專利名稱：作為毒素結(jié)合劑和抗菌試劑的陰離子聚合物的制作方法
相關(guān)的申請這項申請要求2000年4月3日提交的美國專利申請第09/541,268號的優(yōu)先權(quán)和1999年5月13日提交的臨時專利申請第60/133,975號的權(quán)益，在此通過引證將其各項內(nèi)容完整地并入。
本發(fā)明的現(xiàn)有技術(shù)許多病原體產(chǎn)生對宿主生物體有害的、在某些情況下甚至致死的毒素。病原體產(chǎn)生的毒素可以被分成兩個一般的類別，外毒素和內(nèi)毒素。
外毒素通常是蛋白質(zhì)或多肽。這些由病原體分泌的毒素可以在宿主體內(nèi)移動并且在宿主的某些遠離感染部位的區(qū)域引起損害。與外毒素相關(guān)聯(lián)的癥狀變化相當大，其中包括溶血、身體組織休克、破壞白細胞、嘔吐、麻痹和腹瀉。
腸毒素是在小腸上起作用并引起往腸腔中大量分泌流體從而導致腹瀉的外毒素。腸毒素是由包括引起生物體食物中毒的金黃色釀膿葡萄球菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌和蠟樣芽胞桿菌在內(nèi)的各種細菌和腸病原體(霍亂孤菌、大腸埃舍利希氏桿菌和腸炎沙門氏菌)產(chǎn)生的。
內(nèi)毒素是在革蘭氏陰性細菌的細胞壁的外層中發(fā)現(xiàn)的脂多糖/脂蛋白。這些脂多糖被結(jié)合在細胞膜上并且在細胞溶解時被釋放。與內(nèi)毒素的釋放相關(guān)聯(lián)的癥狀包括發(fā)燒、腹瀉和嘔吐。具體地說，內(nèi)毒素刺激宿主細胞，釋放影響調(diào)節(jié)體溫的大腦區(qū)域的蛋白質(zhì)——內(nèi)生熱原質(zhì)。除了發(fā)燒、腹瀉和嘔吐之外，動物宿主可能經(jīng)歷淋巴細胞、白血球和血小板數(shù)字的迅速減少，并且進入一般的炎性狀態(tài)。
雖然內(nèi)毒素的毒性比外毒素小，但是大劑量的內(nèi)毒素通?？赡芡ㄟ^出血性休克和組織壞疽引起死亡。產(chǎn)生內(nèi)毒素的細菌的例子包括埃舍利希氏桿菌屬、志賀氏桿菌屬和沙門氏菌屬的細菌，尤其是沙門氏菌屬的細菌。
在一些情況下，外毒素引起的疾病可以通過給患者服用抗毒素得到治療?？苟舅匕▉碜砸淹ㄟ^注射類毒素(毒素的無毒衍生物)獲得免疫力的動物(通常是馬)的血清的毒素抗體。但是抗毒素的效果是有限的，因為毒素被細胞迅速吸收，變成抗毒素無法得到的。此外，患者的免疫系統(tǒng)可能對抗毒素中存在的外來的蛋白質(zhì)作出反應，從而出現(xiàn)被稱作血清病的狀態(tài)。
難辯梭菌已成為在醫(yī)院和長期護理機構(gòu)中最常見的醫(yī)院獲得的生物體之一。這種生物體通常使正常的腸內(nèi)菌叢由于服用廣譜抗菌素已被破壞的患者感染疾病。與感染相關(guān)聯(lián)的腹瀉和有炎癥的大腸炎代表將導致發(fā)病率和死亡率增加和平均延長大約3星期住院時間的嚴重的內(nèi)科/外科并發(fā)癥。這對于最有可能出現(xiàn)感染癥狀的患有嚴重的潛在疾病的老年人和患者尤其是真實的。與難辯梭菌相關(guān)聯(lián)的腹瀉(CDAN)代表醫(yī)療保健體系主要的經(jīng)濟負擔，保守的估計為每年3-6美元，超出了在美國一個人的醫(yī)療費用。
目前，CDAN的治療方法是不妥當?shù)摹＿@樣的治療方法包括停用引起CDAN的抗菌素，以表明和允許正常的結(jié)腸菌叢盡可能地迅速恢復。但是，在大多數(shù)情況下，這是不充分的，而且另一種抗菌素(滅滴靈或萬古霉素)仍然被用于殺滅難辯梭菌生物體。用滅滴靈時癥狀的改善是緩慢的，通常要花費4～8天。另外，因為滅滴靈由于根除來自腸子的大部分的厭氧微生物也改變正常的菌叢，所以20％被治療的患者通常在停止治療的1至2星期內(nèi)復發(fā)或再次發(fā)生CDAD。在CDAD嚴重或再次發(fā)生的情況下，可以使用萬古霉素。但是，這種藥有類似于滅滴靈的復發(fā)率，而且有可能引起選擇抗多種藥物的腸球菌和葡萄球菌的不需要的副作用。腹瀉和大腸炎是難辯梭菌毒素A和B引起的腸內(nèi)損傷和炎癥的直接后果。難辯梭菌產(chǎn)生的毒素A和B損害腸粘膜并且是對有炎癥的大腸炎負有責任的病原體。當前，沒有一種治療方法可以用來抑制難辯梭菌產(chǎn)生的對導致腹瀉和大腸炎的腸損傷和炎癥負有責任的細菌毒素。能夠抑制毒素A和B的藥物對于CDAD的治療是最符合邏輯的途徑。
因此，需要一種大幅度減少或消除上述問題的用來治療以毒素作為媒介的疾病的改進方法。
在另一個實施方案中，這項發(fā)明涉及包含陰離子聚合物的藥物組合物和用來治療哺乳動物(尤其是人群)中的CDAD和其它與抗菌素相關(guān)聯(lián)的腹瀉(AAD)的方法。本發(fā)明的治療組合物優(yōu)選使難辯梭菌產(chǎn)生的兩種毒素A和B失去活性并且在作為一次性治療被單獨使用時或者作為協(xié)同治療與抗菌素(例如，滅滴靈和萬古霉素)一起使用時在防止CDAD的發(fā)展(預防性治療)以及CDAD的再次發(fā)生和復發(fā)方面是非常有效的。
如同前面討論的那樣，在所述方法中所使用的聚合物是被酸性基團或陰離子基團取代的。適當?shù)乃嵝怨倌軋F包括羧酸、磺酸、膦酸、硫酸氫鹽、磷酸氫鹽、氨基磺酸和硼酸的基團。這些酸性基團也可以與適當?shù)年栯x子結(jié)合以共軛堿的形式存在。
在一個實施方案中，用于給藥的聚合物是以第一種單體或重復單元具有酸性官能團側(cè)基而第二種單體或重復單元具有疏水基團側(cè)基為特征的共聚物。在另一個實施方案中，聚合物是以單體或重復單元具有酸性官能團側(cè)基和疏水基團側(cè)基為特征的。用于給藥的聚合物可以非必選地進一步以單體或重復單元包含諸如羥基或酰胺基團之類的中性的親水基團為特征。
