反基因組”是指作為子代RSV基因組合成模板的分離的正義多核苷酸分子。優(yōu)選，構(gòu)建的cDNA是相應(yīng)于復(fù)制中間體RNA的正義RSV基因組或反基因組，以降低其與編碼產(chǎn)生轉(zhuǎn)錄復(fù)制核殼所必需蛋白的互補序列(即編碼N，P，L，和M2(ORF1)蛋白的序列)的正義轉(zhuǎn)錄本雜交的可能。RSV微基因組系統(tǒng)中，基因組或反基因組在拯救中有同樣的活性，無論由RSV或質(zhì)粒補充，顯示基因組或反基因組都可被使用，因此選擇可以基于方法學(xué)或其它來進行。
天然的RSV基因組典型地包含一種負義多核苷酸分子，其通過互補的病毒mRNA，編碼11個已知的病毒蛋白，即，非結(jié)構(gòu)蛋白NS1和NS2，N，P，基質(zhì)蛋白(M)，小疏水蛋白(SH)，糖蛋白(G)，融合蛋白(F)，M2(ORF1)，M2(ORF2)和L，主要說明于以下文獻(Mink等，Virology 185615-624，1991；Stec等，Virology 183273-287，1991；Connors等，Virology 208478-484，1995；Collins等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.9381-85，1996，分別在此引用作為參考。認為這11個蛋白中的一種或多種可能以獨特的結(jié)構(gòu)形式(可能具有功能差異)表達，一個或多個獨特蛋白種仍然未發(fā)現(xiàn)。
對本發(fā)明來說，重組RSV基因組或反基因組僅需要包含對所編碼的病毒或病毒顆粒的感染性所必需的基因或其部分。此外，該基因或其部分可以多于一種多核苷酸分子的形式提供，即，基因可以通過互補或類似方法來源于單獨的核苷酸分子，或可直接由基因組或反基因組cDNA表達。
重組RSV是指一種RSV或RSV類的病毒或亞病毒顆粒，其直接或間接來自重組表達系統(tǒng)，或由從重組表達系統(tǒng)中產(chǎn)生的病毒或亞病毒顆粒中增殖產(chǎn)生。該重組表達系統(tǒng)具有包含可操作地連接的轉(zhuǎn)錄單位的重組表達載體，該轉(zhuǎn)錄單位具有對RSV基因表達有調(diào)控作用的至少一個遺傳元件，如啟動子、可轉(zhuǎn)錄為RSV RNA的結(jié)構(gòu)或編碼序列，以及合適的轉(zhuǎn)錄起始和終止序列。
為了從已表達出cDNA的RSV基因組或反基因組中獲得感染性RSV，將該基因組或反基因組與那些在以下情況中必需的RSV蛋白共表達，這些情況為(i)產(chǎn)生可進行RNA復(fù)制的核殼；(ii)使子代核殼可進行RNA復(fù)制和轉(zhuǎn)錄。這種基因組核殼的轉(zhuǎn)錄提供了其它RSV蛋白，并引發(fā)有效感染。另外，共表達也可提供有效感染所須的其它RSV蛋白。
通過排列克隆的cDNA區(qū)段(其集合代表了完整的反基因組)，RSV mRNA或基因組RNA反轉(zhuǎn)錄拷貝的聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR述于美國專利4,683,195和4,683,202中和PCR方案方法和應(yīng)用指導(dǎo)(PCRProtocolsA Guide to Metheds and Applications.)，Innis等，學(xué)術(shù)出版社，San Diego，1990，分別在此全文引用作為參考)或同類，構(gòu)建用于本發(fā)明的RSV反基因組。例如，具有從合適的啟動子(如T7 RNA聚合酶啟動子)和與SH基因互補的前導(dǎo)序列開始的反基因組左手末端的cDNA，可以在適當(dāng)?shù)谋磉_載體中裝配，如質(zhì)粒(如pBR322)、各種可得的裝配型質(zhì)粒、噬菌體或DNA病毒載體。載體可通過誘變和/或合成多接頭的插入而被修飾，這種多接頭帶有便于裝配的唯一的限制性位點。例如，此處所述質(zhì)粒載體來源于pBR322，其PstI-EcoRI片段被一段具有方便的限制性酶位點的合成DNA所替代。pBR322做載體可以穩(wěn)定RSV序列的核苷酸3716-3732，否則其保持核苷酸的缺失或插入，質(zhì)粒在細菌菌株DH10B中繁殖，以避免核苷酸4499附近產(chǎn)生的人造的重復(fù)和插入。G，F(xiàn)，和M2基因可以裝配于分別的載體中，以便于制備，L和非轉(zhuǎn)錄尾序列也如此。反基因組質(zhì)粒的右手末端(如L和非轉(zhuǎn)錄尾序列)可根據(jù)要求包含額外的序列，如側(cè)翼的核酶和串聯(lián)T7轉(zhuǎn)錄終止子。核酶可以是錘頭型(產(chǎn)生具有單個非病毒核苷酸的3’末端) (如Grosfeld等，J.Virol.695677-5686，1995)，也可以是任何其它適合的核酶(如δ肝炎病毒的核酶，產(chǎn)生沒有非病毒核苷酸的3’末端)(Perrotts等，Nature 350434-436，1995)。一個中間片段(如G到M2片段)被插入前導(dǎo)區(qū)-SH質(zhì)粒上合適的限制性位點，該質(zhì)粒又是L-尾區(qū)-核酶-終止片段的受體，產(chǎn)生一個完整的反基因組。此處所述的一個模式例子中，前導(dǎo)區(qū)末端構(gòu)建為鄰近T7 RNA聚合酶的啟動子，其包括最優(yōu)活性所需的3個轉(zhuǎn)錄的G殘基；轉(zhuǎn)錄時貢獻這三個非病毒的G到該反基因組5’末端。3個非病毒的G殘基可被省略，以產(chǎn)生一個沒有非病毒殘基的5’末端。非轉(zhuǎn)錄尾區(qū)末端構(gòu)建到錘頭狀核酶附近，當(dāng)其剪切時，將貢獻一個單3’-磷酸化的U殘基到所編碼RNA的3’末端，產(chǎn)生一個呼正確的3’末端。
本發(fā)明的某些實施方案中，編碼生產(chǎn)轉(zhuǎn)錄和翻譯的RSV核殼中必需蛋白的互補序列由一種或多種輔助病毒提供。輔助病毒可以是野生型或突變型。優(yōu)選，該輔助病毒與RSV cDNA編碼的病毒在表型上可區(qū)分。例如，希望提供與該輔助病毒免疫反應(yīng)，而不與RSV cDNA編碼的病毒反應(yīng)的單克隆抗體。抗體可以是中和抗體。一些實施方案中，可使用抗體中和輔助病毒背景以便于重組病毒的檢出和回收，或利用抗體親和層析，將輔助病毒從重組病毒中分離?？蓪⑼蛔円隦SVcDNA，使該重組RSV與中和抗體無反應(yīng)性或?qū)ζ渚哂锌剐浴?br> 可在工程化表達免疫調(diào)節(jié)分子的重組RSV基因組或反基因組中制造各種核苷酸插入和缺失，以產(chǎn)生合適減毒的克隆。野生型人RSV基因組的核苷酸長度(15,222個核苷酸)是6的倍數(shù)，副粘病毒和麻疹病毒屬的成員典型地遵循“6規(guī)則”，即基因組(或微基因組)只有在其核苷酸長度是6的倍數(shù)(被認為是相對于包殼NP蛋白，核苷酸殘基精確間隔的要求)才能有效復(fù)制。單個殘基的增加對于RSV基因組長度的改變沒有復(fù)制效率的影響，傳代后對幾種不同微基因組突變體的序列分析顯示長度的差異因沒有補償性改變而保持。因此，RSV缺乏基因組長度作為6的倍數(shù)的限制要求，可以在RSV基因組中進行核苷酸插入或缺失而不破壞本發(fā)明重組RSV的復(fù)制。
構(gòu)建編碼工程化表達免疫調(diào)節(jié)分子的重組RSV基因組或反基因組的cDNA的其它方法，包括以改進PCR條件以使亞單位cDNA成分降低至一或兩個的反轉(zhuǎn)錄PCR(如，在Cheng等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 915695-5699，1994；Samal等，J.Virol.705075-5082，1996中所述的，在此引用作為參考)。其它實施方案中使用不同的啟動子(如T3，SP6)或不同的核酶(如δ肝炎病毒的核酶)。增殖可使用不同的DNA載體(如裝配型質(zhì)粒)，以更能容納大的基因組或反基因組。
RNA復(fù)制所必需的N，P，和L蛋白的進行性轉(zhuǎn)錄需要如M2(ORF1)蛋白的RNA聚合酶延伸因子。產(chǎn)生感染性RSV需要M2(ORF1)或在負鏈RNA病毒中基本上等價的轉(zhuǎn)錄延伸因子，其在有效感染過程中也是功能性核殼的成分之一。對M2(ORF1)蛋白的需要與其作為轉(zhuǎn)錄延伸因子是符合的。負鏈RNA病毒需要表達RNA聚合酶延伸因子蛋白是本發(fā)明的一個特點。M2(ORF1)可由完整M2-基因的表達提供，通過基因組或反基因組，或二者的共表達(盡管這種形式時第二個ORF2也可能表達，并因此對病毒的回收有抑制效果)。因此，對于利用完全的M2基因產(chǎn)生感染性病毒，應(yīng)平衡兩個ORF的活性，使M(ORF1)足量表達，提供轉(zhuǎn)錄延伸的活性，而M(ORF2)表達量少，不足以抑制RNA的復(fù)制?；蛘呖梢杂晒こ袒淖兊娜狈RF2或編碼缺陷型ORF2的cDNA提供ORF1蛋白。病毒生產(chǎn)的有效性可因額外病毒蛋白基因的共表達而提高，如編碼包膜組分的蛋白(即SH，M，G，F(xiàn)蛋白)。
為獲得工程化表達免疫調(diào)節(jié)分子的感染性重組RSV，編碼重組M2 ORF2缺失和剔除突變RSV基因組或反基因組的分離的多核苷酸(如cDNA)，被獨立或順式地與N，P，L，M2(ORF1)一同表達，包括從cDNA基因組或反基因組表達。該多核苷酸通過轉(zhuǎn)染、電穿孔、機械插入、轉(zhuǎn)導(dǎo)或其它類似方式插入合適的細胞，轉(zhuǎn)染細胞是能夠支持有效PIV感染的，如HEp-2、FRhL-DBS2、MRC和Vero細胞。分離的多核苷酸序列的轉(zhuǎn)染可通過磷酸鈣介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染(Wigler等，Cell14725，1978；Corsaro和Pearson，Somatic Cell Genetics 7603，1981；Graham和Van der Eb，Virology 52456，1973)、電穿孔(Neumann等，EMBO J.1841-845，1982)、DEAE-葡聚糖介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染(Ausubel等，ed.，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley and Sons，Inc.，NewYork，1987)、陽離子脂介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染(Hawley-Nelson等，F(xiàn)ocus 1573-79，1993)、或商業(yè)化轉(zhuǎn)染試劑LipofectACE(Life Technologies)引入培養(yǎng)細胞中(上述文獻在此全文引用作為參考)。
N，P，L和M2(ORF1)蛋白由一個或多個cDNA和表達載體編碼，或由二者組合編碼，表達載體可能與編碼該基因組或反基因組的相同，也可能不同。此外，一種或多種蛋白，特別是M2-1蛋白，可直接由該反基因組或基因組提供(Collins等，Virology 259251-258，1999，在此引用作為參考)。也可根據(jù)需要包含其它蛋白，由其自身載體編碼，或由編碼N，P，L或M2(ORF1)蛋白和/或該完整的基因組或反基因組的載體編碼。轉(zhuǎn)染質(zhì)粒中該基因組或反基因組和蛋白可由T7 RNA聚合酶啟動子控制下的各cDNA表達，而T7 RNA聚合酶啟動子又由T7 RNA聚合酶表達系統(tǒng)的感染，轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)導(dǎo)提供，例如表達T7 RNA聚合酶的痘苗病毒MVA株重組體(Wyatt等，Virology210202-205，1995，在此引用作為參考)。這些病毒蛋白和/或T7 RNA聚合酶也可通過轉(zhuǎn)染哺乳動物細胞，或構(gòu)造的mRNA或蛋白的轉(zhuǎn)染提供。
或者，反基因組或基因組的合成可以在體外(無細胞)組合的轉(zhuǎn)錄-翻譯反應(yīng)中進行，然后轉(zhuǎn)染細胞?；蛘叻椿蚪M或基因組RNA可以在體外合成，并轉(zhuǎn)染表達RSV蛋白的細胞。
根據(jù)本發(fā)明選擇候選疫苗病毒時，用已知的方法決定活性、減毒性和免疫原性的標(biāo)準。最希望用于本發(fā)明疫苗的病毒必須有活性，穩(wěn)定的減毒表型，在免疫宿主體內(nèi)有復(fù)制(即使水平低)，并在受接種者中有效地誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的產(chǎn)生，足以賦予對之后野生型病毒感染所導(dǎo)致的嚴重疾病的抵抗性。與基于其它已知的減毒RSV的報道結(jié)果相反，本發(fā)明的病毒不僅有活性，比先前的候選疫苗更適合地減毒，而且在體內(nèi)遺傳上更穩(wěn)定----仍具有刺激保護性免疫應(yīng)答的能力，有時，因多重修飾的存在可將這種保護擴展，如，誘導(dǎo)抗不同病毒株系或亞型的保護，或由不同的免疫基礎(chǔ)賦予這種擴展的保護，如分泌型與血清型免疫球蛋白，細胞免疫，以及其它類似情況。在本發(fā)明之前，ts表型在體內(nèi)復(fù)制后的遺傳不穩(wěn)定性對于ts病毒是非常普遍的(Murphy等，Infect.Immunol.37235-242，1982)。
使用許可RSV生長的多種細胞系，以繁殖工程化表達免疫調(diào)節(jié)分子的重組RSV，用做疫苗或其它方面。RSV可在多種人和動物細胞中生長。繁殖用于疫苗的減毒RSV病毒的優(yōu)選細胞系包括DBS-FRhL-2，MRC-5和Vero細胞。在表皮細胞系，如Vero細胞中，通?？色@得最高的病毒產(chǎn)量。典型的，細胞接種感染復(fù)數(shù)約0.001到1.0或更高的病毒，在許可病毒復(fù)制的狀態(tài)下培養(yǎng)，如約30-37℃培養(yǎng)約3-5天，或直到達到足夠的效價。病毒從細胞培養(yǎng)物中獲取，與細胞成分分離，典型的是通過已熟知的分離方法，如離心，并可能利用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法進一步純化。
