專利名稱：針對黃病毒感染的重組包膜疫苗的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及涉及用于抵抗黃病毒疾病的疫苗。更具體的，本發(fā)明涉及在細胞生產(chǎn)系統(tǒng)中產(chǎn)生，并用現(xiàn)代佐劑配制的重組包膜(E)糖蛋白，該疫苗顯示能最大程度1)誘導(dǎo)據(jù)信對抵抗感染重要的高滴度病毒中和抗體，和2)向免疫接種的動物提供保護，使其抵抗烈性病毒的攻擊。
背景技術(shù)：
黃病毒科包括原型黃熱病病毒(YF)、四種血清型的登革熱病毒(DEN-1、DEN-2、DEN-3和DEN-4)、日本腦炎病毒(JE)、蜱媒腦炎病毒(TBE)和約70種其他致病病毒。黃病毒是小型包膜病毒，含有一條正鏈RNA基因組。黃病毒的包膜衍生自宿主細胞膜，嵌有病毒編碼的跨膜包膜蛋白。最大的病毒結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)E糖蛋白含有功能性結(jié)構(gòu)域，負責細胞表面吸附和核內(nèi)體融合活性。它也是宿主免疫系統(tǒng)的主要目標，誘導(dǎo)病毒中和抗體和保護性免疫力，以及抑制凝血作用的抗體。
雖然黃病毒傳播和感染病理學(xué)在不同病毒中變化很大，但是登革熱病毒是該科的一個說明性例子。登革熱病毒通過伊蚊屬(主要是埃及伊蚊(A.aegypti)和白紋伊蚊(A.albopictus)傳播給人。該病毒導(dǎo)致特征為高燒、頭痛、肌肉和關(guān)節(jié)疼痛、皮疹的疾病。一些病例(尤其在兒童中)導(dǎo)致感染的更嚴重形式，即登革出血熱/登革熱休克綜合征(DHF/DSS)，表現(xiàn)是嚴重出血，血管滲漏或兩者，導(dǎo)致休克。如果沒有及時的診斷和藥物干預(yù)，DHF/DSS的突然發(fā)作和迅速發(fā)展可能是致命的。
就全球發(fā)病率和死亡率，登革熱是節(jié)肢動物傳播的病毒中最重要的一群，估計每年有100,000,000例登革熱發(fā)生，包括25,000-50,000例DHF/DSS(Rigau Perez等，1998；Gubler，1998)。隨著全球人口增長，人口城市化(尤其在熱帶地區(qū))和缺乏對蚊子長期控制的措施，登革熱的蚊子載體將其分布擴大到了熱帶、亞熱帶和一些溫帶地區(qū)，給全世界一半以上的人群帶來了登革熱感染的危險?，F(xiàn)代的噴氣式飛機旅行和人類遷移促進了血清型登革熱的全球分布，因此在許多地區(qū)現(xiàn)在流行著多種血清型的登革熱。與此同時，登革熱流行的頻率和DHF/DSS的發(fā)生率在過去15年中增加。例如，在東南亞，DHF/DSS是兒童住院和死亡的主要原因(Hayes和Gubler，1992)。
黃病毒基因組是一條正鏈RNA分子，長約10,500個核苷酸，含有短5’和3’非翻譯區(qū)，一個長開放閱讀框，一個5’帽，和非聚腺苷酸化3’末端。已報道了各種黃病毒基因組(包括所有四種DEN血清型和YF病毒)完整的核苷酸序列(Fu等，1992；Deubel等，1986；Hahn等，1988；Osatomi等，1990；Zhao等，1986；Mackow等，1987；Rice等，1985)。該單一開放閱讀框編碼的10個基因產(chǎn)物已翻譯成按下列順序組織的一個多蛋白衣殼(C)蛋白，前膜/膜(prM/M)蛋白，包膜(E)蛋白，非結(jié)構(gòu)蛋白(NS)1、NS2a、NS2b、NS3、NS4a、NS4b和NS5(Chambers等，1990)。該多蛋白的加工是由共翻譯開始的，完全成熟需要宿主和病毒編碼的蛋白酶。已通過比較核苷酸序列和病毒蛋白質(zhì)氨基末端序列，確定了YF病毒中蛋白水解切割的位點。多蛋白加工開始后，prM在病毒釋放中被轉(zhuǎn)變成M(Wengler和Wengler，1989)，病毒在成熟過程中加工錨定的C蛋白(Nowak和Wengler，1989)。
雖然所有登革熱病毒在抗原上相關(guān)，但存在明確的4種血清型的登革熱抗原性區(qū)別。感染了一種血清型的個體提供了抵抗該血清型重新感染的長期免疫力，但不能保護免受其他血清型的感染。事實上，一種血清型感染獲得的免疫力可能潛在的增強其他血清型登革熱的病原性。這特別令人困擾，因為異源血清型的二次感染由于病毒傳播變得越來越普遍，導(dǎo)致在許多地理區(qū)域內(nèi)多種血清型共同周轉(zhuǎn)和DHF/DSS病例數(shù)增加(Rigau Perez等，1998；Gubler，1998)。Halstead(1982)顯示抗登革熱抗體能在體外增強病毒感染性，并提出血清型交叉反應(yīng)性的針對E的非中和抗體能增強體內(nèi)感染，導(dǎo)致DHF/DSS(Halstead，1981)。然而該觀點并未被普遍接受(Rosen，1989)。特別是可引起致病性增強的登革熱基因產(chǎn)物仍然是一些爭論的主題。例如，已提出對NS3專一性的血清型登革熱-交叉反應(yīng)性CD4+CD8-細胞毒性T細胞(CTL)，可通過產(chǎn)生IFN-γ和通過裂解登革熱病毒感染的單核細胞導(dǎo)致DHF/DSS發(fā)病(Kurane等，1991；Okamoto等，1998；Mathew等，1998)。近來的證據(jù)顯示，對E特異性的CTL不是血清型-交叉反應(yīng)性的，這可能提示用E亞單位疫苗不會誘導(dǎo)潛在的有害交叉反應(yīng)性CTL應(yīng)答(Livingston等，1994)。其他研究已提示NS1在DHF/DSS中的可能作用(Falconer，1997)。不論二次異源登革熱感染增強致病性的機制如何，使用四價疫苗的策略應(yīng)能避免這種并發(fā)癥?，F(xiàn)可得到的綜述有助于認識登革熱疾病的性質(zhì)、嘗試開發(fā)合適的疫苗的歷史、黃病毒共有的結(jié)構(gòu)特征、以及黃病毒包膜蛋白的結(jié)構(gòu)特征(Halstead 1988；Brandt 1990；Chambers等，1990；Mandl等，1989；Henchal和Putnak，1990；Putnak 1994；Rey等，1995；Rigau Perez等，1998；Gubler，1998；Cardosa，1998)。
雖然已尋找到許多制備登革熱疫苗的方法，但現(xiàn)在還沒有可接受的疫苗。雖然開發(fā)候選登革熱減毒活疫苗株的投入中已作出了大量努力，但迄今測試的病毒株證明是不能令人滿意的(見例如，Eckels等，1984；Bancroft等，1984；McKee等，1987)。雖然成功有限，但繼續(xù)開發(fā)和測試著候選的減毒活疫苗株(Hoke等，1990；Bhamarapravati等，1987；Dharakul等，1994；Edelman等，1994；Angsubhakorn等，1994；Vaughn等，1996)。幾種感染性全長黃病毒克隆的構(gòu)建(Rice等，1989；Lai等，1991；Sumiyoshi等，1992；Kapoor等，1995；Polo等，1997；Kinney等，1997；Gualano等，1998)促進了鑒定黃病毒毒性決定簇的研究(Bray和Lai，1991；Chen等，1995；Kawano等，1993；Cahour等，1995；Men等，1996；Hiramatsu等，1996；Pryor等，1998；Lai等，1998；Gualano等，1998；Valle和Falgout，1998)。雖然這些研究仍然非常初步幾乎未獲得毒性信息，但是這些研究衍生的cDNA克隆已被用于開發(fā)重組嵌合性登革熱疫苗株的骨架(Bray和Lai，1991；Chen等，1995；Bray等，1996；Lai等，1998)。然而，開發(fā)適當減毒的病毒株和實現(xiàn)平衡的四價制劑的困難仍然困擾著所有的活病毒疫苗法。
類似的，開發(fā)登革熱死疫苗的嘗試也只收到了有限的成功。這些研究主要收到不能從細胞培養(yǎng)系統(tǒng)中獲得足夠的病毒產(chǎn)率所限制。昆蟲細胞(如C6/36細胞)的病毒產(chǎn)量通常是104-105pfu/毫升，遠在生產(chǎn)具有成本-效益的死疫苗所需水平之下。哺乳動物細胞(包括LLC-MK2和Wero細胞)的產(chǎn)量高一些，但最高產(chǎn)量(一Vero細胞系約108pfu/ml)仍低于實現(xiàn)真正的具有成本-效益的疫苗產(chǎn)品所需的水平。
由于沒有有效的登革熱減毒活疫苗或死疫苗，因此在開發(fā)重組的登革熱亞單位或病毒-載體疫苗中投入了大量努力。用重組DNA法的許多疫苗嘗試集中于E糖蛋白。該糖蛋白是亞單位疫苗的一種合理選擇，因為它是病毒生物學(xué)和宿主對病毒免疫應(yīng)答的關(guān)鍵成分。E糖蛋白暴露于病毒表面，與細胞受體結(jié)合，介導(dǎo)融合(Chambers等，1990；Chen等，1996)。還已經(jīng)顯示它是中和抗體應(yīng)答的主要目標。針對純化的黃病毒E糖蛋白的單克隆抗體在體外具有中和性，一些已顯示能賦予體內(nèi)被動保護力(Henchal等，1985；Heinz等，1983；Mathews等，1984；Kimuro-Kuroda和Yasui，1988)。
