專利名稱：口服重組乳桿菌疫苗的制作方法
發(fā)明概要本發(fā)明屬于疫苗開(kāi)發(fā)領(lǐng)域。具體地說(shuō)，本發(fā)明涉及口服疫苗開(kāi)發(fā)。本發(fā)明涉及使用重組非致病菌作為口服應(yīng)用后能夠引發(fā)免疫應(yīng)答的抗原的載體。更具體地說(shuō)，本發(fā)明包括使用乳桿菌屬(Lactobacillus)的乳酸細(xì)菌。所涉及的乳酸細(xì)菌在分類學(xué)上為植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)。所述抗原在所述乳酸桿菌細(xì)胞內(nèi)表達(dá)和/或暴露于表面。由于所述疫苗使用活微生物作為抗原的載體，因此所述疫苗是活疫苗。本發(fā)明還包括新型重組植物乳桿菌以及其中使用的表達(dá)載體。
粘膜疫苗，即使用粘膜傳遞途徑的疫苗，看起來(lái)比使用系統(tǒng)接種有若干好處。它們可以用于產(chǎn)生作為第一線防御的IgA型免疫應(yīng)答。對(duì)粘膜感染的保護(hù)性免疫應(yīng)答極大依賴于分泌型IgA分子的產(chǎn)生。這樣的分子局部產(chǎn)生，并被轉(zhuǎn)運(yùn)到粘膜分泌產(chǎn)物中。
另一類可能有用的粘膜疫苗旨在通過(guò)所述疫苗的粘膜應(yīng)用而不是胃腸外應(yīng)用，誘導(dǎo)系統(tǒng)性免疫應(yīng)答。理想狀況下，所述免疫應(yīng)答應(yīng)該相當(dāng)于足夠有效的胃腸外疫苗所誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答。
然而，刺激粘膜免疫系統(tǒng)時(shí)，系統(tǒng)性應(yīng)用抗原可能不起作用，或作用不可靠。不幸的是，特定抗原的口服給予通常也不導(dǎo)致足夠的免疫應(yīng)答，即使最終它導(dǎo)致某些應(yīng)答。這是由于所述抗原在胃腸(G.I.)道中的吸收差和快速降解，以及對(duì)宿主的耐受性誘導(dǎo)。因此在過(guò)去提出了替代方案。
在嘗試過(guò)的選擇中，包括產(chǎn)生保護(hù)性載體系統(tǒng)如iscom、微球體和脂質(zhì)體，以及使用無(wú)害的活微生物在體內(nèi)局部產(chǎn)生(即在體內(nèi)原位)所需的抗原。
在尋找用作抗原載體的無(wú)害微生物群時(shí)，乳酸細(xì)菌群看起來(lái)是合適的細(xì)菌。它們?cè)谑称飞a(chǎn)技術(shù)中大規(guī)模應(yīng)用。它們構(gòu)成適于人類應(yīng)用的一群食品級(jí)(即通常是GRAS狀態(tài))格蘭氏陽(yáng)性微生物。它們?cè)谑称分杏写罅堪踩褂玫挠涗洝Ｔ谒鼈兊暮锰幹辛硪粋€(gè)有趣的方面當(dāng)然是它們不含LPS(LPS存在于目前用作載體的一些致病微生物中)。這樣，由于預(yù)期它們沒(méi)有關(guān)于內(nèi)毒素性休克風(fēng)險(xiǎn)的問(wèn)題，因此它們對(duì)于通過(guò)粘膜途徑應(yīng)用顯然是安全的。
此外，由于乳酸細(xì)菌能夠定居(即能夠居留和或生長(zhǎng))在諸如口腔、尿生殖道或胃腸道的腔道中，在這些部位它們的作用是維持正常微生物區(qū)系的平衡，因此它們作為益生菌進(jìn)行生產(chǎn)。然而，目前沒(méi)有商業(yè)化使用非致病細(xì)菌的口服疫苗。
在粘膜疫苗領(lǐng)域中，一方面人們必須區(qū)分鼻(以及陰道)疫苗，另一方面必須區(qū)分口服疫苗。口服抗原所面臨的環(huán)境比鼻環(huán)境惡劣得多。此外，已經(jīng)證實(shí)，能夠在鼻應(yīng)用中引發(fā)免疫應(yīng)答的疫苗在口服應(yīng)用時(shí)是不成功的。已經(jīng)提出了使用非致病載體的鼻疫苗，但由于沒(méi)有預(yù)期的特性或效能，無(wú)助于開(kāi)發(fā)口服疫苗面臨的問(wèn)題。例如，已有關(guān)于使用重組干酪乳桿菌(Lactobacillus casei)和植物乳桿菌菌株作為鼻疫苗或在鼻疫苗中使用它們的介紹，這兩種細(xì)菌對(duì)于該給予途徑同樣適合。令人驚訝的是，在本發(fā)明中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)植物乳桿菌株適于用作口服疫苗或用于口服疫苗中。與此不同-下文進(jìn)一步討論，本領(lǐng)域還未能就其它乳桿菌菌株獲得相似的結(jié)果，例如已經(jīng)建議用作鼻疫苗的干酪乳桿菌(Pouwels等，J.Biotech.1996 44183-192；Pouwels等，Int.J.Food Microbiol.1998 41155-167)。
現(xiàn)有技術(shù)領(lǐng)域認(rèn)為是潛在合適的乳酸細(xì)菌型疫苗有3類。其中兩類用作口服疫苗看起來(lái)是潛在可行的。第一類是基于乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)的疫苗，第二類是基于格氏鏈球菌(Streptococcusgordonii)的疫苗。關(guān)于這兩類的各種優(yōu)點(diǎn)和缺點(diǎn)有詳細(xì)文獻(xiàn)介紹(Mercenier A.，載于ProbioticsA critical review，Horizon Scientific Press，Wymondham，U.K.1999，第113-127頁(yè)；Pouwels等，Int.J.FoodMicrobiol.1998 41155-167)。
第三類是基于乳桿菌的疫苗，包括經(jīng)鼻引入的能夠引發(fā)免疫應(yīng)答的重組乳桿菌。然而，目前仍然沒(méi)有口服引入的重組乳桿菌確實(shí)引發(fā)免疫應(yīng)答。而有推測(cè)性公開(kāi)的重組非致病細(xì)菌，該菌在體內(nèi)表達(dá)異源抗原，口服應(yīng)用時(shí)產(chǎn)生顯著的免疫應(yīng)答。
一項(xiàng)研究公開(kāi)了一個(gè)不成功的試驗(yàn)，該試驗(yàn)涉及將在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)異源抗原的重組乳桿菌口服引入小鼠體內(nèi)(Wells等，Antonie vanLeeuwenhoek 1996 70317-330)。第0天、第1天和第2天在小鼠中口服引入在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)大腸桿菌(E.coli)β-半乳糖苷酶的植物乳桿菌80。間隔4周后進(jìn)行隨后的口服加強(qiáng)。該試驗(yàn)揭示沒(méi)有對(duì)所述β-半乳糖苷酶(異源抗原)的顯著抗體應(yīng)答，而所述β-半乳糖苷酶未知其任何免疫原性特性。這項(xiàng)結(jié)果與腹膜內(nèi)結(jié)果相反，腹膜內(nèi)實(shí)驗(yàn)使用同樣的細(xì)菌菌株、同樣的抗原和同樣的表達(dá)系統(tǒng)，獲得了免疫應(yīng)答?？梢蕴岢鲈撌〉母鞣N解釋，但目前沒(méi)有一個(gè)解釋能夠闡明為什么口服接種沒(méi)有好的結(jié)果。
其它技術(shù)提到重組植物乳桿菌的潛在用途。WO99/11284提出，可以使用乳酸細(xì)菌產(chǎn)生口服疫苗。所建議的實(shí)施方案看起來(lái)是其中可溶性蛋白從所述重組微生物中分泌出來(lái)的一個(gè)方案。所述文獻(xiàn)中沒(méi)有提到表面暴露或細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生，并且推測(cè)性地提出許多種可能有用的乳酸細(xì)菌。建議的細(xì)菌是德氏乳桿菌(Lactobacillus delbruekii)、干酪乳桿菌、發(fā)酵乳桿菌(Lactobacillus fermentum)、植物乳桿菌、類植物乳桿菌(Lactobacillus paraplatarum)、戊糖乳桿菌(Lactobacilluspentosus)、棒狀乳桿菌(Lactobacillus coryniformis)、短乳桿菌(Lactobacillus brevis)、希萊曼氏乳桿菌(Lactobacillus leichmannii)以及從腸菌群中分離出來(lái)的乳桿菌屬菌株如鼠李糖乳桿菌(Lactobacillusrhamnosus)901。后者被指出是尤其優(yōu)選的乳酸細(xì)菌，因?yàn)樗鼘?duì)酸液和膽汁均具有抗性。在所述實(shí)施例中提到的乳酸細(xì)菌是植物乳桿菌8826(3×109細(xì)菌/ml，每天兩次，持續(xù)18天)。
按照WO99/11284的乳酸細(xì)菌應(yīng)當(dāng)產(chǎn)生脲酶作為異源抗原。沒(méi)有建議其它抗原，也沒(méi)有提供成功誘導(dǎo)體內(nèi)免疫應(yīng)答的例證。關(guān)于這一點(diǎn)推測(cè)性說(shuō)明的實(shí)施例在本質(zhì)上僅僅是推測(cè)性的，并且沒(méi)有提供實(shí)際的結(jié)果。另外它提示所述抗原(脲酶)由所述細(xì)菌宿主分泌入周圍環(huán)境中成為“游離的”可溶性蛋白(即不暴露于所述細(xì)菌宿主的表面或以其它方式與所述細(xì)菌宿主表面相連接)。
事實(shí)上，對(duì)于所述假設(shè)的方法是否能成功地提供免疫應(yīng)答，存在很大懷疑。許多文章已經(jīng)公開(kāi)地指出可溶性蛋白的分泌不可能誘導(dǎo)免疫應(yīng)答因此，不可能有合適的技術(shù)以提供有用的口服疫苗。這一點(diǎn)加上缺少任何實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，看起來(lái)證明了沒(méi)有使用乳酸桿菌作為宿主的口服疫苗的可能性。充其量它是以治療幽門(mén)螺桿菌(Heliobacter pylori)相關(guān)疾病為目的，推測(cè)性公開(kāi)使用分泌脲酶可溶性蛋白作為異源抗原的乳桿菌。對(duì)于預(yù)期具有特定問(wèn)題的其它抗原，則沒(méi)有公開(kāi)任何事實(shí)，所述特定問(wèn)題如它們?cè)诳谇唤橘|(zhì)/胃腸介質(zhì)的腐蝕性環(huán)境下存活的不可預(yù)見(jiàn)性。
綜述文章(Mercenier，1999)描述了引入植物乳桿菌NCIMB8826(一種人類唾液分離物)的表達(dá)異源抗原(如TTFC)的各種構(gòu)建物。對(duì)于所有這些重組乳桿菌構(gòu)建物，在小鼠中的經(jīng)鼻引入都導(dǎo)致免疫應(yīng)答。此外，該文章指出已經(jīng)進(jìn)行了口服測(cè)試以進(jìn)行比較，但沒(méi)有提供所述口服實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，也沒(méi)有指出所述抗原在細(xì)胞的哪一部分表達(dá)。因此，該文章也沒(méi)有提到任何、某些或全部所述構(gòu)建物是否產(chǎn)生了任何顯著的免疫應(yīng)答。缺乏數(shù)據(jù)再加上由鼻疫苗到口服疫苗的數(shù)據(jù)進(jìn)行推斷的一般知識(shí)，以及以前使用乳桿菌作為口服疫苗的失敗，看起來(lái)是無(wú)法成功的。當(dāng)然一般的解釋是預(yù)期成功的理由不充分。
相似的情況也出現(xiàn)在一份來(lái)自Mercenier集團(tuán)(Institut Pasteur，LilleGrangette等，Immunology letters，69(1)No.1，第176頁(yè)45.13)的摘要，在這份摘要中沒(méi)有給出數(shù)據(jù)以支持免疫的主張。
該結(jié)論得到Pouwels等1998的支持，Pouwels等報(bào)道在干酪乳桿菌中的表達(dá)載體如何獲得異源抗原的良好表達(dá)，但在口服引入后僅提供了相當(dāng)?shù)退降目贵w。這可能是由于干酪乳桿菌的生存力差，但這個(gè)因素沒(méi)有得到進(jìn)一步的研究，并且對(duì)于所述重組干酪乳桿菌不能獲得保護(hù)性免疫應(yīng)答存在多種其它原因。例如，體內(nèi)表達(dá)量可能太低以致于不能真正激發(fā)免疫應(yīng)答，或者所述抗原沒(méi)有按照使其能引發(fā)免疫應(yīng)答的方式呈遞。
在實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)中，包括重組干酪乳桿菌以作為本發(fā)明的植物乳桿菌疫苗的比較。證實(shí)作為異源抗原的體內(nèi)載體的基于干酪乳桿菌的表達(dá)系統(tǒng)無(wú)效。這項(xiàng)發(fā)現(xiàn)質(zhì)疑WO99/11284公開(kāi)的內(nèi)容，因?yàn)樵摪l(fā)明提示干酪乳桿菌可以作為有用載體的一個(gè)例子。