工程化表達免疫調(diào)節(jié)分子的重組RSV，以及那些被滿意減毒和此處所述其它修飾的重組RSV，可以在多種被熟知并普遍認可的體內(nèi)和體外模型中檢測，以確認疫苗使用中的足夠減毒、對表型回復(fù)的抗性、和免疫原性。體外分析中，對修飾了的病毒(如多重減毒的，生物學(xué)來源，或重組RSV)測試如病毒復(fù)制的溫度敏感性(即ts表型)或小噬菌斑表型。修飾了的病毒進一步在RSV感染的動物模型中測試。在此引用的文獻中描述了多種動物模型(Meignier等編輯，呼吸道合胞病毒感染的動物模型(Animal Models of Respiratory Syncytial VirusInfection)，Merieux Foundation Publication，1991，在此引用作為參考)。US4,800,078和Prince等，Virus Res.3193-206，1985(在此引用作為參考)中描述了RSV感染的一種棉鼠模型，其被認為可預(yù)測在人和非人靈長類中的減毒和效果。此外，利用猩猩的RSV感染靈長類模型可預(yù)測其在人中的減毒和效果，以下文獻做了描述(Richardson等，J.Med.Virol.391-100，1978；Wright等，Infect.Immun.37397-400，1982；Crowe等，Vaccine 111395-1404，1993，分別在此引用作為參考)。
評價RSV候選疫苗的減毒和感染性的RSV模型系統(tǒng)(包括嚙齒類和猩猩)在本領(lǐng)域被廣泛認可，從中獲得的數(shù)據(jù)與RSV感染和減毒是非常一致的。對于候選疫苗在猩猩體內(nèi)生長較差的情況(如RSV亞型B病毒)，特別應(yīng)使用小鼠和棉鼠模型。
與以上所述一致并基于以下的實施例，本發(fā)明還提供含有用于疫苗的、工程化表達免疫調(diào)節(jié)分子的、分離的感染性重組RSV病毒的組合物。作為疫苗一個成分的減毒病毒是分離的和(典型的)純化的形式。分離的是指處于非野生型病毒所處的天然環(huán)境的RSV，如被感染人的鼻咽處。更常見的，分離的是指包括該減毒病毒為細胞培養(yǎng)或其它人工培養(yǎng)基成分，在其中其可復(fù)制，并在控制的背景下定性。例如，本發(fā)明的減毒RSV可在感染的細胞培養(yǎng)物中產(chǎn)生，從細胞培養(yǎng)物中獲得分離，并加入穩(wěn)定劑。
本發(fā)明RSV疫苗包含作為活性成分的按此處所述方法產(chǎn)生的具有效免疫原性量的RSV。生物學(xué)來源的或重組的RSV可直接用于疫苗制劑中，或冷凍干燥。凍干的病毒典型的保存在約4℃。使用前，凍干的病毒重溶于穩(wěn)定性溶液中(如鹽溶液、SPG、Mg++和HEPES)，也可能存在或不存在佐劑，以下將進一步說明。重組地修飾的病毒可與一種生理上可接受的載體和/或佐劑共同引入宿主。本領(lǐng)域已知的可用的載體有例如，水、緩沖的水、0.4％鹽、0.3％甘氨酸、透明質(zhì)酸等。得到的水溶液可以立即包裝使用，或冷凍干燥，凍干的制劑在給藥之前與無菌溶液混合，方法如上所述。根據(jù)要求，組合物可能包含藥學(xué)上可接受的輔助物質(zhì)以使其接近生理狀態(tài)，如pH調(diào)節(jié)和緩沖劑、滲漲度調(diào)節(jié)劑、濕潤劑等，例如乙酸鈉、乳酸鈉、氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣、脫水山梨糖醇單月桂酸酯、三乙醇胺油酸酯等?？山邮艿淖魟┌ū绢I(lǐng)域已知的不完全弗氏佐劑、磷酸鋁、氫氧化鋁或明礬。優(yōu)選的佐劑也包括StimulonQS-21(Aquila Biopharmaceuticals，Inc.，F(xiàn)armingham，MA)，MPL(3-O-去乙酰單磷酸脂質(zhì)A；RIBIImmunoChem Research，Inc，Hamilton，MT)和IL-12(遺傳研究所，劍橋，MA)。
用如上所述的重組RSV疫苗組合物經(jīng)噴霧、滴加、口服、局部或其它途徑免疫后，宿主的免疫系統(tǒng)產(chǎn)生特異于一種或多種RSV病毒蛋白(如F和/或G糖蛋白)的抗體作為應(yīng)答。接種后，宿主對RSV的感染具有至少部分或完全的免疫，或具有對輕微或嚴重PIV感染的抗性，尤其在下呼吸道中。
本發(fā)明RSV疫苗可包括減毒病毒，其誘導(dǎo)抗單RSV株或抗原亞型(如A或B)，或抗多個RSV株或抗原亞型的免疫應(yīng)答。文中，RSV可誘導(dǎo)單特異性的免疫應(yīng)答，或抗多種RSV株或抗原亞型的多特異性免疫應(yīng)答。此外，具有不同免疫原特性的RSV可組合成疫苗混合物，或在協(xié)同治療方案中分別給藥，以引發(fā)更有效的抗一個RSV毒株或抗多個RSV毒株或亞型的保護。
疫苗給藥的宿主可以是任何對RSV或其它近源病毒感染敏感，且能對接種病毒的抗原產(chǎn)生保護性免疫應(yīng)答的哺乳動物。因此，合適的宿主包括人，非人靈長類，牛，馬，豬，綿羊，山羊，兔，嚙齒類等。相應(yīng)的，本發(fā)明提供了制作多種用于人和動物的疫苗的方法。
包含工程化表達免疫調(diào)節(jié)分子的減毒重組RSV的疫苗組合物以“有效免疫原性量”給藥對RSV敏感或易受RSV感染攻擊的宿主，以誘導(dǎo)或增強該宿主抗RSV的免疫應(yīng)答能力。對人而言，本發(fā)明減毒的病毒的給藥依據(jù)成熟的人RSV疫苗方案，如以下文獻所述(Wright等，Infect.Immun.37397-400，1982；Kim等，Pediatrics 5256-63，1973；Wright等，J.Pediatr.88931-936，1976，分別在此引用作為參考)。簡述如下，成人或兒童經(jīng)鼻內(nèi)滴劑接種有效免疫原性量的RSV疫苗，典型地是在0.5ml生理可接受的稀釋劑或載體中。與腹膜內(nèi)免疫不復(fù)制性病毒相比，其簡單和安全。也提供對局部呼吸道免疫的直接刺激，這對RSV的抗性非常重要。此外，這種方式的免疫有效地避免了RSV特異的母體來源血清抗體的免疫抑制效果(典型地存在于極小的幼兒中)。RSV抗原的腹膜內(nèi)給藥有時產(chǎn)生免疫病理的并發(fā)癥，而這在活病毒中從未觀察到。
所有個體中，給藥的RSV精確劑量及給藥間隔和次數(shù)依賴于患者健康狀態(tài)和體重、給藥方式、制劑性質(zhì)等，但一般范圍是從每個患者約103-106噬菌斑形成單位(PFU)或更多PFU，如107-108PFU病毒，常見的是每個患者約104-105噬菌斑形成單位PFU的病毒。任何情況時，疫苗制劑應(yīng)提供足量的減毒RSV，以有效刺激或誘導(dǎo)抗RSV的免疫應(yīng)答，如可通過補體活化、噬菌斑中和和/或酶聯(lián)免疫分析，及其它方法進行確定。這方面，也需要監(jiān)視個體是否有上呼吸道疾病出現(xiàn)的跡象和癥狀。對給藥猩猩，該減毒的疫苗病毒在受接種者鼻咽中的復(fù)制水平，比野生性病毒低約10倍或更低，比不完全減毒RSV低約10倍或更低。
新生兒和幼兒中，需要多次給藥以誘導(dǎo)足夠水平的免疫。給藥開始于出生后第一個月，兒童期按需要間隔給藥，如隔2個月，6個月，1年，2年，以維持對天然(野生型)RSV感染的足夠抗性。相似的，對重復(fù)性或嚴重RSV感染特別敏感的成人可能需要多次免疫以建立和/或維持保護性免疫應(yīng)答，包括醫(yī)務(wù)工作者、護理工作者、家庭中有兒童的成員、老人、心肺功能損壞的個體。誘導(dǎo)的免疫水平可通過檢測中和分泌和血清抗體確定，并需要調(diào)整劑量或重復(fù)接種以維持合適的保護水平。進一步，不同的疫苗病毒給藥不同的受體組。例如，表達細胞因子或其它富含T細胞表位的蛋白的工程化RSV株可能特別適宜成人，而非幼兒?；蛘邔τ谀昀系氖芙臃N者選擇低水平的減毒的疫苗。根據(jù)本發(fā)明產(chǎn)生的RSV疫苗，可與表達其它RSV株或亞型抗原的病毒組合，達到抗多種RSV株或亞型的保護?；蛘撸撘呙绮《究蓪⒍喾NRSV株或亞型的保護性表位，工程化引入此處所述的一個RSV克隆中。
典型的，當(dāng)使用不同疫苗病毒時，將以混合物形狀同時給藥，但也可以單獨給藥。例如，兩種RSV亞型的F糖蛋白僅有約10％的氨基酸序列差異，這種相似性是免疫了RSV或F抗原并受一種異源株攻擊的動物中觀察到的交叉保護免疫應(yīng)答的基礎(chǔ)。因此，一種株系的免疫可產(chǎn)生抗相同或不同亞型的不同株的保護。但最佳的保護可能需要同時抗兩亞型的免疫。
工程化表達免疫調(diào)節(jié)分子的重組RSV可誘導(dǎo)抵抗因后來感染野生型RSV所產(chǎn)生的嚴重下呼吸道疾病(如肺炎和細氣管炎)的免疫應(yīng)答。盡管這種自然循環(huán)的病毒仍有感染性，特別在上呼吸道，其接種導(dǎo)致鼻炎發(fā)病幾率的降低，以及對后來的野生型感染增強的抗性。接種后，出現(xiàn)可檢測水平的宿主產(chǎn)生的可在體外和體內(nèi)中和同源(同一亞型)野生型病毒的血清和分泌型抗體。許多情況下宿主抗體也能中和不同的非疫苗亞型的野生型病毒。
本發(fā)明優(yōu)選的RSV候選疫苗顯示比在人體內(nèi)自然循環(huán)的野生型病毒顯著降低的毒性。該病毒足夠減毒使感染癥狀在大多數(shù)免疫個體中不發(fā)生。一些情況時，該減毒病毒仍然可能傳播到未經(jīng)免疫的個體中。但由于其毒性充分消除，在免疫和偶見宿主中不會發(fā)生嚴重的下呼吸道感染。
工程化表達免疫調(diào)節(jié)分子的重組RSV減毒水平的確定是通過例如定量被免疫宿主呼吸道中的病毒量，并將其與野生型PIV或其它被認為是候選疫苗株的減毒PIV的相應(yīng)量比較。例如，在高度敏感的宿主(如猩猩)上呼吸道中，本發(fā)明的減毒病毒復(fù)制與野生型病毒復(fù)制水平相比，被很大程度地限制，如降低5-10，20-50，100-1000倍或降低更多倍。減毒RSV疫苗株在猩猩上呼吸道中的復(fù)制水平比RSV A2ts-1突變體(之前的研究表明其在血清反應(yīng)陰性的幼兒中不完全減毒)低。為了進一步降低鼻液溢的發(fā)展(其與病毒在上呼吸道中的復(fù)制相關(guān))，一個理想的候選疫苗病毒應(yīng)表現(xiàn)在上和下呼吸道復(fù)制水平都降低的性質(zhì)。但為了賦予免疫個體以保護效果，本發(fā)明的減毒病毒應(yīng)在人中有足夠的感染性和免疫原性。確定RSV在感染宿主鼻咽中的水平的方法是本領(lǐng)域所熟知的。樣品獲自抽吸或沖洗鼻咽分泌物，病毒在組織培養(yǎng)或其它培養(yǎng)中通過實驗室方法定量。參見，如Belshe等，J.Med.Virology 1157-162，1977；Friedewald等，J.Amer.Med.Assoc.204690-694，1968；Gharpure等，J.Virol.3414-421，1969；Wright等，Arch.Ges.Virusforsch 41238-247，1973，分別在此引用作為參考?？煞奖愕貦z測宿主動物(如猩猩)鼻咽中的病毒。
有時可能需要將包含工程化表達免疫調(diào)節(jié)分子的重組RSV的本發(fā)明RSV疫苗，與誘導(dǎo)對其它物質(zhì)(特別是其它的兒童期病毒)抗性的保護性應(yīng)答的疫苗組合。例如，本發(fā)明的一個重組RSV可與PIV疫苗同時給藥，如Clements等所述(J.Clin.Microbiol.291175-1182，1991，在此引用作為參考)。本發(fā)明的另一方面，重組RSV可用做其它呼吸道病原如PIV的保護性抗原的載體，方法是在用于產(chǎn)生感染性RSV的RSV基因組或反基因組中引入編碼這些保護性抗原的序列。
以下為說明目的提供了一些實施例，并非是對本發(fā)明的限制。簡述如下實施例I構(gòu)建并定性表達γ干擾素的重組RSVγ干擾素(IFNγ)，一種II型干擾素，由T細胞和自然殺傷(NK)細胞產(chǎn)生，具有多種生物學(xué)效果(綜述參見文獻1和2)。IFNγ具有內(nèi)在的抗病毒活性，正調(diào)節(jié)主要組織相容性I型和II型分子的表達，激活巨噬細胞和NK細胞，對于T輔助(Th)細胞的增殖具有重要的調(diào)節(jié)作用?；诩毎蜃臃置诘姆绞剑瑓^(qū)分出兩個鼠Th細胞亞型Th1亞型，其標(biāo)志細胞因子包括IL-2和IFNγ，Th2亞型，其標(biāo)志包括IL-4，IL-5，IL6，和IL-10。IFNγ優(yōu)選的抑制Th2細胞的增殖，因此有利于Th1應(yīng)答。