雖然黃病毒E糖蛋白的一級氨基酸序列是不同的(45-80％相同性)，但它們都具有12個保守半胱氨酸殘基，形成6個二硫鍵，其幾乎可疊加的親水性模式提示，它們可能具有相似的二級和三級結(jié)構(gòu)。近來，以2分辨率(Rey等，1995)解譯了蜱媒腦炎(TBE)病毒包膜糖蛋白的一可溶性片段的結(jié)構(gòu)。共同合成prM和E看來對于獲得E的天然構(gòu)型是重要的。在缺乏prM時表達E可導(dǎo)致一重組產(chǎn)物，它具有一組與天然病毒顆粒不同的表位(Konishi和Mason 1993；Heinz等，1994；Matsuura等，1989)。與prM一起表達的E表位作圖提示，該共表達的蛋白質(zhì)與天然病毒更加相似。由于prM和E似乎在病毒成熟過程中形成異二聚體，而且E要經(jīng)歷酸性pH誘導(dǎo)的構(gòu)型轉(zhuǎn)變，Heinz等(1994)提出prM與E的結(jié)合是通過分泌途徑轉(zhuǎn)運中防止不可逆性pH誘導(dǎo)的構(gòu)型轉(zhuǎn)變所必需的。然而，己顯示在缺乏prM情況下表達的黃病毒E蛋白的羧端截短形式能誘導(dǎo)抵抗攻擊的保護力(Men等，1991；Jan等，1993；Coller等，未公開資料)，提示在prM缺乏時E蛋白的表達可導(dǎo)致保護性表位的出現(xiàn)。
迄今已在幾種異源表達系統(tǒng)中表達了重組登革熱E糖蛋白(見Putnak，1994和Chambers等，1997近來的綜述)。通常由于受到抗原質(zhì)量、數(shù)量或兩者的限制，對于生產(chǎn)具有成本效益的登革熱疫苗，這些系統(tǒng)被證明是無效的。下列段落著重于敘述主要的登革熱重組亞單位疫苗的嘗試，并總結(jié)迄今獲得的結(jié)果。
用大腸桿菌的大部分嘗試得到的弱免疫原不能誘導(dǎo)保護性應(yīng)答。這可能反映了細菌表達的登革熱蛋白質(zhì)不是天然構(gòu)型的，和通過分泌途徑加工病毒蛋白質(zhì)以達到正確形成二硫鍵和糖基化的必要性。雖然小鼠初步試驗提示有某種水平的效力(Srivastava等，1995；Mason等，1990)，但隨后在靈長類試驗中不能證實該效力(R.Putnak，個人通訊)。近來，將編碼DEN-2病毒包膜蛋白的氨基酸298-400(B結(jié)構(gòu)域)的基因片段融合表達成與大腸桿菌甘露糖結(jié)合蛋白的融合蛋白(Simmons等，1998)。該融合蛋白僅賦予小鼠抵抗DEN-2病毒致死劑量攻擊性感染的部分保護力，再次證明了大腸桿菌表達產(chǎn)物的效力有限。我們實驗室的工作證實大腸桿菌表達的重組產(chǎn)物不能誘導(dǎo)小鼠中登革熱的特異性免疫應(yīng)答。
使用真核酵母表達系統(tǒng)釀酒酵母和巴斯德畢赤酵母(Pichia patoris)表達登革熱E蛋白也已證明獲得的免疫原性重組產(chǎn)物的量低于所需的量。我們實驗室的工作證實在這些系統(tǒng)中實現(xiàn)的登革熱E蛋白表達水平比產(chǎn)生具有成本-效益的登革熱疫苗所需的低。其他實驗室的工作提示，該系統(tǒng)可用于產(chǎn)生病毒樣顆粒(Sugrue等，1997)。然而，表達水平也非常低，該重組產(chǎn)物誘導(dǎo)的中和抗體滴度也非常低(1∶10；Sugrue等，1997)，盡管報道該表達系統(tǒng)能非常有效的異源表達各種重組產(chǎn)物(Cregg等，1993)。
使用桿狀病毒表達系統(tǒng)產(chǎn)生黃病毒亞單位疫苗也收到了有限的成功(Putnak綜述，1994)。與各種異源蛋白質(zhì)在桿狀病毒系統(tǒng)中高表達水平的報道相反，黃病毒結(jié)構(gòu)蛋白的表達水平僅是輕度的(Deubel等，1991；Staropoli等，1997)。另外，一組抗黃病毒單克隆抗體(MAb)的反應(yīng)性表明，表達的黃病毒蛋白不存在許多構(gòu)型性敏感的表位(Deubel等，1991)。這提示桿狀病毒系統(tǒng)產(chǎn)生的重組E蛋白的折疊可能與天然病毒E蛋白不同。另外，用桿狀病毒-表達的DEN-1(Putnak等，1991)、DEN-4(Eckels等，1994)、DEN-2/DEN-3雜交體(Bielefeldt-Ohmann等，1997)、日本腦炎病毒(McCown等，1990)或黃熱病病毒(Despres等，1991)的重組包膜蛋白免疫不能誘導(dǎo)出基本滴度的病毒中和抗體，或抵抗病毒攻擊的保護力。近來，Staropoli等(1997)用親和純化的DEN-2包膜作為免疫原，能在小鼠中顯示中和性抗體和某種保護力。將截短的包膜糖蛋白的C-末端用6個組氨酸殘基(His6尾)代替最后100個氨基酸進行修飾，然而，該產(chǎn)物僅誘導(dǎo)了輕度的中和抗體滴度，在靈長類中僅顯示部分保護力(Velzing等，1999)。
有幾篇報道描述了痘病毒-黃病毒重組株可表達作為聚蛋白質(zhì)一部分的包膜蛋白。通過在表達黃病毒蛋白質(zhì)的痘病毒中共表達prM和E，獲得了最一致的成功結(jié)果。用表達日本腦炎(JE)病毒prM和E蛋白的重組痘病毒免疫小鼠，產(chǎn)生了較高的中和抗體滴度，并能在更高劑量的病毒攻擊(＞10,000LD50；Konishi等，1992)下存活。與此相比，采用僅表達E的重組痘病毒免疫的小鼠在＞10LD50病毒攻擊時不能存活(Mason等，1991)。類似的，用重組表達prM-E的痘病毒-黃熱病(YF)病毒免疫的小鼠受到保護抵御了病毒攻擊(水平相當于減毒YFV-17D疫苗)，而痘病毒-YF病毒重組株(表達E-NS1、C-prM-E-NS1或NS1)不能保護小鼠(Pincus等，1992)。表達prM-E的痘病毒-DEN-1重組株誘導(dǎo)了小鼠的中和抗體和血凝抑制抗體，而表達DEN-1 C-prM-E-NS1-NS2a-NS2b的重組株不能誘導(dǎo)E-特異性免疫應(yīng)答(Fonseca等，1994)。該技術(shù)領(lǐng)域最近缺乏進展主要與其實用性有限有關(guān)，以及與痘病毒載體用于人免疫接種的問題有關(guān)。
采用基于中國倉鼠卵巢(CHO)細胞系的哺乳動物表達系統(tǒng)來表達登革熱病毒E蛋白也是令人失望的。我們和其他實驗室的努力顯示，雖然它是產(chǎn)生各種重組產(chǎn)物的非常有用的表達系統(tǒng)(Bebbington和Hentschel，1987；Cockett等，1990；Kaufman等，1985；Kaufman，1990)，但不能有效表達DEN-2 E。DEN-2 80％E的胞內(nèi)表達水平是≤100納克/毫升，分泌不可檢測到。
因此，雖然已開發(fā)了許多異源表達系統(tǒng)，并顯示能有效產(chǎn)生某些重組產(chǎn)物，但不是所有表達系統(tǒng)都能有效產(chǎn)生所有的重組產(chǎn)物。事實上，盡管某系統(tǒng)據(jù)報道對于產(chǎn)生一種重組蛋白質(zhì)有效，但對于表達其他重組產(chǎn)物效力的預(yù)測并不總是正確的。特別是，有效表達構(gòu)型相關(guān)的黃病毒E蛋白仍然除外。上述各種各樣的細菌、真菌和昆蟲表達系統(tǒng)到哺乳動物表達系統(tǒng)都不能有效產(chǎn)生顯著量的構(gòu)型相關(guān)性黃病毒E蛋白，強調(diào)了異源基因有效表達的高度經(jīng)驗性。
過去十年內(nèi)，己開發(fā)了一種用果蠅(Drosophila melanogaster)Schneider2(S2)細胞系的另一種真核表達系統(tǒng)，它被用于有效表達人免疫缺陷病毒的包膜糖蛋白(Ivey-Hoyle等，1991；Culp等，1991；van der Straten等，1989)。在本文中，本發(fā)明具體采用果蠅S2系統(tǒng)來產(chǎn)生重組黃病毒亞單位多肽(具體例子是登革熱和日本腦炎E亞基)，并發(fā)現(xiàn)該系統(tǒng)能輕易的產(chǎn)生每升培養(yǎng)液20-50毫克重組蛋白質(zhì)(未發(fā)表)。我們大部分努力所致力的重組產(chǎn)物是一種E蛋白的可溶形式，它的羧基端被截短，得到一條代表大約80％全長E分子(氨基酸1-395；80％E)的多肽。我們表達的80％E是含有prM的一條開放閱讀框以增強上述的正確折疊和分泌。用該表達系統(tǒng)和重組DNA構(gòu)建物的組合實現(xiàn)的表達水平達到(20-50毫克/升)，遠遠超過了其他系統(tǒng)，因此提供了對于疫苗生產(chǎn)具有成本-效益的黃病毒抗原來源。另外，我們已證明這些細胞分泌的重組80％E產(chǎn)物是構(gòu)型相關(guān)的，即它能與構(gòu)型敏感的單克隆抗體結(jié)合，并能在小鼠和猴中誘導(dǎo)高滴度的病毒中和抗體(Coller等，準備發(fā)表)。
佐劑是能增強對其給定抗原的免疫應(yīng)答的物質(zhì)。1925年首次描述了在疫苗中加入免疫刺激性化合物(Ramon，1925)。從那以后，已開發(fā)了許多佐劑，但現(xiàn)在人類疫苗產(chǎn)品僅批準使用鈣鹽或鋁鹽。雖然這些佐劑對于一些疫苗是足夠有效的，但許多研究證明其他佐劑對于誘導(dǎo)體液和細胞免疫應(yīng)答更有效，而且可用于誘導(dǎo)保護性應(yīng)答。這些佐劑中的一些(包括弗氏完全佐劑(FCA)和Quil A)已顯示在動物中是十分有效的佐劑。然而，它們具有顯著的毒性或副作用，使它們不能為人用或獸用疫苗所接受。事實上，甚至最近也將氫氧化鋁與動物注射部位產(chǎn)生的肉芽腫相關(guān)聯(lián)起來，從而對其使用的安全性產(chǎn)生了關(guān)注。因為這些問題，對于開發(fā)沒有當前佐劑(如FCA)的不良副作用的強佐劑投入了大量努力。