供本發(fā)明的方法使用的優(yōu)選的治療組合物包括聚苯乙烯磺酸酯及其鹽類。本發(fā)明優(yōu)選的方法包括給患者服用有效治療劑量的本發(fā)明的組合物，在與沒有本發(fā)明的包含聚苯乙烯的組合物存在時可能以其它方式使CDAD或AAD的發(fā)作突然發(fā)生的廣譜抗菌素一起進行協(xié)同治療時也如此。與廣譜抗菌素一起進行協(xié)同治療不僅不會影響抗菌素的效力，而且將同時防止CDAD或AAD的發(fā)作。
在另一個實施方案中，本發(fā)明的組合物可以作為疾病發(fā)作之后的一次性治療被單獨使用或者作為協(xié)同治療與滅滴靈、萬古霉素或其它用于治療CDAD或AAD的抗菌素一起使用。在又一個實施方案中，本發(fā)明的組合物既可以單獨使用，也可以作為協(xié)同治療與其它的抗菌素一起使用，以防止疾病的再次發(fā)生或復發(fā)。
現(xiàn)在的方法有許多優(yōu)點。例如，所使用的聚合物很容易采用標準的聚合物合成技術(shù)和廉價的原材料進行制備。本發(fā)明的方法通常不干擾治療身體的其它感染時往往不可或缺的廣譜抗菌素，因此可以與廣譜抗菌素結(jié)合起來使用。此外，當本發(fā)明的預防性治療法與給患者服用廣譜抗菌素結(jié)合起來使用時，患者可以同時得到保護，使之避免這類往往導致CDAD或AAD的廣譜抗菌素的不利的副作用。同樣，本發(fā)明的治療法通常不干擾滅滴靈或萬古霉素的作用，因此也可以在疾病發(fā)作或后期治療之后與這樣的治療結(jié)合起來使用，以防止疾病的再次發(fā)生或復發(fā)。此外，本發(fā)明的組合物和方法可以作為預防疾病發(fā)作(預防)、發(fā)作之后治療疾病或預防復發(fā)的一次性治療使用。按照本發(fā)明的一次性治療在患者不能忍受抗菌情勢時是特別有利的。


圖1和圖2描繪在下面予以詳細介紹的兩個倉鼠模型中聚苯乙烯磺酸鹽(160-246)對毒素A的作用。
本發(fā)明的詳細說明這項發(fā)明涉及通過給患者(例如，人)服用有效治療劑量的包含眾多酸性官能團例基的聚合物抑制患者體內(nèi)的致病毒素或微生物毒素的方法。酸性官能團可以直接鍵合到聚合物主鏈上，或者通過長度從1到大約20個原子的脂肪族間隔基基團鏈接到聚合物主鏈上。
在本文中使用的術(shù)語“抑制微生物毒素”指的是抑制與特定的疾病狀態(tài)或醫(yī)學狀態(tài)的發(fā)展相關(guān)聯(lián)的毒素的活性。微生物毒素是諸如細菌、真菌、原生動物或病毒之類的微生物產(chǎn)生的內(nèi)毒素或外毒素。毒素可以通過任何機制得到抑制，其中包括但不限于用聚合物結(jié)合毒素。在本文中使用的術(shù)語“有效治療劑量”指的是足以局部地或全面地抑制或防止與患者身體內(nèi)或身體上毒素的活動相關(guān)聯(lián)的組織損害或其它癥狀或者足以防止或減少這種癥狀的進一步發(fā)展的劑量。
這項發(fā)明提供對治療AAD(包括CDAD)和大腸炎有用的方法和治療組合物。本文中使用的術(shù)語“治療”包括那些易感染AAD、CDAD或有炎癥的大腸炎的哺乳動物的預防性治療；AAD、CDAD或有炎癥的大腸炎剛開始發(fā)作時的治療；正在進行的AAD、CDAD或有炎癥的大腸炎的治療；以及在易感染的哺乳動物群中復發(fā)的AAD、CDAD或有炎癥的大腸炎的治療。本文中使用的術(shù)語“易感染的”哺乳動物是由于包括使用可能破壞正常的菌叢導致CDAD的廣譜抗菌素在內(nèi)的任何理由能夠使疾病得以發(fā)展或復發(fā)的哺乳動物。本發(fā)明的治療組合物優(yōu)選包括聚苯乙烯磺酸鹽及其鹽類和共聚物。
本文中使用的術(shù)語“單體”指的是聚合前包含一個或多個可聚合的官能團的分子和聚合物的重復單元兩者。共聚物說的是以存在兩種以上不同的單體為特征。
本文中使用的術(shù)語“聚合物主鏈”或“主鏈”指的是聚合物的那個包含聚合時形成的鍵的連續(xù)鏈部分。聚合物主鏈的構(gòu)成可以利用形成它的單體的同一性予以描述，不管離開聚合物主鏈的支鏈或側(cè)鏈的構(gòu)成。因此，聚(丙烯酸)被說成具有用羧酸基團(-C(O)OH)作為側(cè)鏈取代的聚(乙烯)主鏈。
“側(cè)基”基團是附著在聚合物主鏈上形成側(cè)鏈或一部分側(cè)鏈的部分。例如，側(cè)基基團可以與聚合物主鏈范圍內(nèi)的一個或多個原子直接鍵合，也可以借助間隔基基團接到聚合物主鏈上。
被賦予酸性官能作用的單體包含酸性官能團側(cè)基，例如羧酸基團、磺酸基團、硫酸氫鹽基團、膦酸基團、氨基磺酸基團、磷酸氫鹽基團或硼酸基團。酸性官能團在本文中被稱為酸或者質(zhì)子化形式或部分質(zhì)子化形式。但是，人們將會理解任何酸性官能團也可以在與藥物學上可接受的陽離子結(jié)合時以共軛堿或非質(zhì)子化的形式存在。打算用于給藥的聚合物可以包括以質(zhì)子化形式、非質(zhì)子化形式或它們的組合形式存在的酸性官能團。適當?shù)年栯x子包括堿金屬離子(例如，鈉離子和鉀離子)、堿土金屬離子(例如，鈣離子和鎂離子)、過渡金屬離子以及未被取代的和已被取代的(伯、仲、叔、季)銨離子。在一個實施方案中，陽離子是多價的金屬離子，例如Ca2+、Mg2+、Zn2+、Al3+、Bi3+、Fe2+或Fe3+。
優(yōu)選的是聚合物本質(zhì)上沒有酸酐基團。例如，不足5％，優(yōu)選不足2％。更優(yōu)選在聚合物范圍內(nèi)沒有一個酸性官能團是以酸酐的形式存在的。
酸性官能團可以直接鍵合到聚合物主鏈上，或者可以借助間隔基基團附著到聚合物主鏈上。間隔基基團是聚合物的側(cè)鏈的組成部分并且把酸性官能團接到聚合物主鏈上。間隔基基團可以是線性的、分支的或環(huán)形的；脂肪族的、芳香族的或者部分芳香族部分脂肪族的。適當?shù)闹咀宓拈g隔基基團包括直鏈或支鏈的、飽和或部分不飽和的烴基基團，包括亞烷基基團，例如，象-(CH2)n-那樣的多亞烷基基團(其中n是從1到大約20的整數(shù))和象1，4-環(huán)己基基團那樣的環(huán)烷基基團。亞烷基基團可以是被取代的或者未被取代的。適當?shù)膩喭榛娜〈u基基團和鹵素原子，例如，氟原子、氯原子和溴原子。亞烷基基團也可以在一個或多個點上插入氧原子、氮原子或硫原子之類的雜原子。實例包括氧雜亞烷基基團，-(CH2)2O[(CH2)2O]n(CH2)2-，其中n是在0和大約3之間變動的整數(shù)。間隔基基團還可以是局部不飽和的基團，例如，已被取代或未被取代的C2-C20亞烷基基團或在一個或多個點插入雜原子的C2-C20亞烷基基團。適當?shù)姆枷阕彘g隔基基團包括鄰-、間-和對-亞苯基基團、亞萘基基團和亞聯(lián)苯基基團。