本實施例中，構(gòu)建了一種感染性重組(r)人RSV(rRSV/mIFNγ)，其作為獨立基因插入到G-F基因間隔區(qū)編碼鼠(m)IFNγ。感染了rRSV/mIFNγ的培養(yǎng)細胞分泌的mIFNγ為22mg/106細胞。rRSV/mIFNγ在小鼠上下呼吸道中的復(fù)制比野生型(wt)RSV的分別降低63倍和20倍，而不是具有氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(CAT)基因作為添加基因的對照嵌合rRSV的復(fù)制。因此，體內(nèi)rRSV/mIFNγ減毒歸功于mIFNγ的活性，而非該添加基因本身的存在。小鼠對隨后野生型RSV的攻擊有完全的抗性。盡管其生長限制，rRSV/mIFNγ對小鼠的感染在第56天誘導(dǎo)RSV特異的抗體水平相當(dāng)于，或高于wt RSV感染所誘導(dǎo)的抗體水平。與通過wt RSV誘導(dǎo)相比，感染了rRSV/mIFNγ的小鼠在其肺部產(chǎn)生高水平的IFNγ mRNA和增加IL-12 p40 mRNA量，而其它被檢測的細胞因子mRNA沒有改變。由于RSV的減毒典型地伴隨有免疫原性的降低，由rRSV表達IFNγ代表一種減毒方法，其免疫原性可被保持而非降低。質(zhì)粒構(gòu)建利用寡核苷酸通過PCR方法將RSV基因起始和基因終止信號連接到mlFNγ cDNA上，TATA ATGGGGCAAAT (SEQ ID NO．1) (正義，XmaI位點黑體表示，RSV基因起始序列下劃線，特異于mIFNγ基因5’末端部分的序列斜體，起始密碼子為黑體斜體)，以及ATTA AATTTTTAATAACT (SEQ ID NO.2) (反義，XmaI位點黑體表示，RSV基因終止序列下劃線，特異于mlFNγ基因3’末端部分的序列斜體，終止密碼子的補碼為黑體斜體)。PCR產(chǎn)物克隆在質(zhì)粒pUC19中，確認其序列，再次克隆于先前所述反基因組質(zhì)粒D46/1024 XmaI位點中(13，圖1)。RSV特異性和Ig同種型特異性的酶聯(lián)免疫吸附分析(ELISA)覆蓋純化RSV F糖蛋白(4gg/ml)的96孔板于四倍稀釋度的小鼠血清共同培養(yǎng)，然后與以下生物素偶連的同種型特異性大鼠抗小鼠抗體(i)IgGlκ抗IgG1重鏈，(ii)IgG2aκ，異型IgΚ-1A，抗IgG2a重鏈，和(iii)IgM單克隆抗體克隆LO-MA-7抗IgA重鏈(精確化學(xué)和科學(xué)公司，NY)。平板與連接到堿性磷酸酶的鏈親和素(LifeTechnologies，MD)培養(yǎng)，然后與對硝基苯基磷酸溶液反應(yīng)(Sigma，MO)。試劑與指定同種型的特異性用抗以下商業(yè)來源的純化鼠單克隆抗體ELISA確認，SC)；IgG1(MOPC21)，IgG2a(RPC5)，IgG3(FLOPC21)(Cappel/Organon Teknika，PA)，IgG2b(MOPCI41)，IgA(TEPCI5)，和IgM(MOPCI04E)(Litton Bionetics，SC)。用被測試血清的稀釋液與F覆蓋的平板孵育，再與特異于小鼠IgG、并連接到堿性磷酸酶(Capple)的羊IgG孵育，最后與對硝基苯基磷酸溶液反應(yīng)，檢測總IgG。使用Vmax動力微效價讀取儀(Molecular Devices)進行ELISA測定。構(gòu)建和回收表達mIFNγ,的rRSV編碼mlFNγ的一個cDNA克隆被修飾，使其側(cè)翼為RSV基因起始和基因終止轉(zhuǎn)錄信號(圖1)。該嵌合的轉(zhuǎn)錄盒被插入反基因組cDNAD46的G-F基因間隔區(qū)，該區(qū)已被修飾，含有一個唯一的XmaI位點13.Bukreyev等，J.Virol.706634-6641，1996。具有mIFNγ插入的該嵌合RSV反基因組RNA全長15,729個核苷酸，編碼11個mRNA，從3’到5’的排列計算mIFNγ是第8個。如前所述，從轉(zhuǎn)染的cDNA中回收得到rRSV/mIFNγ(Collins等，Proc.Natl.Acad.Sci USA 9211563-11567，1995)。
rRSV/mIFNγ形成的噬菌斑大小與前述嵌合病毒rRSV/CAT(以前稱為D46/1024CAT))的相當(dāng)，Bukreyev等，J.Virol.706634-6641，1996，rRSV/CAT與rRSV/mIFNγ相同，區(qū)別僅在于其外源基因編碼氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(CAT)而非mIFNγ，并且其插入的長度略長(762對507核苷酸)。各嵌合病毒的噬菌斑大小略小于wt RSV的，但噬菌斑形態(tài)沒有區(qū)別。
感染了rRSV/mIFNγ或wt RSV的細胞中分離的多聚(A+)mRNA的Northern印跡分析表明，前者表達預(yù)期大小的mIFNγ mRNA。以前曾表明放在非片段化負鏈RNA病毒中的外源序列在細胞培養(yǎng)中非常穩(wěn)定(Schnell等，Proc.Natl.Acad.Sci USA 9311359-11365，1996；Bukreyev等，J.Virol.706634-6641，1996)。與之一致，在rRSV/mIFNγ8次傳代過程中，對mIFNγ基因的Northern印跡和反轉(zhuǎn)錄PCR分析證明其無缺失。體外rRSV/mIFNγ的生長和mIFNγ的生產(chǎn)在HEp-2細胞中比較rRSV/mIFNγ，rRSV/CAT，wt RSV的生長特征(圖2)。rRSV/CAT被選用作為額外的對照，因為其在相同的基因組位置具有相似大小的插入。這兩個嵌合病毒生長比wt RSV慢，最終效價也低。例如，rRSV/mIFNγ在感染后40小時獲得的最高效價為106.4PFU(噬菌斑形成單位)/ml，比較wt RSV在感染后48小時的最高效價為107.6PFU，顯示降低了16倍。
在感染后不同時間點，分析覆蓋感染rRSV/mIFNγ或rRSV/CAT的HEp-2細胞的培養(yǎng)基中mIFNγ(圖3)。感染后8小時(最早的檢測時間)mIFNγ的濃度為0.1ng/ml，40小時后為1.8mg/ml，在120小時達到最大值4.4mg/ml，相當(dāng)于22mg/106細胞。rRSV/mIFNγ在BALB/c小鼠中的復(fù)制，免疫原性和保護效率為評價rRSV/mIFNγ在體內(nèi)的復(fù)制，小鼠鼻內(nèi)感染106PFU的rRSV/mIFNγ、rRSV/CAT或wt RSV。動物在感染后3，4或5天被處死，噬菌斑分析測定病毒在上(鼻甲)、下(肺)呼吸道的濃度。rRSV/mIFNγ在上下呼吸道中的復(fù)制分別比wt RSV降低63倍和20倍(圖4)。相反，rRSV/CAT與wt RSV的復(fù)制無顯著區(qū)別，表明相當(dāng)大小的額外外源基因的存在其本身并不能使RSV復(fù)制在小鼠中減毒。
在第0，28，56天從感染了rRSV/mIFNγ、rRSV/CAT或wt RSV的小鼠中采集血清，并進行RSV特異性和抗體同種型特異性的ELISA分析和RSV中和分析(表1)。病毒誘導(dǎo)的IgA抗體水平?jīng)]有顯著不同。與感染wt RSV或rRSV/CAT的動物相比，感染rRSV/mIFNγ的小鼠中特異于RSV F蛋白的總IgG在第56天有顯著的增加(4倍)，而第28天沒有此現(xiàn)象。第28天病毒間IgG1抗體的效價無顯著差異，但第56天以rRSV/mIFNγ免疫小鼠IgG1的平均效價高于以wt RSV(倒數(shù)12.1 log2對9.3 log2；p＜0.05)或rRSV/CAT免疫小鼠。相反，第56天以rRSV/mIFNγ免疫小鼠IgG2a的平均效價與以wt RSV免疫小鼠相比降低了(9.6 log2對11.6 log2；p＜0.001)。與wt RSV和rRSV/CAT相比，以RSV/mIFNγ感染小鼠中和抗體效價在第28天有少量減低，但在第56天則偏高(12.3對11.6，log2；p＜0.2)。
為評價保護效率，第56天從上述組中取出5只小鼠，攻擊每只小鼠，在其鼻內(nèi)滴加106PFU的wt RSV。4天后處死小鼠，收集鼻甲和肺用于病毒定量分析。在先前感染rRSV/mIFNγ的小鼠中未檢測到攻擊病毒，在先前感染wt RSV的動物上呼吸道僅發(fā)現(xiàn)極低水平的復(fù)制。
表1.在第0(免疫前)，28，56天RSV血清抗體效價(倒數(shù)平均值log2±標(biāo)準誤差)a
a各組使用8只小鼠。第56天的抗體效價在獨立的分析中測定。
b由于個體樣品的高度多樣性，相對于wt RSV對照的差異在統(tǒng)計學(xué)上不顯著(斯氏t-檢驗)c，d，e，f與wt RSV對照相比斯氏t-檢驗計算統(tǒng)計學(xué)的差異cp＜0.05；αp＜0.001；ep＜0.02；fp＜0.2。肺細胞因子mRNA在感染了rRSV/mIFNγ或wt RSV的小鼠肺中檢測編碼所選的細胞因子的mRNA水平，以確定mIFNγ的mRNA合成水平是否增加，以及其合成是否影響其它Th1或Th2細胞因子mRNA的水平。感染了rRSV/mIFNγ、wt RSV或安慰劑的每組5只的小鼠在感染后1和4天被處死，或在第28天接受wt RSV攻擊的后1和4天(第29和32天)被處死。分離總的肺RNA，利用商品化的核糖核酸酶保護分析，測定選定細胞因子mRNA(圖5)。這種直接分析反映在特定時間目的位點上的mRNA濃度，并排除了由于收集細胞的體外操作所產(chǎn)生的可能假象。測定mRNA水平包括Th1標(biāo)志細胞因子IL-2和IFNγ，Th2的標(biāo)志細胞因子IL-4，IL-6，和IL-10，和IL-12 p40蛋白，其是IL-12異源二聚體的可誘導(dǎo)成分。
圖5是以所示病毒免疫后4天收集的5只動物肺部IFNγ和IL-12p40 mRNA的放射自顯影。在感染了rRSV/mIFNγ的動物中見到mIFNγ的累積增加，并且與感染wt RSV相比，感染了rRSV/mIFNγ的動物中IL-12 p40 mRNA有微量但也是統(tǒng)計學(xué)顯著的增加。用磷光計定量此處以及其它凝膠中的結(jié)果，各組5只小鼠的平均值用相同凝膠道中小鼠L-32管家基因mRNA的百分比來表示(圖6)。
wt RSV感染后1或4天觀察到(i)Th1細胞因子IFNγmRNA表達，但IL-2不表達；(ii)IL-12 p40 mRNA水平增加；和(iii)Th2細胞因子IL-6和IL-10 mRNA表達。rRSV/mIFNγ感染誘導(dǎo)的細胞因子模式類似wt RSV誘導(dǎo)，除了IFNγmRNA水平在第1和4天更高，尤其在第4天，并且IL-12 p40 mRNA水平在第1和4天也更高。因此，除了在IFNγ和IL-12 p40量的差異，wt RSV和rRSV/mIFNγ誘導(dǎo)相似的Th1和Th2細胞因子模式。病毒攻擊(第29和32天)后，免疫了wt RSV或rRSV/mIFNγ的小鼠與模擬免疫的小鼠比較，IFNγ、IL-2、IL-10和IL-12 p40，但不是IL-6，水平也增加了。
作為額外的對照，在同一實驗中在腹膜內(nèi)以福爾馬林滅活的RSV免疫另一組動物(Connors等，J.Virol.667444-7451，1992)，并進行相同的收集和攻擊方案。初始免疫或感染后，在這種組和其它組中未發(fā)現(xiàn)IL-4 mRNA。在被攻擊后，接受福爾馬林處理的疫苗的組IL-4mRNA極大地增加，而其它組中未發(fā)現(xiàn)。
以上的實施例詳述了嵌合病毒rRSV/mIFNγ的構(gòu)建，其從基因順序位于第8的位置上，介于G-F基因間，一個額外的轉(zhuǎn)錄單位以獨立mRNA表達mIFNγ基因。該病毒在細胞培養(yǎng)中定向指導(dǎo)高水平的mIFNγ的合成。與wt RSV相比，rRSV/mIFNγ在細胞培養(yǎng)中的生長降低16倍。但這種效果與在rRSV/CAT(在相同的基因位置含CAT基因)中觀察到的程度相當(dāng)。因此，這種體外生長的限制是因外源基因的存在，而非因為其編碼產(chǎn)物的活性。并不驚訝mIFNγ表達不抑制人HEp-2細胞中病毒的生長，因為人IFNγ和mIFNγ僅具有40％的氨基酸序列同一性。
rRSV/mIFNγ在BALB/c小鼠上下呼吸道中的復(fù)制分別比wt RSV降低63倍和20倍。相反，對rRSV/CAT的平行分析與wt RSV相比無限制，表明rRSV/mIFNγ在體內(nèi)的減毒并非因為額外基因的存在本身，而是mIFNγ表達的結(jié)果。由于這種體內(nèi)的生長限制發(fā)生在感染早期，可能由于表達的mIFNγ對內(nèi)在免疫的影響，如誘導(dǎo)寡腺苷酸合成酶和產(chǎn)生的抗病毒級聯(lián)效應(yīng)，或可能激活NK細胞和巨噬細胞，而非對適應(yīng)性免疫的影響。rRSV/mIFNγ的生長僅限制了63倍或更少暗示IFNγ不是抗RSV的主要效應(yīng)物。其它呼吸道病毒，流感A病毒，宿主IFNγ表達對于有效的免疫應(yīng)答是不需要的，盡管其存在導(dǎo)致偏向Th2的抗體和細胞因子應(yīng)答(Gramham等，J.Exp.Med.1781725-1732，1993)。
在RSV感染過程中IFNγ共表達是否能進一步使T細胞增殖偏向Th1應(yīng)答的問題，通過分析細胞因子mRNA模式和RSV特異的抗體同種型得以解決。wt RSV的感染與Th1標(biāo)志IFNγ(但不是IL-2)，Th2標(biāo)志IL-6和IL-10，和主要由單核細胞和巨噬細胞產(chǎn)生的IL-12 p40mRNA水平的增加相關(guān)。與wt RSV的感染所觀察到的相比，rRSV/mIFNγ的感染導(dǎo)致IFNγ mRNA水平的增加，以及稍高(小于兩倍)的IL-12 p40 mRNA水平。IFNγmRNA的增加大概至少是部分因為重組病毒的表達。IL-12 p40 mRNA的增加可能是單核細胞/巨噬細胞來源IFNγ介導(dǎo)激活的結(jié)果，盡管先前在體外未發(fā)現(xiàn)這種情況(D’Andrea等，J.Exp.Med.1761387-1398，1992)。
感染rRSV/mIFNγ的動物和感染wt RSV的動物在其它Th1標(biāo)記，IL-2，其它Th2標(biāo)記IL-6或IL-10 mRNA的水平?jīng)]有顯示差異。免疫rRSV/mIFNγ的小鼠和免疫wt RSV的相比，總IgG和IgG1 RSV特異抗體略有增加，后者抗體是Th2應(yīng)答的一個標(biāo)志(Snapper等，F(xiàn)undamental Immunology，ed.Paul，W.E.(Raven Press，New York)，pp.837-863，1993)。IgG2a也略有增加，其是Th2應(yīng)答的一個標(biāo)志(Snapper等，F(xiàn)undamental Immunology，ed.Paul，W.E.(Raven Press，New York)，pp.837-863，1993)。因此，細胞因子和抗體應(yīng)答都與rRSV/mIFNγ的最初感染或wt RSV后來攻擊所增加的對Th1標(biāo)志的偏向不一致。
wt RSV或rRSV/mIFNγ免疫的小鼠對RSV的攻擊有強的抗性。盡管其在體內(nèi)的生長限制，rRSV/mIFNγ誘導(dǎo)的抗RSV F蛋白的總IgG和中和RSV的血清抗的效價比wt RSV誘導(dǎo)的更高。先前研究(Crowe等，Vaccine 12，783-790，1994)顯示以一個候選活減毒病毒疫苗，RSVcpts248/404，接種的猩猩與wt RSV免疫的動物相比，產(chǎn)生的RSV中和抗體的效價較低(7.9log2對11.1log2，9.2倍的差異)，暗示了RSV復(fù)制水平與其免疫原性的相關(guān)性。盡管病毒復(fù)制水平降低，對rRSV/IFNγ的抗體應(yīng)答總體略有增加，這標(biāo)志發(fā)展活的減毒RSV疫苗非常理想的表型。