已開發(fā)了許多現(xiàn)代佐劑制劑，并顯示具有顯著的引用前景，特別是和重組產(chǎn)物聯(lián)用的。已在設(shè)計用于檢測效力和安全性的臨床前和臨床試驗中測試了幾種這樣的現(xiàn)代佐劑。近來的幾篇綜述總結(jié)了用于開發(fā)人類疫苗的現(xiàn)代佐劑的方法(Cox和Coulter，1997；Gupta和Siber，1995；Hughes和Babiuk，1994)。如這些綜述所述，有5種主要的佐劑作用模式免疫調(diào)節(jié)、遞呈、誘導(dǎo)細胞毒性細胞應(yīng)答、靶向和儲存。各種佐劑制劑在免疫動物內(nèi)針對不同作用模式，導(dǎo)致各種應(yīng)答。對于任何給定疫苗可根據(jù)目標疾病和需要的應(yīng)答預(yù)設(shè)最優(yōu)的特異性佐劑制劑。然而，常常需要憑經(jīng)驗確定這種最佳制劑。
佐劑可用多種方法分類(Cox和Coulter，1997；Gupta和Siber，1995；Hughes和Babiuk，1994)。廣義而言有兩大類，顆粒狀或非顆粒狀佐劑。在顆粒狀佐劑中有鋁鹽、鈣鹽、油包水乳液、水包油乳液、免疫刺激復(fù)合物(ISCOM)和ISCOM基質(zhì)、脂質(zhì)體、納米和微米顆粒、蛋白質(zhì)體、病毒顆粒、硬酯酰酪氨酸和γ-菊粉。非顆粒佐劑包括胞壁酰二肽(MDP)和衍生物(如蘇氨酰MDP、胞壁肽等)、非離子嵌段共聚物、皂苷(如Quil A和QS21)、脂類A或其衍生物4’一磷酯酰脂A(MPL)、二霉菌酸海藻糖脂(TDM)、各種細胞因子(包括γ-干擾素和白細胞介素2或4)、糖類聚合物、衍生的多糖(如二乙基氨基乙基葡萄糖)和細菌毒素(如霍亂毒素或大腸桿菌不穩(wěn)定毒素)?，F(xiàn)代佐劑制劑常常設(shè)計成各種成分的組合以產(chǎn)生最大的特異性免疫應(yīng)答。
描述各種現(xiàn)代佐劑在疫苗制備中的應(yīng)用的文獻非常廣泛。許多研究已用動物模型證明，用各種重組產(chǎn)物和現(xiàn)代佐劑制劑免疫后能產(chǎn)生強免疫應(yīng)答(Vogel綜述，1998；O’Hagan 1998；Cox和Coulter，1997；Gupta和Siber，1995；Hughes和Babiuk，1994)。幾種佐劑在效力和安全性上表現(xiàn)卓越，而且正在人類臨床試驗中測試。然而，任何給定佐劑的效力是免疫原依賴性的，因此不能可靠的預(yù)測哪種組合能成功。
在最有效的現(xiàn)代佐劑中，有ISCOM和ISCOM基質(zhì)(美國專利號5,679,354)它們顯示在動物中對于流感、呼吸道合胞病毒、利什曼病、瘧疾和HIV免疫原有效(Andersson等，1999；Verschoor等，1999；Hu等，1998；Deliyannis等，1998；Papadopoulou等，1998；Bengtsson和Sjolander，1996；Barr和Mitchell，1996；Jones等，1995；Ronnberg等，1995；Takahashi等，1990)。還證明以可代謝的油配制的由脫毒的內(nèi)毒素衍生物、單磷酰脂A、二霉菌酸海藻糖酯、含或不含細胞壁骨架組成的Ribi佐劑系統(tǒng)，能在動物研究中誘導(dǎo)強免疫應(yīng)答(Baldridge和Ward，1997；Todd等，1997；Lipman等，1992；Johnson和Tomai，1990；Kenney等，1989；Tomai和Johnson，1989；Ribi等，1984)。雖然這些佐劑己顯示對于某些免疫原是有效的，但也有報道描述了比理想差的效果，包括用IscoMatrix(細粒棘球絳蟲(Echinococcus granulosus)外被抗原-Carol和Nieto，1998；單純皰疹病毒糖蛋白-Simms等，1998；利什曼主要寄生表面抗原-Sjolander等，1998)和Ribi佐劑系統(tǒng)(合成的多肽-Deeb等，1992；多殺巴斯德菌(Pasteurellamultocida)抗原-McClimon等，1994；三硝基苯酚-雞蛋清蛋白-Bennet等，1992；Smith等，1992)。因此，雖然在文獻中描述了許多佐劑的可能效力，但對任何給定免疫原和任何給定目標疾病的最佳佐劑還必需憑經(jīng)驗來確定。
我們已證明某些現(xiàn)代佐劑，特別是ISCOM基質(zhì)和Ribi佐劑系統(tǒng)(RAS)與我們果蠅表達的prM80％E黃病毒亞單位組合，獲得了一種特別強的疫苗制劑。IscoMatrix是具有iscom樣結(jié)構(gòu)的免疫調(diào)節(jié)劑，并在iscom樣結(jié)構(gòu)中含有至少一種脂質(zhì)和至少一種皂苷，和一種藥物學(xué)上可接受的載體。該組合在小鼠和猴中誘導(dǎo)了非常高滴度的病毒中和抗體，并提供了抵抗病毒攻擊的顯著保護力。然而，我們的重組prM80％E與其他現(xiàn)代佐劑的組合不能誘導(dǎo)這種強免疫應(yīng)答，提示該組合的獨特性。因此，黃病毒prM80％E表達構(gòu)建體與果蠅表達系統(tǒng)的這種獨特組合使我們克服了先前在嘗試有效產(chǎn)生重組黃病毒亞單位蛋白質(zhì)疫苗中所遇到的主要限制。在該重組產(chǎn)物中加入特異性現(xiàn)代佐劑能有效克服這個最后的障礙，產(chǎn)生了能顯著增強疫苗接種動物免疫應(yīng)答的有效的黃病毒重組亞單位疫苗。下文包括描述該獨特組合效力的實施例。
發(fā)明公開本發(fā)明提供了含有作為活性成分的果蠅細胞分泌的、重組產(chǎn)生的截短形式的黃病毒包膜糖蛋白疫苗。本發(fā)明還包括一種現(xiàn)代佐劑，作為該有效疫苗制劑的關(guān)鍵成分。該疫苗能誘導(dǎo)產(chǎn)生針對黃病毒的中和抗體，并提供保護力抵抗活病毒的攻擊。在下文說明中，所有產(chǎn)物表達為含有prM的多蛋白，采用人組織纖溶酶原激活物分泌信號序列(tPAL)從果蠅Schneider2細胞中分泌產(chǎn)生其成熟的重組80％E產(chǎn)物。
因此在一個方面，本發(fā)明涉及一種用于保護個體抵抗黃病毒感染的疫苗。該疫苗含有作為活性成分的截短的黃病毒包膜蛋白，和用于調(diào)節(jié)對包膜蛋白的免疫應(yīng)答的現(xiàn)代佐劑。該截短的E蛋白作為重組產(chǎn)生的蛋白質(zhì)可從昆蟲細胞中分泌出來。該疫苗還可以含有其他類似產(chǎn)生的截短的黃病毒E蛋白。
附圖簡述

圖1顯示了用DEN-1、-2、-3和-4prM80％E表達構(gòu)建物轉(zhuǎn)染的S2細胞的粗培養(yǎng)液的SDS-PAGE分析。
圖2代表轉(zhuǎn)染的S2細胞在生物反應(yīng)器中的典型生長曲線，以及DEN-2 80％E表達的蛋白質(zhì)印跡分析。
圖3顯示了登革熱免疫親和柱各組分的銀染色SDS-PAGE分析。
圖4顯示了成年小鼠對給予以IscoMatrix和弗氏佐劑配制的純80％E的劑量應(yīng)答。
圖5顯示了用IscoMAtrix配制的DEN-2 80％E蛋白免疫的小鼠的存活情況。
圖6證明了用幾種佐劑配制的DEN-280％E免疫的小鼠免疫力持續(xù)的時間。
圖7A-D比較了含有DEN-2 80％E蛋白的樣品凍干前和凍干后沒有喪失產(chǎn)品，沒有喪失免疫反應(yīng)性。
圖8A-C比較了不含賦形劑和含有蔗糖或海藻糖賦形劑的凍干DEN-2 80％E的穩(wěn)定性。
實施本發(fā)明的模式本發(fā)明首次提供了具有增強免疫原性的黃病毒亞單位疫苗，它可用重組表達系統(tǒng)有效產(chǎn)生和分泌，而且在誘導(dǎo)對黃病毒的強病毒中和應(yīng)答中有效。雖然已進行了許多嘗試以獲得這種亞單位疫苗，但先前的研究未能達到符合商品化疫苗產(chǎn)品所要求的抗原表達的質(zhì)和量的水平。本申請人發(fā)現(xiàn)-基因工程重組改造的羧基端截短的黃病毒包膜糖蛋白(對應(yīng)于氨基酸1-395)可被某些常規(guī)真核重組宿主有效分泌，其形式允許加工來模擬該蛋白質(zhì)的天然構(gòu)型。另外，該分泌形式能(尤其當在某些現(xiàn)代佐劑存在時施用時)在動物中產(chǎn)生高滴度的病毒中和抗體，保護這些動物抵抗活病毒的攻擊。因此，這些蛋白質(zhì)代表了有用的疫苗組分，可保護個體抵抗黃病毒感染。
本文所用的“80％E”指跨越DEN-2包膜蛋白的Met 1-Gly395的多肽。本申請中所述的序列代表登革熱2型病毒的包膜蛋白；已知還有3種不同登革熱的血清型。因此，“80％E”還指這些血清型包膜蛋白的對應(yīng)肽區(qū)域，以及任何天然存在的變體。“80％E”還指其他黃病毒(包括但不限于日本腦炎、黃熱病、蜱媒腦炎和丙型肝炎病毒)的包膜蛋白相應(yīng)的肽區(qū)域。所有80％E蛋白是由含有編碼黃病毒prM(作為與80％E的融合蛋白)的DNA的載體所產(chǎn)生的。通過細胞酶加工該融合蛋白質(zhì)以釋放成熟的80％E蛋白質(zhì)。
重組技術(shù)提供了大規(guī)模生產(chǎn)這些亞單位用于疫苗的最實際的方法。然而，為了有效，這些蛋白質(zhì)必須經(jīng)過正確的加工，采取與天然登革熱包膜蛋白相似的構(gòu)型。為了實現(xiàn)這個目的，重組生產(chǎn)必須在真核細胞(優(yōu)選果蠅細胞)中進行，因為必須實現(xiàn)有效產(chǎn)生正確加工和正確折疊的產(chǎn)物，以實現(xiàn)具有成本-效益的實用疫苗。
如前所述，己發(fā)現(xiàn)具有生物活性的、截短的成熟黃病毒包膜蛋白的有效分泌可用果蠅Schneider-2細胞最好的實現(xiàn)。該產(chǎn)物的表達是由有效的昆蟲細胞啟動子(果蠅金屬硫蛋白啟動子)驅(qū)動的，用真核細胞分泌前導(dǎo)肽(人組織纖溶酶原激活物分泌前導(dǎo)肽)和含有E的分泌信號的黃病毒prM蛋白靶向分泌。還可采用其他啟動子和分泌前導(dǎo)肽。一般本發(fā)明包括能在真核細胞中操作的表達系統(tǒng)，它導(dǎo)致截短的黃病毒包膜蛋白質(zhì)有效分泌到培養(yǎng)基中。因此，本發(fā)明所用的是含有能導(dǎo)致產(chǎn)生和分泌截短的成熟黃病毒包膜蛋白的表達系統(tǒng)的細胞和細胞培養(yǎng)物。