為進(jìn)一步支持在這個(gè)領(lǐng)域內(nèi)在物種間的數(shù)據(jù)外推并不總是可靠的，以前的實(shí)驗(yàn)已經(jīng)比較了重組植物乳桿菌和非重組干酪乳桿菌的引發(fā)佐劑活性。證實(shí)干酪乳桿菌是引發(fā)體內(nèi)佐劑活性的最佳微生物。因此，人們推測(cè)干酪乳桿菌是用于疫苗的比植物乳桿菌或任何其它乳酸細(xì)菌菌株更優(yōu)選的候選者。
在本說(shuō)明書(shū)中，除特別指出外，下文中提到的術(shù)語(yǔ)和詞組具有下面的含義。
“細(xì)菌宿主”指用于表達(dá)所需抗原(如通過(guò)重組技術(shù))的細(xì)菌或細(xì)菌菌株。它作為疫苗或作為疫苗的組成部分給予人體或動(dòng)物(哺乳動(dòng)物)，以引發(fā)針對(duì)所述抗原的免疫應(yīng)答。該術(shù)語(yǔ)用于表示轉(zhuǎn)化表達(dá)所述抗原的天然菌株、表達(dá)所述抗原的重組菌株(也獨(dú)立地稱為“重組宿主菌株”)、或所述二者。
疫苗的“粘膜傳遞(途徑)”是指不需要透過(guò)或刺穿皮膚(例如靜脈內(nèi)給予、肌肉內(nèi)給予、皮下給予或腹膜內(nèi)給予)給予人體或動(dòng)物體的任何給藥途徑。通常這意味著所述疫苗通過(guò)一個(gè)體腔給予機(jī)體，以便它與粘膜相接觸。因此，粘膜給予尤其是指鼻給予、口服給予和/或陰道內(nèi)給予。
“粘膜疫苗”是指任何適于、改變后用于、預(yù)定用于和/或配制用于粘膜傳遞的疫苗。
(疫苗的)“口服傳遞(途徑)”是指通過(guò)該途徑所述疫苗可以呈遞到人類或動(dòng)物胃腸道(G.I.)或其任何部分達(dá)的任何傳遞途徑。通常包括給予到胃腸道或通過(guò)口腔給予到胃腸道?！翱诜o予”也包括例如使用管或?qū)Ч苤苯咏o予到胃腸道或其任何部分，包括給予到胃。
“口服疫苗”是指任何適于、改變后用于、預(yù)定用于和/或配制用于上文所定義的口服傳遞的疫苗。
假如一種應(yīng)答(如抗體應(yīng)答或免疫應(yīng)答)導(dǎo)致人體或動(dòng)物體內(nèi)可檢測(cè)的改變或反應(yīng)，尤其是可檢測(cè)到的免疫改變或免疫反應(yīng)，如抗體、細(xì)胞因子、淋巴因子的產(chǎn)生等等，則這種反應(yīng)就被認(rèn)為是“顯著的”。確定一種應(yīng)答是否是“顯著的”的測(cè)試是本領(lǐng)域內(nèi)已知的，包括但不限于使用ELISA技術(shù)、ELISPOT技術(shù)以及體外淋巴細(xì)胞刺激測(cè)試來(lái)滴定生物學(xué)樣品中的抗體水平。通常在從人類或動(dòng)物獲得的生物樣品如生物體液或細(xì)胞樣品上實(shí)施這樣的技術(shù)。
一種“顯著的”應(yīng)答同時(shí)也可以是、但不一定是如下文所定義的“保護(hù)性”應(yīng)答。當(dāng)一種應(yīng)答(如針對(duì)病原體或抗原的免疫應(yīng)答)能夠保護(hù)具有這種反應(yīng)的人類或動(dòng)物對(duì)抗所述病原體和/或?qū)古c所述抗原有關(guān)的病原體時(shí)，這種反應(yīng)就被認(rèn)為是“保護(hù)性”的。
當(dāng)一種抗原在細(xì)菌宿主的表面(如細(xì)菌細(xì)胞壁或被膜)上存在、構(gòu)成其組成部分、附著和/或以其它方式連接或可檢測(cè)到(如使用合適的免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)如FACS或免疫熒光顯微術(shù))時(shí)，就認(rèn)為該抗原“暴露”(也稱為所述抗原的“(表面)暴露”)在所述細(xì)菌宿主上。
“暴露的”最好是指所述細(xì)菌當(dāng)以足夠時(shí)間和足夠量呈遞到人類或動(dòng)物能夠介導(dǎo)免疫應(yīng)答的細(xì)胞(如下文提到的胃腸道細(xì)胞)時(shí)，能夠引發(fā)針對(duì)所述抗原的“足夠”免疫應(yīng)答。細(xì)菌菌株使用已知參數(shù)可以容易地鑒定植物乳桿菌菌株(如BergeysManual of determinative bacteriology和Vescovo等，Ann.Microbiol.Enzymol.43 261-284(1993))。因此技術(shù)人員可以容易地鑒定一種乳酸細(xì)菌是否是植物乳桿菌。在不同機(jī)構(gòu)已經(jīng)保藏了多種植物乳桿菌菌株，并且這些菌株是容易獲得的。
選定作為細(xì)菌宿主的天然菌株應(yīng)當(dāng)最好是GRAS(一般認(rèn)為是安全的)狀態(tài)，并且更優(yōu)選是食品級(jí)的。
另外，所使用的細(xì)菌宿主在用編碼抗原的合適構(gòu)建物轉(zhuǎn)化時(shí)，應(yīng)當(dāng)允許所需抗原在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)和/或表達(dá)的抗原暴露在表面上。
根據(jù)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳或FACS測(cè)定，所述抗原表達(dá)(如在細(xì)胞內(nèi)和/或暴露在表面)的水平最好應(yīng)當(dāng)至少占總細(xì)胞蛋白的1-5％，或者是植物乳桿菌菌株256在同樣條件、使用同樣表達(dá)載體所提供的表達(dá)水平的80％或更多、最好100％或更多。
此外，所述細(xì)菌宿主最好能夠居留在和/或定居在至少部分胃腸道，如口腔、咽、喉、腸、小腸、大腸、回腸和/或結(jié)腸，或它們的組合。所述細(xì)菌宿主最好是這樣的它主要居留在腸內(nèi)，更優(yōu)選居留在小腸或盲腸內(nèi)。
所述(重組)植物乳桿菌菌株最好在需要免疫的個(gè)體內(nèi)保持至少5天(在口服給予時(shí)，并且根據(jù)該菌株在糞便中的存在確定)，至少9天，合適的是多于15天甚至20天。假如如下所述，給予方案包括使用一次或多次加強(qiáng)免疫，則不需要更長(zhǎng)的持續(xù)性。
優(yōu)選的實(shí)施方案顯示在同等條件下比植物乳桿菌80保持更長(zhǎng)、最好比植物乳桿菌NCIMB 8826保持更長(zhǎng)。這可以小鼠胃腸道客觀地評(píng)估，所述小鼠最好是同樣年齡并且處于同等治療條件下，雖然可選擇條件。
所述植物乳桿菌菌株最好不是LMG 9211(以上Mercinier稱為NCIMB8826)、DSM 4229干酪乳桿菌393、和/或植物乳桿菌80。所述細(xì)菌宿主最好是下面植物乳桿菌菌株中的一種256、LMG1284、LMG 6907、LMG 8155、LMG 9205、LMG 9206、LMG 9208、LMG 9209、LMG 9210、LMG 9212、LMG 11405、LMG 11460、LMG8095、LMG 8027、LMG 12167、LMG 13556、LMG 17552、LMG 18021、LMG 18023、LMG 18024、LMG 18027、LMG 18095；386、299、105或275(見(jiàn)Molin等，1993.J.Appl.Bacteriol.74314)、299v(見(jiàn)WO96/29083)；So5、36E、95、120或44(見(jiàn)Johannson等1995，Int.J.Syst.Bacteriol，第45卷(4)670-675)、79、107、98、53、97、101或125(見(jiàn)Johansson等1995，Int.J.Food.Micro.25159)、CH、ATCC 8041、ATCC10012、ATCC 10776、WCFS、DF66 IIIa、DF66spez.-IVa和/或可以從日本微生物保藏中心獲得的下列保藏號(hào)的植物乳桿菌菌株8341、8342、8343、8344、8345、8346、8347和/或8348。
所使用的乳桿菌屬細(xì)菌最好對(duì)于所給予(例如接種)的個(gè)體(人類或動(dòng)物)是外源性的。本發(fā)明的細(xì)菌是修飾或重組細(xì)菌，因此所述野生型或天然細(xì)菌(即非重組或未修飾的乳桿菌屬細(xì)菌)最好是外源性的。因此外源性是指?jìng)€(gè)體(或人類)以前沒(méi)有接觸過(guò)的乳桿菌屬菌株。換句話說(shuō)，優(yōu)選使用非人類來(lái)源的乳桿菌屬菌株，例如沒(méi)有在人體內(nèi)發(fā)現(xiàn)過(guò)或存在的菌株。所述菌株最好是一種沒(méi)有在人類或動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)過(guò)的菌株，例如在腸(胃腸道)中不存在的菌株。這樣的菌株將引起更顯著或更大的免疫應(yīng)答。因此雖然以前的工作者使用從人體得到的植物乳桿菌菌株(例如NCIMB 8826，一種人類唾液分離物)，本發(fā)明的發(fā)明人采用了一種反直覺(jué)的方法，尋找在人體內(nèi)不存在的菌株。
例如，在先工作者已經(jīng)使用保藏號(hào)為NCIMB 8826的植物乳桿菌菌株。該菌株在人體內(nèi)發(fā)現(xiàn)，例如它已經(jīng)存在于胃腸道內(nèi)。這意味著它不可能引起或引發(fā)象對(duì)人類是外源(或不存在于人體內(nèi))的乳桿菌屬菌株那樣好的免疫應(yīng)答。
因此，本發(fā)明最好使用沒(méi)有在個(gè)體的粘膜(非粘膜)或胃腸道中發(fā)現(xiàn)的乳桿菌屬菌株，例如它不是內(nèi)源性的(對(duì)于需要接種的人類或動(dòng)物物種)。實(shí)際上，最優(yōu)選法的菌株(如植物乳桿菌256)存在于青貯飼料。這樣的菌株對(duì)于人類明顯是外源性的，因此提供增強(qiáng)的免疫應(yīng)答。然而，所述菌株最好能夠附著到腸粘膜上。
所述菌株也可以是非食品來(lái)源的，例如未在(人類)食品中發(fā)現(xiàn)。這樣就可以排除一些干酪乳桿菌菌株，如393。菌株393在奶酪中發(fā)現(xiàn)，因此最好排除在乳制品或發(fā)酵制品中發(fā)現(xiàn)的菌株。這意味著個(gè)體不曾(或可能不曾)曾經(jīng)接觸(例如攝取)過(guò)所述菌株，因此使用沒(méi)有在食物中發(fā)現(xiàn)的菌株更有可能引起免疫應(yīng)答。這可以解釋為什么某些乳酸桿菌保持時(shí)間長(zhǎng)?？赡苡捎谶@些細(xì)菌不被免疫系統(tǒng)所識(shí)別，因此它們清除更慢。因此，適當(dāng)?shù)氖?，所述菌株是?dòng)物來(lái)源細(xì)菌，例如來(lái)自動(dòng)物飼料(如青貯飼料)。一般更合適的菌株是共生細(xì)菌(腸道內(nèi))，而不是與飲食有關(guān)的細(xì)菌(如乳制品來(lái)源)。
所述乳桿菌屬菌株最好是活的并且是完整的。它們最好能夠在個(gè)體內(nèi)(在粘膜內(nèi))持續(xù)至少7天。這可以使用本領(lǐng)域內(nèi)已知的程序容易地檢測(cè)(例如，檢測(cè)所述生物在糞便中的存在情況)。
因此，本發(fā)明還涉及非人類來(lái)源和/或非人類食物來(lái)源的乳桿菌屬細(xì)菌，例如植物乳桿菌，其中已經(jīng)修飾所述細(xì)菌以表達(dá)異源抗原(在細(xì)胞內(nèi)和/或在細(xì)胞表面)。該細(xì)菌最好能在所要給予的個(gè)體內(nèi)引發(fā)免疫應(yīng)答。因此，天然存在或未修飾的植物乳桿菌最好對(duì)于所述個(gè)體是外源性的，例如它對(duì)于所要給予的人類或動(dòng)物不是內(nèi)源性的。所述選定的植物乳桿菌菌株最好不存在于人類或該動(dòng)物物種的胃腸道或粘膜內(nèi)。
本發(fā)明還涉及已經(jīng)經(jīng)過(guò)修飾而在細(xì)胞內(nèi)和/或在細(xì)胞表面上表達(dá)異源抗原、從而在個(gè)體內(nèi)引發(fā)免疫應(yīng)答，并且在該個(gè)體的胃腸道內(nèi)保持至少7天的植物乳桿菌細(xì)菌。
技術(shù)人員可以根據(jù)一種或多種以下特性或因素選擇其它合適的菌株-編碼所述抗原的構(gòu)建物在所選定的細(xì)菌宿主中的穩(wěn)定性；抗原在所選定的細(xì)菌宿主中的表達(dá)水平；抗原表達(dá)在所選定的細(xì)菌宿主中的調(diào)節(jié)；抗原在所選定的細(xì)菌宿主中的表達(dá)位點(diǎn)；和/或所產(chǎn)生的抗原的穩(wěn)定性；-所使用的菌株的生物化學(xué)特性，例如其糖發(fā)酵概況(API)、細(xì)胞壁組成、LTA結(jié)構(gòu)、肽聚糖結(jié)構(gòu)、16S RNA序列、酸抗性、膽汁酸抗性、凝集特性、佐劑活性、免疫調(diào)節(jié)特性、體外附著特性、甘露糖特異性附著、蛋白質(zhì)類附著因子的存在、mapA樣附著因子的存在和/或具有重復(fù)氨基酸序列的大蛋白質(zhì)類附著因子的存在；和/或-所述細(xì)菌宿主與所述宿主(作為按照本發(fā)明的疫苗的一部分)所要給予的個(gè)體的細(xì)胞的相互作用，包括但不限于它的持續(xù)性、生存力、抗原的體內(nèi)表達(dá)和/或組織特異性持續(xù)性。