如小鼠或棉鼠的嚙齒動物積聚有效的抗RSV抗原的免疫應(yīng)答(Collins等，Vaccine 8164-168，1990)，而當(dāng)在非人靈長類或人志愿者中評價時，其免疫原性通常更低。這對于小嬰兒特別重要，因其抗RSV的抗體應(yīng)答顯示降低(Murphy等，J.Clin.Microbiol.24894-898，1986)。因此由于嚙齒類動物對RSV抗原具有更強的免疫應(yīng)答，對于人非常重要的抗原性差異在嚙齒類動物中不經(jīng)常被發(fā)現(xiàn)。此外，RSV在嚙齒類動物中的復(fù)制被極大地限制了，因此僅小部分肺部細胞被感染，典型地不會產(chǎn)生疾病。很有可能在充分許可的宿主中IFNγ對于減毒，免疫原性或反應(yīng)原性的影響更大。為評價這一點，本發(fā)明構(gòu)建表達人的IFNγ而非鼠IFNγ的重組RSV。對病毒在猩猩，在RSV復(fù)制、疾病和免疫原性方面與人最相似的動物中的評價可以用于調(diào)整候選疫苗的減毒及其它特征。使用來自不同種的細胞可以消除一種復(fù)雜情況，即在被感染的靈長類培養(yǎng)細胞中表達人細胞因子可能阻礙疫苗的制備。
如上所述，多種細胞因子基因插入了重組DNA病毒，主要是疫苗病毒，表現(xiàn)出減毒、致病性和免疫原性的效應(yīng)(Ramshaw等，Nature329545-546，1987；Flexner等，Nature 330259-262，1987；Rolf等，Curr.Opin.Immunol.9517-524，1997，綜述參見Rolf等，Curr.Opin.Immunol.9517-524，1997)。痘病毒中，表達IFNγ或I型IFN為宿主減毒，但這種減毒伴隨有體液免疫應(yīng)答的降低(Leong等，J.Virol.688125-8130，1994；Bembridge等，J.Virol.724080-4087，1998；Karaca等，Vaccine161496-1503，1998)。缺乏nef基因的猿猴免疫缺陷病毒(SIV)表達IFNγ導(dǎo)致該SIV突變體在猴子中進一步減毒，但該細胞因子插入在復(fù)制幾周后非常不穩(wěn)定，減毒也伴隨有對SIV糖蛋白體液免疫應(yīng)答的降低(Giavedoni等，J.Virol.71866-872，1997)。本發(fā)明擴展了這種方案，提供抗負鏈病毒的疫苗。此處的結(jié)果表明減毒病毒，同時保持其免疫原性是可能的，先前僅在痘苗病毒載體表達IL-2的這個獨特的例子中獲得這種結(jié)果(Flexner等，Vacinne 817-21，1990)。因此在重組RSV中共表達IFNγ代表非區(qū)段化負鏈RNA病毒減毒的一個新類型，為一種既降低病毒的生長又不危及免疫原性類型。實施例II編碼鼠IL-2的重組RSV的構(gòu)建和定性本實施例中，構(gòu)建了一種重組RSV，其含有以轉(zhuǎn)錄盒插入到G-F基因間隔區(qū)的鼠白介素2(mIL-2)的編碼序列。該回收病毒(rRSV/mIL-2)在細胞培養(yǎng)中高水平表達mIL-2(達2.8μg/ml)。與野生型(wt)重組RSV(rRSV)相比，rRSV/mIL-2在體外的復(fù)制降低達13.6倍，這種效果是由于外源基因的插入而非特異于mIL-2。rRSV/mIL-2病毒在BALB/c小鼠上下呼吸道中的復(fù)制降低達6.3倍，這種效果是特異于mIL-2的。其抗體應(yīng)答，包括RSV特異的血清IgG1、IgG2a、IgA，和總IgG的水平，以及抗wt RSV攻擊的保護效率的水平，與wt rRSV無顯著不同。rRSV/mIL-2感染后1和4天分離的總肺細胞因子mRNA的分析表明，與wt rRSV相比，IL-2、IFNγ、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-13和IL-12 p40的mRNA水平提升。流式細胞儀分析rRSV/mIL-2感染10天后分離的總肺單核細胞表明，與wt rRSV相比，單獨表達IFNγ或IL-4的CD4+T淋巴細胞水平增加。這些相對于填滿wt rRSV的動物細胞因子mRNA或表達細胞因子CD4+細胞的增加，在28天用wtRSV攻擊后未被觀察到。因此重組RSV表達mIL-2與下列活動相關(guān)，病毒在體內(nèi)生長的適度減毒，與wt rRSV相比血清抗體的誘導(dǎo)，以及與wt rRSV相比，Th1和Th2 CD4+淋巴細胞和細胞因子mRNA的瞬時增加。
IL-2是一種先前已知的是“T細胞生長因子”的原型細胞因子。由Th1和Th2 CD4+細胞產(chǎn)生(Th1水平更高)，當(dāng)CD8+受到抗原或促細胞分裂原刺激時也能產(chǎn)生(Gaffen等，細胞因子手冊，A.W.Thomson(ed.)，p 73-103，學(xué)術(shù)出版社，1998；和Thorpe，細胞因子，A.Mire-Sluis和R.Thore(eds)，p19-33，1998)。人IL-2蛋白的合成以153個氨基酸作前體，剪切一段20氨基酸的信號肽后加工成為133氨基酸的成熟蛋白。其鼠的類似物大小相似，有63％的氨基酸相同(Kashima等，Nature3 13402-4，1985Yokota等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 8268-72，1985，分別在此引用作為參考)。幼稚T細胞表達IL-2包含β和γ鏈的低親和的受體，用與α鏈相關(guān)物修飾使其成為高親和受體。受體結(jié)合IL-2后，通過與該受體相關(guān)的JAK1激酶引發(fā)多種轉(zhuǎn)錄因子的激活。
IL-2的調(diào)節(jié)網(wǎng)非常復(fù)雜。IL-2有多效的生物學(xué)效果，主要但不完全局限于白細胞。IL-2刺激活化T細胞急劇生長和增殖，高濃度時可引起靜息T細胞的增殖。IL-2刺激T細胞細胞裂解活性。也刺激活化B細胞的增殖和促進免疫球蛋白的分泌。IL-2刺激自然殺傷(NK)細胞和淋巴細胞活化的殺傷(LAK)細胞的活性。也促進單核細胞的增殖和分化。趨化因子受體CCR1，CCR2，CCR5由IL-2誘導(dǎo)。IL-2被用于治療某些病毒感染，包括乙肝病毒，人免疫缺陷病毒，以及單純性皰疹病毒(Gaffen等，細胞因子手冊，A.W.Thomson(ed.)，p73-103，學(xué)術(shù)出版社，1998；和Thorpe，細胞因子，A.Mire-Sluis和R.Thore(eds)，p19-33，1998)。IL-2給藥AIDS患者誘發(fā)顯著和持續(xù)的CD4+細胞的增加(Kovacs等，New Eng.J.Med.3351350-1356，1996，在此引用作為參考)。
本實施例顯示被含有編碼鼠白介素2(mIL-2)基因，其側(cè)翼為RSV特異的基因起始(GS)和基因終止(GE)信號修飾的重組RSV的構(gòu)建和評價。圖7顯示了rRSV/mIL-2的基因組圖譜。含有鼠IL-2基因cDNA拷貝的質(zhì)粒被線性化，并用以下引物進行PCR擴增TATA ATGGGGCAAAT TACAGCATGCAGCTCGC(SEQID NO.3)(XmaI限制性內(nèi)切酶位點斜體表示，RSV基因起始序列下劃線，IL-2翻譯起始密碼子為黑體)，以及ATTA AATTTTTAATAACT TTGAGGGCTTGTTGAGA(SEQ ID NO.4) (XmaI限制性內(nèi)切酶位點斜體表示，RSV基因終止序列補碼下劃線，IL-2翻譯終止密碼子補碼為黑體)。天然產(chǎn)生的IL-2 mRNA在該mRNA3’不翻譯區(qū)具有“不穩(wěn)定序列”，其介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)節(jié)。插入rRSV中的IL-2 cDNA特別設(shè)計為缺失該序列。擴增的片段用XmaI限制性內(nèi)切酶消化，瓊脂糖凝膠電泳進行純化，克隆于質(zhì)粒pUC19的XmaI位點，進行完全測序以確定正確的初始結(jié)構(gòu)。該質(zhì)粒用XmaI消化，純化插入片段并克隆于前述的RSV反基因組質(zhì)粒D46/1024(Bukreyev等，J.Virol.706634-6641，1996)唯一的XmaI位點中，其編碼15,231核苷酸長的RSV反基因組，XmaI連接體插入G-F基因間隔區(qū)。該rRSV/mIL-2反基因組質(zhì)粒編碼15,772核苷酸的反基因組RNA，分別比生物學(xué)來源RSV的15,222和重組RSV的15,223核苷酸的反基因組，長549-550個核苷酸。
該反基因組質(zhì)粒如前述方法用于指導(dǎo)重組病毒的回收(Collins等，Proc.Natl.Acad.Sci USA 9211563-11567，1995，在此引用作為參考)。病毒在HEp-2細胞中傳代，并用前述的噬菌斑分析法定量(Murphy等，Vaccine 8497-502，1990)。rRSV/mIL-2病毒形成的噬菌斑略小于野生型RSV，但在形態(tài)上難以區(qū)分。rRSV/mIL-2略微降低的噬菌斑大小與前述rRSV/CAT和rRSV/mIFNγ的噬菌斑相當(dāng)(Bukreyev等，J.Virol.706634-6641，1996，和Proc.Natl.Acad.Sci.USA 962367-2372，1999，分別在此引用作為參考)。
含有IL-2的病毒(rRSV/mIL-2)在感染的組織培養(yǎng)細胞培養(yǎng)基中發(fā)現(xiàn)高水平表達(達2.8微克/ml)IL-2。這對應(yīng)于每106細胞中14微克的IL-2，與rRSV/mIFNγ病毒每106細胞中22微克IFNγ的產(chǎn)量相當(dāng)(Bukreyev等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 962367-2372，1999)。
為確定rRSV/mIL-2病毒生長的動力學(xué)，以每個細胞MOI為2 PFU用該重組或野生型RSV感染HEp-2細胞。以8小時為時間點采取培養(yǎng)基樣品，冷凍，之后進行噬菌斑分析。發(fā)現(xiàn)rRSV/mIL-2病毒在HEp-2細胞的生長減毒，最大產(chǎn)量與野生型相比降低約14-17倍。這種減毒水平與觀察到的，在相同反基因組位置上含有CAT基因或mIFNγ基因的rRSV結(jié)果相似(Bukreyev等，J.Virol.706634-6641，1996，和Proc.Natl.Acad.Sci.USA 962367-2372，1999，分別在此引用作為參考)。因此，細胞培養(yǎng)中減毒的效果似乎由于插入的存在，但與插入物的性質(zhì)無關(guān)。mIL-2和mIFNγ在HEp-2細胞中沒有體外生物學(xué)效果，這個結(jié)果并不令人驚訝，因為細胞因子來自鼠而細胞來自人。
使用Northern印跡雜交分析外源IL-2基因，以及G，F(xiàn)，和L基因的轉(zhuǎn)錄。用rRSV/mIL-2或wt RSV感染HEp-2細胞，5天后收獲細胞，純化總RNA，分離多聚(A+)部分。Northern印跡分析確定rRSV/IL-2定向mIL-2 mRNA的表達，以及小的種類表達，這些小種類為來自臨近基因轉(zhuǎn)錄通讀產(chǎn)生的合適大小的IL-2-G和F-IL-2雙順反子mRNA。用G和F探針雜交確定這些雙順反子mRNA。與F，G和L探針的雜交顯示二者均表達這些mRNA，正如預(yù)期那樣。
分析了外源基因的穩(wěn)定性。rRSV/mIL-2病毒在HEp-2細胞中8次傳代。分離第8次傳代的總細胞RNA，用分別對應(yīng)于插入(G和F基因)位點上下游基因組片段的正向和反向引物對其進行RT-PCR。這導(dǎo)致產(chǎn)生對應(yīng)于預(yù)期的867核苷酸長度的單一的可檢測PCR產(chǎn)物，沒有反映該插入部分或完全缺失的更短的可檢測PCR產(chǎn)物。結(jié)果與先前的發(fā)現(xiàn)一致，即8次傳代后從25個回收的rRSV/CAT噬菌斑分離物中任何一個都保有CAT基因，以一種能表達酶活性的CAT形式(Bukreyev等，J.Virol.706634-6641，1996，在此引用作為參考)。
為定量mIL-2的表達，以MOI為2 PFU/每細胞用rRSV/mIL-2(第8次傳代)感染HEp-2細胞，用Quantikine M鼠IL-2免疫分析儀(R&D系統(tǒng))所收集的培養(yǎng)基樣品。感染后8小時分泌的mIL-2濃度為1.7ng/ml，在感染后120小時增加超過1000倍，達到最大值2.8μg/ml。
在BALB/c鼠中評價rRSV/mIL-2的復(fù)制。第0天小鼠鼻內(nèi)以0.1ml接種量分別含有106PFU的rRSV/mIL-2、rRSV/CAT或wt RSV免疫小鼠，或用0.1ml接種量的Opi-MEM培養(yǎng)基模擬感染。每組5只小鼠在感染后3，4和5天被處死，收集鼻甲和肺組織，用噬菌斑分析稀釋的組織抽提液，分析感染性RSV(Murphy等，Vaccine 8497-502，1990，在此引用作為參考)。與野生型RSV相比，rRSV/mIL-2病毒在上下呼吸道中的復(fù)制是減毒的，以程度很小，但統(tǒng)計學(xué)顯著的方式減毒，唯一的例外的是第5天鼻甲中病毒效價與野生型RSV相比沒有顯著差異(圖8)。復(fù)制的最大差異是5倍和6.3倍，分別是在第3天的上呼吸道和第5天的肺中。相反，除了第3天在肺中，這兒與rRSV/mIL-2相當(dāng)，rRSV/CAT與野生型RSV沒有顯著差異。第3天的肺樣品是一個例外，該RSV/CAT的效價與wt rRSV相比是降低的，但與rRSV/mIL-2相似。
rRSV/CAT病毒含15,984核苷酸的基因組，而野生型RSV是15,222核苷酸，rRSV/IL-2病毒是15,772核苷酸。因此，rRSV/CAT和野生型RSV效價間的接近一致顯示僅有插入，至少在該大小范圍內(nèi)的插入，不能使RSV在小鼠內(nèi)顯著減毒。先前的工作也有相似的報道(Bukreyev等，Proc.Natl.Acad.Sci USA 962367-2372，1999，在此引用作為參考)。相反，rRSV/IL-2效價在體內(nèi)6個樣品中的5個都顯示顯著降低。因此，攜帶549個核苷酸在相同的基因組位置插入mIL-2基因的rRSV/IL-2的減毒表現(xiàn)為特異于mIL-2。