從細胞培養(yǎng)液中回收正確加工的截短的E蛋白，純化并配制成疫苗。純化使用標準技術(shù)，這是常規(guī)的優(yōu)化工作。必須憑經(jīng)驗確定合適的制劑(包括佐劑)。
本發(fā)明的活性疫苗可單獨使用，或與其他活性疫苗聯(lián)用，如含有減毒病毒或死病毒形式的疫苗，或含有其他可得到的活性亞單位疫苗。該疫苗可以僅含一個亞單位作為活性成分，或可加入其他分離的活性成分?？稍谝痪唧w制劑中包含一個或幾個血清型的相應(yīng)或不同的亞單位。
為了免疫個體抵抗登革熱，例如將含有亞單位的疫苗用常規(guī)免疫方案施給個體，這些方案通常涉及疫苗的多次施用。施用疫苗通常通過注射，通常肌肉內(nèi)或皮下注射；然而，還可使用其他全身性施藥模式。雖然技術(shù)還未完全開發(fā)，在本發(fā)明的范圍內(nèi)包括透粘膜和透皮制劑作為口服給藥的有效方法。
在下列實施例中，說明了分泌的黃病毒糖蛋白的表達、分泌、加工和免疫原性。作為修飾的prM-80％E融合蛋白重組產(chǎn)生的產(chǎn)物須經(jīng)宿主細胞蛋白酶有效加工，以除去prM部分并從果蠅細胞中分泌出來。分泌的80％E產(chǎn)物以高水平(達50微克/毫升)分泌。另外，根據(jù)與構(gòu)型敏感性單克隆抗體的反應(yīng)性，分泌的80％E產(chǎn)物具有類似天然的構(gòu)型，并且用80％E免疫接種小鼠和/或非人類靈長類誘導(dǎo)強病毒中和性免疫應(yīng)答。
下列實施例是為了說明但不是為了限制。
實施例1登革熱病毒RNA的分離將登革熱病毒型1、3或4感染的細胞小團在C6/36細胞中盲目傳代。收集全部培養(yǎng)物、細胞和培養(yǎng)液，在Vero細胞上滴定。以0.1pfu/細胞感染C6/36細胞的單層培養(yǎng)物，在感染后4、5和6日分別收集細胞和培養(yǎng)液。150,000xg離心3小時從澄清培養(yǎng)液中沉淀病毒。以酸性硫氰酸胍裂解病毒感染的細胞和沉淀的病毒，用苯酚-氯仿和氯仿抽提，然后用乙醇沉淀純化得到RNA。還根據(jù)該方法制備了DEN-1株258848、DEN-3株CH53489和DEN-4株H241的病毒RNA。
實施例2登革熱2prM80％E(包膜)cDNA表達克隆的制備這是根據(jù)制備方法A的方法，用2’-O-苯甲?；?6-O-烯丙基-11-氨基-3-去克拉定糖基-11-脫氧-3-氧-2-氟-15甲基紅霉素A 11，12-環(huán)氨基甲酸酯代替2’-O-苯甲?；?6-O-烯丙基-11-氨基-3-去克拉定糖基-11-脫氧-3-氧-15-甲基紅霉素A11，12-環(huán)氨基甲酸酯制備的。
用衍生自血清型登革熱2(DEN-2)的病毒株P(guān)R159/S1的cDNA克隆(Eckels等，1980，Infect.Immun.27175-180)作為產(chǎn)生所有DEN-2表達質(zhì)粒的起始材料。用cDNA克隆pC8(Hahn等，1988，Virology 162167-180)作為模板擴增編碼包膜蛋白(80％E)氨基末端80％的基因組部分。用聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)，引物D2E937p和D2E2121m實現(xiàn)了該擴增。在引物名稱中，首先標出病毒血清型(D2代表DEN-2)，然后是相應(yīng)的登革熱基因(即在次指出了包膜，E)。數(shù)字表示引物在克隆序列中采用Hahn等(1988)的編號的位置，最后的字母表示該寡核苷酸引物引導(dǎo)正(p)鏈或負(m)鏈合成。用上方的字母寫出了引物中對應(yīng)于登革熱cDNA的序列，用下方的數(shù)字寫出了非登革熱的序列。D2E937p2 ATG CGC TGC ATA GGA ATA TC-3′(SEQ ID NO1)D2E2121m TTT CTT GAA CCA G-3′(SEQ ID NO2)D2E2121m引物位于E的第395個密碼子后的兩個終止子。在該克隆銜接子中的XbaI位點消化80％E擴增的cDNA片段，并克隆入pBR322的NheI位點獲得9D280E。用鏈式終止測序法確定了克隆的80％E的核苷酸序列。該分析鑒定到在核苷酸2001處有一個PCR誘導(dǎo)的沉默突變(AAC/Asn到AAT/Asn)。
用基本如上所述亞克隆80％E的PCR擴增，構(gòu)建了所設(shè)計的編碼前膜，膜和包膜基因(prM100％E)的DEN-2 PR159/S1的cDNA克隆。該cDNA克隆包括DEN-2基因組的核苷酸439-2421(Hahn等的編號，pC8)。用合成寡核苷酸引物D2pM439p和D2E2421m，和質(zhì)粒pC8(Hahn等，1988)作為模板產(chǎn)生了登革熱cDNA片段。除了DEN-2特異性序列外，該引物緊靠前膜序列的第一個密碼子(苯丙氨酸)前含有上述相同銜接子序列(除了甲硫氨酸密碼子(ATG))。引物是D2prM439p TTT CAT CTG ACC ACA CGC-3′(SEQ ID NO3)D2E2421m CTG CAC CAT AAC TCC-3′(SEQ ID NO4)用限制性內(nèi)切酶XbaI消化PCR-產(chǎn)生的prM100％E cDNA片段，并連接入pBluescript SK+的XbaI位點(Stratagene，San Diego，CA)以獲得質(zhì)粒p29prME13。PCR產(chǎn)生的cDNA克隆的DNA序列分析鑒定到三個位于pc8和p29prMe13之間的PCT導(dǎo)入的核苷酸差異。核苷酸1255處T→C的轉(zhuǎn)變導(dǎo)致沉默突變。核苷酸1117處A→G轉(zhuǎn)變導(dǎo)致纈氨酸保守性氨基酸取代了異亮氨酸。最后在核苷酸1750處的轉(zhuǎn)變用纈氨酸代替了甲硫氨酸。
為了產(chǎn)生代表prM80％E的cDNA亞克隆，從編碼包膜羧基末端的p29prME13除去了794bpBamHI-SalI片段。用p29D280E(編碼截短的包膜糖蛋白80％E的羧基端)的431堿基對Bam HI-Sal I片段替換該片段。該BamHI位點是包膜cDNA內(nèi)天然存在的位點，而SalI位點是緊靠PCR引物編碼的終止密碼子之后的基因工程改造的位點。用限制消化和DNA序列分析確證得到的截短的cDNA克隆p48BSprM80E，以編碼整條prM蛋白質(zhì)和該包膜糖蛋白的氨基酸1-395。該cDNA保持了核苷酸1117處的轉(zhuǎn)變(異亮氨酸→纈氨酸的改變)，保持了核苷酸1255和2001處的沉默突變，但修復(fù)了核苷酸1750處的改變。
構(gòu)建的用于從果蠅S2細胞分泌DEN2 80％E的表達載體其基礎(chǔ)是pMttbns載體(Culp等，1991)。載體pMttbns基于pBR322，含有果蠅金屬硫蛋白基因啟動子(Pmtn)，人組織纖溶酶原激活物前導(dǎo)序列(tPAL)，和SV40早聚腺苷酸信號(Culp等，1991)。除去pMttbns的含有Xho I位點的15bpBam HI DNA片段，產(chǎn)生pMttΔXho，其中Bgl II和Xho I限制性內(nèi)切核酸酶位點是唯一的。通過序列分析證實了該改變。通過限制性消化質(zhì)粒p48BSprM80E并連接入用Bgl II和Xho I消化的pMttΔXho中，獲得了編碼全長的DEN2prM和包膜的氨基酸1-395的Bgl II-Sal I片段。該構(gòu)建導(dǎo)致prM80％E片段與tPAL序列融合。在組織纖溶酶原激活物正常成熟中，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的信號酶除去了該前導(dǎo)序列的20個氨基酸的前肽區(qū)域，在高爾基體中酶反應(yīng)除去了11個氨基酸的原肽區(qū)域。通過限制性消化和有限的序列分析證實了得到的質(zhì)粒pMttD2prM80％E。下文顯示了tPAL-prM80E融合基因的核苷酸序列和設(shè)計的氨基酸序列(分別是SEQ ID NO5和SEQ ID NO；6)。
前原-tPA接頭序列分別用前-tPA和原-tPA標出了tPA前肽和原肽區(qū)域，用黑體表示登革熱序列。Phe1殘基是prM蛋白質(zhì)的N-末端氨基酸，Gly395是該包膜糖蛋白氨基末端的殘基395。接頭序列包括引入異源基因序列的限制性位點。
鑒于核苷酸1117的突變(纈氨酸代替包膜氨基酸61的異亮氨酸)可能有不良作用，在pMttD2prM80％E表達克隆中糾正了該突變。我們鑒定到包含突變1117的獨特的限制性內(nèi)切核酸酶片段，使我們能夠在一個簡單步驟中用pC8的相應(yīng)片段替換pMttD2prM80％E中的該片段。因此，從pMttD2prM80E除去783bp的AflII片段(核苷酸1101-1783)，在其位置上連接pC8的相應(yīng)的AflII片段。得到的質(zhì)粒pMttD2prM80E(Ile61).4在2001位具有一個沉默突變，并產(chǎn)生與野生型病毒E蛋白質(zhì)序列等價的80％E多肽。附錄1中列出了該表達質(zhì)粒的特征和序列。由于分析中使用的軟件將文件名限于8個字母，所以附錄I中列出的質(zhì)粒名為MttprM80。