在至少一些、最好大多數(shù)、更優(yōu)選基本上全部這些特性中，例如根據(jù)本領(lǐng)域內(nèi)針對(duì)已知的這些特性本身的測(cè)試/測(cè)定進(jìn)行的測(cè)定，所使用的菌株應(yīng)當(dāng)基本(至少)等同于上文所提到的菌株，更優(yōu)選等同于植物乳桿菌256。在選出合適的宿主后，可以用如本文所述的遺傳構(gòu)建物對(duì)其進(jìn)行轉(zhuǎn)化，然后測(cè)試其作為口服疫苗的適合性，即使用在下面的實(shí)施例中描述的測(cè)試和方法。預(yù)計(jì)在本文的描述的基礎(chǔ)上，并可選地進(jìn)行本文所述的測(cè)試(目的是證實(shí)實(shí)施方案)后，技術(shù)人員將能夠鑒定適于用作或用在本發(fā)明的疫苗中的其它植物乳桿菌菌株。
所述植物乳桿菌最好是屬于1群(或簇)(包括菌株101、97、53、256、ATCC 14917、36E、95、98、299、299v、107、105、79、275、386、So5和ATCC 8014)、最好屬于1b亞群(或亞簇)(包括256、ATCC14917、36E、95和98)。特別優(yōu)選的是植物乳桿菌株256。
也可以使用上文提到的一個(gè)或多個(gè)株的組合。重組方面本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案是這樣一種疫苗其中所述重組植物乳桿菌包含表達(dá)載體，所述表達(dá)載體能夠在胃腸道內(nèi)的條件下在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)異源抗原和/或以便所述異源抗原暴露在細(xì)胞表面。
疫苗形式的重組植物乳桿菌的任何實(shí)施方案包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)，其中所述異源抗原特異性誘導(dǎo)針對(duì)致病微生物的免疫原性。所述宿主可以表達(dá)一種異源抗原，所述抗原對(duì)于粘膜定居病原體或通過(guò)粘膜、特別是通過(guò)口服途徑進(jìn)入機(jī)體的病原體具有特異性。所述異源抗原可以是胃腸道定居病原體特異性的。破傷風(fēng)(破傷風(fēng)梭菌，Clostridium tetanus)特異性異源抗原如TTFC是尤其合適的候選抗原。
所述重組細(xì)菌宿主(如植物乳桿菌)可以包含表達(dá)載體，所述表達(dá)載體能夠在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)異源抗原和/或使所述異源抗原暴露在細(xì)胞表面上，其暴露程度足以誘導(dǎo)保護(hù)性免疫原性。
最好配制所述疫苗成為合適單劑劑量。然而，例如為了使胃腸道中持續(xù)存在所述細(xì)菌宿主，也設(shè)想了在一段時(shí)間內(nèi)多次應(yīng)用的實(shí)施方案。對(duì)于依照本發(fā)明的疫苗制劑，也設(shè)想了提供加強(qiáng)接種。
優(yōu)選的給予方案包括在第1天到4天的任一天中給予一劑或多劑“起始”劑量，然后在第14天到21天的任一天加強(qiáng)給予一次或多次，任選在第28天到25天的任一天再進(jìn)行一次或多次加強(qiáng)給予。一次起始給予、然后在這段時(shí)間內(nèi)一次加強(qiáng)給予通常就足夠了。
驚人的是，在一些病例中，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)例如當(dāng)使用持續(xù)6到12天的細(xì)菌宿主時(shí)，僅在第一次加強(qiáng)給予后就基本獲得了顯著的免疫應(yīng)答。盡管在第一次加強(qiáng)時(shí)，即第14到21天，在所述個(gè)體的糞便中不能再檢測(cè)到所述細(xì)菌宿主(即來(lái)自起始給予的細(xì)菌宿主)。后一個(gè)實(shí)例顯示在起始引發(fā)后2、3或4周，當(dāng)再次給予所述口服疫苗時(shí)，同樣引發(fā)的小鼠都得到加強(qiáng)。因此在一個(gè)方面，本發(fā)明涉及適于這種給予和加強(qiáng)方案的方法和制劑。
本發(fā)明還涉及包含重組植物乳桿菌(最好包含一種或多種表達(dá)載體)的疫苗，所述重組植物乳桿菌能夠在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)所述異源抗原和/或所述異源抗原暴露在細(xì)胞表面上，其暴露程度超過(guò)就植物乳桿菌80表達(dá)β-半乳糖苷酶所公開(kāi)的載體的程度，或超過(guò)表達(dá)半乳糖苷酶的植物乳桿菌80的程度。
設(shè)想了盡可能高的表達(dá)程度，同時(shí)不損害接種的細(xì)胞或宿主的生存力。對(duì)于免疫目的，可能需要高表達(dá)、低給予頻率和低劑量。當(dāng)然，劑量方案將不僅依賴于抗原的量，而且依賴于抗原類型以及所述疫苗中其它免疫原性刺激因子存在與否。
通過(guò)對(duì)所述疫苗中所述重組植物乳桿菌內(nèi)存在的表達(dá)載體使用同源表達(dá)和/或分泌信號(hào)，可以獲得高水平的表達(dá)。在所述實(shí)施例的構(gòu)建物中存在的表達(dá)調(diào)節(jié)信號(hào)是合適有用的。其他表達(dá)信號(hào)顯而易見(jiàn)的。根據(jù)所述表達(dá)載體所摻入的乳桿菌屬菌株，它可以最優(yōu)化表達(dá)。
驚人的是，發(fā)現(xiàn)在干酪乳桿菌中適度表達(dá)(但沒(méi)有達(dá)到足以使重組干酪乳桿菌被考慮作為疫苗的程度)的表達(dá)載體為植物乳桿菌提供了足夠的表達(dá)，以在口服給予時(shí)提供免疫原性。因此，本發(fā)明包括包含能在干酪乳桿菌中表達(dá)的表達(dá)載體的植物乳桿菌。預(yù)期情況并不是這樣，因?yàn)槭紫仍诟衫胰闂U菌內(nèi)缺乏疫苗用途的足夠表達(dá)，其次由于不同乳酸細(xì)菌間表達(dá)水平的不可預(yù)見(jiàn)性。
優(yōu)選的植物乳桿菌是植物乳桿菌256，因?yàn)樵摼晏峁┝撕玫慕Y(jié)果，該結(jié)果比在同等條件下的干酪乳桿菌更好?？乖隹乖軌蛞l(fā)或刺激免疫應(yīng)答，因此可以是任何在動(dòng)物體內(nèi)(最好是哺乳動(dòng)物，例如人)能夠引發(fā)針對(duì)其的免疫應(yīng)答的任何抗原，所述免疫應(yīng)答更具體地說(shuō)是如上文所定義的“顯著的”免疫應(yīng)答和/或“保護(hù)性”免疫應(yīng)答。所述抗原一般與所述疫苗所要給予的人類或動(dòng)物的病原體、疾病狀態(tài)和/或疾病有關(guān)系。所述抗原最好能夠與一種或多種(如特異性)受體相互作用，所述受體例如存在于淋巴細(xì)胞上或存在于從淋巴細(xì)胞釋放的抗體中。因此所述抗原可以是一種免疫原。由于所述抗原一般是能夠引發(fā)免疫應(yīng)答的抗原，因此通常排除酶(如脲酶、β-半乳糖苷酶)，例如已經(jīng)在所述個(gè)體內(nèi)存在的蛋白。因此抗原最好對(duì)于該個(gè)體是外源性的。
可以使用任何本身已知能夠在所述微生物宿主中表達(dá)的抗原、抗原性成分或表位。通常抗原是肽、蛋白或其抗原性部分或片段，如表位。同樣，它或者是天然抗原性肽或蛋白(或其部分、片段或表位)，或者是其例如通過(guò)合成或使用重組DNA技術(shù)獲得的抗原性類似物或突變體。
可以提供重組細(xì)菌和/或細(xì)菌菌株以及以其為基礎(chǔ)的疫苗，用于引發(fā)針對(duì)各種抗原的顯著的免疫應(yīng)答，最好是保護(hù)性的免疫應(yīng)答。合適的抗原包括-變態(tài)反應(yīng)原；-病毒抗原和/或細(xì)菌抗原，包括HIV病毒抗原(如HIV病毒的gp160包膜蛋白)、表面糖蛋白(利什曼原蟲(chóng)屬(Leishmania)寄生蟲(chóng)的表面糖蛋白)、志賀樣毒素(Shiga-like toxin)、志賀氏菌屬(Shigella)脂多糖抗原、大腸桿菌菌毛抗原、CFA抗原(產(chǎn)腸毒素的大腸桿菌菌株的CFA抗原)、炭疽毒素、百日咳毒素、破傷風(fēng)毒素；-來(lái)自病原體的抗原，所述病原體例如皰疹病毒、風(fēng)疹病毒、流感病毒、腮腺炎病毒、麻疹病毒、脊髓灰質(zhì)炎病毒、輪狀病毒、呼吸道合胞病毒、彎曲桿菌屬(Campylobacter)細(xì)菌、衣原體(Chlamydial)屬生物、Cryptosporidium屬物種、巨細(xì)胞病毒、人類免疫缺陷病毒、放線菌屬(Actinomyces)物種、溶組織內(nèi)阿米巴(Entamoeba histolytica)、沙粒病毒、蟲(chóng)媒病毒、肉毒梭菌(Clostridium botulinum)、假絲酵母屬(Candida)物種、霍亂弧菌(Vibrio cholera)、新型隱球酵母(Cryptococcusneoformans)、大腸桿菌O157H7、O26H11、O111H8和O104H21的EHEC株、大腸桿菌ETEC株、顯示具有腸侵襲性的大腸桿菌菌株(EIEC)、大腸桿菌的EPEC株、大腸桿菌的EAggEC株、大腸桿菌的DAEC株、線狀病毒科、細(xì)小病毒、絲蟲(chóng)目(Filarioidea)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus
aureus)、產(chǎn)氣莢膜梭菌(Clostridium perfringens)屬細(xì)菌、幽門(mén)螺桿菌、杯狀病毒、蘭伯氏賈第蟲(chóng)(Giardia lamblia)、淋病奈瑟氏球菌(Neisseria gonorrhoeae)、漢坦病毒屬、甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、丁型肝炎病毒、戊型肝炎病毒、軍團(tuán)菌屬(Legionellae)菌株、麻風(fēng)分枝桿菌(Mycobacterium leprae)、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌(Listeriamonocytogenes)、產(chǎn)氣莢膜梭菌屬細(xì)菌、布氏疏螺旋體(Borreliaburgdorferi)、類鼻疽伯克霍爾德氏菌(Pseudomonaspseudomallei)、EB病毒、旋盤(pán)尾絲蟲(chóng)(Onchocerca volvulus)、痘病毒、百日咳桿菌(Bordetella pertussis)、鼠疫耶爾森氏菌(Yersinia pestis)、伯納特氏柯克斯氏體(Coxiella brunetti)、狂犬病病毒、蒼白密螺旋體(Treponema pallidium)、結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis)、傷寒沙門(mén)氏菌(Salmonellatyphi)、引起瘧疾的真核寄生蟲(chóng)、肺炎卡氏肺囊蟲(chóng)(Pneumocystispneumonia)、以及引起弓形體病的媒介。
所述變態(tài)反應(yīng)原最好是人類變態(tài)反應(yīng)原，或者是在所述組合物所要給予的個(gè)體類型或個(gè)體種型中引起變態(tài)反應(yīng)的變態(tài)反應(yīng)原。它可以是室內(nèi)變態(tài)反應(yīng)原或昆蟲(chóng)變態(tài)反應(yīng)原，例如塵螨變態(tài)反應(yīng)原，如Der p1。
除天然抗原和抗原性成分(包括其抗原性部分、片段或表位)外，還可以使用通過(guò)化學(xué)合成或通過(guò)重組DNA技術(shù)獲得的其抗原性變體或類似物。此外，在本發(fā)明的疫苗中，可以存在或表達(dá)兩種或更多種所述抗原的組合。這些抗原可以由一種(菌型或菌株)細(xì)菌宿主表達(dá)，或者由幾種不同的(菌型或菌株)細(xì)菌宿主表達(dá)。
在上面提到的抗原中，在本發(fā)明的疫苗中尤其優(yōu)選用作抗原的是針對(duì)和/或特異性針對(duì)以下病原體的抗原輪狀病毒、呼吸道合胞病毒、結(jié)核分枝桿菌、人類免疫缺陷病毒、大腸桿菌、霍亂弧菌、鏈球菌和衣原體。
所述抗原最好是這樣的在表達(dá)時(shí)，它允許所述重組細(xì)菌宿主(至少在某種程度上，而這與天然株相比可能降低)在給予后居留和/或定居在(部分)胃腸道，并保持在胃腸道。保留時(shí)間足以提供針對(duì)所述抗原和/或與其相關(guān)的病原體的顯著免疫應(yīng)答。