為評價rRSV/mIL-2的免疫原性，如上所述，用rRSV/mIL-2、rRSV/CAT或wt RSV感染小鼠，在0天(感染前)，28天和56天采集血清樣品(表2)。各病毒都誘導(dǎo)高效價的RSV中和的血清抗體，在此方面，這三個病毒沒有區(qū)別。此外，如用純化RSV F蛋白做抗原采用ELISA方法測定一樣，在誘導(dǎo)RSV特異的血清IgA、IgG1、IgG2a和總IgG方面，這三個病毒間也沒有顯著差異(表2)。第56天各組小鼠被鼻內(nèi)接種的每只動物106PFU的wt RSV攻擊。4天后，即第60天，處死小鼠，測定病毒在上下呼吸道內(nèi)的效價。所有先前感染的動物都表現(xiàn)對攻擊病毒復(fù)制的高水平抗性。在先前感染了rRSV/CAT或rRSV/mIL-2的動物中未發(fā)現(xiàn)攻擊病毒的復(fù)制(鼻甲中平均效價為＜2.0log10PFU/g，肺中為＜1.7log10PFU/g)，而免疫了wt rRSV的動物中發(fā)現(xiàn)了低水平的RSV(鼻甲中平均效價為2.3 log10PFU/g，肺中為＜1.7log10PFU/g)。相反，先前未被感染的動物在鼻甲和肺中平均效價為4.7log10PFU/g。因此，這3種病毒誘導(dǎo)對再感染高水平抗性的能力沒有區(qū)別。
在106PFU的rRSV/mIL-2或wt rRSV感染或模擬感染后，測定所選定的細胞因子肺mRNA的水平。這種分析的優(yōu)點在于其不要求體外細胞的刺激或操作，并檢測所用肺細胞的累積應(yīng)答。每組4或5只的小鼠在感染后1和4天被處死前收集肺。天的選擇與活性RSV復(fù)制的時期一致，在這一時期細胞因子mRNA顯示有大量的表達(Graham等，J.Immunol.1512032-2040，1993，在此引用作為參考)。分離總的肺RNA，采用前述方法，進行RNA酶保護法分析(Bukreyev等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 962367-2372，1999，在此引用作為參考)。將來自單個動物的RNA分別分析。測序膠中顯示的細胞因子特異性膠帶用磷光計定量，各鼠每一條帶的量用同一鼠來自同一膠道的L-32管家基因mRNA的百分比表示。就確定了各組小鼠的平均值和標(biāo)準誤差(圖9)。
表2.抗rRSV/mIL-2感染的RSV血清抗體應(yīng)答a
a在0天以0.1ml接種量的指定病毒106PFU/每只動物感染各組8只小鼠。第56天的抗體效價在獨立的分析中測定。
b如文獻描述，測定了特異于RSV F蛋白的同種型特異的血清ELISA抗體的效價(Bukreyev等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 962367-2372，1999)。
c利用補體增強60％的噬菌斑減小分析(Crowe等，Vaccine 111395-1404，1993)測定了RSV中和血清抗體。
分析表明wt rRSV感染刺激Th1細胞因子IFNγ和Th2細胞因子IL-6的mRNA大量的積累，也刺激IL-12 p40 mRNA，為IL-12異源二聚體的可誘導(dǎo)亞單位的積累。IL-12由除T淋巴細胞外的在其他細胞中的單核細胞和巨噬細胞產(chǎn)生，IFNγ可以增強其產(chǎn)生。這三種豐富mRNA也出現(xiàn)于rRSV/IL-2感染的小鼠，并累積到高于wt rRSV的水平。rRSV/mIL-2的感染也導(dǎo)致IL-2 mRNA的累積，這在wt rRSV感染的動物中不存在，可能直接由該病毒編碼。rRSV/mIL-2的感染，但不是wt rRSV也刺激幾種不太豐富的Th2細胞因子mRNA的積累，即IL-4，IL-5，IL-10和IL-13。因此，重組RSV共表達IL-2與Th1和Th2標(biāo)志細胞因子mRNA積累的增加相關(guān)。
相同組的各小鼠在第28天接受wt RSV的攻擊，在29和32天(攻擊后1或4天)收集肺樣品進行分析。感染wt rRSV并在28天后接受wt RSV攻擊的小鼠表現(xiàn)IL-6，mIFNγ，和IL-12 p40 mRNA水平的升高，IL-2和IL-10mRNA也升高但程度較弱，而未檢測到IL-4，IL-5，和IL-13的mRNA。感染rRSV/mIL-2并接受wt RSV攻擊的小鼠表現(xiàn)相同的現(xiàn)象，只有一個例外，對于IL-12 p40 mRNA，在第29天沒有顯著不同，但在32天，rRSV/mIL-2已接觸抗原組與wt rRV已接觸抗原組相比，有小的降低(32％，P＜0.01)。
也檢測了rRSV/mIL-2比對wt rRSV的總肺CD4+T淋巴細胞應(yīng)答。特別地，細胞內(nèi)的細胞因子免疫染色和流式細胞計數(shù)分析被用來定量表達Th1標(biāo)志IFNγ或表達Th2標(biāo)志IL-4的肺CD4+T淋巴細胞(Hussell等，J.Gen.Virol.772447-2455，1996；Openshaw等，J.Exp.Med.1821357-1367，1995；Prussin等，J.Immunol.Methods 188117-128，1995；分別在此引用作為參考)。106PFU的rRSV/mIL-2或wt rRSV感染或模擬品感染小鼠，在第4和10天各組的4只動物被處死，收集肺并按以下所述加工。各組中剩余的小鼠在第28天鼻內(nèi)攻擊接種106PFU的wt RSV，攻擊后4和10天(第32和38天)，每組4只動物被處死，收集肺部進行處理。肺部切碎并用DNAseI和膠原酶消化，離心并與Ficoll-Paque Plus介質(zhì)(Amersham Pharmacia Biotech)結(jié)合，以分離總肺單核細胞，來自每個動物的材料都單獨處理。與非特異性促細胞分裂原(2.5ng/ml佛波醇12-豆蔻酸13-乙酸和250ng/ml離子霉素)在莫能菌素(阻礙胞吐作用，使細胞因子在細胞內(nèi)累積)存在下37℃培養(yǎng)4小時，以體外刺激細胞。Fc受體通過與純化的大鼠抗-小鼠CD16/CD32(FcγIII/II受體)在4℃預(yù)先孵育細胞15分鐘被封閉。細胞用低聚醛溶液(Cytofix Buffer，PharMingen，4℃ 20分鐘)固定，透化(Perm Wash，PharMingen，4℃20分鐘)并染色CD4+(三色偶連的大鼠IgG2a克隆CT-CD4，Caltag Laboratories)，IFNγ(FITC-偶連的大鼠IgG1克隆XMG1.2，PharMingen)和IL-4(R-PE-偶連的大鼠IgG2b克隆BVD4-1D11，PharMingen)分子。用各標(biāo)記抗體預(yù)先最優(yōu)化的量，在黑暗中進行免疫染色4℃30分鐘。染色的特異性與對照比較確定，其中(i)與相同抗體未經(jīng)偶連的制備物預(yù)先孵育4℃30分鐘，反應(yīng)活性被封閉，和(ii)當(dāng)一級抗體被相同同種型但具有異源特異性的抗體替代時，反應(yīng)活性消失。發(fā)表的研究顯示體外刺激步驟并不改變細胞因子表達模式(Hussell等，J.Gen.Virol.772447-2455，1996，在此引用作為參考)。淋巴細胞部分如文獻描述受到門控(Hussell等，1996，同上)，并用FACS Calibur流式細胞儀(Becton Dickinson)進行三色流式細胞儀分析。每個樣品分析近60,000門控淋巴細胞。值得注意的是檢測的是總肺淋巴細胞而非灌洗分離的亞群。
約一半的總肺單核細胞被作為淋巴細胞門控，與未感染的對照比較，在對rRSV/mIL-2或wt rRSV的初次感染或攻擊后的應(yīng)答中，這種百分比沒有顯著改變。鑒定為CD4+淋巴細胞在單核細胞中的百分比在兩種病毒中的任一病毒初始感染后，與未感染的對照相比平均百分比(第4、10天分別為9.0和7.2)，基本沒有改變(對wt rRSV在4和10天的平均百分率分別是7.6和7.9；對rRSV/mIL-2在4和10天的平均百分率分別是7.5和10.7)。但在攻擊后32和38天，與未感染的對照(同上)相比，該百分率幾乎增加一倍(對wt rRSV在32和38天的平均百分率分別是18.2和15.4；對rRSV/mIL-2在32和38天的平均百分率分別是15.7和14)。這顯示了一種強的二級免疫應(yīng)答，盡管攻擊病毒復(fù)制被極大地限制。檢測CD4+群體用于表達的IFNγ對IL-4。圖10顯示了三只動物感染rRSV/mIL-2，wt rRSV或模擬品處理并在第10天進行分析的實驗數(shù)據(jù)。完整實驗總結(jié)在表3中。
表3流式細胞分析從感染wt RSV或rRSV/mIL-2的小鼠中表達IFNγ，IL-4或表達二者的肺CD4+淋巴細胞a
a0天時在小鼠鼻內(nèi)接種感染106PFU/每只動物的指定病毒，或模擬感染。各組動物如表所示在第4和10天處死。剩余動物(包括模擬感染組)在28天接受106PFU wt RSV/每只動物的攻擊，在32和38天處死動物(攻擊后4和10天)，如表所示。對CD4，IFNγ和IL-4免疫染色，用流式細胞分析總肺單核細胞。值以CD4+淋巴細胞的百分比表示。每組有4只小鼠，以下除外wt RSV組在第4天有3只動物；模擬感染組第4天有2只動物；模擬感染組第10天和38天各有3只動物。各動物的細胞被單獨處理，每組以2-4個小鼠的單個數(shù)據(jù)的平均值和標(biāo)準誤差(SE)表示。
bc與wt rRSV對照相比，斯氏t檢驗計算統(tǒng)計學(xué)顯著性。
d備注模擬組動物在0天模擬感染，但在28天接受攻擊。因此，第38天的點相應(yīng)于wt RSV組的第10天點。
最初感染后4天，接種rRSV/mIL-2或wt rRSV的動物表現(xiàn)出CD4+淋巴細胞(IFNγ陽性、IL-4陽性或雙陽性)水平的增加，但兩個病毒應(yīng)答程度相似。第10天，IFNγ陽性、IL-4陽性或雙陽性細胞的平均數(shù)量在rRSV/mIL-2感染的小鼠中，比在wt rRSV感染的小鼠中統(tǒng)計學(xué)顯著地增加分別為2.1倍(P＜0.05)、3.6倍(P＜0.001)、4.1倍(P＜0.001)。因此第4天觀察到的Th1和Th2細胞因子mRNA的增加(圖9)是第10天時通過CD4+淋巴細胞細胞因子合成的反映，但非第4天。這種延遲可能反映了后一分析低敏感性，或表達的延遲，或?qū)τ贗FNγ而言，除了CD4+淋巴細胞以外的合成，如NK細胞的合成(Hussell等，J.Gen.Virol.792593-2601，1998，在此引用作為參考)。
動物在28天接受攻擊以及在32天檢測肺CD4+細胞時，已接觸rRSV/mIL-2的動物中IFNγ陽性細胞的數(shù)量比wt rRSV免疫的動物中數(shù)量低3倍((P＜0.001)。IL-4陽性或雙陽性細胞的百分比在兩組小鼠中相似。所觀察到的表達IFNγ的CD4+的減少并未反映在總肺IFNγmRNA的量上，表明除了CD4+以外，還有其它細胞有助于該mRNA的總水平，如NK細胞。IFNγ陽性細胞的減少是瞬時的，在第38天最初已接觸rRSV/mIL-2或wt rRSV的小鼠之間表達IFNγ或表達IL-4細胞的數(shù)目沒有顯著差異。在該時間點，表達IFNγ或表達IL-4的總肺CD4+細胞百分比分別是～19％和～0.5。
總而言之，重組RSV在BALB/c鼠模型中共表達mIL-2(i)導(dǎo)致病毒生長的適量減毒，(ii)通過分析總肺mRNA，發(fā)現(xiàn)Th1和Th2細胞因子的表達增加，和(iii)增加了表達IFNγ或IL-4的總肺CD4+淋巴細胞的應(yīng)答。提高的抗rRSV/mIL-2的免疫應(yīng)答可能說明與wtrRSV比較的適量減毒。病毒生長的減毒可能因為CD4+淋巴細胞應(yīng)答增加的結(jié)果，或IFNγ產(chǎn)量的增加，或可能包括其它在此未監(jiān)測到的因子，如CD8+或NK細胞的激活和增殖，或其它抗病毒細胞因子分泌的刺激，如I型IFNs或αTNF(Karupiah等，J.Exp.Med.1721495-1503，1990；Karupiah等，J.Immunol.144290-298，1990；Karupiah等，J.Immunol.1474327-4332，1991，分別在此引用作為參考)。Th1和Th2細胞因子mRNA和CD4+T淋巴細胞累積量的增加僅在rRSV/mIL-2的初始感染中發(fā)現(xiàn)，而在隨后的wt RSV攻擊過程中未發(fā)現(xiàn)。事實上，在攻擊后4天IFNγ陽性的CD4+T淋巴細胞和IL-12 p40 mRNA略有降低，二者可能相關(guān)。但IFNγ陽性的CD4+T淋巴細胞的減少是瞬時的，在攻擊后10天沒有被觀察到。
rRSV/mIL-2的初始感染中免疫應(yīng)答升高，由細胞因子mRNA和CD4+T淋巴細胞的增加所證明，沒有反映為增加RSV特異的血清抗體或增加保護效率。但RSV特異抗體的效價和RSV在小鼠中感染誘導(dǎo)的保護性免疫水平非常高，以至于不清楚它們是否對進一步的刺激敏感。例如，當(dāng)先前感染了RSV的小鼠受到攻擊，極少或絕無觀察到攻擊病毒的復(fù)制，因此可能也觀察不到保護免疫的進一步增加。為使這種效果更特異，進一步在非人的靈長類中評價rRSV/mIL-2的復(fù)制和免疫原性，其中對RSV的免疫應(yīng)答較弱。所得的rRSV/mIL-2病毒能容易用于該目的，因為在人和小鼠之間存在有眾多的種交叉IL-2活性(Flexner等，Nature 330259-262，1987；Hugin等，Cell Immunol152499-509，1993，分別在此引用作為參考)?；蛘撸磉_人IL-2的重組RSV可根據(jù)本發(fā)明容易地構(gòu)建。實施例III編碼鼠粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(mGM-CSF)的重組RSV的構(gòu)建和定性本實施例中，檢測了RSV共表達鼠GM-CSF(mGM-CSF)對鼠中RSV免疫應(yīng)答的效果。依據(jù)上述關(guān)于rRSV/mIL-2和rRSV/mIFNγ病毒的一般策略，構(gòu)建了反基因組cDNA，其含有在RSV基因起始和終止信號控制下的，插入G-F基因間隔區(qū)的mGM-CSF基因。該反基因組cDNA被用于回收rRSV/mGM-CSF病毒。該重組病毒在細胞培養(yǎng)中生長略有減毒，復(fù)制效率與rRSV/CAT、rRSV/IL-2和rRSV/mIFNγ病毒基本上沒有區(qū)別。培養(yǎng)細胞感染rRSV/mGM-CSF病毒后，高水平的mGM-CSF被分泌到細胞培養(yǎng)基。rRSV/GM-CSF病毒接種到BALB/c小鼠后，表現(xiàn)輕微的減毒，生長表型介于rRSV/IL-2病毒(減毒約為上述的5倍)，rRSV/CAT和野生型RSV病毒之間，野生型RSV病毒在體內(nèi)不減毒。以rRSV/GM-CSF免疫的小鼠對野生型RSV后來的攻擊有強的抗性。有趣的是，如上所述用F特異的ELISA法分析血清抗體應(yīng)答，rRSV/mGM-CSF病毒誘導(dǎo)的血清IgG1和總IgG的效價比野生型RSV誘導(dǎo)，分別高10倍和6倍。因此，RSV共表達mGM-CSF與增強的免疫原性有關(guān)。