在一個實施方案中，聚合物范圍內(nèi)至少有一部分重復單元進一步包括疏水基團側(cè)基。疏水基團側(cè)基可以是已被取代或未被取代的、飽和或局部不飽和的C2-C24烴基基團，或者是已被取代或未被取代芳基或芳烷基基團。適當?shù)耐榛娜〈膶嵗ㄏ蠓踊蚵仍幽菢拥柠u素原子和象苯基基團那樣的芳基基團。芳基的取代基可以包括鹵素原子、C1-C6烷基基團和C1-C6烷氧基基團。優(yōu)選的疏水基團例基是直鏈或支鏈的C2-C24烷基基團。
在一個實施方案中，打算用于給藥的聚合物是均聚物。在另一個實施方案中，打算用于給藥的聚合物是以被賦予酸性官能作用的單體和疏水單體為特征的共聚物。如上所述，在本文中使用的術(shù)語“疏水單體”指的是包含疏水基團側(cè)基的單體。適當?shù)氖杷畣误w包括但不限于已被取代或未被取代的N-C3-C24烷基丙烯酰胺，例如N-癸基丙烯酰胺和N-異丙基丙烯酰胺；已被取代或未被取代的C3-C24烷基丙烯酸酯，例如丙烯酸丁酯和丙烯酸癸酯；苯乙烯和已被取代的苯乙烯，例如七氟苯乙烯和4-氟苯乙烯；乙烯基亞萘基和乙烯基聯(lián)苯。共聚物可以有寬廣的構(gòu)成范圍，例如，包含從大約10摩爾％到大約50摩爾％的疏水單體和從大約90摩爾％到大約50摩爾％的被賦予酸性官能作用的單體。
在優(yōu)選的實施方案中，打算用于給藥的聚合物是以重復單元包含一個酸性官能團為特征的。在這個實施方案中，在聚合物范圍內(nèi)將沒有兩個酸性官能團被接在聚合物主鏈中相鄰的原子上。在一個實施方案中，打算用于給藥的聚合物是以如下通式表征的重復單元或單體為特征的 其中X是上述的間隔基基團或者直接的鍵，R1和R2各自獨立地是氫或烷基基團(優(yōu)選甲基或乙基)，而Y是酸性官能團。這種類型的適當?shù)膯误w的實例包括丙烯酸、甲基丙烯酸、乙烯基磺酸、乙烯基膦酸、3-烯丙氧基-2-羥基-1-丙磺酸、乙烯基乙酸和乙烯醇和烯丙醇與象硫酸、磷酸和硼酸那樣的無機酸的酯(其中包括乙烯基硫酸氫鹽、乙烯基磷酸二氫鹽、烯丙基硫酸氫鹽、烯丙基磷酸二氫鹽以及它們的共軛堿)。單體還可以是用諸如十一碳烯酸、十一碳烯基硫酸氫鹽和十一碳烯基磺酸之類的酸性官能團取代的聚合烯烴。其它適當?shù)膶嵗ū毁x予酸性官能作用的苯乙烯，例如苯乙烯磺酸酯、苯乙烯膦酸酯和乙烯基苯甲酸；被賦予酸性官能作用的乙烯基亞萘基，例如乙烯基亞萘基磺酸酯；以及被賦予酸性官能作用的乙烯基聯(lián)苯，例如乙烯基聯(lián)苯磺酸酯。
在另一個實施方案中，打算用于給藥的聚合物是以如此通式表征的重復單元或單體為特征的 其中Z是氧或NH，而X是上述的間隔基基團或直接的鍵。Y是酸性官能團，而R1和R2各自獨立地是氫或烷基基團(優(yōu)選甲基或乙基)。這種類型的適當?shù)膯误w的實例包括2-丙烯酰胺基羥基乙酸和2-丙烯酰胺基-2-甲基-1-丙磺酸。
在這項發(fā)明的方法中使用的適當?shù)墓簿畚锇ū┧岷虲2-C20烷基丙烯酸酯的共聚物，例如丙烯酸與丙烯酸癸酯的共聚物和丙烯酸與丙烯酸丁酯的共聚物。另外，諸如丙烯酸與N-異丙基丙烯酰胺的共聚物和丙烯酸與N-癸基丙烯酰胺的共聚物之類的丙烯酸與N-C2-C20烷基丙烯酰胺的共聚物，以及丙烯酸與苯乙烯或諸如七氟苯乙烯或4-氟苯乙烯之類的已被取代的苯乙烯的共聚物也被包括在內(nèi)。
在另一個實施方案中，打算用于給藥的聚合物是包含被賦予酸性官能作用的單體、疏水單體和中性的親水單體的共聚物。中性的親水單體是包含按生理pH值既不略微呈酸性也不略微呈堿性的極性基團的單體。適當?shù)闹行缘挠H水單體的實例包括丙烯酰胺、N-(2-羥乙基)丙烯酰胺、N-(3-羥丙基)丙烯酰胺、丙烯酸2-羥乙酯、乙烯基乙酸酯、乙烯醇和N-乙烯基吡咯烷酮。這種類型的適當?shù)墓簿畚锸潜┧?丙烯酸癸酯/丙烯酰胺的三聚物。
另外，打算用于給藥的聚合物還可以以重復單元包含疏水基團側(cè)基和酸性官能團側(cè)基兩者為特征。適當?shù)氖杷鶊F和酸性官能團包括前面討論過的那些。這種類型的聚合物包括聚(2-烷基丙烯酸)，其中烷基基團包含2到大約24個碳原子。這種類型的一種適當?shù)木酆衔锸蔷?2-乙基丙烯酸)或它的共軛堿。另外，打算用于給藥的聚合物還可以包含有疏水基團側(cè)基和酸性官能團側(cè)基的第一單體和類似于以前討論過的中性親水單體的中性親水的第二單體。
在一個實施方案中，打算用于給藥的聚合物包含其中包含酸性官能團側(cè)基的第一種重復單元和包含諸如酰胺基或酯基之類基團的酸性衍生物側(cè)基的第二種重復單元。這種類型的聚合物的適當?shù)膶嵗ㄒ徊糠只撬狨セ艳D(zhuǎn)化成磺胺或磺化酯的基團的聚(苯乙烯磺酸酯)和一部分羧酸酯基已轉(zhuǎn)化成酰胺或酯的基團的聚丙烯酸酯。聚合物的性質(zhì)可以通過改變經(jīng)由酰胺化或酯化過程引入聚合物的基團的數(shù)量和化學特征得以改變。在一個實施方案中，聚合物包含有來源于諸如薄荷醇之類的醇、諸如膽酸或石膽酸之類的膽汁酸、或諸如直鏈或支鏈的C4-C12烷醇之類的烷醇的酯基側(cè)基的重復單元。在另一個實施方案中，聚合物包含有來源于諸如烷基胺(例如直鏈或支鏈的C4-C12烷基胺或銨烷基胺)之類的胺的酰胺基團側(cè)基的重復單元。適當?shù)匿@烷基胺包括用化學式R1(R2)(R3)N+(CH2)nNH2表征的化合物，其中R1、R2和R3各自獨立地是氫、C1-C12烷基基團或芳烷基基團，而n是從1到大約12的整數(shù)。