可以使用任何本身已知的表達(dá)系統(tǒng)在細(xì)菌宿主中表達(dá)所述抗原，所述表達(dá)系統(tǒng)以使得所述重組細(xì)菌宿主適于用于疫苗的方式在所述宿主中表達(dá)所述抗原。這意味著所述抗原至少應(yīng)當(dāng)在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)和/或使其暴露在所述細(xì)菌宿主的表面，并且所述抗原應(yīng)當(dāng)以合適水平表達(dá)，例如至少為總細(xì)胞蛋白的1-5％(根據(jù)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳和標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)染色測(cè)定)。表達(dá)系統(tǒng)通常所述表達(dá)系統(tǒng)包含遺傳構(gòu)建物，所述遺傳構(gòu)建物包含至少一種編碼所需抗原(即組成成分)的核苷酸序列，所述核苷酸序列最好操作性地連接能夠在所述細(xì)菌宿主中指導(dǎo)所述序列表達(dá)的啟動(dòng)子。所要表達(dá)的抗原最好由適合所述細(xì)菌宿主的優(yōu)選密碼子使用的核酸序列編碼。所述構(gòu)建物還可以包含在所選定的細(xì)菌宿主中起作用的(所有)其它合適元件，其中包括增強(qiáng)子、轉(zhuǎn)錄起始序列、信號(hào)序列、報(bào)道基因、轉(zhuǎn)錄終止序列等等。
所述構(gòu)建物最好采用適于轉(zhuǎn)化所述細(xì)菌宿主的形式和/或能夠在所述細(xì)菌宿主中穩(wěn)定維持的形式，如載體或質(zhì)粒。更優(yōu)選使用食品級(jí)的構(gòu)建物。
按照本發(fā)明尤其優(yōu)選的構(gòu)建物包括在PCT/NL95/00135(WO-A-96/32487)中描述的多拷貝表達(dá)載體，其中所述載體中已經(jīng)摻入編碼所述抗原的核苷酸序列。這樣的構(gòu)建物特別適于在乳酸細(xì)菌(尤其是在乳桿菌屬)中以高表達(dá)水平表達(dá)所需蛋白或多肽，并且還可以有利地用于指導(dǎo)所表達(dá)的產(chǎn)物轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)菌細(xì)胞表面。所述構(gòu)建物(如PCT/NL95/00135的構(gòu)建物)可以特征在于編碼所述抗原的核酸序列前面有5′非翻譯核酸序列，所述5′非翻譯核酸序列至少包含核糖體識(shí)別和RNA穩(wěn)定所需的最小序列。該核酸序列的后面可以是翻譯起始密碼子，所述翻譯起始密碼子的后面可以(緊接著)是乳酸細(xì)菌基因的翻譯核酸序列5′末端部分的至少5個(gè)密碼子片段，或所述片段的結(jié)構(gòu)或功能等同物。所述片段也可以由啟動(dòng)子控制。PCT/NL95/00135的內(nèi)容、包括該文公開(kāi)的不同實(shí)施方案、以及在本說(shuō)明書(shū)中提到的所有其它文件都通過(guò)引用結(jié)合到本文中。
所使用的構(gòu)建物最好提供這樣一種表達(dá)水平所述表達(dá)水平至少與PCT/NL95/00135的載體在同樣細(xì)菌宿主和同等條件下所提供的水平相當(dāng)(如在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)和/或暴露在表面)。
本發(fā)明的疫苗最好是口服疫苗，也就是說(shuō)它們適合口服給予。這樣的口服疫苗組合物通常是堿性的，因?yàn)橥ǔＰ枰獕A中和胃酸并使所述細(xì)菌(或至少大部分細(xì)菌)通過(guò)胃到達(dá)腸時(shí)仍然存活。優(yōu)選所給予的大部分細(xì)菌活著通過(guò)胃并到達(dá)腸。當(dāng)所述細(xì)菌是活的(也就是說(shuō)有活力)、而不是死的，就可以獲得增強(qiáng)的免疫應(yīng)答。這是因?yàn)樗鼈兛梢猿掷m(xù)在體內(nèi)表達(dá)異源抗原。藥用制劑并不都是堿性的，因此那些不是堿性的制劑(例如鼻制劑)不適于口服給予。
編碼所述抗原的序列可以從任何天然來(lái)源獲得，和/或使用眾所周知的DNA合成技術(shù)通過(guò)合成制備。接著(例如)可以將編碼所述抗原的序列摻入合適的表達(dá)載體，以提供本發(fā)明的遺傳構(gòu)建物，然后用所述遺傳構(gòu)建物轉(zhuǎn)化預(yù)定的細(xì)菌宿主菌株(如在PCT/NL95/00135中所述)。
然后可以培養(yǎng)如此獲得的重組細(xì)菌宿主，可選地在進(jìn)一步的純化和/或加工步驟(如凍干形成粉末)后，所收獲的細(xì)胞可以用于配制疫苗。
需要用于產(chǎn)生包含所述抗原編碼序列的遺傳構(gòu)建物以及用于轉(zhuǎn)化、培養(yǎng)和收獲所述細(xì)菌宿主的技術(shù)是本領(lǐng)域內(nèi)眾所周知的。例如在PCT/NL95/00135和標(biāo)準(zhǔn)手冊(cè)中有關(guān)于它們的描述，包括Sambrook等，“Molecular CloningA Laboratory Manual”(第二版)，第1-3卷，ColdSpring Harbor Laboratory(1989)和F.Ausubel等編著，“Current protocolsin molecular biology”，Green Publishing and Wiley Interscience，NewYork(1987)。
可以以已知方法配制包含所述細(xì)菌宿主的疫苗，所述方法例如用于動(dòng)物或人口服給予的疫苗配制方法和/或活細(xì)菌制劑配制方法?？梢詤⒖缄P(guān)于口服給予的益生菌(如為了治療胃腸疾病)的制備方法。
依照本發(fā)明的疫苗可以采用適于口服給予的形式，所述形式可以是固體形式、半固體形式或液體形式，包括但不限于通常優(yōu)選的所述細(xì)菌的溶液和/或懸浮液。
所述疫苗制劑也可以采用粉末的形式，如可以在使用前重建(如用合適液體)的凍干粉末。它可以采用在給予前與固體、半固體或液體食物混合的固體或液體制劑形式。它也可以采用發(fā)酵產(chǎn)品的形式。
除所述細(xì)菌外，所述疫苗可以包含一種或多種藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑，如水。所述疫苗也可以包含一種或多種適于口服給予的佐劑，如免疫佐劑。這些物質(zhì)與所述細(xì)菌宿主匹配，并最好不(太嚴(yán)重地)干擾其所需的免疫原性特性。依照一個(gè)實(shí)施方案，所述佐劑可以是乳酸細(xì)菌，如所述細(xì)菌宿主本身、一種上文提到的其它植物乳桿菌菌株、另一種乳桿菌屬細(xì)菌、甚至是適于口服給予人類或動(dòng)物的乳球菌屬(Lactococcus)、雙歧桿菌屬(Bifidobacterium)或丙酸桿菌屬(Propionibacterium)細(xì)菌。
此外，所述疫苗可以包含一種或多種其它藥用物質(zhì)和/或一種或多種可促進(jìn)和/或增強(qiáng)所述細(xì)菌在(部分)胃腸道定居和/或所述細(xì)菌在胃腸道中的生長(zhǎng)的物質(zhì)。所述制劑還可以采用適于例如通過(guò)管或?qū)Ч?直接)給予胃或腸的形式。所述細(xì)菌宿主在口服給予時(shí)最好居留在、并因此可以定居在胃腸道或至少其部分，如口腔、腸、小腸(如十二指腸、空腸或回腸)、大腸(或其部分，如盲腸)或結(jié)腸，最好是在小腸或盲腸。免疫原性因此，由所述細(xì)菌宿主表達(dá)的抗原可以與粘膜層、胃腸道的內(nèi)層和/或壁(本文總稱為“胃腸道壁”)接觸，更具體地說(shuō)是與該壁內(nèi)的細(xì)胞相接觸。這可以介導(dǎo)針對(duì)如此呈遞的(例如抗原呈遞細(xì)胞(例如巨噬細(xì)胞、樹(shù)突細(xì)胞和/或B-淋巴細(xì)胞))抗原的免疫應(yīng)答。這種胃腸道壁內(nèi)細(xì)胞的免疫應(yīng)答本身已經(jīng)可以構(gòu)成如本文所定義的顯著免疫應(yīng)答，和/或它可以進(jìn)一步觸發(fā)所述疫苗所給予的人類或動(dòng)物體內(nèi)的免疫反應(yīng)/應(yīng)答，這也可以是如本文所定義的顯著反應(yīng)和/或保護(hù)性反應(yīng)。然而，本發(fā)明不限于通過(guò)重組細(xì)菌宿主引發(fā)任何免疫應(yīng)答的任何特定機(jī)制。例如，與由同樣抗原(如(游離的)可溶蛋白)引發(fā)的應(yīng)答相比，由所述細(xì)菌宿主表達(dá)的抗原所引發(fā)的免疫應(yīng)答可以提供更強(qiáng)烈或增強(qiáng)的免疫應(yīng)答。
在本發(fā)明中，與給予、表達(dá)和/或使用作為游離可溶性蛋白的所述抗原相比，所述抗原呈遞和/或傳遞到胃腸道壁和/或其中的特定細(xì)胞(例如介導(dǎo)和/或參與免疫應(yīng)答的細(xì)胞)的方式得到改善或增強(qiáng)。例如，由于所述細(xì)菌宿主可以附著到胃腸道的壁上并可以原位持續(xù)相當(dāng)長(zhǎng)的時(shí)間，因此所述抗原在胃腸道壁局部的呈遞量更大、水平或濃度更高、更穩(wěn)定或更有抗性和/或呈遞時(shí)間更長(zhǎng)。因此這些因素中的任何一種都可以提供(增強(qiáng)的)免疫應(yīng)答。
所述細(xì)菌宿主或其任何部分或片段和/或其產(chǎn)生的任何其它化合物可以與胃腸道壁和/或其中的特定細(xì)胞相互作用，所述細(xì)胞如介導(dǎo)和/或涉及免疫應(yīng)答的細(xì)胞。例如與給予、表達(dá)和/或使用作為游離、可溶蛋白的抗原相比，這可以引起、促進(jìn)或增強(qiáng)針對(duì)與所述細(xì)菌宿主結(jié)合的抗原的免疫反應(yīng)。
雖然所述抗原最好由所述細(xì)菌宿主表達(dá)以便所述抗原暴露于細(xì)胞表面，但并不排除為了增強(qiáng)免疫應(yīng)答，由所述細(xì)菌宿主在原位(即在胃腸道壁局部)釋放和/或放出所述細(xì)菌宿主的細(xì)胞內(nèi)容物，如通過(guò)使所述細(xì)菌細(xì)胞壁的壁可通透和/或破壞所述細(xì)胞或細(xì)菌細(xì)胞壁的機(jī)制。因此，有可能完整的細(xì)菌宿主不會(huì)引起/引發(fā)(在胃腸道壁原位的)免疫原性應(yīng)答，而是由其部分、片段、小部分或化合物例如所述抗原本身和/或包含所述抗原的細(xì)胞片段或細(xì)胞部分引起/引發(fā)免疫原性應(yīng)答。因此，雖然優(yōu)選所述疫苗包含完整、有活力和/或活的細(xì)菌，但并不排除(例如，同時(shí))包含來(lái)自所述重組細(xì)菌宿主的片段、部分、溶菌產(chǎn)物等等的疫苗。劑量所給予細(xì)菌的量并不是關(guān)鍵的，但給予劑量最好足以使所述細(xì)菌居留和/或定居在(需要部分)胃腸道，和/或引起顯著的免疫應(yīng)答。合適的劑量是每劑至少108cfu，最好108-1010cfu。這將允許足夠量的細(xì)菌進(jìn)入腸道，如果需要的話。低于108cfu劑量的口服給予并不總能獲得所需的免疫原性(至少不以可靠的方式)，而大于5×1010cfu的量在不利于口服給予時(shí)不是優(yōu)選的。例如，上面所述細(xì)菌量(劑量)可能相當(dāng)于每公斤體重(人類或動(dòng)物)106到108cfu。在所述疫苗(或其它制劑)中細(xì)菌的濃度可以是至少5×109/ml，如至少1010/ml?？梢詢H給予所述制劑長(zhǎng)至2、3或4天。在第一次或最后一次給予后至少5天、7天或9天，在所述個(gè)體中仍然可以檢測(cè)到所述細(xì)菌。疫苗需要接種的個(gè)體最好是人類或動(dòng)物。所述人類可以是嬰兒、無(wú)免疫應(yīng)答的人、老人或正常的健康嬰兒、兒童或成人。
所使用的細(xì)菌宿主的一個(gè)好處是它們能夠存活/通過(guò)腸道而足量定居在腸道內(nèi)。然而，人們可以給予所述細(xì)菌的包衣制劑或膠囊化制劑，例如延遲釋放組合物或腸溶包衣組合物形式。合適的膠囊化化合物包括但不限于殼聚糖、麥芽糊精、脂質(zhì)和寡糖及多糖。膠囊化也可以改善所述疫苗的保存期。所述疫苗可以不含佐劑，但最好包含一種或多種佐劑。
雖然本發(fā)明主要參照植物乳桿菌菌株進(jìn)行了描述，但是也可能存在證明適合用作例如本發(fā)明疫苗中的細(xì)菌宿主的其它各種乳桿菌屬細(xì)菌的菌株。這樣的菌株可以包括來(lái)自以下細(xì)菌的菌株戊糖乳桿菌、路氏乳桿菌(L.reuteri)、動(dòng)物乳桿菌(L.animalis)(＝鼠乳桿菌(L.murinus))、發(fā)酵乳桿菌、嗜酸乳桿菌(L.acidophilus)、卷曲乳桿菌(L.crispatus)、加氏乳桿菌(L.gasseri)、約氏乳桿菌(L.johnsonii)、唾液乳桿菌(L.salivarius)、短乳桿菌、鼠李糖乳桿菌和/或類干酪乳桿菌(L.paracasei)。