GM-CSF由多種細胞產(chǎn)生，包括T和B淋巴細胞，巨噬細胞，表皮和內(nèi)表皮細胞，以及成纖維細胞，經(jīng)常是對抗原(T和B淋巴細胞)，或炎癥介質(zhì)(巨噬細胞，表皮細胞以及成纖維細胞)刺激的應(yīng)答(綜述參見如Quesniaux和Jones，pp.35-670，in The Cytokines，A.W.Thomas(ed.)，Academic Press，1998，在此引用作為參考)。GM-CSF對于造血細胞增殖和分化，宿主防御，和免疫應(yīng)答有重要作用。例如，它刺激粒細胞-巨噬細胞前體的增殖和分化，誘導(dǎo)神經(jīng)軸突的遷移，以及抗微生物活性，并誘導(dǎo)產(chǎn)生樹突細胞。盡管其主要應(yīng)用于抗腫瘤免疫領(lǐng)域，也顯示當(dāng)用作佐劑可以增加初次和再次免疫應(yīng)答(Tarr等，pp.219-232，in Manual of GM-CSF，M.Marty(ed.)，Blackwell Science，1996，在此引用作為參考)。但這些前期的實施例沒有提供在呼吸道復(fù)制的RSV疫苗病毒共表達GM-CSF對宿主免疫應(yīng)答可能影響的信息。
mGM-CSF的成熟形式是一個124氨基酸的糖蛋白。由其前體切除N末端17個氨基酸的信號序列而合成mGM-CSF。GM-CSF ORF的cDNA可克隆在pUC18中而獲得，在質(zhì)粒中其兩端使用唯一的限制位點，并插入以來自合成的寡核苷酸DNA雙螺旋替代短的限制性片段進行修飾。在該GM-CSF質(zhì)粒中，ORF前是HindIII位點，在緊鄰ATG起始密碼子的下游具有一個MluI位點。該HindIII和MluI限制性片段被切除，用合成的回收了GM-CSF編碼序列的HindIII-MluI片段替代，并將其放置于RSV基因起始信號控制下，該信號之前按順序是XmaI位點。在GM-CSF ORF的下游末端，一個BsrI位點在其終止密碼子之前，該終止密碼子之后是BamHI位點。切除該BsrI-BamHI片段，用合成的回收編碼序列的BsrI-BamHI片段替代，并加入下游的RSV基因終止信號和一個XmaI位點(圖11)。該轉(zhuǎn)錄盒被插入完整RSV反基因組cDNA的G-F基因間隔區(qū)，該區(qū)被插入的XmaI位點修飾。重組RSV基因組的長度增加465個核苷酸，從15,223到15,688，并且編碼mRNA的數(shù)量由10增加到11。
使用如上所述的rRSV/mIFNγ和rRSV/mIL-2病毒的實驗策略和方法，表達mGMCSF的重組RSV(rRSV/mGMCSF)病毒被回收，生長并且分析。來自感染細胞的胞內(nèi)RNA的RT-PCR分析確認了在回收的rRSV/mGMCSF病毒基因組中GM-CSF轉(zhuǎn)錄盒的存在以及體外連續(xù)傳代中該插入的穩(wěn)定性。Northern印跡分析確認了mGM-CSF作為一種獨立的，豐富mRNA表達。此外，感染了rRSV/mGMCSF的HEp-2細胞表達分泌的mGM-CSF，每毫升培養(yǎng)上清中數(shù)量接近1ug。
該回收的嵌合rRSV/mGMCSF病毒形成的噬菌斑略小于wt rRSV(大小降低10-15％)。以MOI為2PFU感染HEp-2細胞，測定感染性病毒產(chǎn)生和釋放的動力學(xué)，檢測rRSV/mGMCSF、rRSV/CAT和wtrRSV病毒的體外生長(圖12)。這表明rRSV/mGMCSF和rRSV/CAT病毒的生長基本上沒有區(qū)別，與wt重組RSV相比，有一定程度的延遲和降低(最大差異是感染40小時后rRSV/CAT和wt rRSV間相差52倍)。這些結(jié)果與一般觀察一致額外基因插入RSV基因組使其體外生長減毒，如在前述實施例中的詳細說明。該效果可能因為基因組長度的增加，或轉(zhuǎn)錄盒數(shù)量的增加，或兩種情況都有，但似乎不特異于GM-CSF蛋白。此外，人和鼠GM-CSF在生物學(xué)活性和受體結(jié)合方面沒有交叉反應(yīng)性(Quesniaux和Jones，pp.35-670，in The Cytokines，A.W.Thomas(ed.)，Academic Press，1998)，因此，該鼠細胞因子在人細胞系，HEp-2細胞中應(yīng)無活性。
為評價rRSV/mGMCSF在體內(nèi)的復(fù)制，在每只動物鼻內(nèi)以106PFU的rRSV/mGMCSF、rRSV/CAT或wt rRSV感染BALB/c小鼠。注意，在相同實驗中，評行分析了rRSV/mIFNγ和rRSV/mIL-2，結(jié)果如上述。各組動物在感染后3，4，和5天被處死，噬菌斑分析檢測病毒在上(鼻甲)下(肺)呼吸道的濃度(表4)。如上所述，除了第3天在肺中，低0.4log10，盡管小但也是統(tǒng)計學(xué)顯著的差異(p＜0.01)，rRSV/CAT與wt rRSV在所有時間點任何位點的復(fù)制都沒有明顯差異。rRSV/mGMCSF的效價在任何時間點兩個位點都低于兩種其它病毒，但僅第5天在肺中與rRSV/CAT和wt rRSV相比的差異是統(tǒng)計學(xué)上顯著的(比wt rRSV和rRSV/CAT大約降低5倍，p分別小于0.01和0.001)。表4.BALB/c小鼠上(鼻甲)下(肺)呼吸道中野生型rRSV、rRSV/CAT和rRSV/mGMCSF的復(fù)制a
a0天光麻醉下在小鼠鼻內(nèi)施用106PFU/每只動物的指定病毒，并在3，4和5天處死動物。
b確定鼻甲和肺組織中病毒效價，以平均效價±標(biāo)準誤差(log10Pfu/g組織)，n＝5表示。
c-f斯化t-檢驗同一列值值中統(tǒng)計學(xué)顯著性c.p＜0.05；d.p＜0.01；e.p＜0.02；f.p＜0.001；其它p值超過0.05。
為了評價rRSV/mGMCSF的免疫原性，如上所述用rRSV/mGMCSF、rRSV/CAT或wt rRSV感染小鼠，在0天(即在感染前)，28和56天采集血清樣品(表5)。各病毒都誘導(dǎo)高效價的RSV中和血清抗體。與rRSV/mGMCSF病毒相關(guān)的效價比用wt rRSV或rRSV/CAT病毒觀察到的高1.5-2倍。此外，利用純化RSV F蛋白做抗原，ELISA測定RSV特異血清IgA，IgG1，IgG2a，和總IgG的效價(表5)。wt rRSV和rRSV/CAT病毒間抗體效價無顯著差異。相反，rRSV/mGMCSF病毒誘導(dǎo)的IgG1和總IgG抗體效價分別比wt rRSV高9.2和4.9倍。作為對比，先前的實施例中，rRSV/IFNγ病毒誘導(dǎo)的IgG1和總IgG效價分別比wt rRSV高7倍和4倍。因此，小鼠中RSV的免疫原性因mIFNγ或mGM-CSF的共表達而增加。
表5.在第0(免疫前)，28，56天RSV血清抗體效價(倒數(shù)平均值log2±標(biāo)準誤差)α
a各組使用8只小鼠。第56天的抗體效價在獨立的分析中測定。注意IG亞型的ELISA數(shù)據(jù)不能與先前實施例中接種rRSV/mIFNγ或RSV/mIL-2病毒的動物精確比較，因為使用了不同的ELISA切斷。但可以進行定性比較。
各組中小鼠在56天受到攻擊，每只動物鼻內(nèi)接種106PFU的wtRSV。4天后，即第60天，處死小鼠，測定上下呼吸道的病毒效價(未發(fā)表資料)。先前感染的所有動物表現(xiàn)對攻擊病毒復(fù)制的高水平抗性。先前感染了rRSV/CAT或rRSV/mGMCSF的動物中不能檢測出攻擊病毒的復(fù)制(鼻甲中平均效價為＜2.0 log10PFU/g和肺中為＜1.7 log10PFU/g)，而在先前免疫了wt rRSV的動物中檢測出低水平的RSV(鼻甲中平均效價為2.3 log10PFU/g和肺中為＜1.7 log10PFU/g)。相反，先前未感染的動物鼻甲和肺中平均效價為4.7 log10Pfu/g。因此這三種病毒在誘導(dǎo)對再感染的高水平抗性的能力方面不能區(qū)別。
檢測了rRSV/mGMCSF比對wt rRSV的總肺CD4+T淋巴細胞應(yīng)答。106PFU的rRSV/mGMCSF或wt rRSV感染或模擬品感染小鼠。在第4和10天各組的4只動物被處死，收集肺并加工分離總肺單核細胞。各組中剩余的小鼠在第28天以106PFU的wt RSV鼻內(nèi)攻擊，攻擊后4和10天(第32和38天)，每組4只動物被處死，收集肺并分離單核細胞。使用上述rRSV/mIL-2病毒中的方法，免疫染色CD4+標(biāo)記，流式細胞分析總肺單核細胞，Th2標(biāo)志細胞因子IL-4，或Th1標(biāo)志細胞因子IFNγ在胞內(nèi)的表達。來自動物個體的細胞被單獨處理。
最初感染后4天，接種rRSV/mGMCSF或wt rRSV的動物表現(xiàn)CD4+淋巴細胞(IFNγ陽性，IL-4陽性或雙陽性)百分比的增加(表6)，但兩個病毒應(yīng)答程度相似，不太高(IFNγ陽性3.43-3.79％，未感染對照為1.04％)。相反，第10天，接種rRSV/mGMCSF動物顯示水平極高的IFNγ陽性的CD4+淋巴細胞(21.4％％，wt rRSV感染的動物為6.7％％，未感染對照為2.4％)。IL-4陽性CD4+細胞的百分比則低的多，在任意一天都表現(xiàn)少量增加(第10天值對rRSV/mGMCSF是1.72％，對RSV感染的動物是1.08％，未感染對照為1.15％)。小鼠被攻擊時，接種wt rRSV或rRSV/mGMCSF的動物具有強的二級應(yīng)答，在第38天，有大約20.5％的細胞是IFNγ陽性。相反，表達IL-4的CD4+淋巴細胞百分比與未感染RSV的動物相同。因此，感染時RSV基因組表達mGM-CSF導(dǎo)致Th1 CD4+淋巴細胞的強烈刺激，IFNγ陽性細胞的百分比比初次RSV感染產(chǎn)生的高3倍以上，與二次RSV感染相關(guān)的二級應(yīng)答所產(chǎn)生的IFNγ陽性細胞的百分比相當(dāng)。
表6.流式細胞分析從感染野生型RSV或rRSV/GMCSF的小鼠中分離到的總肺CD4+細胞a
a0天時在小鼠鼻內(nèi)接種106PFU/每只動物的指定病毒，或模擬品感染。各組動物在第4和10天收集(多數(shù)情況下，每天處死每組動物中的4只)。剩余動物在28天接受106PFU wt RSV/每只動物的攻擊，在32和38天處死每組4只的動物。免疫染色CD4，IFNγ和IL-4，用流式細胞分析總肺單核細胞。以CD4+淋巴細胞百分比表示數(shù)值，顯示了標(biāo)準誤差。Dbl+表示IFNγ和IL-4都為陽性。
廣泛地認為偏向Th1的T淋巴細胞應(yīng)答是抗RSV的保護性免疫應(yīng)答的標(biāo)志，而非免疫病理學(xué)反應(yīng)(Connors等，J.Virol.685321-5325，1994；Waris等，J.Virol.702852-2860，1996；Hussell等，Eur.J.Immunol.273341-3349，1997；Fischer J.E，J.Virol.718672-8677；在此引用作為參考)。分泌IFN的CD4+淋巴細胞增加的水平顯示rRSV/mGMCSF病毒刺激一種極為偏向Th1亞型的免疫應(yīng)答。事實上，RSV感染本身就刺激偏向Th1的應(yīng)答，這可能是由于自然殺傷細胞和CD8+T淋巴細胞所產(chǎn)生的IFN(Hussell等，Eur.J.Immunol.273341-3349，1997；Srikiatkhachom等，J.Exp.Med.186421-432，1997；Spender等，J.Gen.Virol.791751-1758，1998，在此引用作為參考)。因此對rRSV/mGMCSF病毒的免疫應(yīng)答類似自然的感染，但大大增強了。RNA酶保護實驗對總肺mRNA的分析顯示wt rRSV或rRSV/mGMCSF的感染導(dǎo)致IFN和IL-12 p40亞單位mRNA的增加，與偏向Th1的應(yīng)答相一致，這種應(yīng)答對rRSV/mGMCSF病毒更強。
總而言之，重組RSV在BALB/c小鼠模型中共表達mGMCSF(i)導(dǎo)致病毒生長的適量減毒，(ii)增加RSV特異的血清IgG1和總IgG的表達，和(iii)初始感染時增加表達IFNγ的總肺CD4+T淋巴細胞的應(yīng)答。這種增加似乎依賴于mGM-CSF的進行性表達，因為其并不在wt rRSV后來的攻擊中消失。病毒生長的減毒可能在CD4+T淋巴細胞應(yīng)答的所觀察增加的結(jié)果，IFNγ產(chǎn)量的增加，或RSV特異的抗體的增加，或可能包括其它在此不為監(jiān)測到的因子，如CD8+或NK細胞的激活和增殖，或其它抗病毒細胞因子分泌的刺激，如I型IFNs或αTNF。因此，RSV感染中共表達GM-CSF增加了免疫應(yīng)答的強度，并保持強烈的偏向CD4+淋巴細胞的Th1亞型。這些對于RSV疫苗是非常有利的，并且可能未被預(yù)測到。實施例IV編碼鼠IL-4的重組RSV的構(gòu)建人IL-4長153氨基酸，加工為129氨基酸的分泌形式。IL-4由活性T淋巴細胞，肥大細胞，和嗜堿性細胞產(chǎn)生，作用于多種細胞(Chopart等，細胞因子手冊，A.W.Thomson(ed.)，p133-174，學(xué)術(shù)出版社，1998，在此引用作為參考)。IL-4的一個重要作用是誘導(dǎo)T輔助細胞前體分化為Th2亞型，而IFNγ和IL-2的效果是促進其分化為Th1亞型。Th1和Th2亞型被在小鼠和在較小程度上人中作了定性，并且作為泛化與細胞介導(dǎo)的細胞毒和炎癥反應(yīng)應(yīng)答(Th1)，對偏向產(chǎn)生抗體，尤其是IgE，以及嗜酸性細胞增殖和功能(Th2)的應(yīng)答相關(guān)(Mosmann andSad，Immunol.Today 17138-146，1996，在此引用作為參考)。