實施例3從DEN-1(病毒株2548848)、DEN-3(病毒株CH53489)和DEN-4(病毒株H241)克隆prM80％E在果蠅Schneider2細胞中克隆并表達了與DEN-2 prm80％E構(gòu)建物類似的DEN-1、-3和-4prM80％E cDNA構(gòu)建物。用于制備prM80％E cDNA的克隆策略采用了反轉(zhuǎn)錄酶-聚合酶鏈式反應(yīng)(RT-PCR)法。簡單說，如實施例1所述制備了感染的C6/36蚊子細胞沉淀的總RNA。RT-PCR反應(yīng)采用登革熱特異性的合成性寡核苷酸引物來擴增所需片段。對于DEN-1產(chǎn)生的cDNA片段含有基因組圖(DEN-1病毒株的共有序列圖)上的核苷酸422-2102；對于DEN-3，為基因組圖(根據(jù)參考病毒株D3H87)上的核苷酸437-2113；和對于DEN-4，所選片段包含基因組圖(病毒株H241)上的核苷酸441-2120。用限制性內(nèi)切核酸酶BglII和XhoI(在寡核苷酸引物中所含的位點)消化DEN-1和-4的PCR產(chǎn)物，直接克隆入用BglII和XhoI消化的果蠅表達質(zhì)粒pMttΔXho(見實施例2)。用gglII和SalI消化DEN-3的PCR產(chǎn)物，直接克隆入用BglII和XhoI消化的果蠅表達質(zhì)粒pMttΔXho中。選擇三個血清型登革熱各自的克隆進行DNA序列分析。
衍生自病毒株258848的DEN-1 prM80％E(克隆#2)分子克隆的序列分析表明，它具有一個PCR-引起的錯誤，導(dǎo)致一個氨基酸取代。然后對其他己冷凍保存但最初未測序的克隆測序。發(fā)現(xiàn)克隆#7具有無PCR錯誤的相應(yīng)的限制性片段(BglII-XbaI)，隨后用于替換克隆#2中的片段來糾正該錯誤。用序列分析驗證了所得克隆pMttDlprM80Ef.6的DNA序列，在所有隨后的表達工作中均采用該克隆。
從病毒株CH53489衍生的DEN-3 prM80％E分子克隆的序列分析證明一個克隆pMttD3prM80E.11含有天然的DEN-3序列。在所有隨后的表達工作中均采用該克隆。
衍生自病毒株H241的DEN-4 prM80％E的兩個所選的分子克隆的序列分析表明各自含有一個PCR誘導(dǎo)的錯誤，它導(dǎo)致一個氨基酸取代。選擇克隆#2用于修復(fù)，因為它在果蠅Schneider細胞中顯示有最高表達水平。對冷凍保存但最初未測序的其他4個克隆，隨后進行測序。發(fā)現(xiàn)克隆#4擁有無PCR錯誤的相應(yīng)的限制性片段，將其用于替換克隆#2中的片段來糾正該錯誤。用DNA序列分析驗證了所得克隆pMttD4prM80Ef.3的序列。
將pMttD4prM80Ef.3序列與各種出版的序列廣泛比較，表明在E氨基酸153處預(yù)測的糖基化位點周圍存在序列異源性。雖然DEN-4 H241序列的初始報道提出，該糖基化位點是完整的(Kawano等，1993)，但后來的報道(出版的(Lanciotti等，1997)和未出版的)提出在某些病毒株中，包括某些H241分離物中，未保留該糖基化位點，因為氨基酸從蘇氨酸改變成異亮氨酸。我們的克隆在該位置編碼異亮氨酸，從而不含該糖基化位點。由于缺乏該糖基化可能對產(chǎn)物的表達或免疫原性造成不良影響，我們進行了定點誘變，將E的氨基酸155位的異亮氨酸改變?yōu)樘K氨酸。用寡核苷酸定向誘變的標準技術(shù)，我們將密碼子從ATA突變?yōu)锳CA，來編碼蘇氨酸。通過序列分析證實了得到的克隆pMttprM80Ef.3+6.13，將其用于所有隨后的表達研究。
實施例4構(gòu)建JEV prM80％E的cDNA表達克隆在果蠅S2細胞中構(gòu)建并表達了與上述登革熱病毒類似的JEV構(gòu)建物。從含有JEV病毒株JaOArS9821-5576位核苷酸(Sumiyoshi等，1992)的cDNA克隆1079.14PCR擴增了編碼JEV的prM和80％E蛋白產(chǎn)物的序列。設(shè)計了寡核苷酸引物JEpM477p和JEE2177m來擴增對應(yīng)于JEV編碼prM和80％E的核苷酸477-2177的片段。5’末端引物含有BglII位點，而3’末端引物含有XhoI位點以方便克隆。用這些酶消化PCR產(chǎn)物，并直接克隆入事先用相同限制性內(nèi)切核酸酶消化的pMttΔXho載體中。通過限制性消化和有限的序列分析確認了所得表達克隆的身份。
實施例5
用表達質(zhì)粒傳染果蠅細胞果蠅表達系統(tǒng)是以S2細胞與含有感興趣的基因和選擇質(zhì)粒的表達質(zhì)粒的共轉(zhuǎn)染為基礎(chǔ)的。將這些質(zhì)粒以高拷貝數(shù)共整合入基因組中，并選擇含有整合的表達構(gòu)建物的細胞所偏愛的質(zhì)粒。在產(chǎn)生我們的細胞系中使用的選擇質(zhì)粒pCoHygro(Van der Straten等，1987；Van der Straten等，1989)攜帶有在果蠅可轉(zhuǎn)座元件長末端重復(fù)序列的轉(zhuǎn)錄控制下的大腸桿菌潮霉素B磷酸轉(zhuǎn)移酶基因，從而可賦予對潮霉素B的抗性。
在轉(zhuǎn)染前一天，將S2細胞以1×106細胞/毫升接種于含有10％熱滅活的胎牛血清(FBS；Hyclone)的4毫升Schneiders培養(yǎng)基(Gibco-BRL)中，該培養(yǎng)液置于60毫升組織培養(yǎng)皿中。用磷酸鈣共沉淀法轉(zhuǎn)染細胞(Wigler等，1977)。簡單說，將20微克表達質(zhì)粒(如pMttD2prM80E(Ile61).4)和1微克選擇質(zhì)粒pCoHygro與鈣溶液混合。將該混合物緩慢加到等體積的含有磷酸鹽的HEPES緩沖鹽中，得到細磷酸鈣-DNA沉淀。將沉淀置于S2細胞上，培養(yǎng)過夜。約16小時后，換培養(yǎng)液2次洗滌轉(zhuǎn)染細胞，重新接種在含有10％FBS的5毫升新鮮Schneiders培養(yǎng)液中。3日后，加入最終濃度為300微克/毫升的潮霉素B(Boehringer MannheimBiochemicals)。轉(zhuǎn)染后，將細胞維持在含有300微克/毫升潮霉素B的選擇性培養(yǎng)基中。所有細胞維持在26℃的濕室中。將細胞以2×106細胞/毫升接種于無血清的培養(yǎng)液(Excell400，JRH Biosciences)中，加入最終濃度0.2mM的硫酸銅誘導(dǎo)啟動子評價重組產(chǎn)物的表達。誘導(dǎo)后第7日收集細胞和培養(yǎng)上清液，用SDS-PAGE和Western印跡法評估。
實施例6分泌的黃病毒80％E產(chǎn)物的特征分析SDS-PAGE和Western印跡法對胞內(nèi)和分泌的蛋白質(zhì)的分析揭示，有效產(chǎn)生了重組的80％E產(chǎn)物(DEN-1、-2、-3、-4和JEV)，并分泌入培養(yǎng)液中?？捡R斯藍染色未濃縮的培養(yǎng)液可見～48干道爾頓(kD)的條帶，該條帶可被血清型特異性多克隆抗血清(超免疫的小鼠腹水-HMAF)識別。比較胞內(nèi)和分泌的蛋白質(zhì)證明，這些產(chǎn)物是有效分泌的。時間過程揭示，80％E蛋白質(zhì)隨時間聚集于培養(yǎng)液中。如圖1所示，在誘導(dǎo)后第7日，未克隆細胞群中分泌水平根據(jù)考馬斯染色凝膠估計是5-20毫克/升。
特別是，圖1顯示了用DEN-1、DEN-2、DEN-3和DEN-4 80％E轉(zhuǎn)染的S2細胞粗培養(yǎng)液的SDS-PAGE分析。將10微升粗培養(yǎng)液加到非還原性12％SDS-PAGE凝膠上，用考馬斯藍染色。箭頭表示80％E條帶的位置。注意在這些條件下DEN-2 80％E比DEN-1、-3和-4 80％E條帶遷移得稍慢一些。
在內(nèi)切糖苷酶處理后，用SDS-PAGE中蛋白質(zhì)分子量漂移和Western免疫印跡評估了分泌的80％E對內(nèi)切糖苷酶的敏感性。分泌的80％E對內(nèi)切糖苷酶Hf(EndoHf；New England Biolabs)消化的抗性和對肽N-糖苷酶F(PNGase F；New EnglandBiolabs)消化的敏感表明了該分泌的產(chǎn)物具有N-連接的糖基化，并提示了甘露糖-3型糖基化，這是昆蟲細胞表達系統(tǒng)的特征(數(shù)據(jù)未顯示)。
免疫熒光研究證明，未克隆群中5-25％的細胞是抗原陽性的，這些抗原陽性細胞可被許多構(gòu)型敏感性和不敏感性抗黃病毒MAb所識別。該組MAb包括各種表位特異性，包括那些登革熱型特異性、登革熱復(fù)合物和亞復(fù)合物特異性和黃病毒組特異性的MAb。表1總結(jié)了所選MAb的80％E結(jié)合活性譜。MAb與S2細胞表達的DEN-2 prM80％E的反應(yīng)性與預(yù)期的模式一致。顯示各已知與DEN-2E蛋白質(zhì)(4G2、5A2和9D12；Henchal等，1982；Megret等，1992)結(jié)合的MAb能與該亞單位抗原結(jié)合。如預(yù)期的，用S2 DEN-2 prM80％E細胞作IFA試驗，MAb 2H2(對登革熱prM/M蛋白質(zhì)特異的)是陽性的，因為prM80％E構(gòu)建物也表達M蛋白。IFA顯示對登革熱NS1蛋白質(zhì)特異性的MAb 7E11不起反應(yīng)，這與prM80％E構(gòu)建物中不存在NS1序列相一致。

*滲透的(prM)80％E轉(zhuǎn)化的果蠅細胞的間接免疫熒光分析。染色強度的主要指標-＝陰性；+＝陽性；+++＝強陽性。