用于本發(fā)明的菌株最好具有GRAS狀態(tài)，更優(yōu)選是食品級(jí)。此外，它們最好與上文提到的PCT/NL95/00135的表達(dá)載體、或另一種與這種優(yōu)選表達(dá)載體產(chǎn)生相似表達(dá)水平(如在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)和/或暴露在所述細(xì)菌宿主的表面的表達(dá))的載體組合使用。
此外，雖然優(yōu)選使用屬于乳桿菌屬的菌株，但設(shè)想也有可能從雙歧桿菌和丙酸桿菌如從雙歧桿菌屬和/或丙酸桿菌屬選出合適的菌株。技術(shù)人員可以采用與選出植物乳桿菌和/或乳桿菌相同的方式，選出合適的菌株。
例如，用于確定/確認(rèn)選定菌株是否適于用作按照本發(fā)明細(xì)菌宿主的合適測(cè)定如下用攜帶TTFC的載體pLP401(用于TTFC抗原的表面錨定/表面暴露表達(dá))和/或攜帶TTFC的載體pLP503(用于TTFC抗原的細(xì)胞內(nèi)表達(dá))轉(zhuǎn)化所述宿主，然后最好按照實(shí)施例中提到的單劑激發(fā)和加強(qiáng)方案，將如此獲得的重組宿主口服給予動(dòng)物、最好是哺乳動(dòng)物(如小鼠，例如BALB/c和/或C57bl/6小鼠)，在此之后使用破傷風(fēng)類毒素通過(guò)ELISA測(cè)量個(gè)體血清中IgG的終點(diǎn)滴度。在這樣的測(cè)定中，當(dāng)使用同樣載體轉(zhuǎn)化并在同樣條件下給予時(shí)，所選定的重組宿主最好提供比植物乳桿菌NICMB8826和/或植物乳桿菌80更高(即至少高1％)的抗體滴度；更優(yōu)選抗體滴度至少高10％，甚至更優(yōu)選至少高20％。
所選定的重組宿主最好提供這樣的滴度該滴度是用同樣載體轉(zhuǎn)化并在同樣條件下給予的植物乳桿菌256提供的滴度的至少70％、更優(yōu)選至少90％，甚至更優(yōu)選所述滴度至少相當(dāng)于用同樣載體轉(zhuǎn)化并在同樣條件下給予的植物乳桿菌256所提供的滴度。
本發(fā)明還涉及前面描述用于本發(fā)明疫苗的細(xì)菌。本發(fā)明還涉及適于異源抗原在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)或暴露在細(xì)胞表面的表達(dá)載體。這種表達(dá)將發(fā)生在細(xì)菌內(nèi)，例如如前所述的植物乳桿菌。
本發(fā)明還涉及使用經(jīng)修飾表達(dá)異源抗原(如在細(xì)胞內(nèi)和/或在細(xì)胞表面)的乳桿菌(如植物乳桿菌)生產(chǎn)疫苗，所述疫苗用于所述未修飾的植物乳桿菌對(duì)其是外源性的個(gè)體。所述未修飾的植物乳桿菌最好不存在于人類(或人類食物)，或例如不存在于哺乳動(dòng)物的胃腸道或粘膜。本文所述的細(xì)菌可以用于生產(chǎn)疫苗。所述疫苗可適用于口服給予。所述細(xì)菌最好在給予時(shí)引發(fā)免疫應(yīng)答。本發(fā)明的疫苗尤其可以用于破傷風(fēng)或預(yù)防破傷風(fēng)。
假如法律允許，本發(fā)明也涉及將所述細(xì)菌或疫苗給予個(gè)體，如人類或動(dòng)物(如哺乳動(dòng)物)，所述個(gè)體(或合適對(duì)象)需要細(xì)菌或疫苗。如上文所述，所述個(gè)體可能需要治療或預(yù)防特定疾病。
本發(fā)明一個(gè)方面的優(yōu)選特征和特點(diǎn)同樣適用于另一方面的必要修改。
現(xiàn)在將通過(guò)下面涉及附圖的實(shí)施例舉例說(shuō)明本發(fā)明，提供所述實(shí)施例的目的僅僅是為了舉例說(shuō)明，不應(yīng)當(dāng)認(rèn)為本發(fā)明僅限于隨后的實(shí)施例。
在粘膜免疫的目標(biāo)位點(diǎn)有活力的活微生物疫苗載體代表了同時(shí)在粘膜位點(diǎn)和系統(tǒng)位點(diǎn)促進(jìn)免疫應(yīng)答的有效傳遞系統(tǒng)。目前為止的觀察已經(jīng)強(qiáng)調(diào)了減毒致病病毒和細(xì)菌與非復(fù)制型抗原相比在誘導(dǎo)粘膜免疫應(yīng)答上的優(yōu)越性。因此，基于肽或純化的重組蛋白的口服亞單位疫苗方法可能在這一重要的必要條件(即在胃腸道本身誘導(dǎo)保護(hù)性免疫)上是不完善的?？诜臃N仍然是安全及便宜的，同時(shí)保持進(jìn)行單劑免疫的潛力，因此這有利于改善接種方案的順從率。目前，針對(duì)破傷風(fēng)的接種涉及破傷風(fēng)類毒素(TT)制劑，這種接種覆蓋差并且有與所有同時(shí)注射針傳遞疫苗的污染風(fēng)險(xiǎn)。破傷風(fēng)毒素片段C(TTFC)是破傷風(fēng)全毒素的50kDa無(wú)毒性木瓜蛋白酶切割產(chǎn)物，是可替代使用的保護(hù)性免疫原，目前用于幾種開(kāi)發(fā)中的活載體系統(tǒng)。出于對(duì)腸胃外疫苗所面臨的障礙的理性反應(yīng)，人們通過(guò)合適的活微生物載體將疫苗亞單位傳遞到粘膜表面。然而，潛在的安全性和環(huán)境考慮，尤其是發(fā)展中國(guó)家疫苗接受者的免疫狀況，仍然否定了使用大部分粘膜傳遞載體候選者如大腸桿菌、沙門(mén)氏菌屬和痘苗病毒。因此，非致病性、食品級(jí)或共生細(xì)菌載體已經(jīng)由于它們用作疫苗的潛力而受到注意。
共生細(xì)菌與宿主保持復(fù)雜非侵襲性生態(tài)學(xué)，它們雖然受到免疫系統(tǒng)監(jiān)視，但不一定對(duì)它們的生態(tài)學(xué)小生境中的免疫清除敏感。乳桿菌在氣性消化道各個(gè)部位內(nèi)優(yōu)勢(shì)存說(shuō)明了它們用作口服活疫苗的獨(dú)特潛力。根據(jù)它們?cè)谑称饭I(yè)中的應(yīng)用，它們的“一般認(rèn)為是安全的”(GRAS)狀態(tài)看來(lái)是顯而易見(jiàn)的；在共同給予DxRRV獼猴-人重分配口服輪狀病毒疫苗和TNP-綴合抗原時(shí)，已經(jīng)證實(shí)了它們?cè)鰪?qiáng)免疫應(yīng)答的能力，其效果可能是由于格蘭氏陽(yáng)性肽聚糖和脂磷壁質(zhì)酸組份的巨噬細(xì)胞激活特性和IFN-γ誘導(dǎo)特性。乳桿菌所參與的粘膜免疫穩(wěn)態(tài)綜合存在物理性排阻、IgA分泌和T細(xì)胞亞型主動(dòng)調(diào)節(jié)。如下研究了口服傳遞后避免抗原特異性外周耐受性(口服耐受性)的可能性以顆粒形式(與可溶膳食性抗原不同)的TTFC進(jìn)行接種，以允許通過(guò)一般性腸道菌群的免疫調(diào)節(jié)機(jī)制進(jìn)行加工和呈遞。數(shù)據(jù)顯示與干酪乳桿菌393相比，植物乳桿菌256株更有效，并且作為細(xì)胞內(nèi)抗原表達(dá)的TTFC的傳遞在某些情況下比細(xì)胞表面表達(dá)稍好(在測(cè)試條件和所使用的檢測(cè)技術(shù)下)。重組DNA技術(shù)使用大腸桿菌DH5α作為宿主株以操作以前所述的pLP401或-503穿梭載體(Maassen等，Vaccine 172117，1999)。使用PCR技術(shù)在3′端延長(zhǎng)編碼TTFC的1329 bp DNA(A.Mercenier，Lille，F(xiàn)rance)，使其具有Xho I和Nco I限制位點(diǎn)，以促進(jìn)克隆入pLP401和pLP503穿梭載體。
在通過(guò)電穿孔將所述質(zhì)粒轉(zhuǎn)移進(jìn)入乳桿菌前，通過(guò)Not I消化除去在所述穿梭載體上存在的Tldh終止子序列，得到在下面表1中所示的pL401和pLP503質(zhì)粒。表1使用的細(xì)菌菌株和質(zhì)粒菌株或質(zhì)粒 相關(guān)基因型或表型來(lái)源/參考文獻(xiàn)植物乳桿菌 256，野生型 本研究干酪乳桿菌 393 ATCCpLP503-TTFC P-ldh，Ampr，Eryr，TTFC Pouwel等，1996，見(jiàn)上文pLP401-TTFC Pα-amy，Ampr，Eryr，ssAmy，Pouwel等，1996，見(jiàn)上文Anchor，TTFC其中p-ldh＝干酪乳桿菌的ldh基因的啟動(dòng)子序列，Pα-amy＝食淀粉乳桿菌(L.
amylovorus)的α-淀粉酶基因的啟動(dòng)子序列，Eryr＝紅霉素抗性基因，Ampr＝氨芐青霉素抗性基因，ssAmy＝編碼干酪乳桿菌的α-淀粉酶基因分泌信號(hào)(36個(gè)氨基酸)的序列，Anchor＝干酪乳桿菌的錨定肽(117個(gè)氨基酸)編碼序列，TTFC＝編碼破傷封毒素片段C的1329 bp DNA。
所述載體的重連接將所述TTFC蛋白編碼序列符合讀框地與下列序列并列連接起來(lái)分別存在于pLP401和pLP503中的調(diào)節(jié)型淀粉酶基因(o-淀粉酶)下游的翻譯起始區(qū)密碼子或組成型乳酸脫氫酶(Ldh)基因啟動(dòng)子序列。在電穿孔感受態(tài)乳桿菌后，在紅霉素(5μg/ml)瓊脂平板上選擇轉(zhuǎn)化體。使用已知技術(shù)(Maassen等，見(jiàn)上文)進(jìn)行通用分子克隆技術(shù)和乳桿菌的轉(zhuǎn)化。乳桿菌屬菌株的選擇如下鑒定適于用作轉(zhuǎn)化宿主菌株的乳桿菌在用一系列利福平抗性野生型乳酸桿菌以109細(xì)胞單劑胃內(nèi)接種小鼠后，定量培養(yǎng)獲得的排泄物樣品。選擇在胃腸道內(nèi)持續(xù)達(dá)12天的植物乳桿菌256(P.Conway，Sydney，Australia或Adlerberth等，Appl & Env.Microbiology，第62卷(7)2244-2251，1996)以及在72小時(shí)內(nèi)就檢測(cè)不到的干酪乳桿菌(ATCC 393)作為原型宿主菌株。凝膠電泳和蛋白質(zhì)印跡分析從甘油貯藏物中按照常規(guī)制備包含表1中詳細(xì)描述的質(zhì)粒的重組干酪乳桿菌和植物乳桿菌在含5μg/ml紅霉素的MRS培養(yǎng)基中半無(wú)氧過(guò)夜(o/n)培養(yǎng)1∶50的稀釋物。
最好在含2％(w/v)葡萄糖的抗生素選擇性LCM培養(yǎng)基中，于37℃下，培養(yǎng)攜帶有包含組成型ldh啟動(dòng)子的質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化體。通過(guò)在含有甘露醇(2％w/v)的LCM培養(yǎng)基中以1∶50稀釋細(xì)胞的過(guò)夜培養(yǎng)物，培養(yǎng)攜帶有包含調(diào)節(jié)型α-淀粉酶啟動(dòng)子的質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化體。使用W870BransonTM超聲波儀，以開(kāi)30秒鐘/關(guān)30秒鐘的循環(huán)超聲波破碎細(xì)胞四次，釋放胞質(zhì)蛋白或細(xì)胞膜結(jié)合蛋白，從而從所述細(xì)菌獲得總細(xì)胞提取物。
通過(guò)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)，(10％丙烯酰胺，400 mMTris[pH 8.9])在25mM Tris，192mM甘氨酸緩沖液(pH 8.3)中以200V進(jìn)行45分鐘，分離在30μg總細(xì)胞提取物中的蛋白。使用BioradTM電泳裝置將蛋白質(zhì)電泳轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素上。使用最佳稀釋的兔TTFC特異性抗血清和山羊抗兔IgG特異性磷酸酶綴合物(Nordic，Tilburg，荷蘭)顯影免疫印跡。細(xì)胞表面表達(dá)TTFC的流式細(xì)胞術(shù)分析在確定時(shí)間點(diǎn)，制備細(xì)菌以通過(guò)FACScan進(jìn)行分析。細(xì)胞洗滌兩次，并重懸浮于PBS/1％牛血清白蛋白(BSA)中。在所述細(xì)胞中加入50μl最佳稀釋的兔TTFC特異性抗血清處理1小時(shí)。再次洗滌細(xì)胞兩次，并通過(guò)與以1∶1000稀釋的異硫氰酸熒光素綴合(FITC)抗兔溫育30分鐘，檢測(cè)結(jié)合的抗體。洗滌細(xì)胞兩次后，用Becton-Dickinson流式細(xì)胞儀分析光散射和熒光。根據(jù)前向散射和側(cè)向散射的細(xì)胞質(zhì)量(cytogram)，在大致合適尺寸事件設(shè)置一個(gè)門(mén)(gate)。通過(guò)染色野生型干酪乳桿菌393或植物乳桿菌256、用未免疫兔血清染色重組體或排除兔TTFC特異性抗血清，從而制備對(duì)照。所有程序都在冰上用1％BSA進(jìn)行。對(duì)每個(gè)樣品收集10,000-20,000個(gè)閘門(mén)事件的數(shù)據(jù)。從細(xì)菌細(xì)胞懸浮液中獲得的熒光用熒光柱狀圖代表，并計(jì)算平均通道強(qiáng)度。免疫用表達(dá)TTFC的重組干酪乳桿菌或植物乳桿菌制劑胃內(nèi)(o)或鼻內(nèi)(i.n.)免疫6-8周齡BALB/c或C57BL/6小鼠。從過(guò)夜培養(yǎng)物中獲得的細(xì)菌在MRS或含1％葡萄糖的LCM培養(yǎng)基中1∶50稀釋，在37℃培養(yǎng)6小時(shí)直到OD695nm達(dá)到0.6-0.8(對(duì)數(shù)期中期)。通過(guò)在4℃離心而沉淀細(xì)胞，用PBS洗滌細(xì)胞一次，并在無(wú)菌PBS中制備合適濃度的細(xì)菌。