依據(jù)上述rRSV/mIL-2、rRSV/mIFNγ和rRSV/mGM-CSF總策略，構(gòu)建了反基因組cDNA，其含有在RSV基因起始和基因終止信號控制下的，插入G-F基因間隔區(qū)的mIL-4基因。該反基因組cDNA用于回收rRSV/mIL-4病毒。該重組病毒在細胞培養(yǎng)中生長略有減毒，復(fù)制效率與包含CAT，mIFNγ，mIL-2和mGM-CSF的其它rRSV病毒基本沒有區(qū)別。培養(yǎng)細胞感染rRSV/mIL-4病毒后，高水平的IL-4被分泌到細胞培養(yǎng)基。rRSV/mIL-4病毒接種BALB/c鼠后，其復(fù)制效率與rRSV/CAT和野生型RSV病毒(在體內(nèi)不減毒)基本沒有區(qū)別。因此，mIL-4的共表達不造成RSV復(fù)制的減毒。免疫rRSV/mIL-4的小鼠對野生型RSV后來的攻擊有強的抗性。
以上這些實施例表述了由rRSV表達單個的鼠細胞因子，以及其在BALB/c鼠中的評價。這些結(jié)果表明一種作例證的細胞因子，即mIFNγ的表達，使RSV高度減毒。mIL-2的表達中度的減毒，mGM-CSF略有減毒，mIL-4不減毒。盡管rRSV/mIFNγ病毒高度減毒，其免疫原性沒有降低。這可能反映了其表達的細胞因子，mIFNγ的生物活性。對于rRSV/mGM-CSF病毒也觀察到免疫原性增強的證據(jù)。因此，由rRSV共表達免疫調(diào)節(jié)分子有兩個優(yōu)點即，減毒和免疫原性增加。這些都是RSV疫苗很理想的表型特征。
基于鼠模型中表明的結(jié)果，含有相應(yīng)人細胞因子基因的其它重組RSV可被容易地在靈長類動物模型中使用并評價作為疫苗使用。由于小鼠是唯一對RSV感染是半許可性的，預(yù)期在小鼠模型中觀察到的效果在靈長類將會增強，其中高水平的RSV復(fù)制和基因表達將產(chǎn)生更高水平的RSV抗原和細胞因子。除了本發(fā)明這些方面，多種其它的免疫調(diào)節(jié)分子可根據(jù)本發(fā)明，被引入重組RSV中。IL-8是一種有前景的候選者，其是一個Th1型細胞因子，在刺激IFNγ產(chǎn)生和刺激NK細胞和細胞毒T細胞中有重要作用(Dinarello等，J.Allergy Clin.Immunol.10311-24，1999，在此引用作為參考)。
微生物保藏信息以下材料已保藏在美國典型培養(yǎng)物保藏中心(10801 UniversityBoulevard，Manassas，Virginia 20110-2209)，遵循布達佩斯條約，并命名如下質(zhì)粒 保藏號 保藏日期cpts RSV 248 ATCC VR 2450 1993年3月22日cpts RSV 248/404 ATCC VR 2454 1993年3月22日cpts RSV 248/955 ATCC VR 2453 1993年3月22日cpts RSV 530 ATCC VR 2452 1993年3月22日cpts RSV 520/1009ATCC VR 2451 1993年3月22日cpts RSV 530/1030ATCC VR 2455 1993年3月22日RSV B-1 cp 52/2B5ATCC VR 2542 1996年9月26日RSV B-1 cp 23ATCC VR 2579 1997年7月15日p3/7(131)ATCC979901997年4月18日p3/7(131)2G ATCC979891997年4月18日p218(131)ATCC979911997年4月18日盡管為清晰理解目的，上述發(fā)明通過實施例進行了詳細描述，業(yè)內(nèi)人士可以很清楚地了解，在不局限于其表述方式的附錄的范圍內(nèi)，該公布可以有某些變化和修飾。
序列表<110>美國政府健康及人類服務(wù)部彼得·L·柯林斯亞歷山大·布克列耶夫布賴恩·R·墨菲斯蒂芬·S·懷特黑德<120>表達免疫調(diào)節(jié)分子的重組呼吸道合胞病毒的制備<130>15280-388000PC<140><141><150>60/143,425<151>1999-07-13<160>10<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>41<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述針對MIFNy的基因起始附著寡核苷酸<400>1tatacccggg atggggcaaa tatgaacgct acacactgca t 41<210>2<211>44<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述針對MIFNy的基因末端附著寡核苷酸<400>2attacccggg aatttttaat aacttcagca gcgactcctt ttcc44<210>3<211>41<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述具有基因起始序列的IL-2PCR引物<400>3tatacccggg atggggcaaatatgtacagc atgcagctcg c41<210>4<211>44<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述具有基因末端序列的IL-2PCR引物<400>4attacccggg aatttttaat aactttattg agggcttgtt gaga44<210>5<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述具有基因起始序列的IFNy插入片段的側(cè)翼序列<400>5cccgggatgg ggaaataatg 20<210>6<211>23<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述具有基因末端序列的IFNy插入片段的側(cè)翼序列<400>6tgaagttatt aaaaattccc ggg 23<210>7<211>14<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述XmaI連接的序列詳情<400>7aggccccggg gcct 14<210>8<211>83<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述具有基因起始序列的GMLsF插入片段的側(cè)翼序列<400>8agttacttaa aaacatatta tcacaaaagg ccccggggcc ttgaccaaacttaaacagaa 60tcaaaataaa ctctggggca aat 83<210>9<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述具有基因末端序列的GMLsF插入片段的側(cè)翼序列<400>9cccgggatgg ggcaaatatg 20<210>10<211>23<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述XmaI連接的序列詳情<400>10taaagttatt aaaaattccc ggg 2權(quán)利要求
1.一種分離的感染性呼吸道合胞病毒(RSV)，包含重組RSV基因組或反基因組，核殼蛋白(N)、核殼磷蛋白(P)、大聚合酶蛋白(L)和RNA聚合酶延伸因子，其中該重組基因組或反基因組摻入了編碼一種免疫調(diào)節(jié)分子的異源多核苷酸序列。
2.權(quán)利要求1的重組RSV，其中免疫調(diào)節(jié)分子是細胞因子、趨化因子、酶、細胞因子拮抗劑、趨化因子拮抗劑、表面受體、可溶性受體、附著分子或配基。
3.權(quán)利要求2的重組RSV，其中免疫調(diào)節(jié)分子是細胞因子，選自白介素2(IL-2)、白介素4(IL-4)、γ干擾素(IFNλ)或粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)。
4.權(quán)利要求2的重組RSV，其中細胞因子是γ干擾素(IFNλ)。
5.權(quán)利要求2的重組RSV，其中細胞因子是粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)。
6.權(quán)利要求2的重組RSV，其中細胞因子是白介素2(IL-2)。
7.權(quán)利要求2的重組RSV，其中細胞因子是白介素4(IL-4)。
8.權(quán)利要求1的重組RSV，其中細胞因子導(dǎo)入所述重組基因組或反基因組，使重組RSV與野生型或突變親本病毒相比被賦予了一種或多種所需的表型改變，包括(i)在細胞培養(yǎng)中病毒生長的改變，(ii)在哺乳動物宿主的上和/或下呼吸道中減毒，(iii)病毒噬菌斑大小的改變，或(iv)細胞病原性的改變，或與野生型或突變親本病毒引發(fā)的宿主免疫應(yīng)答相比被賦予了一種或多種改變了的宿主免疫應(yīng)答，選自抗RSV中和抗體應(yīng)答，T輔助細胞應(yīng)答，細胞毒T細胞(CTL)應(yīng)答，和/或自然殺傷(NK)細胞應(yīng)答。
9.權(quán)利要求1的重組RSV，其中病毒在細胞培養(yǎng)中的生長，與相應(yīng)野生型或突變親本RSV株相比，減毒約10-15倍或更多。
10.權(quán)利要求1的重組RSV，其中該重組病毒在細胞培養(yǎng)基中表達的免疫調(diào)節(jié)分子的水平約10-20微克/106細胞，或更多。
11.權(quán)利要求1的重組RSV，其中該病毒在細胞培養(yǎng)中的生長和在哺乳動物宿主的上下呼吸道的復(fù)制都是減弱的，并且其中該病毒在免疫接種的宿主內(nèi)引發(fā)抗RSV的保護性免疫應(yīng)答。
12.權(quán)利要求1的重組RSV，其中該病毒由感染細胞中表達的免疫調(diào)節(jié)分子的活性而減毒。
13.權(quán)利要求1的重組RSV，其中該病毒所誘導(dǎo)的血清IgG的效價比野生型RSV誘導(dǎo)的血清IgG的效價高2-10倍，或更多。
14.權(quán)利要求1的重組RSV，其中所述基因組或反基因組被進一步修飾，引入一種或多種生物學(xué)衍生突變?nèi)薘SV中鑒定的減毒突變。
15.權(quán)利要求14的重組RSV，其中所述基因組或反基因組摻入一組生物學(xué)衍生突變?nèi)薘SV株中存在的至少一個直至全套減毒突變，所述組包括cpts RSV 248ATCC VR 2450)；cpts RSV 248/404(ATCCVR 2454)；cpts RSV 248/955(ATCC VR 2453)；cpts RSV 530(ATCCVR 2452)；cpts RSV 530/1009(ATCC VR 2451)；cpts RSV 530/1030(ATCC VR 2455)；RSV B-1 cp52/2B5(ATCC VR 2542)和RSV B-1cp23(ATCC VR 2579)。
16.權(quán)利要求14的重組RSV，其中所述基因組或反基因組摻入至少一個直至全部決定以下氨基酸替代的減毒突變，包括RSV N基因內(nèi)的Val267，RSV F基因內(nèi)的Glu218和/或Thr523，RSV聚合酶基因L內(nèi)的Asn43，Cys319，Phe521，Gln831，Met1169，Tyr1321，和/或His1690，和M2基因起始序列內(nèi)的核苷酸替代。
17.權(quán)利要求14的重組RSV，其中所述基因組或反基因組摻入至少兩個減毒突變。
18.權(quán)利要求14的重組RSV，其中所述基因組或反基因組至少包含一個減毒突變，指定該突變的密碼子內(nèi)多個核苷酸的改變使這種減毒突變得以穩(wěn)定。
19.權(quán)利要求1的重組RSV，其中所述基因組或反基因組包含決定以下表型改變的額外的核苷酸修飾，表型改變選自細胞培養(yǎng)時的生長、減毒、溫度敏感、冷適應(yīng)、噬菌斑大小、宿主范圍限制、抗原的表達或免疫原性的變化。
20.權(quán)利要求19的重組RSV，其中額外的核苷酸修飾改變了該重組RSV的SH，NS1，NS2，M2ORF2或G基因。
21.權(quán)利要求20的重組RSV，其中SH，NS1，NS2，M2 ORF2或G基因被整體或部分地缺失，或通過移碼或在基因讀碼框內(nèi)引入一個或多個終止子或翻譯起始位點的修飾，基因的表達被降低或消除。
22.權(quán)利要求19的重組RSV，其中額外的核苷酸修飾在重組RSV基因組或反基因組中包括選定基因的順式作用調(diào)節(jié)序列核苷酸的缺失，插入，替代，添加或重排。
23.權(quán)利要求19的重組RSV，其中NS1或NS2基因的基因終止(GE)信號被修飾。
24.權(quán)利要求19的重組RSV，其中額外的核苷酸修飾在重組RSV基因組或反基因組中包括翻譯起始位點的插入，缺失，替代，或重排。
25.權(quán)利要求24的重組RSV，其中分泌形式的RSV G糖蛋白的翻譯起始位點被去除。
26.權(quán)利要求19的重組RSV，其中所述基因組或反基因組被修飾成編碼非RSV分子，這些非RSV分子選自一種或多個T輔助細胞表位，限制性位點標(biāo)記，或在哺乳動物宿主中引發(fā)保護性免疫應(yīng)答的微生物病原體的蛋白。
27.權(quán)利要求19的重組RSV，其中所述基因組或反基因組摻入來自副流感病毒(PIV)的基因或基因組區(qū)段。
28.權(quán)利要求27的重組RSV，其中基因組或反基因組區(qū)段編碼PIV HN或F糖蛋白，或免疫原性的結(jié)構(gòu)域或其表位。
29.權(quán)利要求27的重組RSV，其中基因組區(qū)段編碼PIV1，PIV2，或PIV3 HN或F的胞內(nèi)域或免疫原性表位。
30.權(quán)利要求1的重組RSV，其中基因組或反基因組包含人或牛RSV的部分或完整的RSV背景基因組或反基因組，其組合了不同RSV的異源基因或基因組區(qū)段，形成人-牛嵌合RSV基因組或反基因組。
31.權(quán)利要求30的重組RSV，其中異源基因或基因組區(qū)段編碼RSV F，G或SH糖蛋白，或免疫原性的結(jié)構(gòu)域或其表位。