實施例7用可除去的飼養(yǎng)層有限稀釋法克隆轉(zhuǎn)染的S2細胞免疫熒光研究證明，5-25％細胞對于黃病毒80％E抗原表達是陽性的(實施例6)，因此如果能將抗原陽性細胞從該混合群中克隆出來，那么表達水平可能提高。開發(fā)克隆細胞的方法，目的是實現(xiàn)克隆性純化的、高水平表達的細胞系。因為S2細胞對低細胞密度非常敏感，明顯需要優(yōu)化。
用可除去的飼養(yǎng)層實現(xiàn)了細胞亞克隆，使細胞能在亞克隆過程中存活。將細胞以特定的細胞密度接種于含有10％FBS和150微克/毫升潮霉素B的完全IPL-41培養(yǎng)基中。我們發(fā)現(xiàn)細胞在亞克隆中存活需要血清，潮霉素B的濃度必須降低到150微克/毫升，以避免潮霉素B晶體在96孔培養(yǎng)皿中沉淀。以30個細胞/毫升在96孔培養(yǎng)皿中進行第一輪亞克隆。支撐可除去飼養(yǎng)層的插入物是0.2微米Anopore膜組織培養(yǎng)插入物(Nunc)。將由同源細胞構(gòu)成的飼養(yǎng)層以1000細胞/插入物接種。一旦細胞達到匯合，除去飼養(yǎng)層，一般在1-2周之內(nèi)。一旦達到了顯著的亞克隆生長，首先讓它們在96孔中，然后在6孔，最后在60毫升組織培養(yǎng)皿中的無血清的培養(yǎng)液中擴增。最初通過在各96孔培養(yǎng)皿中誘導(dǎo)亞克隆和斑點印跡分析評估表達情況。然后擴增最佳的表達物，并邊培養(yǎng)邊誘導(dǎo)用上述的SDS-PAGE和Western印跡分析(實施例6)進行評估。如上所述主要進行第二輪和第三輪亞克隆，除了將細胞以1細胞/孔，而不是30細胞/孔接種外，插入物中的細胞數(shù)增加到10,000。
用該方法我們產(chǎn)生了克隆純化的DEN-2 80％E細胞系，它以25-35毫克/升表達80％E。表達DEN-1、DEN-3和DEN-4 80％E的細胞通過了第一輪亞克隆，達到了20-50毫克/升的表達水平。
實施例8轉(zhuǎn)化的果蠅S2細胞系的大規(guī)模培養(yǎng)大規(guī)模培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的果蠅S2細胞的嘗試采用了具有5升容器的New BrunswickScientific(NBS)Bioflo3000生物反應(yīng)器。該儀器是一種采用船用槳葉輪的攪拌罐系統(tǒng)。這些方法的開發(fā)中一個重要的考慮是所用培養(yǎng)液的成本。在靜態(tài)培養(yǎng)中，我們采用Schneider(Gibco-BRL)和Excell 400(JRH Biosciences)培養(yǎng)液培養(yǎng)果蠅細胞。當完全補充時，這些培養(yǎng)液是較貴的。因此，我們找到了一種較便宜的合適培養(yǎng)液。根據(jù)Olsen等(1992)的報道，IPL-41培養(yǎng)液(Gibco-BRL)能支持果蠅細胞的劇烈生長，成本是每升～$10。在大量運轉(zhuǎn)的基礎(chǔ)上，我們開發(fā)出了能促使有效生產(chǎn)運行的條件。該條件總結(jié)如下標準化的生物反應(yīng)器條件·培養(yǎng)基IPL-41(粉末狀；Gibco-BRL)·去離子水·培養(yǎng)基添加物(列出了培養(yǎng)基中的最終濃度)◇Yeastolate，3.33克/升(Gibco-BRL)◇脂類濃縮物，1％(v/v)(Gibcol-BRL)◇Pluronic多醇F-68，0.1％(w/v)(Gibco-BRL)·溶解氧維持在50％空氣飽和度·氣體噴射速度0.133升氣體/升培養(yǎng)基/分，用環(huán)形分布器·攪拌速度用兩個船用漿葉80rpm。
·pH6.4，用酸-堿進料維持·Schneider細胞接種密度1×106細胞/毫升·用0.2mM CuSO4誘導(dǎo)時的細胞密度2-3×106細胞/毫升·收集時的細胞密度≥1×107細胞/毫升圖2顯示了在典型生物反應(yīng)器運轉(zhuǎn)過程中80％E分泌入培養(yǎng)液的時間過程的生長曲線和相應(yīng)的Western印跡。
在該圖中，圖2a顯示了在生物反應(yīng)器中培養(yǎng)的S2 DEN-2prM80％E細胞的生長曲線，圖2b顯示了在指定時間點從同一培養(yǎng)物中取得的分泌的DEN-2 80％E的Western印跡分析。在7日誘導(dǎo)后從組織培養(yǎng)皿(“TC培養(yǎng)皿”)收集了培養(yǎng)液。
實施例9黃病毒抗原的免疫親和純化在S2細胞中各種黃病毒重組80％E亞單位均有顯著表達，以及在小鼠中測試純化的抗原的需要必須開發(fā)迅速的純化方法。最初，我們采用免疫親和層析(IAC)來純化用于在小鼠中測試的抗原。
免疫親和層析依靠抗體和抗原之間的選擇性、高親和性識別和可逆的相互作用。對于黃病毒抗原純化，選擇了兩種構(gòu)型敏感性單克隆抗體(MAb)9D12(DEN-1、-2、-3)和4G2(DEN-4，JEV)。通過在柱上加載抗體(其緩沖液已換成0.1M NaHCO3、0.5M NaCl(pH8.3)緩沖液，并在室溫下溫育3小時)使這些抗體與N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)活化的Sepharose柱偶聯(lián)。從柱上洗下未偶聯(lián)的抗體，用0.5M乙醇胺灌注柱，滅活任何剩余的NHS位點。
在層析制備中，在無細胞培養(yǎng)液中加入最終濃度0.05％(w/v)的疊氮化鈉(用10％儲液)，通過0.2微米濾膜(SerumAcrodisc，Gelman Sciences)過濾。將體積基本對應(yīng)于1毫克80％E的培養(yǎng)液加到預(yù)先用含有0.05％疊氮化鈉的磷酸緩沖液(PBS140mM NaCl，3mM NaH2PO4和8mM Na2HPO4，pH7.2)平衡的IAC柱上。用PBS(含有0.05％疊氮化鈉)洗滌，從柱上洗去未結(jié)合的物質(zhì)，直到洗液光密度(在280納米處測量)達到基線。用100mM甘氨酸pH2.5和在線監(jiān)測280納米處的光密度，以確保準確收集蛋白質(zhì)峰，進行了80％E的洗脫。加樣和PBS洗滌步驟的流速約為0.6毫升/分鐘，但低pH洗脫以1.5-2毫升/分鐘進行。立即用大約1/10體積的1M TrispH8中和酸-洗脫的物質(zhì)，然后用Centricon-30(Amicon)將緩沖液換成PBS，0.2微米膜無菌過濾(Acrodisc13，Gelman Sciences)。
未純化起始培養(yǎng)基、流穿和洗脫的含抗原組分的SDS-PAGE分析表明通常產(chǎn)物的產(chǎn)率大約是80％，在流穿組分中有5％的起始80％E損失。最終產(chǎn)品的純度一般約80-90％。圖3顯示了典型的純化過程的SDS-PAGE分析。特別是，該圖顯示了黃病毒免疫親和層析柱各組分的銀染色SDS-PAGE凝膠情況。用SDS-加樣緩沖液(不含還原劑)1∶1稀釋各組分的一部分，加到12％聚丙烯酰胺凝膠凝膠上。銀染色可見被分辨的蛋白質(zhì)。箭頭表明登革熱80％E的位置。抗體對照泳道含有5％抗體作為標準。
實施例10采用羥基磷灰石/大小排阻高效液相層析(HTP-SEC)的純化將含有重組DEN 80％E抗原(血清型1-4)的果蠅Schneider2細胞培養(yǎng)物以羥基磷灰石(HTP；BioRad)柱緩沖液(10mM磷酸鈉，pH6.45)滲液，采用裝有30kDa分子量截留膜的切面流裝置。然后將緩沖液己交換的培養(yǎng)液加到HTP柱上，用分步梯度50、100、150、200和400mM的磷酸鈉緩沖液(pH6.45)洗脫。用紫外光譜(280納米處的吸光度)監(jiān)測產(chǎn)物洗脫，用SDS-PAGE分析鑒定含有80％E的組分。超濾濃縮含有80％E的組分，進一步用TSK G3000SWXL柱(TosoHaas)和20mM磷酸鈉(pH6.45，含有100mM NaCl)的流動相以HPLC-SEC純化。用紫外光譜A280監(jiān)測產(chǎn)物洗脫。可將四種血清型DEN 80％E抗原各自純化到95％以上的均一性，該方法產(chǎn)率60％以上。
實施例11在小鼠中評價采用幾種不同佐劑的DEN-2 80％E的免疫原性用各種現(xiàn)代和傳統(tǒng)佐劑中配制的DEN-2 80％E免疫成年小鼠。免疫時間視佐劑制造者的推薦而不同，表2包括了細節(jié)。免疫過程完成后對動物取血，血清分析抗體應(yīng)答。用DEN-2 80％E作為包被抗原，以間接ELISA試驗檢測了能與80％E結(jié)合的抗體。用蝕斑減少中和試驗(PRNT)測試了中和抗體，與對照相比，導(dǎo)致蝕斑數(shù)量至少減少80％的最高血清稀釋度報告為PRNT80滴度。表2總結(jié)了結(jié)果。簡單說，幾種佐劑(包括MF75、RIBI和IscoMatrix)誘導(dǎo)了強的病毒中和抗體應(yīng)答。另一方面，MF59、弗氏佐劑和鋁鹽誘導(dǎo)了高滴度的80％E結(jié)合抗體，但低滴度的中和應(yīng)答。這與這些佐劑已顯示和其他各種免疫原合作良好的事實不同。這證明確定佐劑亞單位疫苗制劑效力需要經(jīng)驗，即制劑是否有效并不能根據(jù)文獻報道來預(yù)計，而必須用實驗證明。