在另一個實施方案中，打算用于給藥的聚合物是包含被賦予酸性官能作用的單體或重復單元、陽離子型重復單元和非必選的疏水的重復單元和/或中性親水的重復單元。例如，被賦予酸性官能作用的、疏水的和中性親水的重復單元可以包括這些類型中曾被討論過的任何重復單元。陽離子型重復單元在生理條件下攜帶正電荷，并且優(yōu)選包括氨基或銨基側(cè)基。這種類型的適當?shù)闹貜蛦卧ㄔ谕ㄟ^引證被完整地并入本文的美國專利申請第08/934,495號中揭示的那些。適當?shù)年栯x子型重復單元的實例包括烯丙胺、N-取代的烯丙胺、季銨化的烯丙胺、二烯丙基胺、N-取代的二烯丙基胺，季銨化的二烯丙基胺、乙烯胺、N-取代的乙烯胺、季銨化的乙烯胺、N-甲基丙烯酰胺和N-氨烷基甲基丙烯酰胺、N-銨烷基丙烯酰胺和N-銨烷基甲基丙烯酰胺、氨烷基丙烯酸酯和氨烷基甲基丙烯酸酯、銨烷基丙烯酸酯和銨烷基甲基丙烯酸酯。陰離子型重復單元和陽離子型重復單元的比率可以大范圍地變化，例如，相對聚合物中總的帶電單體從大約95％的陰離子型單體和大約5％的陽離子型單體到大約5％的陰離子型單體和大約95％的陽離子型單體，優(yōu)選的是75％以上的單體是陰離子型的。
本發(fā)明優(yōu)選的聚合物包括但不限于聚(硫酸乙烯酯)、聚(硫酸丙烯酯)、聚(硫酸丁烯酯)、聚(硫酸戊烯酯)、聚(硫酸己烯酯)、聚(硫酸庚烯酯)、聚(硫酸辛烯酯)、聚(硫酸壬烯酯)、聚(硫酸癸烯酯)、聚(硫酸十一碳烯酯)、聚(硫酸十二碳烯酯)；聚(磺酸乙烯酯)、聚(磺酸丙烯酯)、聚(磺酸丁烯酯)、聚(磺酸戊烯酯)、聚(磺酸己烯酯)、聚(磺酸庚烯酯)、聚(磺酸辛烯酯)、聚(磺酸壬烯酯)、聚(磺酸癸烯酯)、聚(磺酸十一碳烯酯)、聚(磺酸十二碳烯酯)；聚(磷酸乙烯酯)、聚(磷酸丙烯酯)、聚(磷酸丁烯酯)、聚(磷酸戊烯酯)、聚(磷酸己烯酯)、聚(磷酸庚烯酯)、聚(磷酸辛烯酯)、聚(磷酸壬烯酯)、聚(磷酸癸烯酯)、聚(磷酸十一碳烯酯)、聚(磷酸十二碳烯酯)；聚(膦酸乙烯酯)、聚(膦酸丙烯酯)、聚(膦酸丁烯酯)、聚(膦酸戊烯酯)、聚(膦酸己烯酯)、聚(膦酸庚烯酯)、聚(膦酸辛烯酯)、聚(膦酸壬烯酯)、聚(膦酸癸烯酯)、聚(膦酸十一碳烯酯)、聚(膦酸十二碳烯酯)；角叉聚糖、肝素、硫酸乙酰肝素、葡聚糖硫酸酯、戊聚糖硫酸酯、昆布多糖硫酸酯、硫酸軟骨素、硫酸皮膚素；聚(苯乙烯磺酸酯)、聚(苯乙烯硫酸酯)、聚(苯乙烯磺胺酸酯)、聚(磺苯基叔胺)、聚(酪氨酸硫酸酯)、聚(磺苯乙基丙烯酰胺)、聚(磺苯乙基甲基丙烯酰胺)、聚(萘磺酸乙烯酯)、聚(萘硫酸乙烯酯)、聚(磺酸乙烯基聯(lián)苯酯)、聚(硫酸乙烯基聯(lián)苯酯)、聚(茴香腦磺酸酯)、聚(乙烯基苯甲酸)；聚(磺苯基丙烯)、聚(磺苯基丁烯)、聚(磺苯基戊烯)、聚(磺苯基己烯)、聚(磺苯基庚烯)、聚(磺苯基辛烯)、聚(磺苯基壬烯)、聚(磺苯基癸烯)、聚(磺苯基十一碳烯)、聚(磺苯基十二碳烯)；聚(硫酸化苯基丙烯)、聚(硫酸化苯基丁烯)、聚(硫酸化苯基戊烯)、聚(硫酸化苯基己烯)、聚(硫酸化苯基庚烯)、聚(硫酸化苯基辛烯)、聚(硫酸化苯基壬烯)、聚(硫酸化苯基癸烯)、聚(硫酸化苯基十一碳烯)、聚(硫酸化苯基十二碳烯)；聚(膦苯基丙烯)、聚(膦苯基丁烯)、聚(膦苯基戊烯)、聚(膦苯基己烯)、聚(膦苯基庚烯)、聚(膦苯基辛烯)、聚(膦苯基壬烯)、聚(膦苯基癸烯)、聚(膦苯基十一碳烯)、聚(膦苯基十二碳烯)；聚(磷酸化苯基丙烯)、聚(磷酸化苯基丁烯)、聚(磷酸化苯基戊烯)、聚(磷酸化苯基己烯)、聚(磷酸化苯基庚烯)、聚(磷酸化苯基辛烯)、聚(磷酸化苯基壬烯)、聚(磷酸化苯基癸烯)、聚(磷酸化苯基十一碳烯)、聚(磷酸化苯基十二碳烯)；磺化的聚(乙烯基苯基酮)、磺化的聚(二苯砜)、磺化的聚(4-甲基苯乙烯)、磺化的聚(α-甲基苯乙烯)、磺化的苯乙烯-環(huán)氧乙烷-苯乙烯嵌段共聚物、磺化的環(huán)氧乙烷-苯乙烯-環(huán)氧乙烷嵌段共聚物、磺化的聚(4-甲氧基苯乙烯)、磺化的聚(二苯氧基膦嗪)、磺化的環(huán)氧乙烷-苯乙烯嵌段共聚物、磺化的苯乙烯-乙烯嵌段共聚物、磺化的聚苊、磺化的聚乙烯基咔唑、磺化的苯乙烯-丁二烯嵌段共聚物、磺化的苯乙烯-(乙烯/丁烯共聚物)-苯乙烯嵌段共聚物；苯乙烯磺酸酯/馬來酸共聚物、苯乙烯磺酸酯/丙烯酸共聚物、苯乙烯磺酸酯/甲基丙烯酸共聚物、苯乙烯磺酸酯/丙烯?；奔谆榛撬狨ス簿畚?、苯乙烯磺酸酯/衣康酸共聚物、苯乙烯磺酸酯/乙烯基苯甲酸共聚物；苯乙烯磺酸酯/氯化二烯丙基甲基銨共聚物、苯乙烯磺酸酯/氯化二烯丙基二甲基銨共聚物、苯乙烯磺酸酯/氯化二烯丙基甲基辛基銨共聚物、苯乙烯磺酸酯/烯丙胺共聚物、苯乙烯磺酸酯/乙烯胺共聚物、苯乙烯磺酸酯/氯化乙烯基芐基三甲基銨共聚物；苯乙烯磺酸酯/苯乙烯共聚物、苯乙烯磺酸酯/辛基苯乙烯磺胺共聚物、苯乙烯磺酸酯/基苯乙烯磺酸酯共聚物、苯乙烯磺酸酯/石膽酸磺酸酯共聚物。
在現(xiàn)在的方法中使用的聚合物可以是線性的，也可以是交聯(lián)的。例如，通過在多官能團共聚單體的聚合物范圍內(nèi)合并，可以使聚合物交聯(lián)。適當?shù)亩喙倌軋F的共聚單體包括二丙烯酸酯、三丙烯酸酯和四丙烯酸酯、二甲基丙烯酸酯、二丙烯酰胺、二烯丙基丙烯酰胺、二(甲基丙烯酰胺)、三烯丙胺和烷基銨的離子。
特定的實例包括二丙烯酸乙二醇酯、二丙烯酸丙二醇酯、二丙烯酸丁二醇酯、二甲基丙烯酸乙二醇酯、二甲基丙烯酸丙二醇酯、二甲基丙烯酸丁二醇酯、亞甲基雙(甲基丙烯酰胺)、亞甲基雙(丙烯酰胺)、1，2-亞乙基雙(甲基丙烯酰胺)、1，2-亞乙基雙(丙烯酰胺)、1，1-亞乙基雙(甲基丙烯酰胺)、1，1-亞乙基雙(丙烯酰胺)、四丙烯酸季戊四醇酯，三羥甲基丙烷三丙烯酸酯、雙酚A二甲基丙烯酸酯和雙酚A二丙烯酸酯。其它適當?shù)亩喙倌軋F單體包括諸如二乙烯基苯之類的多乙烯基芳烴。交聯(lián)劑的數(shù)量以重量比計，相對于聚合物重量通常介于大約1.0％和大約30％之間，優(yōu)選按重量計從大約5％到大約25％。