32.權(quán)利要求30的重組RSV，其中異源基因或基因組區(qū)段替代在部分RSV背景基因組或反基因組內(nèi)相對應(yīng)的基因或基因組區(qū)段。
33.權(quán)利要求30的重組RSV，其中異源基因或基因組區(qū)段在靠近或在部分或完整RSV背景基因組或反基因組內(nèi)的非編碼區(qū)處添加。
34.權(quán)利要求30的重組RSV，其中嵌合基因組或反基因組包含部分或完整的人RSV背景基因組或反基因組，其組合了來自牛RSV的異源基因或基因組區(qū)段。
35.權(quán)利要求30的重組RSV，其中嵌合基因組或反基因組包含部分或完整的牛RSV背景基因組或反基因組，其組合了來自人RSV的異源基因或基因組區(qū)段。
36.權(quán)利要求34的重組RSV，其中一個或多個人RSV糖蛋白基因F，G，和SH，或編碼胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域，跨膜結(jié)構(gòu)域，胞內(nèi)域，或其免疫原性表位的基因組區(qū)段，替代了在牛RSV背景基因組或反基因組內(nèi)相對應(yīng)的基因或基因組區(qū)段。
37.權(quán)利要求36的重組RSV，其中一個或兩個人RSV糖蛋白基因F和G替代在牛RSV背景基因組或反基因組內(nèi)一個或兩個相對應(yīng)的F和G糖蛋白基因。
38.權(quán)利要求37的重組RSV，其中人RSV糖蛋白基因F和G均替代了在牛RSV背景基因組或反基因組內(nèi)相對應(yīng)的F和G糖蛋白基因。
39.權(quán)利要求36的重組RSV，其中異源基因或基因組區(qū)段來自人RSV亞型A或亞型B。
40.權(quán)利要求36的重組RSV，其中人-牛嵌合基因組或反基因組摻入來自人RSV亞型A和亞型B的抗原決定簇。
41.權(quán)利要求1的重組RSV，其是病毒。
42.權(quán)利要求1的重組RSV，其是亞病毒顆粒。
43.一種刺激個體免疫系統(tǒng)誘導(dǎo)抗RSV的保護的方法，包含以足夠的免疫量的權(quán)利要求1的重組RSV組合生理學(xué)上可接受載體給個體施用。
44.權(quán)利要求43的方法，其中重組RSV的給藥劑量為103-107PFU。
45.權(quán)利要求43的方法，其中重組RSV被給藥于上呼吸道。
46.權(quán)利要求43的方法，其中重組RSV通過噴灑，小滴或氣溶膠方式給藥。
47.權(quán)利要求43的方法，其中重組RSV給藥于對RSV抗體為血清反應(yīng)陰性的個體，或給藥于具有來自胎盤自母體的獲得的抗RSV抗體的個體。
48.權(quán)利要求43的方法，其中與相應(yīng)野生型或突變親本RSV株的生長和抗原表達相比，重組RSV減毒并表現(xiàn)抗原表達的增加。
49.權(quán)利要求43的方法，其中重組RSV引發(fā)抗人RSV A，人RSVB，或抗這兩者的免疫應(yīng)答。
50.一種引發(fā)抗RSV免疫應(yīng)答的免疫原性組合物，含有在生理學(xué)上可接受載體中包含的足夠免疫量的權(quán)利要求1的重組RSV。
51.權(quán)利要求50的免疫原性組合物，配制劑量為103-107PFU。
52.權(quán)利要求50的免疫原性組合物，配制成用于通過噴灑，小滴或氣溶膠方式給藥于上呼吸道的形成。
53.權(quán)利要求50的免疫原性組合物，其中與相應(yīng)野生型或突變親本RSV株的生長和抗原表達相比，重組RSV表現(xiàn)減毒性和抗原表達的增加。
54.權(quán)利要求50的免疫原性組合物，其引發(fā)抗人RSV A，人RSVB，或抗這兩者的免疫應(yīng)答。
55.一種包括RSV基因組或反基因組的分離的多核苷酸分子，所述基因組或反基因組經(jīng)修飾摻入了編碼免疫調(diào)節(jié)分子的多核苷酸序列。
56.權(quán)利要求55的分離的多核苷酸，其中免疫調(diào)節(jié)分子是細胞因子。
57.權(quán)利要求56的分離的多核苷酸分子，其中細胞因子選自白介素2(IL-2)，白介素4(IL-4)，白介素5(IL-5)，白介素6(IL-6)，白介素18(IL-18)，α腫瘤壞死因子(TNF)，γ干擾素(IFNλ)，或粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)。
58.權(quán)利要求55的分離的多核苷酸分子，其中所述基因組或反基因組被進一步修飾，引入了一個或多個在生物和衍生突變?nèi)薘SV中鑒定的減毒突變，其中人RSV糖蛋白基因F和G均替代在牛RSV基因組或反基因組內(nèi)相對應(yīng)的F和G糖蛋白基因。
59.權(quán)利要求55的分離的多核苷酸分子，其中基因組或反基因組包含額外的核苷酸修飾，其決定以下表型變化選自生長特性，減毒，溫度敏感性，冷適應(yīng)，噬菌斑大小，宿主范圍限制或免疫原性的改變。
60.權(quán)利要求59的分離的多核苷酸分子，其中通過整體或部分地缺失SH，NS1，NS2，G基因或M2-2 ORF，或通過引入移碼或在基因的讀碼框中引入終止子，基因組或反基因組被修飾從而降低或消除基因的表達。
61.權(quán)利要求60的分離的多核苷酸分子，其中SH，NS1，NS2，G基因或M2-2 ORF被整體或部分地缺失。
62.權(quán)利要求59的分離的多核苷酸分子，其中核苷酸修飾包括在RSV基因組或反基因組內(nèi)的選定的RSV基因的順式作用調(diào)節(jié)序列核苷酸的缺失，插入，添加或重排。
63.一種從一個或多個分離的、編碼RSV的多核苷酸分子中生產(chǎn)感染性減毒RSV顆粒的方法，包括在細胞或無細胞裂解液中表達表達載體，該載體包含分離的多核苷酸，該多核苷酸包含被修飾摻入編碼免疫調(diào)節(jié)分子和RSV N、P、L和RNA聚合酶延伸因子蛋白的重組RSV基因組或反基因組。
64.權(quán)利要求63的方法，其中重組RSV基因組或反基因組和N、P、L和RNA聚合酶延伸因子蛋白由兩個及多個的不同的表達載體表達。
65.權(quán)利要求1的分離的感染性重組RSV，其中重組基因組或反基因組包含部分或完整的RSV載體基因組或反基因組，其組合了編碼一個或多個異源病原體的一個或多個抗原決定簇的一個或多個異源基因或基因組區(qū)段。
66.權(quán)利要求65的分離的感染性重組RSV，其中所述一個或多個異源病原體是異源RSV，而所述異源基因或基因組區(qū)段編碼一個或多個RSV NS1，NS2，N、P、M、SH，M2(ORF1)，M2(ORF2)，L，F(xiàn)或G蛋白或其片段。
67.權(quán)利要求65的分離的感染性重組RSV，其中載體基因組或反基因是部分或完整的RSV A基因組或反基因組，并且編碼抗原決定簇的異源基因或基因組區(qū)段是RSV B亞型病毒。
68.權(quán)利要求65的分離的感染性重組RSV，其中所述嵌合基因組或反基因組摻入一個或多個決定減毒的BRSV基因或基因組區(qū)段。
69.權(quán)利要求65的分離的感染性重組RSV，其中編碼一個或多個HN和/或F糖蛋白或抗原結(jié)構(gòu)域、片段或其表位的一個或多個HPIV1，HPIV2或HPIV3基因或基因組區(qū)段，被加入或摻入到部分或完整的HRSV載體基因組或反基因組。
70.權(quán)利要求65的分離的感染性重組RSV，其中載體基因組或反基因組是部分或完整的BRSV基因組或反基因組，并且編碼抗原決定簇的異源基因或基因組區(qū)段是一個或多個HRSV。
71.權(quán)利要求70的分離的感染性重組RSV，其中部分或完整的BRSV基因組或反基因組摻入編碼一種或多種選自F、G和SH的HRSV糖蛋白基因的一個或多個基因或基因組區(qū)段，或編碼HRSV F、G和/或SH胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域、胞內(nèi)域或免疫原性表位的一個或多個基因組區(qū)段。
72.權(quán)利要求65的分離的感染性重組RSV，其中載體基因組或反基因組是部分或完整的HRSV或BRSV基因組或反基因組，異源病原體選自麻疹病毒、呼吸道合胞病毒的亞型A和B、腮腺炎病毒、人乳頭瘤病毒、人免疫缺陷病毒1型和2型、單純皰疹病毒、巨細胞病毒、狂犬病病毒、EB病毒、線狀病毒、布尼亞病毒、黃病毒、甲病毒和流感病毒。
73.權(quán)利要求72的分離的感染性重組RSV，其中所述一種或多種異源抗原決定簇選自麻疹病毒HA和F蛋白、呼吸道合胞病毒的亞型A和B的F、G、SH和M2蛋白、腮腺炎病毒HN和F蛋白、人乳頭瘤病毒L1蛋白、人免疫缺陷病毒1型和2型gp160蛋白、單純皰疹病毒和巨細胞病毒的gB、gC、gD、gE、gG、gH、gI、gJ、gK、gL和gM蛋白、狂犬病病毒G蛋白、EB病毒gp350蛋白、線狀病毒G蛋白、布尼亞病毒G蛋白、黃病毒E和NS1蛋白和甲病毒E蛋白，以及其抗原結(jié)構(gòu)域、片段和表位。
74.權(quán)利要求72的分離的感染性重組RSV，其中異源病原體是麻疹病毒，而異源抗原決定簇選自麻疹病毒HA和F蛋白，以及其抗原結(jié)構(gòu)域、片段和表位。
75.權(quán)利要求74的分離的感染性重組RSV，其中轉(zhuǎn)錄單位包括麻疹病毒HA基因讀碼框(ORF)的被添加或摻入HRSV載體基因組或反基因組中。
76.權(quán)利要求1的分離的感染性重組RSV，其中重組基因組或反基因組在所述重組基因組或反基因組內(nèi)具有一個或多個移位的RSV基因或基因組區(qū)段，相對于在野生型RSV基因組或反基因組內(nèi)的位置，其移動后的位置與所述RSV基因或基因組區(qū)段位置更接近或遠離啟動子。
77.權(quán)利要求76的分離的感染性重組RSV，其中所述一個或多個移位的基因或基因組區(qū)段，是在所述部分或完整的重組RSV基因組或反基因組內(nèi)通過一個或多個移位多核苷酸缺失、插入或重排，移動到接近或遠離啟動子的位置。
78.權(quán)利要求77的分離的感染性重組RSV，其中所述移位的多核苷酸包括一種或多種長度為150核苷酸(nts)到4000核苷酸的多核苷酸的插入，其插入基因組或反基因組非編碼區(qū)(NCR)內(nèi)，或作為獨立的基因單位(GU)，所述多核苷酸的插入缺少完整的讀碼框(ORF)并在所述重組RSV中決定一種減毒表型。
79.權(quán)利要求76的分離的感染性重組RSV，其中所述移位的多核苷酸包括一個或多個RSV基因或基因組區(qū)段，選自RSV的NS1，NS2，N，P，M，SH，M2(ORF1)，M2(ORF2)，L，F(xiàn)和G基因或基因組區(qū)段，以及RSV基因或其基因組區(qū)段的前導(dǎo)、非轉(zhuǎn)錄尾區(qū)和基因間隔區(qū)域。
80.權(quán)利要求76的分離的感染性重組RSV，其中所述移位的多核苷酸包括一個或多個牛RSV(BRSV)或人RSV(HRSV)基因或基因組區(qū)段，選自RSV的NS1，NS2，N，P，M，SH，M2(ORF1)，M2(ORF2)，L，F(xiàn)和G基因或基因組區(qū)段，以及RSV基因或其基因組區(qū)段的前導(dǎo)、非轉(zhuǎn)錄尾區(qū)和基因間隔區(qū)域。
81.權(quán)利要求80的分離的感染性重組RSV，其中所述移位的多核苷酸被缺失，形成重組RSV基因組或反基因組，導(dǎo)致在所述重組RSV基因組或反基因組內(nèi)所述一個或多個移位的基因或基因組區(qū)段相對于所述RSV基因或基因組區(qū)段在野生型RSV基因組或反基因組內(nèi)的位置，移動到更加接近或遠離啟動子的位置。
82.權(quán)利要求81的分離的感染性重組RSV，其中所述移位的多核苷酸被缺失，形成包含一個或多個RSV NS1，NS2，SH，M2(ORF2)，或G基因或其基因組區(qū)段的重組RSV基因組或反基因組。
83.權(quán)利要求76的分離的感染性重組RSV，其中RSV糖蛋白基因G在所述重組RSV基因組或反基因組內(nèi)，與G的野生型基因順序位置相比重排到更加接近啟動子的基因順序位置。
84.權(quán)利要求76的分離的感染性重組RSV，其中RSV糖蛋白基因F在所述重組RSV基因組或反基因組內(nèi)，與F的野生型基因順序位置相比，重排到更加接近啟動子的基因順序位置。
85.權(quán)利要求76的分離的感染性重組RSV，其中RSV糖蛋白基因G和F在所述重組RSV基因組或反基因組內(nèi)，與G和F的野生型基因順序位置相比均重排到更加接近啟動子的基因順序位置。
86.權(quán)利要求85的分離的感染性重組RSV，其中在所述重組RSV基因組或反基因組內(nèi)，RSV糖蛋白基因G移動到基因順序位置1，RSV糖蛋白基因F移動到基因順序位置2。
87.權(quán)利要求76的分離的感染性重組RSV，其中RSV SH和NS2基因都缺失，形成重組RSV基因組或反基因組或反基因組。
88.權(quán)利要求76的分離的感染性重組RSV，其中RSV SH，NS1和NS2基因都缺失，形成重組RSV基因組或反基因組或反基因組。
全文摘要
提供了表達一種或多種免疫調(diào)節(jié)分子的重組呼吸道合胞病毒(RSV)。該重組病毒通過添加或替代編碼免疫調(diào)節(jié)分子(優(yōu)選細胞因子)的多核苷酸序列而修飾。細胞因子的增加、降低,或增強了病毒生物學(xué)和/或?qū)SV的宿主免疫應(yīng)答的一些方面,使該病毒更便于用做疫苗。本發(fā)明使用的細胞因子包括但不局限于:白介素2(IL－2),白介素4(IL－4),白介素5(IL－5),白介素6(IL－6),或白介素18(IL－18),α腫瘤壞死因子(TNF),γ干擾素(IFN),和粒細胞－巨噬細胞集落刺激因子(GM－CSF)。多核苷酸或免疫調(diào)節(jié)分子優(yōu)選地添加或替代到該重組病毒基因組或反基因組,典型地在基因間隔區(qū)或其它非編碼位點,作為一個單獨基因,也可以其它形式,如作為融合蛋白表達。
文檔編號A61K48/00GK1384883SQ00810303
公開日2002年12月11日 申請日期2000年7月12日 優(yōu)先權(quán)日1999年7月13日
發(fā)明者彼得·L·柯林斯, 亞歷山大·布克列耶夫, 布賴恩·R·墨菲, 斯蒂芬·S·懷特黑德 申請人:美國政府健康及人類服務(wù)部