表2成年小鼠中佐劑對DEN-2 80％E免疫原性的影響佐劑 免疫原/接種時間表 ELISA滴度PRNT80滴度2.5微克DEN-2 80％E，第0日MF59佐劑 25,600 2612.5微克DEN-2 80％E，第21日12.5微克DEN-2 80％E，第42日皮下接種2.5微克DEN-2 80％E，第0日MF75佐劑 102,000 229812.5微克DEN-2 80％E，第21日12.5微克DEN-2 80％E，第42日皮下接種25微克DEN-2 80％E，第0日RIBI佐劑 25,600 33312.5微克DEN-2 80％E，第21日12.5微克DEN-2 80％E，第42日皮下接種25微克DEN-2 80％E，第0日Alum 8445 2412.5微克DEN-2 80％E，第21日12.5微克DEN-2 80％E，第42日(氫氧化鋁)皮下接種弗氏完全佐劑 25微克DEN-2 80％E，第0日36,204 ＜10弗氏不完全佐劑 12.5微克DEN-2 80％E，第21日弗氏不完全佐劑 12.5微克DEN-2 80％E，第42日腹膜內(nèi)接種10微克DEN-2 80％E，第0日IscoMatrixTM25,600400010微克DEN-2 80％E，第28日皮下接種佐劑25微克DEN-2 80％E，第0日無佐劑 8445 1112.5微克DEN-2 80％E，第21日12.5微克DEN-2 80％E，第42日皮下接種儀PBS，第0日PBS＜100 ＜10儀PBS，第21日儀PBS，第42日皮下接種實施例12對IscoMatrix和弗氏佐劑配制的DEN-2 80％E的劑量應(yīng)答為了證明對重組80％E產(chǎn)物免疫應(yīng)答的劑量依賴性，用各種劑量的DEN-2 80％E和弗氏佐劑或IscoMatrix免疫成年小鼠。用弗氏佐劑免疫的小鼠間隔兩周接受了三次劑量，兩次加強劑量是最初劑量的一半，以弗氏不完全佐劑配制施用。用IscoMatrix配制的該重組產(chǎn)物接種的小鼠，間隔28日接受以10微克IscoMatrix配制的兩次等價劑量接種。在圖4中顯示了獲得的中和抗體滴度。特別是，該圖顯示了用DEN-2 80％E和IscoMatrix或弗氏佐劑免疫的小鼠的劑量應(yīng)答。用各種劑量的DEN-2 80％E和IscoMatrix或弗氏佐劑免疫后測定了中和抗體滴度。將幾何平均PRNT80滴度對兩種佐劑疫苗的抗原劑量作圖。對兩種佐劑疫苗的劑量應(yīng)答都冥想，然而對弗氏佐劑疫苗的應(yīng)答在大約3微克蛋白質(zhì)時看來達到了平臺。顯然，病毒中和抗體應(yīng)答則是IscoMatrix佐劑疫苗強得多。
實施例13用IscoMatrix配制的所有4種血清型的登革熱純化的80％E接種小鼠的免疫應(yīng)答用經(jīng)羥基磷灰石/大小排阻層析(HTP/SEC)或免疫親和層析純化的DEN-1-DEN-4 80％E抗原免疫成年雌性BALB/c小鼠。用10微克純化的80％E抗原和10微克IscoMatrixTM佐劑以100微升PBS配制皮下接種小鼠(每實驗組5只小鼠)。間隔28日給予兩次注射，第二次免疫10日后收集血清。系列稀釋用DEN-2 80％E免疫的小鼠血清，用純化DEN-2 80％E包被的微量滴定板作ELISA分析。以捕獲ELISA測試用DEN-1、-3和-4 80％E免疫的小鼠血清，其中用家兔-抗-登革熱病毒抗體包被板來捕獲同源重組DEN-80％E抗原。還用蝕斑減少中和法測試了血清中針對同源病毒的中和抗體的存在。表3總結(jié)了幾何平均ELISA滴度和血清中和抗體應(yīng)答反應(yīng)(80％蝕斑減少)。

實施例14采用IscoMatrix的純化DEN-1-DEN-480％E抗原接種成年小鼠的劑量應(yīng)答關(guān)系用增量的免疫親和純化的DEN 80％E抗原和10微克IscoMatrixTM(IscotecAB，Sweden)佐劑免疫接種成年雌性BALB/c小鼠。小鼠皮下接種兩次，間隔28天。第二次免疫后10天采集血清，用ELISA(以DEN-2 80％E直接包被在板上)或用MAb 4G2抗原捕獲ELISA(DEN-1-DEN-3)法評價抗體滴度，并用蝕斑減少中和試驗評價對同源病毒的病毒中和抗體滴度(表4)。采用DEN-1、DEN-2和DEN-4的80％E可見清晰的劑量應(yīng)答反應(yīng)。采用DEN-3的80％E于大約1微克劑量時達到了平臺，而1微克以上劑量未見滴度明顯增加。


NT-未測試*yi PRNT50滴度報告DEN-4 PRNT滴度，雖然其他報告為PRNT80滴度。
這反映了方法中一個變化，以適應(yīng)登革熱領(lǐng)域其他人所用的標準。實際滴度包括與PRNT80法相比2倍稀釋，因此可比較用我們的PRNT80和新的PRNT50法獲得的數(shù)據(jù)。
實施例15用DEN-2 80％E和IscoMatrix免疫的哺乳期小鼠對病毒攻擊的保護將皮下誘導(dǎo)劑量的含DEN-2 80％E和IscoMatrixTM佐劑的PBS溶液施給哺乳期小鼠。2周后進行增強接種，一周后進行顱內(nèi)DEN-2病毒攻擊(100LD50劑量)。攻擊后監(jiān)測小鼠21日，看是否有發(fā)病和死亡癥狀的變化。該實驗包括以下實驗分組1.DEN-2 80％E(5微克/劑量)+2微克IscoMatrixTM佐劑2.DEN-2 80％E(5微克/劑量)+1微克IscoMatrixTM佐劑3.DEN-2 80％E(5微克/劑量)+0.5微克IscoMatrixTM佐劑4.DEN-2 80％E(5微克/劑量)的鹽水溶液5.陽性對照，活DEN-2病毒(S16803)的5×105顆粒形成單位6.陰性對照，PBS圖5描述了該攻擊研究的結(jié)果，顯示用活登革熱-2病毒攻擊后免疫的小鼠的存活。以不同劑量的IscoMatrixTM佐劑、鹽水(陰性對照)配制的DEN-2 80％E，或活DEN-2病毒(陽性對照)免疫接種后，顱內(nèi)用100LD50劑量的DEN-2病毒(NewGuinea C)攻擊小鼠。第0日是病毒攻擊日。接種以2微克IscoMatrixTM配的DEN-280％E和皮下活DEN-2病毒的陽性對照獲得了完全保護抵御了神經(jīng)嗜性病毒攻擊，沒有致病的跡象。減少佐劑量導(dǎo)致保護下降。
實施例16用JEV 80％E和IscoMatrix免疫對哺乳期小鼠的部分保護用8微克JEV 80％E和2微克IscoMatrix佐劑皮下免疫三周齡的ICR或Balb/c小鼠。一些動物在21日后用相同劑量加強。加強免疫7日后，顱內(nèi)注射100LD50(50,000pfu)毒性JEV病毒攻擊動物。表5總結(jié)了結(jié)果。用ELISA監(jiān)測病毒結(jié)合反應(yīng)，記錄為1∶400血清稀釋度時獲得的光密度。病毒中和應(yīng)答記錄為PRNT75滴度。雖然PRNT滴度比用登革熱抗原獲得的低，但這代表了免疫系統(tǒng)尚未成熟的乳鼠的非最佳免疫方案。即使這樣，這種數(shù)量級的滴度也是其他有效JEV疫苗典型的。類似的，雖然不是完全保護，至少對于ICR小鼠，兩劑量方案與對照動物相比較顯示抵御病毒攻擊的保護力有顯著增強。

實施例17免疫接種各種佐劑配制的用DEN-2 80％E所誘導(dǎo)的免疫力的持續(xù)時間按下列時間表給成年雌性BALB/c小鼠接種DEN-2 80％E(a)RIBI第0日，25微克80％E和0.2毫升RIBI MPL+TDM(0.1毫升皮下，肩部；0.1毫升皮下，后腿)；第21日，如上用12.5微克80％E；第42日，如第21日；6個月，加強免疫，如第21日和42日。(b)IscoMatrixTM第0日，10微克80％E+10微克IscoMatrixTM，0.1毫升皮下，肩部；第28日，如第0日；6個月后，如第0日。(c)MF-75第0日，1∶1稀釋的抗原與佐劑混合。與RIBI時間表相同，除了皮下而非肩部注射0.1毫升體積外。(d)MF-75+ThrMDP同MF-75，每劑用40微克ThrMDP。在上述初次接種/加強方案后，每隔1月取測試血樣，共6個月。在6個月時，如上所述給予末次加強接種，10日后采取末次測試血樣。用蝕斑減少中和試驗測試所有測試血樣，測定了PRNT80滴度。圖6總結(jié)了結(jié)果，顯示給予上述列出的各種佐劑疫苗后對DEN-2 80％E免疫力的持續(xù)時間。
實施例18用所有4種血清型登革熱的80％E免疫小鼠所誘導(dǎo)的四價應(yīng)答測定了成年雌性BALB/c小鼠對免疫親和純化的DEN-1、-2、-3和-4 80％E抗原或等重量的DEN-1-DEN-4的80％E組合抗原的病毒中和抗體應(yīng)答。用10微克或2.5微克DEN-1、-2、-3或-4 80％E(每組5只)或四種抗原各10微升聯(lián)合(每組10只小鼠)皮下免疫小鼠。各0.1毫升劑量還含有10微克IscoMatrixTM佐劑和PBS稀釋液。4周后給予加強免疫，10日后收集血清。表6顯示了接受10微克劑量的各血清型80％E抗原或四價登革熱疫苗和IscoMatrixTM的小鼠的中和抗體滴度總和。這些結(jié)果證明同源80％E抗原誘導(dǎo)了對各病毒的中和抗體應(yīng)答，重要的是，當以四價制劑遞呈抗原時，保持了這種應(yīng)答。

NT-未測試實施例19用在IscoMatrixTM佐劑和DEN-2 80％E免疫恒河猴為了評價有效的DEN-2 80％E和IscoMatrix制劑，進行了恒河猴(Macanamulatta)的研究。該研究的終點是a)以體外病毒蝕斑減少試驗測定血清病毒中和抗體的誘導(dǎo)，和b)活病毒攻擊后登革熱病毒血癥的減輕。該實驗使用了11只猴子。在研究第0日用指定的疫苗皮下免疫接種，和在研究第34和97日加強接種動物ID編號的恒河猴。IscoMatrix疫苗制劑含有50微克佐劑。在鋁疫苗制劑中，于接種前用來自Reheis，Inc的氫氧化鋁(Alum)佐劑0.1％吸附抗原1小時。WRAIR(實驗室批號9，97年5月)的登革熱-2純化滅活疫苗(PIV)在接種前用1∶4的PBS稀釋。在研究的第132日，用104pfu活登革熱-2病毒(S16803親本病毒株)攻擊所有動物，攻擊后12日進行病毒血癥測定。表7顯示了中和抗體分析的結(jié)果。所有制劑在三劑量方案后誘導(dǎo)了高滴度的中和抗體應(yīng)答。在接受IscoMatrix和5微克DEN-2 80％E抗原的猴子中檢測到了特別高的滴度應(yīng)答。