為進(jìn)行口服免疫，連續(xù)三天胃內(nèi)給予在250μl體積0.2MNaHCO3中的2-5×109細(xì)胞。為進(jìn)行鼻內(nèi)免疫，將在20μl體積PBS中的2-5×109細(xì)胞給到未麻醉小鼠鼻孔。對(duì)照小鼠接受相同劑量的野生型乳桿菌。對(duì)所有接種物樣品進(jìn)行平板計(jì)數(shù)，以確認(rèn)給予小鼠的CFU量。樣品收集和ELISA從免疫前小鼠尾靜脈獲得的血液樣品制備血清，并從免疫后21開(kāi)始以7天間隔從小鼠尾靜脈獲得的血液樣品制備血清。
為獲得支氣管肺泡灌洗液樣品，在特定時(shí)間點(diǎn)處死小鼠，插導(dǎo)管進(jìn)入肺內(nèi)，并用0.7mlPBS/0.1％BSA反復(fù)灌洗，然后在1000g下離心收集到的洗液，并將上清液貯藏在-80℃。
使用以50μl 0.16μg/ml的TT溶液(RIVM，Bilthoven，荷蘭)過(guò)夜包被的微量滴定板，評(píng)估抗原特異性免疫球蛋白G(IgG)水平。通過(guò)連續(xù)的log2稀釋物滴定各個(gè)血清樣品，并進(jìn)行一式二份測(cè)定。通過(guò)加入50μl最佳稀釋的山羊抗小鼠IgG磷酸酶綴合物(Nordic，Tilburg，荷蘭)，檢測(cè)結(jié)合的抗體。在加入PNPP(在0.1M DEA/MgCl2中，1mg/ml)色原底物后，通過(guò)測(cè)量反應(yīng)起始30-90分鐘后獲得的平板A405nm值，定量抗體水平。使用由免疫前小鼠獲得的1∶10稀。釋血清的平均吸光度(OD 0.2)確定的臨界點(diǎn)，計(jì)算終點(diǎn)滴度。對(duì)于支氣管肺泡灌洗液中的抗原特異性免疫球蛋白A(IgA)水平，則使用最佳稀釋的山羊抗小鼠IgA磷酸酶綴合物(Nordic)，進(jìn)行同樣程序?？乖禺愋訲淋巴細(xì)胞增殖測(cè)定和ELISPOT在最后一次免疫后的第12天和第21天，無(wú)菌操作取出小鼠的脾和頸淋巴結(jié)(CLN)。使其通過(guò)一個(gè)細(xì)胞濾網(wǎng)(70uM Nylon；B&D，)并在1500rpm離心10分鐘，制備單細(xì)胞懸浮液。通過(guò)錐蟲(chóng)藍(lán)染料排阻來(lái)評(píng)估有活力并且未分級(jí)分離的細(xì)胞數(shù)目。
為了測(cè)試抗原特異性T-淋巴細(xì)胞增殖，將細(xì)胞重懸浮并以3×105細(xì)胞/脾或5×105細(xì)胞/LN的濃度接種到無(wú)菌平底96孔培養(yǎng)板(Nunc，丹麥)中，終體積為200μl的培養(yǎng)基(RPMI-1640，補(bǔ)充10％熱失活的胎牛血清、2mM L-谷氨酰胺、20U/ml青霉素和20μg/ml鏈霉素(都來(lái)自Gibco，Pairsley，UK)和50μM 2-巰基乙醇{Sigma，MO})。對(duì)照孔僅含培養(yǎng)基，而抗原則按指定劑量范圍加入三個(gè)平行培養(yǎng)物中。所有細(xì)胞在濕化5％CO2空氣中在37℃下維持4天。在收獲前最后的16-18小時(shí)內(nèi)，用0.6uCi[3H]胸苷(3H-TdR，5 Ci/mMol，TRA 120，Amersham，UK)以30μl體積/培養(yǎng)孔脈沖標(biāo)記所述細(xì)胞。使用ILACON細(xì)胞收集器收集細(xì)胞，并將細(xì)胞放置到玻璃纖維濾膜片(Whatman)上。通過(guò)氣體閃爍光譜測(cè)定法(β-平板計(jì)數(shù)器，Canberra Packard，Meriden，CT)評(píng)估胸苷摻入，結(jié)果按照三個(gè)平行培養(yǎng)物的平均c.p.m(±SD)計(jì)算，并表示為刺激指數(shù)(SI)。
按照Czerkinsky等，J.Immunol.Methods 65109(1983)，定量所述脾和CLN中TT特異性抗體分泌細(xì)胞(ASC)的數(shù)量。微量滴定板(Maxisorp plates，Nunc，丹麥)用50μl 0.16μg/ml的TT溶液(RIVM，Bilthoven，荷蘭)或作為對(duì)照的50μl PBS包被過(guò)夜。徹底洗滌、并用PBS/0.1％BSA封閉板后，將細(xì)胞以1×106及2×105細(xì)胞/脾或5×105及1×105細(xì)胞/LN的濃度加入50μl終體積的培養(yǎng)基中，在濕化5％CO2空氣中在37℃下溫育4小時(shí)。洗板并用含10mM EDTA的冰冷的PBS溫育20分鐘以除去細(xì)胞，然后用PBS/0.05％Tween-20和PBS/0.5％BSA再次洗滌。通過(guò)加入50μl最佳稀釋的兔抗小鼠Ig磷酸酶綴合物(DAKO，丹麥)于4℃過(guò)夜，檢測(cè)結(jié)合的抗體。充分洗板，并與含1％低融溫度瓊脂糖的AMP緩沖液中的1mg/ml BCIP溫育。將所述平板翻轉(zhuǎn)放在光源上，顯微鏡計(jì)數(shù)觀察到的藍(lán)點(diǎn)。重組TTFC在乳桿菌中的表達(dá)收集對(duì)數(shù)期中期細(xì)胞，超聲處理破碎所述細(xì)菌，證明植物乳桿菌和干酪乳桿菌轉(zhuǎn)化體胞質(zhì)表達(dá)TTFC或表達(dá)細(xì)胞壁結(jié)合TTFC。通過(guò)SDS-PAGE分離蛋白，并使用TTFC特異性兔抗血清顯示免疫印跡。
具體地說(shuō)，在LCM(+2％甘露醇)中培養(yǎng)pLP401-TTFC轉(zhuǎn)化體(表面錨定表達(dá))，在MRS(Difco)中培養(yǎng)pLP503-TTFC轉(zhuǎn)化體(細(xì)胞內(nèi)表達(dá))，(兩種培養(yǎng)基都補(bǔ)充了5μg/ml紅霉素)，在37℃下培養(yǎng)到OD 0.6，然后沉淀并通過(guò)超聲處理進(jìn)行破碎。在10％SDS/聚丙烯酰胺凝膠上電泳分析30μg總蛋白，并將分離的蛋白通過(guò)電泳轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上。用兔抗TTFC(1∶500)和磷酸酶/PNPP色原組合使TTFC顯色。條線指示分子量標(biāo)記的遷移。
對(duì)表達(dá)TTFC為表面錨定產(chǎn)物的重組植物乳桿菌pLP401-TTFC和干酪乳桿菌pLP401-TTFC進(jìn)行免疫熒光分析。根據(jù)前向和側(cè)向散射門(mén)控乳桿菌，并用按1∶500稀釋的兔TTFC特異性抗血清(Calbiochem，Ca)染色。用最佳稀釋的FITC綴合抗兔IgG(Jackson，PA)檢測(cè)結(jié)合抗體。通過(guò)FACScan(Becton Dickinson)分析在OD 0.6收集的細(xì)胞的熒光水平，并將所述熒光水平以柱狀圖顯示，顯示數(shù)據(jù)相對(duì)于與用非重組乳桿菌獲得的熒光水平。在每個(gè)實(shí)驗(yàn)中分析10,000個(gè)細(xì)胞。
從蛋白表達(dá)的照片和Mackintosh產(chǎn)生的FACScan，顯示包含pLP503-TTFC的乳桿菌僅表達(dá)細(xì)胞內(nèi)50kDa TTFC多肽。包含載體pLP401-TTFC的植物乳桿菌表達(dá)表面錨定的75kDa多肽，該多肽相當(dāng)于與25kDa錨定序列融合的50kDa TTFC，其水平高于干酪乳桿菌pLP401-TTFC的水平。通過(guò)FACScan，確認(rèn)了TTFC通過(guò)與錨定序列融合而暴露在植物乳桿菌和干酪乳桿菌的細(xì)胞壁上。在用重組乳桿菌鼻內(nèi)免疫后的TTFC特異性抗體應(yīng)答從免疫前小鼠收集血清，并從第7天開(kāi)始以7天間隔從小鼠收集血清。使用以PBS中0.16μg/ml破傷風(fēng)類毒素在4℃下包被過(guò)夜的微量滴定板，通過(guò)ELISA測(cè)量個(gè)體或匯集的血清中的TTFC特異性血清IgG。通過(guò)加入抗小鼠AP綴合物和PNPP底物，檢測(cè)結(jié)合的抗體。90分鐘時(shí)測(cè)量每個(gè)孔的OD405nm值。使用按照1∶10稀釋的免疫前血清的平均OD+2 SD’s(≈0.2)計(jì)算的臨界點(diǎn)，確定終點(diǎn)滴度。表2顯示了下面三種方法的結(jié)果。
A.在第1-3天用3劑20μl PBS中的5×109植物乳桿菌pLP503-TTFC或3劑20μl PBS中的5×109干酪乳桿菌pLP503-TTFC鼻內(nèi)免疫3只BALB/c小鼠。在第28-30天給予相同的加強(qiáng)免疫。
B.在第1-3天用3劑20μl PBS中的5×109植物乳桿菌pLP503-TTFC鼻內(nèi)免疫、或用3劑200μl NaHCO3中的5×109植物乳桿菌pLP503-TTFC口服免疫16只C57BL/6小鼠。
在第28-30天給予相同的加強(qiáng)免疫。
C.在第1天和第28天用20μl PBS中的5×109植物乳桿菌pLP503-TTFC鼻內(nèi)免疫3只BALB/6小鼠；或在第1-3天用3劑20μl PBS中的植物乳桿菌pLP401-TTFC鼻內(nèi)免疫3只BALB/6小鼠，然后或者在第28-30天用20μl PBS中的5×109植物乳桿菌pLP503-TTFC進(jìn)行一次鼻內(nèi)加強(qiáng)，或者在第28-30天和第49-51天用20μl PBS中的5×109植物乳桿菌pLP401-TTFC鼻內(nèi)進(jìn)行加強(qiáng)。
在第1-3天接受三次鼻內(nèi)劑量的細(xì)胞內(nèi)表達(dá)TTFC的植物乳桿菌或干酪乳桿菌的BALB/c和C57BL/6小鼠受到強(qiáng)烈的引發(fā)，在第28-30天接受鼻內(nèi)加強(qiáng)給予后發(fā)生對(duì)TTFC的繼發(fā)反應(yīng)。在用重組植物乳桿菌免疫后的BALB/c小鼠中TTFC特異性應(yīng)答的滴度高于使用重組干酪乳桿菌的滴度(表2A)，早至第28天就可以檢測(cè)到IgG，滴度在第49天分別上升到103.5和102.9。表2A滴度(log10)與免疫后天數(shù)的關(guān)系天數(shù) 0 23 35 42 49鼻內(nèi)免疫植物乳桿菌TTFc 平均值*0.0 0.01.23.5 3.4標(biāo)準(zhǔn)差 0.0 0.00.43 0.630.75鼻內(nèi)免疫干酪乳桿菌TTFc 平均值 0.0 0.00.32.952.8標(biāo)準(zhǔn)差 0.0 0.00.60 0.780.50*終點(diǎn)滴度(TT特異性IgG)C57BL/6小鼠顯示出比BALB/c小鼠更高的平均終點(diǎn)滴度(雖然并不顯著)(表2B)，因此選擇C57BL/6小鼠進(jìn)行進(jìn)一步分析，就是使用在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)TTFC的植物乳桿菌轉(zhuǎn)化體，用單劑引發(fā)和加強(qiáng)方案進(jìn)行鼻內(nèi)免疫(表2C)。表2B滴度(log10)與免疫后天數(shù)的關(guān)系天數(shù) 0 23 35 42 50口服免疫植物乳桿菌TTFc 平均值*0.000 0.100 0.881 1.350 0.986標(biāo)準(zhǔn)差0.000 0.400 1.234 1.319 1.258鼻內(nèi)免疫植物乳桿菌TTFc 平均值*0.000 1.840 4.275 4.219 4.163標(biāo)準(zhǔn)差0.000 1.172 0.338 0.417 0.407*終點(diǎn)滴度(TT特異性IgG)表2C滴度(log10)與免疫后天數(shù)的關(guān)系植物乳桿菌pLP401-TTFC/用植物乳桿菌pLP401-TTFC加強(qiáng)天數(shù) 014 28 42 49 566370 77 88平均值*000.2 0.1 0.05 1.55 1.9 2.2 2.7 2.8植物乳桿菌pLP401-TTFC/用植物乳桿菌pLP503-TTFC加強(qiáng)天數(shù) 01428 42 49 56平均值*00 02.73.43.95植物乳桿菌pLP503-TTFC/用植物乳桿菌pLP503-TTFC加強(qiáng)天數(shù) 0142842 49平均值*00 1.2 4.04.1*終點(diǎn)滴度(TT特異性IgG)與表2A在BALB/c小鼠中獲得的結(jié)果相比，到第49天在C57BL/6中誘導(dǎo)了更高的血清IgG平均滴度(104.2)。然而，不考慮是使用三劑量還是單劑量引發(fā)和加強(qiáng)免疫方案，C57BL/6小鼠顯示出沒(méi)有顯著不同的血清IgG終點(diǎn)滴度增加。