另外，聚合物也可以在聚合之后交聯(lián)。例如，一部分酸性官能團可以象技術(shù)上已知的那樣被轉(zhuǎn)化成反應的衍生物。例如，羧酸和磺酸的基團可以與亞硫酰氯反應，分別產(chǎn)生?；群突酋Ｂ鹊幕鶊F。然后，這些反應基團可以與二胺、二醇或氨基醇(優(yōu)選氨基和/或羥基基團被諸如C3-C18亞烷基鏈之類的亞烷基鏈分開的二胺、二醇或氨基醇)起反應。這種反應導致在給定的聚合物鏈上形成酯和/或胺的基團，這些基團被鏈接到在毗鄰的聚合物鏈上的類似的基團上。交聯(lián)的程度可以受到控制，例如，通過控制轉(zhuǎn)化成反應基團的酸性官能團的份數(shù)。
聚合物的分子量不太重要，但是優(yōu)選適合要用的給藥模式，并且允許聚合物到達并且保留在身體的目標區(qū)域里面。例如，治療腸感染的方法應該使用分子量或交聯(lián)度足夠高的聚合物，以便足以部分地或完全阻止從胃腸道到身體的其它部分的吸收。如果打算用于給藥的聚合物是直鏈的，則優(yōu)選分子量在大約大于1道爾頓和大約100萬道爾頓或以上之間變動，例如2,000道爾頓到大約500,000道爾頓，5,000道爾頓到大約150,000道爾頓，或者大約25,000道爾頓到大約100萬道爾頓。換言之，分子量可以從大約100,000道爾頓到大約100萬道爾頓或介于400,000道爾頓和大約100萬道爾頓之間。
現(xiàn)在的方法中使用的聚合物優(yōu)選本質(zhì)上不會生物降解的而且不能被吸收的。換句話說，聚合物本質(zhì)上在生理條件下不破碎成身體組織可吸收的碎片。聚合物優(yōu)選具有在身體的目標區(qū)域(例如，胃腸道)中遇到的條件下本質(zhì)上呈惰性的不水解的主鏈。特別優(yōu)選的聚合物是聚苯乙烯磺酸酯。優(yōu)選的是分子量介于大約400,000到100萬道爾頓(例如，600,000道爾頓)的可溶的未交聯(lián)的聚苯乙烯磺酸酯。另外，適合這項發(fā)明的聚合物主鏈包括聚丙烯酰胺、聚丙烯酸酯、聚乙烯和聚乙烯亞胺、聚苯乙烯的主鏈。這項發(fā)明的共聚合物可以包含這些主鏈要素中的至少兩個要素的組合。打算用于給藥的聚合物也可以是縮聚物，例如聚酰胺或聚酯。
給定聚合物的給藥量將在個人的基礎上確定，并且將至少部分地通過考慮個人的實情、已知的或懷疑的致病生物體的同一性，待治療的癥狀嚴重性和被尋找的結(jié)果來確定。聚合物可以單獨給藥或者用包含聚合物和一種或多種藥物學上可接受的載體、稀釋劑或賦形劑的藥物組合物給藥。藥物組合物還可以非必選地包括諸如抗菌素、消炎劑或止痛劑之類的一種或多種附加藥物。
聚合物可以通過供給管借助皮下或其它注射局部給藥、靜脈給藥、口服給藥、腸胃道給藥、經(jīng)皮給藥或經(jīng)直腸給藥。優(yōu)選的是聚合物或包含聚合物的藥物組合物通過口服給藥。聚合物的給藥形式(例如，粉末、藥片、膠囊、溶液或乳液)將取決于給藥的路徑。有效治療劑量的藥物可以按單一的劑量或者按一系列被適當?shù)臅r間間隔(例如，數(shù)小時)分開的劑量給藥。
就口服而言，聚合物可以按大約0.1到10g/Kg/day、優(yōu)選1.0到7.0g/Kg/day、更優(yōu)選2.0到6.6g/Kg/day的劑量給藥。
聚合物也可以與選自技術(shù)上已知的抗菌素的一種或多種抗微生物制劑結(jié)合起來給藥。打算用于給藥的抗菌素通常是根據(jù)技術(shù)上已知的致病的微生物的同一性或被懷疑的同一性選定的。例如，如果致病的微生物是C.parvum，可以與聚合物結(jié)合給藥的一種適當?shù)目咕厥前妄埫顾?。聚合物和抗微生物制劑可以同時給藥，例如，按分開用藥的方式、或按單一用藥的方式、或按用適當?shù)臅r間間隔分開的順序。
術(shù)語“抗微生物制劑”傾向于包括抗菌劑、抗真菌制劑、殺菌劑和類似的東西。適當?shù)目刮⑸镏苿┘夹g(shù)上是已知的，其中包括異煙肼、利福平、吡嗪酰胺、乙胺乙醇、紅霉素、萬古霉素、四環(huán)素、氯霉素、磺胺、慶大霉素、羥氨芐青霉素、青霉素、鏈霉素、對氨基水楊酸、甲紅霉素、氯苯吩嗪、二甲胺四環(huán)素、磺胺、乙硫異煙肼、環(huán)絲氨酸、卡那霉素、丁胺卡那霉素、卷曲霉素、紫霉素、對乙酰胺基亞芐基縮氨基硫脲、利福布丁、環(huán)丙氟哌酸、氟嗪酸和西洛沙星之類的喹啉衍生物。術(shù)語“抗菌劑”包括但不限于微生物為了抑制其它微生物生長而產(chǎn)生的天然的抗生素以及在實驗室中合成或改性的具有殺菌活性或制菌活性的制劑，例如，包括諸如羧芐青霉素、氨芐青霉素、鄰氯青霉素、苯甲異噁唑青霉素和pieracillin之類藥物在內(nèi)的β-內(nèi)酰胺類抗菌劑；包括諸如頭孢氯、頭孢羥唑、頭孢唑啉、頭孢哌酮、ceftaxime，頭孢西丁、頭孢他定、頭孢三嗪酮(ceftriazone)之類的藥物在內(nèi)的頭胞菌素類和其它cephem類制劑；包括諸如亞胺培南和美洛哌平之類的藥物在內(nèi)的1-碳青霉烯類制劑；以及糖蛋白類、大環(huán)內(nèi)酯類、喹諾酮類(例如，萘啶酮酸)、四環(huán)素類、氨基糖苷類(例如，慶大霉素和巴龍霉素)的制劑，并且進一步包括抗真菌制劑。一般的說，如果抗菌劑是制菌的，那么它意味著該制劑制止細菌細胞的成長(但不殺死細菌)；如果抗菌劑是殺菌劑，那么它意味著該制劑殺死細菌的細胞(并且可以在殺死細菌之前制止它生長)。
因此，本文中介紹的聚合物和組合物可以在醫(yī)藥中(例如在制造供本文中介紹的治療和處理使用的藥物時)使用。