在研究第132日，用104蝕斑形成單位的活登革熱-2病毒(菌株S16803親本)攻擊所有動物。每日采集血樣12日，將血清(0.1毫升)接種在C6/36細胞上。28℃培養(yǎng)接種的細胞14日，來擴增存在的任何病毒。在Vero細胞單層上用蝕斑試驗檢測0.2毫升C6/36細胞培養(yǎng)液中的病毒。然后，直接在Vero細胞單層上蝕斑滴定經(jīng)C6/36擴增試驗檢測為病毒陽性的血清樣品。表8顯示了病毒血癥研究的結(jié)果。用5微克DEN-2 80％E聯(lián)合50微克IscoMatrixTM佐劑達到了病毒血癥的完全抑制，證明在非人靈長動物中該疫苗的效力。

a)+＝約100或更多病毒蝕斑；？＝1-5個病毒蝕斑；0＝無病毒蝕斑實施例20DEN-2 80％E和IscoMatrix的凍干任何疫苗的穩(wěn)定性對其成功的實施都是關(guān)鍵的，因此重組80％E產(chǎn)物的穩(wěn)定性是其專利性的重要組成。因此，我們證明了純化的80％E可以凍干形式儲藏在室溫下是穩(wěn)定的。它在ELISA和小鼠測試中保持了全部免疫原性。
以10mM磷酸鈉，pH7.0和5％(w/v)蔗糖、海藻糖或乳糖賦形劑溶液將純化的DEN-2 80％E抗原配成0.525毫克/毫升分成等份(200微升)。在干冰-丙酮上凍結(jié)樣品后，-34℃，在45mT的壓力下19小時。然后將擱板溫度在400分鐘內(nèi)提升到25℃，每30分鐘遞增5℃。25℃干燥樣品19小時，真空密封。
用SDS-PAGE和ELISA比較凍干前后樣品，證明凍干不會導(dǎo)致產(chǎn)品損失或免疫反應(yīng)性改變。圖7A-7D分別顯示了DEN-1到DEN-4 80％E凍干后的ELISA活性。一式兩份(即#1和#2)進行各血清型80％E的試驗，起始濃度為0.5毫克/毫升(以10mM磷酸pH7.2)含有5％(w/v)乳糖的溶液配制。-35℃凍結(jié)樣品。-33℃凍干樣品過夜，25℃真空再次干燥。加入水將凍干的團塊重建到起始條件，在夾心ELISA試驗中與未凍干的相匹配樣品進行比較。ELISA涉及以9D12 MAb包被和針對DEN-2B結(jié)構(gòu)域(E138-2)的第二多克隆家兔血清作夾心試驗分析。
2和5個月儲藏后，溶解用海藻糖或蔗糖作為賦形劑凍干的DEN-2 80E樣品。ELISA(9D12和E138-2夾心法)和SDS-PAGE分析表明相對于在凍干后立即重建的樣品，顯示無蛋白質(zhì)降解或免疫反應(yīng)性喪失。圖8A-8C說明凍干的DEN-2 80％E的穩(wěn)定性。凍干了以不含(8A)無賦形劑(8B)5％蔗糖，或(8C)5％海藻糖的10mM磷酸鹽(pH7.2)配制的幾種樣品對室溫儲藏2-5月的重建到起始條件的樣品進行了夾心ELISA(9D12 MAb為捕獲抗體，E138-2抗結(jié)構(gòu)域B家兔多克隆抗體為檢測抗體)；“第0日”的檢測數(shù)據(jù)相應(yīng)于凍干的并在次日重建的樣品。
用免疫親和純化的DEN-2 80％E(已從含有下列賦形劑蔗糖、海藻糖或乳糖(方法上文詳述)的溶液中凍干)皮下免疫成年雌性BALB/c小鼠(n＝5每組)。凍干后一日，以PBS重建抗原樣品，用于免疫小鼠，各0.1毫升劑量，含有10微克DEN-280％E和10微克IscoMatrixTM佐劑。首次免疫4周后，小鼠接受了凍干儲藏在環(huán)境室溫下一月后新鮮重建的DEN-2 80％E的加強注射。4℃貯存在PBC中的DEN-280％E作為陽性對照。加強接種每劑也含有10微克DEN-2 80％E和10微克IscoMatrixTM。在加強免疫后10日收集血清用于分析。雖然所有賦形劑均顯示具有穩(wěn)定80％E抗原的傾向，但僅在乳糖存在下凍干的DEN-2 80％E顯示出與液態(tài)儲藏的對照抗原相比中和抗體滴度，具有統(tǒng)計學(xué)顯著的升高(0.025＜p＜0.05)。表9顯示了ELISA和病毒中和抗體滴度(80％病毒蝕斑減少，PRNT80)。

在新的重組DEN-2 80％E制劑中，將免疫親和純化的80％產(chǎn)物單獨，而且與IscoMatrix佐劑聯(lián)合凍干。證明該重建產(chǎn)物在小鼠中保持了免疫原性能力。凍干每等份200微升的含5％(w/v)乳糖賦形劑和10mM磷酸鈉、pH7.0的100微克純化的DEN-2 80％E。小管的一半還含有等量(100微克)的IscoMatrix佐劑。在干冰-丙酮上凍結(jié)樣品，-33℃57mT壓力下凍干20小時。然后將擱板溫度在400分鐘內(nèi)提升到25℃，每30分鐘遞增5℃。25℃干燥樣品19小時，真空密封。
用加或不加IscoMatrix佐劑一起凍干的免疫親和純化的DEN-2 80％E皮下免疫成年雌性BALB/c小鼠(如上所述)。凍干后一日，以PBS重建抗原樣品，用于免疫小鼠；各0.1毫升劑量含有10微克DEN-2 80％E和10微克IscoMatrix佐劑。凍干時不加IscoMatrix的DEN-2 80％E樣品在注射時加入IscoMatrix。首次免疫4周后，小鼠接受了已凍干儲藏在環(huán)境室溫下一月后新鮮重建的DEN-2 80％E加或不加IscoMatrix的加強注射。加強接種每劑也含有10微克DEN-2 80％E和10微克IscoMatrix。加強免疫后10日收集血清用于分析，用前述的PRNT試驗分析中和抗體應(yīng)答。表10總結(jié)了結(jié)果。數(shù)據(jù)清楚顯示，和IscoMatrix一起凍干的DEN-280％E與液體形式的DEN-2 80％E和不和IscoMatrix一起凍干的DEN-2 80％E相比，保持了完全的免疫原性(見實施例11、12、13和14)。就我們的知識而言，這首次證明了含有IscoMatrix佐劑的凍干的重組亞單位的制劑的效力。

權(quán)利要求
1.一種疫苗，其特征在于，該疫苗含有一種或多種重組黃病毒包膜蛋白質(zhì)亞單位和具有免疫刺激復(fù)合物的免疫調(diào)節(jié)劑以及藥物學(xué)上可接受的載體，所述免疫調(diào)節(jié)劑免疫刺激復(fù)合物樣結(jié)構(gòu)中含有至少一種脂質(zhì)和至少一種皂苷。
2.一種疫苗，其特征在于，該疫苗含有一種或多種重組黃病毒包膜蛋白亞單位，和一種免疫調(diào)節(jié)劑，以及藥物學(xué)上可接受的載體，所述免疫調(diào)節(jié)劑含有內(nèi)毒素衍生物、二霉菌酸海藻糖酯。
3.如權(quán)利要求1所述的疫苗，其特征在于，所述至少一種脂質(zhì)是固醇。
4.如權(quán)利要求1所述的疫苗，其特征在于，所述固醇是膽固醇。
5.如權(quán)利要求1所述的疫苗，其特征在于，所述至少一種皂苷是三萜皂苷。
6.如權(quán)利要求1所述的疫苗，其特征在于，所述三萜皂苷是Quil A。
7.如權(quán)利要求2所述的疫苗，其特征在于，所述內(nèi)毒素衍生物是單磷酰脂質(zhì)A。
8.如權(quán)利要求2所述的疫苗，其特征在于，所述二霉菌酸海藻糖是合成的海藻糖二柯楠霉菌酸酯。
9.如權(quán)利要求1所述的疫苗，其特征在于，所述重組黃病毒包膜蛋白質(zhì)是羧基末端截短的蛋白質(zhì)。
10.如權(quán)利要求1所述的疫苗，其特征在于，所述黃病毒是登革熱病毒。
11.如權(quán)利要求1所述的疫苗，其特征在于，所述黃病毒是日本腦炎病毒。
12.如權(quán)利要求2所述的疫苗，其特征在于，所述重組黃病毒包膜蛋白質(zhì)是羧基末端截短的蛋白質(zhì)。
13.如權(quán)利要求2所述的疫苗，其特征在于，所述黃病毒是登革熱病毒。
14.如權(quán)利要求2所述的疫苗，其特征在于，所述黃病毒是日本腦炎病毒。
15.如權(quán)利要求9所述的疫苗，其特征在于，所述羧基末端截短的包膜蛋白包含氨基酸1-395。
16.如權(quán)利要求12所述的疫苗，其特征在于，所述羧基末端截短的包膜蛋白包含氨基酸1-395。
17.如權(quán)利要求1所述的疫苗，其特征在于，重組黃病毒包膜蛋白亞單位的混合物和免疫調(diào)節(jié)劑一起配制，并作為含有藥物學(xué)上可接受的載體和賦形劑的整體凍干。
18.如權(quán)利要求1所述的疫苗，其特征在于，所述重組黃病毒包膜蛋白在果蠅Schneider2(S2)細胞系中表達。
19.如權(quán)利要求18所述的疫苗，其特征在于，所述重組黃病毒包膜蛋白是可溶的截短的蛋白質(zhì)，代表了80％全長的E分子。
20.如權(quán)利要求2所述的疫苗，其特征在于，所述重組黃病毒包膜蛋白在果蠅Schneider2(S2)細胞系中表達。
全文摘要
一種疫苗，含有作為疫苗的活性成分的至少一種果蠅細胞分泌的重組產(chǎn)生形式的截短的黃病毒包膜糖蛋白質(zhì)和一種作為疫苗關(guān)鍵成分的佐劑。該佐劑是一種免疫調(diào)節(jié)劑，具有iscom樣結(jié)構(gòu)，在iscom樣結(jié)構(gòu)內(nèi)含有至少一種脂質(zhì)和至少一種皂苷，和藥物學(xué)上可接受的載體。這樣的疫苗能保護個體免受黃病毒感染。
文檔編號A61P31/14GK1424917SQ00810205
公開日2003年6月18日 申請日期2000年7月12日 優(yōu)先權(quán)日1999年7月13日
發(fā)明者J·艾維, G·比格納默, M·麥克唐內(nèi)爾, D·E·克萊門茨, B·A·G·科勒 申請人:夏威夷生物技術(shù)集團股份有限公司