與此不同，為了在使用在細(xì)胞表面表達(dá)TTFC的植物乳桿菌鼻內(nèi)免疫的C57BL/6小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)TTFC特異性血清IgG，需要在第1-3天對(duì)小鼠進(jìn)行引發(fā)，并隨后至少加強(qiáng)兩次(在第28-30天和第49-51天)，然后才能測(cè)量到抗原特異性應(yīng)答(表2C)。然而，有趣的是，如上文用植物乳桿菌pLP401-TTFC引發(fā)的小鼠，在第28-30天用植物乳桿菌pLP503-TTFC轉(zhuǎn)化體加強(qiáng)時(shí)，的確誘導(dǎo)了TTFC特異性血清IgG(動(dòng)力學(xué)比首次用于實(shí)驗(yàn)的小鼠的應(yīng)答更迅速)(表2C)。這項(xiàng)觀察令人感興趣地提示小鼠的抗原特異性致敏實(shí)際上發(fā)生在給予用pLP401-TTFC轉(zhuǎn)化的植物乳桿菌之后，雖然所述免疫應(yīng)答的成熟和可測(cè)量性由于各種原因而沒(méi)有發(fā)生。然而，與此不同，在細(xì)胞表面表達(dá)TTFC的干酪乳桿菌不能在BALB/c品系或C57BL/6品系中顯示任何引發(fā)效應(yīng)，而在第1天、第28天和第56天單劑量給予植物乳桿菌轉(zhuǎn)化體本身也如此。
在用植物乳桿菌pLP503-TTFC鼻內(nèi)免疫小鼠后，研究在支氣管肺泡灌洗液中的破傷風(fēng)類毒素特異性IgA抗體的誘導(dǎo)情況。C57BL/6小鼠在第1-3天用5×109植物乳桿菌pLP503-TTFC鼻內(nèi)(A&B)或口服(C&D)免疫，然后在第28-30天鼻內(nèi)(A&B)或口服(C&D)進(jìn)行相同加強(qiáng)免疫。在12(A&C)和21(B&D)天，在最后一次加強(qiáng)后，每組處死4只小鼠，通過(guò)用導(dǎo)管以0.7ml PBS/0.1％BSA沖洗肺，獲得支氣管肺泡灌洗液。使用以PBS中0.16μg/ml破傷風(fēng)類毒素在4℃下包被過(guò)夜的微量滴定板，通過(guò)ELISA測(cè)量這些樣品中的TT特異性IgA。通過(guò)加入抗小鼠AP綴合物和PNPP底物，檢測(cè)結(jié)合的抗體。在4℃下過(guò)夜后測(cè)量每個(gè)孔的OD405nm值。
如表3A&3B所示，在第1-3天接受三劑表達(dá)TTFC的植物乳桿菌的C57BL/6小鼠進(jìn)行粘膜引發(fā)，在第28-30天鼻內(nèi)給予加強(qiáng)后的第12天和第21天，在支氣管肺泡灌洗液中測(cè)量到TT特異性IgA應(yīng)答。在第12天及第21天，從用野生型植物乳桿菌256鼻內(nèi)免疫的小鼠獲得的支氣管肺泡灌洗液都沒(méi)有顯示與TT包被的微量滴定板的反應(yīng)性。表3A、B、C和DOD405nm與鼻內(nèi)(A，B)或口服(C，D)加強(qiáng)后天數(shù)的關(guān)系




*稀釋倍數(shù)**OD405nm(TT特異性IgA ELISA)在用重組乳桿菌口服免疫后的TTFC特異性抗體應(yīng)答在一項(xiàng)鼻內(nèi)免疫與口服免疫的比較研究中，C57BL/6小鼠在第1-3天接受三劑細(xì)胞內(nèi)表達(dá)TTFC的植物乳桿菌，然后在第28-30天接受加強(qiáng)給予。在口服免疫后，測(cè)試的16只小鼠中有9只發(fā)生了TTFC特異性血清IgG應(yīng)答的誘導(dǎo)(表2B)。在鼻內(nèi)免疫后，所有16只小鼠都應(yīng)答產(chǎn)生高TTFC特異性終點(diǎn)滴度，在加強(qiáng)后7天內(nèi)平均滴度為104.3，該滴度保持高水平長(zhǎng)達(dá)3周。口服應(yīng)答在第7天的平均終點(diǎn)滴度是101.6，并在加強(qiáng)后第14天達(dá)到峰值102.4。與鼻內(nèi)組不同，在口服免疫的小鼠中，在第12天和第21天都沒(méi)有在支氣管肺泡灌洗液中測(cè)量到TT特異性IgA應(yīng)答(表3C&D)。
在另一項(xiàng)研究中，小鼠在第1、2和3天接受口服引發(fā)，并在2、3或4周后接受加強(qiáng)。不論加強(qiáng)的時(shí)間的時(shí)間如何，在加強(qiáng)接種后7天內(nèi)均觀察到TTFC特異性IgG應(yīng)答。
與此不同，用干酪乳桿菌轉(zhuǎn)化體(在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)TTFC或表面錨定TTFC)或在細(xì)胞表面表達(dá)TTFC的植物乳桿菌口服免疫的BALB/c或C57BL/6小鼠在所有等同的檢查時(shí)間點(diǎn)都不能誘導(dǎo)可檢測(cè)的TTFC特異性血清IgG應(yīng)答。接受野生型乳桿菌或不相關(guān)載體的小鼠在任何時(shí)間點(diǎn)都沒(méi)有顯示出TTFC特異性血清IgG應(yīng)答(數(shù)據(jù)未顯示)。脾和CLN中的TT特異性抗體分泌細(xì)胞和T細(xì)胞應(yīng)答在第1-3天，使用5×109植物乳桿菌pLP503-TTFC轉(zhuǎn)化體或作為對(duì)照的野生型植物乳桿菌256，口服或鼻內(nèi)免疫C57BL/6小鼠。隨后在第28-30天同樣加強(qiáng)免疫。在最后一次加強(qiáng)后的第12天或第21天，處死小鼠，并制備脾細(xì)胞和CLN細(xì)胞懸浮液。表4在最后一次加強(qiáng)后12天和21天，在脾和頸淋巴結(jié)中每106細(xì)胞中破傷風(fēng)類毒素特異性抗體分泌細(xì)胞的枚舉。
12天21天組別*脾 CLN 脾 CLN口服免疫植物乳桿菌256 0# 0 0 0口服免疫植物乳桿菌TTFC0 0 0.4(0-2) 0鼻內(nèi)免疫植物乳桿菌256 0 0 0 0鼻內(nèi)免疫植物乳桿菌TTFC48(7-107) 195(156-233)16(4-31) 13(5-27)注*在第1-3天，每組16只C57N1/6小鼠用5×109植物乳桿菌(植物乳桿菌256或植物乳桿菌pLP503-TTFC轉(zhuǎn)化體)鼻內(nèi)(i.n.)或口服免疫，然后在第28-30天同樣加強(qiáng)免疫。在最后一次加強(qiáng)后12天或21天每組處死8只動(dòng)物，并制備脾和頸淋巴結(jié)(CLN；按每2只動(dòng)物匯集)細(xì)胞懸浮液。通過(guò)ELISPOT測(cè)定TT特異性Ig生產(chǎn)細(xì)胞量。#該數(shù)據(jù)按每106細(xì)胞的抗體分泌細(xì)胞(ASC)表示，代表8個(gè)脾樣品或4個(gè)CLN樣品的平均值(范圍)，所述樣品以三個(gè)平行孔測(cè)量。在表4中，顯示了根據(jù)ELISPOT確定的在脾或CLN中存在的TT特異性抗體分泌細(xì)胞(ASC)的數(shù)量。在用植物乳桿菌轉(zhuǎn)化體鼻內(nèi)免疫后，在最后一次加強(qiáng)后12天在鼻內(nèi)免疫的小鼠的脾和CLN中發(fā)現(xiàn)大量TT特異性ASC，到第21天時(shí)ASC細(xì)胞數(shù)降低。這些數(shù)據(jù)提示小鼠的抗原特異性致敏局部出現(xiàn)在CLN水平上，并且系統(tǒng)性地出現(xiàn)在脾中。在口服免疫組中，測(cè)試的8份脾細(xì)胞懸浮液中有2份包含TT特異性ASC，而在CLN中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)ASC。
使用植物乳桿菌-pLP503-TTFC研究小鼠鼻內(nèi)免疫對(duì)抗原特異性T細(xì)胞的誘導(dǎo)。在第1-3天，用5×109植物乳桿菌(植物乳桿菌256或植物乳桿菌pLP503-TTFC轉(zhuǎn)化體)鼻內(nèi)(i.n.)或口服免疫C57BL/6小鼠，然后在第28-30天同樣加強(qiáng)免疫。在最后一次加強(qiáng)后12天(A&C)或21天(B&D)，每組處死8只動(dòng)物，并制備脾(A&B)和CLN(每2只動(dòng)物匯集)(C&D)細(xì)胞懸浮液。在將每孔3×105脾細(xì)胞或5×105CLN細(xì)胞與TTFC、TT、TT肽P30或僅培養(yǎng)基溫育72小時(shí)后，檢測(cè)細(xì)胞中的[3H]胸苷摻入。在最后18小時(shí)，在所述培養(yǎng)物中加入[3H]胸苷。結(jié)果表示為SI，SI如下計(jì)算將細(xì)胞三個(gè)平行測(cè)試培養(yǎng)物的平均cpm除以僅接受緩沖液的培養(yǎng)物的平均cpm。僅接受緩沖液的培養(yǎng)物的背景值為A 220-760 cpm，B150-240 cpm，C 1000-4000 cpm和D 150-560 cpm。
在

圖1中，顯示了脾或CLN的抗原特異性T細(xì)胞應(yīng)答。在用植物乳桿菌pLP503-TTFC轉(zhuǎn)化體鼻內(nèi)免疫的小鼠中，在用TTFC、TT或TT肽P30再刺激后測(cè)量到增殖，這提示鼻內(nèi)免疫最初通過(guò)局部淋巴結(jié)激活來(lái)誘導(dǎo)特異性免疫。在BALB/c小鼠中也獲得了脾和CLN的抗原特異性T細(xì)胞應(yīng)答。在從用野生型植物乳桿菌口服免疫或以同樣途徑免疫的小鼠獲得的細(xì)胞中，沒(méi)有觀察到抗原特異性增殖(圖1)。
所述pLP401-/503-質(zhì)粒使得能夠進(jìn)行TTFC的定向(表面或細(xì)胞內(nèi))和可調(diào)節(jié)表達(dá)，其表達(dá)水平和效率是以前在乳桿菌屬中沒(méi)有達(dá)到過(guò)的。此外，在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)TTFC的植物乳桿菌pLP503-TTFC在鼻內(nèi)傳遞、第1-3天引發(fā)并在第28-30天加強(qiáng)后，顯示具有很高的免疫原性。免疫原性在系統(tǒng)水平上，體現(xiàn)為高TT特異性IgG血清滴度，并且在粘膜水平上，體現(xiàn)為BAL液體中的TT特異性IgA。此外，在脾的系統(tǒng)水平上以及在頸LN的局部水平上，都顯示出TT特異性ASC和抗原特異性T細(xì)胞增殖。在口服傳遞植物乳桿菌-pLP503-TTFC后，測(cè)量到中等滴度的TT特異性血清IgG。干酪乳桿菌和植物乳桿菌菌株受到鼻道內(nèi)存在的M樣細(xì)胞的有效取樣，并誘導(dǎo)了血清中的相當(dāng)水平的免疫球蛋白。所述重組菌株間在TTFC表達(dá)水平、未降解TTFC的可維持水平以及在胃腸道中的持續(xù)性上的差異可能對(duì)于所述重組疫苗的效價(jià)有關(guān)鍵性的影響，并可解釋為什么常常意外觀測(cè)到植物乳桿菌菌株和干酪乳桿菌菌株之間的結(jié)果不同。討論表達(dá)相當(dāng)?shù)退奖砻姹┞禩TFC的植物乳桿菌pLP401-TTFC重組菌株在鼻內(nèi)給予后是有免疫原性的，但是需要引發(fā)小鼠(在第1-3天)并隨后加強(qiáng)兩次(在第28-30天和第49-51天)，然后才能測(cè)量到抗原特異性應(yīng)答。雖然TTFC的表面表達(dá)使B細(xì)胞表面存在的Ig能夠直接結(jié)合，從而潛在增強(qiáng)免疫原性，但這種表面抗原表達(dá)可能特別容易受到粘膜免疫后疫苗載體所遇到的低pH、膽汁酸或蛋白水解環(huán)境的影響。然而，有趣的是，如上文用植物乳桿菌pLP401-TTFC引發(fā)的小鼠在第28-30天用植物乳桿菌pLP503-TTFC轉(zhuǎn)化體加強(qiáng)時(shí)，的確誘導(dǎo)了TTFC特異性血清IgG(動(dòng)力學(xué)比首次用于實(shí)驗(yàn)的小鼠的應(yīng)答更迅速)。這項(xiàng)觀察提示小鼠的抗原特異性致敏實(shí)際上發(fā)生在給予用pLP401-TTFC轉(zhuǎn)化的植物乳桿菌之后，雖然所述免疫應(yīng)答的增強(qiáng)、成熟和可測(cè)量性由于各種原因而沒(méi)有發(fā)生。這提示為了最小化抗原降解并保證在免疫誘導(dǎo)位點(diǎn)保持能夠利用足夠的抗原，高水平的“穩(wěn)定”表面表達(dá)可能不如增加細(xì)胞內(nèi)抗原水平那么關(guān)鍵。
本研究在觀察到鼻免疫后的免疫原性后，進(jìn)一步地第一次證明用細(xì)胞內(nèi)表達(dá)TTFC的5×109植物乳桿菌口服免疫C57BL/6小鼠誘導(dǎo)了TTFC特異性血清IgG應(yīng)答，這提供了對(duì)基于乳桿菌屬的疫苗的重要支持。用干酪乳桿菌轉(zhuǎn)化體(在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)TTFC或表達(dá)表面錨定的TTFC)口服免疫BALB/c或C57BL/6小鼠結(jié)果相反。