在一個實施方案中，包含眾多酸性官能團側(cè)基的聚合物是與優(yōu)選包含氨基和/或銨基的陽離子型聚合物結(jié)合起來給藥。這種類型的適當?shù)木酆衔飳嵗窃谕ㄟ^引證在此將其完整地并入的未審的專利申請第08/934,495號中揭示的。適當?shù)年栯x子型聚合物可以是線性的或交聯(lián)的。包含諸如烯丙胺、二烯丙胺、二烯丙基甲基胺、乙烯胺、N-氨烷基丙烯胺、N-氨烷基甲基丙烯胺酸、氨烷基丙烯酸酯、氨烷基甲基丙烯酸酯以及它們的酸性加成鹽和單烷基取代的、二烷基取代的和三烷基取代的(季化的)衍生物之類的重復單元或單體的聚合物被包括在內(nèi)。適當?shù)年栯x子型聚合物包括這些重復單元的均聚物和至少包含這些重復單元之一和非必選地包含一個或多個前面討論過的疏水單體和/或中性親水單體的共聚物。被賦予酸性官能作用的聚合物和陽離子型聚合物可以按不同的重量比給藥并且可以同時給藥，例如按單一的用藥方式或分開的用藥方式或按間隔數(shù)分鐘或數(shù)小時的順序同時給藥。適當?shù)挠盟幒徒o藥方法對于技術(shù)上熟練的人可能很容易確定。在一個實施方案中，陰離子型聚合物是聚苯乙烯磺酸酯，而陽離子型聚合物是聚(二烯丙基甲基胺)或一部分重復單元已被烷基取代(例如，用諸如辛基或癸基之類的C4-C12烷基基團取代)的聚(二烯丙基甲基胺)。
這項發(fā)明的聚合物可以借助技術(shù)上已知的方法制備，例如，通過被賦予酸性官能作用的單體的直接聚合或者通過包含被賦予酸性官能作用的單體和至少一種諸如被賦予酸性官能作用的第二種單體、疏水單體、中性的親水單體、多官能團交聯(lián)單體或它們的組合之類的附加的共聚單體的單體混合物的共聚。例如，單體混合物可以采用技術(shù)上已知的自由基聚合、陽離子聚合或陰離子聚合的方法完成聚合。由于兩種或多種單體在反應速率方面的差異，共聚物產(chǎn)品中單體的摩爾比可能不同于在最初的反應混合物中單體的摩爾比。這種反應性差異還可能導致單體沿著聚合物鏈呈非隨機分布。
聚合物還可以通過活化的聚合物上親核的側(cè)鏈被合成出來。這種方法將借助具有容易被所需要的側(cè)鏈取代的不安定的側(cè)鏈的中間聚合物繼續(xù)進行。這種類型的適當?shù)木酆衔锇ㄅc伯胺反應形成N-取代的聚丙烯酰胺的聚(丙烯?；u丁二酰亞胺)(pNAS)。另一種具有不安定的側(cè)鏈的適當?shù)木酆衔锸窃谂c伯胺反應時也形成N-取代的聚丙烯酰胺的聚(丙烯酸4-硝基苯酯)。
例如，具有包含用酸性官能團取代的酰胺氮原子和用疏水基團取代的酰胺氮原子的聚丙烯酰胺主鏈的共聚物可以通過用(相對N-丙烯?；u丁二酰亞胺單體)不足一個當量的以諸如氨基酸(例如氨基乙酸)的酸性官能團終端的伯胺處理pNAS來進行制備。然后，可以引入疏水基團，其方法是使至少一部分剩余的N-丙烯酰基羥丁二酰亞胺單體與第二種伯胺(例如C2-C20烷基胺)反應。進一步包含中性親水單體的共聚合物可以這樣制備，即使剩余的N-丙烯酰基羥丁二酰亞胺單體與諸如2-氨基乙醇或氨之類東西反應。因此，各種各樣的共聚物構(gòu)成都能通過用不同比率的選定的胺處理活化的聚合物被輕易地得到。
本發(fā)明的方法中使用的聚合物也可以通過用酸性官能團賦予前體聚合物酸性官能作用來合成。例如，具有包括芳基基團的側(cè)鏈的聚合物可以采用已知的生產(chǎn)具有磺酸基團側(cè)基的聚合物的方法磺化。諸如聚乙烯醇和聚烯丙醇之類的包括羥基基團的前體聚合物可以采用已知的方法硫酸化，以形成包含硫酸酯酯基的聚合物。具有酸性官能團和疏水基團兩者的聚合物也可以采用這種通用方法來合成。例如，諸如聚苯乙烯之類的乙烯基芳環(huán)聚合物的聚合物可以通過與諸如發(fā)煙硫酸之類的東西反應形成聚苯乙烯磺酸酯完成磺化。
被賦予酸性官能作用的聚合物可以通過把至少一部分酸性基團轉(zhuǎn)化成諸如亞酰胺或酯之類的酸的衍生物而得到改性。例如，聚苯乙烯磺酸酯可以與以磺酸酯基團為基礎以亞化學計量的量的亞硫酰氯反應，借此把一部分磺酸酯基團轉(zhuǎn)化成磺酰氯基團。由此產(chǎn)生的聚合物可以與過量的伯胺反應，以便把磺酰氯基團轉(zhuǎn)化成N-取代的磺胺基團，或者與醇反應，以便把磺酰氯基團轉(zhuǎn)化成磺酸酯酯基。由此產(chǎn)生的聚合物的疏水性可以通過改變N-取代基或酯的功能性和磺酸酯基團向磺胺或磺酸酯酯基轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)化程度而得以改變。
能用這項發(fā)明的方法抑制的致病毒素包括但不限于諸如由包括肺炎鏈球菌和釀膿鏈球菌在內(nèi)的鏈球菌；包括腸炎沙門氏菌在內(nèi)的沙門氏菌；包括空腸炎彎曲桿菌在內(nèi)的彎曲桿菌；包括大腸埃舍利希氏桿菌在內(nèi)的埃舍利希氏桿菌；包括難辯梭菌和肉毒梭狀芽胞桿菌在內(nèi)的梭狀芽胞桿菌；包括金色釀膿葡萄球菌在內(nèi)的葡萄球菌；包括志賀氏痢疾桿菌在內(nèi)的志賀氏桿菌；包括綠膿假單胞菌在內(nèi)的假單胞菌；包括百日咳博德特氏菌在內(nèi)的博德特氏菌；包括單核細胞增多性李司忒菌在內(nèi)的李氏桿菌；霍亂孤菌；包括小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌在內(nèi)的耶爾森氏菌；包括侵肺軍團菌在內(nèi)的軍團菌屬；包括炭疽桿菌在內(nèi)的芽胞桿菌；螺桿菌；棒狀桿菌；放線桿菌；氣單胞菌；包括脆弱擬桿菌在內(nèi)的擬桿菌；包括腦膜炎奈瑟氏菌在內(nèi)的奈瑟氏菌；諸如粘膜炎摩拉克氏菌之類的摩拉克氏菌和巴斯德氏菌產(chǎn)生的外毒素和/或內(nèi)毒素之類的毒素。諸如痢疾內(nèi)變形蟲和棘變形蟲產(chǎn)生的毒素之類的原生動物毒素和寄生物毒素也被包括在內(nèi)。
本發(fā)明的方法還可以用來抑制病毒的毒素，諸如由輪狀病毒、人體免疫缺陷病毒、流行性感冒病毒、脊髓灰質(zhì)炎病毒、皰疹性口炎病毒、牛痘病毒、腺病毒、軟腦(脊)膜病毒、囊膜病毒(例如，sindbis病毒和semlikifores病毒)、副粘病毒、乳突淋瘤病毒產(chǎn)生的毒素。可以用本發(fā)明的方法抑制的毒素包括由這些病毒中任何一種病毒產(chǎn)生的病毒孔蛋白分子?？梢杂帽景l(fā)明的方法抑制的優(yōu)選的毒素是輪狀病毒的NSP4蛋白質(zhì)。其它可以得到抑制的毒素包括流行性感冒病毒的M2蛋白質(zhì)、HIV Vpu和gp41蛋白質(zhì)、小核糖核酸病毒的3A蛋白質(zhì)、囊膜病毒的6K蛋白質(zhì)、呼吸道合胞體病毒的SH蛋白質(zhì)、冠狀病毒的D3蛋白質(zhì)和腺病毒的E5蛋白質(zhì)。