由于干酪乳桿菌和植物乳桿菌在胃腸道內(nèi)的持續(xù)時(shí)間不同，因此選擇它們進(jìn)行研究。在持續(xù)性上的差異可解釋在免疫原性上的差異。
據(jù)認(rèn)為可能有幾種解釋植物乳桿菌(細(xì)胞表面表達(dá))結(jié)果的因素。首先，所述抗原在細(xì)胞表面的表達(dá)量比在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)量低(幾乎相差一個(gè)數(shù)量級(jí))，因此可能存在劑量效應(yīng)。此外，在腸腔內(nèi)存在降解蛋白質(zhì)的酶，因此細(xì)胞表面蛋白對(duì)于蛋白水解更容易受到影響。此外，所述蛋白質(zhì)可能在細(xì)胞表面具有與等同的細(xì)胞內(nèi)蛋白稍微不同的構(gòu)象，另外這樣的在細(xì)胞表面的抗原可能在細(xì)胞表面上改變活性，例如就附著而言。
所述的抗原傳遞載體強(qiáng)調(diào)了以下需要確定宿主載體組合，并評(píng)估細(xì)胞活力、細(xì)胞數(shù)目、對(duì)粘膜的附著以及免疫系統(tǒng)的觸發(fā)機(jī)制對(duì)于所述重組乳桿菌的免疫原性的影響。本發(fā)明首次證明了通過(guò)口服途徑傳遞重組乳桿菌之后的TTFC免疫原性，這支持使用安全的基于乳桿菌屬的口服新型疫苗來(lái)對(duì)抗例如目前每年記錄到的400,000例破傷風(fēng)死亡。
權(quán)利要求
1.一種包含重組乳酸細(xì)菌的口服疫苗，所述重組乳酸細(xì)菌能夠在細(xì)胞內(nèi)和/或在所述細(xì)菌的表面上表達(dá)異源抗原，其中所述細(xì)菌是植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)而且能夠激發(fā)針對(duì)所述異源抗原的免疫應(yīng)答和/或免疫原性。
2.依照權(quán)利要求1的疫苗，其中所述重組植物乳桿菌包含能夠在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)所述異源抗原和/或在細(xì)胞表面暴露性表達(dá)所述異源抗原的表達(dá)載體，任選所述表達(dá)在胃腸道內(nèi)的條件下進(jìn)行。
3.依照權(quán)利要求1或2的疫苗，其中所述異源抗原能夠誘導(dǎo)針對(duì)致病微生物、任選針對(duì)粘膜定居病原體特異性異源抗原或通過(guò)粘膜例如經(jīng)口途徑進(jìn)入體內(nèi)的病原體特異性異源抗原的免疫原性。
4.依照前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的疫苗，其中所述異源抗原誘導(dǎo)針對(duì)定居在胃腸道的致病微生物的免疫原性。
5.依照前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的疫苗，其中所述致病微生物是皰疹病毒、風(fēng)疹病毒、流感病毒、腮腺炎病毒、麻疹病毒、脊髓灰質(zhì)炎病毒、輪狀病毒、呼吸道合胞病毒、彎曲桿菌屬(Campylobacter)細(xì)菌、衣原體(Chlamydial)屬生物、Cryptosporidium屬物種、巨細(xì)胞病毒、人類免疫缺陷病毒、放線菌屬(Actinomyces)細(xì)菌、溶組織內(nèi)阿米巴(Entamoeba histolytica)、沙粒病毒、蟲(chóng)媒病毒、肉毒梭菌(Clostridiumbotulinum)、假絲酵母屬(Candida)真菌、霍亂弧菌(Vibrio cholera)、新型隱球酵母(Cryptococcus neoformans)、大腸桿菌O157H7、O26H11、O111H8和O104H21的EHEC株、大腸桿菌ETEC株、顯示具有腸侵襲性的大腸桿菌菌株(EIEC)、大腸桿菌的EPEC株、大腸桿菌的EAggEC株、大腸桿菌的DAEC株、線狀病毒科、細(xì)小病毒、絲蟲(chóng)目(Filarioidea)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、產(chǎn)氣莢膜梭菌(Clostridium perfringens)屬細(xì)菌、幽門(mén)螺桿菌(Helicobacter pylori)、杯狀病毒、蘭伯氏賈第蟲(chóng)(Giardia lamblia)、淋病奈瑟氏球菌(Neisseriagonorrhoeae)、漢坦病毒屬、甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、丁型肝炎病毒、戊型肝炎病毒、軍團(tuán)菌屬(Legionellae)菌株、麻風(fēng)分枝桿菌(Mycobacterium leprae)、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌(Listeriamonocytogenes)、產(chǎn)氣莢膜梭菌屬細(xì)菌、布氏疏螺旋體(Borreliaburgdorferi)、類鼻疽伯克霍爾德氏菌(Pseudomonas pseudomallei)、EB病毒、旋盤(pán)尾絲蟲(chóng)(Onchocerca volvulus)、痘病毒、百日咳桿菌(Bordetella pertussis)、鼠疫耶爾森氏菌(Yersinia pestis)、伯納特氏柯克斯氏體(Coxiella brunetti)、狂犬病病毒、蒼白密螺旋體(Treponemapallidium)、結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis)、傷寒沙門(mén)氏菌(Salmonella typhi)、引起瘧疾的真核寄生蟲(chóng)、肺炎卡氏肺囊蟲(chóng)(Pneumocystis pneumonia)、以及引起弓形體病的媒介，以及上述致病微生物的組合。
6.依照任一項(xiàng)前述權(quán)利要求的疫苗，所述疫苗激發(fā)針對(duì)輪狀病毒、呼吸道合胞病毒、結(jié)核分枝桿菌、人類免疫缺陷病毒、大腸桿菌、霍亂弧菌、鏈球菌和或衣原體的保護(hù)性應(yīng)答。
7.依照前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的疫苗，其中所述異源抗原是一種病毒抗原和/或細(xì)菌抗原，任選為HIV病毒的(gp160)包膜蛋白、利什曼原蟲(chóng)屬(Leishmania)寄生蟲(chóng)表面糖蛋白、志賀樣毒素、志賀菌屬(Shigella)脂多糖抗原、大腸桿菌菌毛抗原、產(chǎn)腸毒素的大腸桿菌菌株的CFA抗原、炭疽毒素、百日咳毒素、破傷風(fēng)毒素。
8.依照權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)的疫苗，其中所述異源抗原是一種人類變態(tài)反應(yīng)原或所述異源抗原是破傷風(fēng)特異性異源抗原。
9.依照前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的疫苗，所述疫苗可以誘導(dǎo)保護(hù)性免疫原性。
10.依照前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的疫苗，所述疫苗配制為單劑量疫苗。
11.依照前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的疫苗，其中所述重組植物乳桿菌在細(xì)胞內(nèi)和/或在細(xì)胞表面表達(dá)所述異源抗原，其表達(dá)程度超過(guò)植物乳桿菌80表達(dá)β-半乳糖苷酶的程度。
12.依照前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的疫苗，其中所述重組植物乳桿菌包含同源表達(dá)和/或分泌信號(hào)，所述同源表達(dá)和/或分泌信號(hào)任選為用于乳桿菌、優(yōu)選植物乳桿菌的表達(dá)載體的同源表達(dá)和/或分泌信號(hào)。
13.依照前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的疫苗，其中所述重組植物乳桿菌菌株保持(在接種個(gè)體內(nèi))5天以上、最好9天以上、優(yōu)選15天以上甚至20天。
14.依照前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的疫苗，其中所述重組植物乳桿菌在同等條件下比植物乳桿菌80保持更長(zhǎng)時(shí)間、最好比植物乳桿菌NCIMB8826保持更長(zhǎng)時(shí)間。
15.依照前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的疫苗，所述疫苗配制用于給予人類，例如嬰兒、無(wú)免疫應(yīng)答的人、老人或正常健康嬰兒、兒童或成人。
16.依照前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的疫苗，其中所述重組植物乳桿菌是重組植物乳桿菌256。
17.依照前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的疫苗，其中所述疫苗包含至少一種佐劑或藥學(xué)上可接受的載體。
18.一種前述任一項(xiàng)疫苗權(quán)利要求定義的重組植物乳桿菌，所述重組植物乳桿菌任選為植物乳桿菌256的重組菌株。
19.依照權(quán)利要求18的細(xì)菌，所述細(xì)菌是非人類來(lái)源的細(xì)菌。
20.一種非人類來(lái)源和/或非人類食品來(lái)源的乳桿菌屬細(xì)菌，所述乳桿菌屬細(xì)菌已進(jìn)行修飾以表達(dá)異源抗原并在個(gè)體內(nèi)激發(fā)免疫應(yīng)答。
21.依照權(quán)利要求20的細(xì)菌，其中(a)所述天然或未修飾的植物乳桿菌對(duì)于所述個(gè)體是外源性的或者不存在于人類胃腸道或粘膜內(nèi)；(b)所述抗原在細(xì)胞內(nèi)和/或在細(xì)胞表面上表達(dá)；和/或(c)所述抗原是一種免疫原。
22.一種乳桿菌屬細(xì)菌，所述乳桿菌屬細(xì)菌已進(jìn)行修飾以在細(xì)胞內(nèi)和/或在細(xì)胞表面上表達(dá)異源抗原，并在個(gè)體內(nèi)激發(fā)免疫應(yīng)答，并且所述乳桿菌屬細(xì)菌能夠在所述個(gè)體的胃腸道內(nèi)保持至少7天。
23.依照權(quán)利要求18至22中任一項(xiàng)的乳桿菌屬細(xì)菌，所述乳桿菌屬細(xì)菌是植物乳桿菌或者是用于疫苗的乳桿菌屬細(xì)菌。
24.一種適用于細(xì)胞內(nèi)表達(dá)或暴露(在細(xì)胞表面上)性表達(dá)外源抗原的表達(dá)載體，所述表達(dá)載體能夠在胃腸道內(nèi)條件下在植物乳桿菌內(nèi)表達(dá)所述異源抗原。
25.依照權(quán)利要求19至24中任一項(xiàng)的細(xì)菌，所述細(xì)菌用于人類或動(dòng)物體的預(yù)防或治療方法。
26.一種乳桿菌屬細(xì)菌用于生產(chǎn)疫苗的用途，所述乳桿菌屬細(xì)菌已經(jīng)進(jìn)行修飾，從而在細(xì)胞內(nèi)和/或在所述細(xì)胞表面表達(dá)異源抗原，所述疫苗用于未修飾的植物乳桿菌對(duì)其是外源性的個(gè)體。
27.依照權(quán)利要求26的用途，其中所述未修飾的乳桿菌屬細(xì)菌是植物乳桿菌、不存在于人類(所述菌株是內(nèi)源性的)或不存在于哺乳動(dòng)物胃腸道或粘膜。
28.依照權(quán)利要求19至24中任一項(xiàng)的細(xì)菌的用途，所述細(xì)菌用于生產(chǎn)疫苗。
29.依照權(quán)利要求28的用途，其中所述疫苗適合口服給予和/或給予時(shí)激發(fā)免疫應(yīng)答。
30.依照權(quán)利要求26至29中任一項(xiàng)的用途，所述應(yīng)用是用于治療或預(yù)防破傷風(fēng)。
全文摘要
描述了用于疫苗的重組或修飾乳桿菌屬(Lactobacillus)細(xì)菌。所述細(xì)菌在細(xì)胞內(nèi)或在所述細(xì)菌的表面表達(dá)異源抗原,并將引發(fā)免疫應(yīng)答。所述疫苗適于口服給予。優(yōu)選的細(xì)菌是植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum),尤其是植物乳桿菌256。
文檔編號(hào)A61P31/04GK1387442SQ0081533
公開(kāi)日2002年12月25日 申請(qǐng)日期2000年9月18日 優(yōu)先權(quán)日1999年9月17日
發(fā)明者D·M·肖, R·J·萊爾, P·普維爾斯 申請(qǐng)人:荷蘭應(yīng)用自然科學(xué)研究組織