感染可以是全身感染或局部感染。優(yōu)選的是感染被局限于口腔、眼睛、包括喉的胃腸道、皮膚和耳朵(例如，耳道和中耳)的一個或多個部位。
給定聚合物的給藥量將在個人的基礎上確定，并且將至少部分地通過考慮個人的實情、待治療癥狀的嚴重性和被尋找的結(jié)果來確定。聚合物可以單獨給藥或者用包含聚合物、藥物學上可接受的載體或稀釋劑和非必選的一種或多種附加藥物的藥物組合物給藥。
聚合物可以系統(tǒng)地或非系統(tǒng)地給藥，例如，通過皮下或其它注射給藥、靜脈內(nèi)給藥、局部給藥、口服給藥、腸胃外給藥、經(jīng)皮給藥或經(jīng)直腸給藥。選定的給藥路徑通常將取決于感染究竟是全身的還是局部的。聚合物的給藥形式(例如，粉末、藥片、膠囊、溶液或乳液)將取決于它的給藥路徑。有效治療劑量的藥物可以按一系列被適當?shù)臅r間間隔(例如，數(shù)小時)分開的劑量給藥。例如，優(yōu)選的是聚合物經(jīng)口腔或局部地通過應用于皮膚、眼睛、諸如口腔粘膜之類的口腔組織或胃腸組織非系統(tǒng)地給藥。
在優(yōu)選的實施方案中，毒素是致病菌株產(chǎn)生的外毒素。大腸埃舍利希氏桿菌(大腸埃舍利希氏桿菌株06H-、0157H7、0143和其它臨床隔離種群)和難辯梭菌具有特殊的致病重要性。諸如0157H7之類的引起腸出血的大腸埃舍利希氏桿菌(EHEC)能夠引起叫做出血性結(jié)腸炎的不發(fā)燒的特征性的帶血的腹瀉。EHEC產(chǎn)生大量的在結(jié)構(gòu)和功能上類似于志滋賀毒素并且被稱為類志賀毒素的兩種相關(guān)的細胞毒素之一或兩者(SLT I或SLT II)。人們認為這些類志賀毒素損害腸粘膜，從而導致出血性大腸炎的癥狀。
在優(yōu)選的實施方案中，微生物產(chǎn)生的一種或多種毒素是由難辯梭菌生產(chǎn)的。難辯梭菌生產(chǎn)兩種毒素，毒素A和毒素B。毒素A是刺激嗜中性粒細胞的滲透和炎癥傳遞介質(zhì)的釋放從而導致分泌流體、改變膜的滲透性和出血性壞死的腸毒素。毒素B是細胞毒素。難辯梭菌與許多與抗菌素相關(guān)聯(lián)的腹瀉案例以及大多數(shù)假膜大腸炎(一種嚴重的、可能致命的結(jié)腸炎)的案例相關(guān)聯(lián)。難辯梭菌感染的治療通常包括萬古霉素或滅滴靈的給藥。在一個實施方案中，待處理的狀態(tài)是難辯梭菌誘發(fā)的腸胃炎，例如與抗菌素相關(guān)聯(lián)的腹瀉或假膜性結(jié)腸炎。在這個實施方案中，聚合物可以非必選地與至少部分地對難辯梭菌有效的一種或多種抗菌劑(例如，萬古霉素和滅滴靈)結(jié)合起來給藥。
如同本文中使用的那樣，與難辯梭菌相關(guān)聯(lián)的腹瀉(CDAD)的“治療”包括那些對CDAD敏感的患者的預防治療；在CDAD剛發(fā)作時的治療；進行中的CDAD的治療和對敏感的患者群中復發(fā)CDAD的治療。如同本文中使用的那樣，“有效治療劑量”是足以防止、減小和根除疾病的癥狀的劑量。
在優(yōu)選的實施方案中，治療/預防CDAD的治療法(該方法導致疾病的預防，發(fā)作后疾病的減輕和根除，或疾病復發(fā)的預防)包括有效治療劑量的包含聚苯乙烯磺酸酯，優(yōu)選包含可溶的未交聯(lián)的聚苯乙烯磺酸酯，更優(yōu)選包含分子量介于400,000和100萬道爾頓之間、最優(yōu)選分子量為600,000的可溶的未交聯(lián)的聚苯乙烯磺酸酯的治療組合物的給藥。盡管不傾向于受任何機制的限制，但是按照本發(fā)明的組合物將結(jié)合毒素(例如，難辯梭菌產(chǎn)生的毒素)。毒素A是一種刺激嗜中性粒細胞的滲透和炎癥傳遞介質(zhì)的釋放從而導致分泌流體、改變膜滲透性和出血性壞死的腸毒素。毒素B是細胞毒素。人們認為這些毒素對CDAD和其它AAD的癥狀負有責任。
本發(fā)明還設想一種預防性治療法，該方法包括作為廣譜抗菌素療法的協(xié)同治療方法使用包含聚苯乙烯磺酸酯的治療組合物。如同本文中使用的那樣，“協(xié)同治療方法”意味著兩種藥物同時給藥或間隔數(shù)分鐘、數(shù)小時或數(shù)天按順序給藥但以某種方式一起發(fā)揮作用提供符合要求的治療效果的治療法。
現(xiàn)在將通過下面的實施例進一步具體地介紹這項發(fā)明。
實施例2丙烯酸/丙烯酸癸酯(96∶4)的共聚物的合成用二噁烷(200mL)制備丙烯酸(10.0g，133毫摩爾)和丙烯酸癸酯(1.0g，4.71毫摩爾)的溶液。借助快速氮氣流從中通過使溶液脫氣，然后添加AIBN(0.6g，相對單體總量為5mol％)。使溶液進一步脫氣30分鐘，然后將反應物加熱到70攝氏度維持16小時。將溶液冷卻并且倒入乙酸乙酯(600mL)中使之發(fā)生沉淀。將乙酸乙酯輕輕地倒出不攪動白色的纖維狀產(chǎn)品，然后，用乙酸乙酯(300mL)洗滌該產(chǎn)品，再用己烷(200mL)洗滌。聚合物在真空中干燥，得到9.0g 81％的易碎的白色固體。
實施例3丙烯酸/丙烯酸癸酯(9∶1)的共聚物的合成用二噁烷(200mL)制備丙烯酸(10.0g，133毫摩爾)和丙烯酸癸酯(2.0g，14.41毫摩爾)的溶液。借助快速氮氣流從中通過使溶液脫氣，然后添加AIBN(0.6g，相對單體總量為5mol％)。使溶液進一步脫氣30分鐘，然后將反應物加熱到70攝氏度維持17小時。將溶液冷卻并且倒入乙酸乙酯(600mL)中使之發(fā)生沉淀。將乙酸乙酯輕輕地倒出不攪動白色的纖維狀產(chǎn)品，然后，用乙酸乙酯(300mL)洗滌該產(chǎn)品，再用己烷(200mL)洗滌。聚合物在真空中干燥，得到9.0g(81％)易碎的白色固體。
丙烯酸和丙烯酸丁酯(10∶3)的共聚物是用同樣的方法制成的。
實施例4丙烯酸/丙烯酸癸酯/丙烯酰胺(70∶7.5∶22.5)的三聚物的合成用二噁烷(200mL)制備丙烯酸(10.0g，133毫摩爾)、丙烯酸癸酯(3.0g，14.2毫摩爾)和丙烯酰胺(3.0g，42.2毫摩爾)的溶液。用快速氮氣流使溶液脫氣之后，添加AIBN(1.3g)。使溶液進一步脫氣30分鐘，然后將反應物加熱到70攝氏度維持17小時。聚合物在反應繼續(xù)進行時作為纖維狀白色固體沉淀。使溶液冷卻并且將二噁烷輕輕地倒出。用乙酸乙酯(600mL)洗滌殘留物，然后倒掉乙酸乙酯。聚合物最后用己烷(300mL)洗滌并且在真空中干燥。
實施例5丙烯酸/丙烯酸丁酯/丙烯酰胺(60∶15∶25)的三聚物的合成用二噁烷(200mL)制備丙烯酸(10.0g，133毫摩爾)、丙烯酸丁酯(4.0g，31.4毫摩爾)和丙烯酰胺(4.0g，56.3毫摩爾)的溶液。用快速氮氣流使溶液脫氣之后，添加AIBN(1.3g)。使由此產(chǎn)生溶液進一步脫氣30分鐘，然后加熱到70攝氏度維持17小時。在反應進行時，聚合物作為纖維狀白色固體沉淀。使溶液冷卻并且將二噁烷輕輕地倒出。將聚合物用乙酸乙酯(600mL)洗滌，然后用己烷(300mL)洗滌并且在真空中干燥。
實施例6丙烯酸和丙烯酸癸酯(10∶2)的共聚物的合成用二噁烷(300mL)制備丙烯酸(10.0g，133毫摩爾)和丙烯酸癸酯(5.64g，26.6毫摩爾)的溶液。用快速氮氣流使溶液脫氣之后，添加AIBN(0.8g)。使由此產(chǎn)生的溶液進一步脫氣30分鐘，然后將反應混合物加熱到70攝氏度維持16小時。將溶液冷卻后添加到乙酸乙酯(600mL)中。將乙酸乙酯輕輕地倒出不攪動由此產(chǎn)生的纖維狀白色產(chǎn)品。然后，將該產(chǎn)品用二噁烷(150mL)再次溶解，用乙酸乙酯(500mL)使之沉淀，過濾后用冷的己烷(300mL)洗滌并且在真空中干燥。
實施例72％交聯(lián)的聚(乙二醇甲基丙烯酸磷酸酯)凝膠的制備聚(乙二醇丙烯酸磷酸酯)是這樣制備的，即在乙醇/水(50/50)中用大約1mol％的AIBN作為引發(fā)劑使乙二醇甲基丙烯酸磷酸酯(29.4毫摩爾，6.178g)與二乙烯基苯(“DVB”)(0.926毫摩爾，0.1319g)聚合。將由此產(chǎn)生的彈性凝膠在兩個50mL的離心管中被分成兩個部分，然后用總量大約為120mL的乙醇洗滌4次。凝膠在70攝氏度的鼓風烘箱中干燥過夜。將干燥的凝膠碾碎、過篩，再在50mL的離心管中用水洗滌3次。凝膠再次在70攝氏度的鼓風烘箱中干燥過夜。
實施例8磺化的聚苯乙烯凝膠的制備聚苯乙烯凝膠是利用大約1mol％的AIBN作為引發(fā)劑使苯乙烯與二乙烯基苯在甲苯中聚合制備的，具體作法如下
聚苯乙烯凝膠(6％DVB)將苯乙烯(282毫摩爾，3.23mL)添加到裝有隔膜帽(septumcap)的40mL的小瓶中。添加甲苯(5mL)，然后將溶液脫氣15分鐘。制備AIBN溶液(將0.9852g AIBN溶解在10mL甲苯中)，并且將0.5mL添加到上述溶液中。使溶液進一步脫氣5分鐘，然后在60攝氏度下保持21小時。由此產(chǎn)生的無色透明的凝膠在50mL的離心管中用乙醇洗滌5次，并且在70攝氏度的鼓風烘箱中干燥過夜。
具有下述交聯(lián)水平的聚苯乙烯凝膠也是采用這種方法制備的4％DVB；2％DVB；1.5％DVB；1％DVB和0.5％DVB。
聚苯乙烯凝膠的磺化將干燥的聚苯乙烯凝膠轉(zhuǎn)移到40mL的玻璃瓶中。添加濃硫酸(10mL)，然后將混合物在100攝氏度下加熱1小時。由此產(chǎn)生的溶脹的棕色凝膠被冷卻到室溫并且用甲醇徹底地洗滌直到pH值為4-5。凝膠在70攝氏度的鼓風烘箱中干燥過夜。然后，將干燥的凝膠用咖啡豆磨具碾碎，轉(zhuǎn)移到50mL的離心管中，用水洗滌幾次。
實施例9磺化的聚2-乙烯基萘凝膠的制備聚2-乙烯基萘凝膠是利用大約1mol％的AIBN作為引發(fā)劑使2-乙烯基萘與二乙烯基苯在甲苯中聚合制備的，具體作法如下
聚2-乙烯基萘凝膠(2％DVB)將2-乙烯基萘(29.4毫摩爾，4.534g)和二乙烯基苯(0.6毫摩爾，85.46微升)添加到裝有隔膜帽的40mL的小瓶中。添加甲苯(10mL)，然后將溶液加熱以使單體溶解。將溶液脫氣15分鐘。制備AIBN溶液(將0.9852g AIBN溶解在10mL甲苯中)，并且將0.5mL添加到聚合溶液中。使溶液進一步脫氣5分鐘，然后在60攝氏度下保持21小時。由此產(chǎn)生的棕色透明的凝膠借助重力過濾用乙醇(總量2升)洗滌，并且在70攝氏度的鼓風烘箱中干燥兩天。
聚2-乙烯基萘凝膠的磺化將干燥的聚2-乙烯基萘凝膠轉(zhuǎn)移到40mL的玻璃瓶中。添加濃硫酸(10mL)，然后將混合物在100攝氏度下加熱1小時。由此產(chǎn)生的溶脹的棕色凝膠被冷卻到室溫并且借助重力過濾用甲醇徹底地洗滌直到pH值為4-5。凝膠再用水洗滌幾次。凝膠在70攝氏度的鼓風烘箱中干燥兩天。
實施例10磺化的聚4-乙烯基聯(lián)苯凝膠的制備聚4-乙烯基聯(lián)苯凝膠是利用大約1mol％的AIBN作為引發(fā)劑使4-乙烯基聯(lián)苯與二乙烯基苯在甲苯中聚合制備的，具體作法如下聚4-乙烯基聯(lián)苯凝膠(2％DVB)將4-乙烯基聯(lián)苯(29.4毫摩爾，5.299g)和二乙烯基苯(0.6毫摩爾，85.46微升)添加到裝有隔膜帽的40mL的小瓶中。添加甲苯(10mL)，然后將溶液加熱以使單體溶解。將溶液脫氣15分鐘。制備AIBN溶液(將0.9852g AIBN溶解在10mL甲苯中)，并且將0.5mL添加到聚合溶液中。使溶液進一步脫氣5分鐘，然后在60攝氏度下保持21小時。由此產(chǎn)生的棕色透明的凝膠借助重力過濾用乙醇(總量2升)洗滌，并且在70攝氏度的鼓風烘箱中干燥兩天。
2％交聯(lián)的聚4-乙烯基聯(lián)苯凝膠的磺化將干燥的聚4-乙烯基聯(lián)苯凝膠轉(zhuǎn)移到40mL的玻璃瓶中。添加濃硫酸(10mL)，然后將混合物在100攝氏度下加熱1小時。由此產(chǎn)生的溶脹的棕色凝膠被冷卻到室溫并且借助重力過濾用甲醇徹底地洗滌直到pH值為4-5。凝膠再次用水洗滌幾次。然后在70攝氏度的鼓風烘箱中干燥兩天。實施例11苯乙烯磺酸鹽與苯乙烯N-辛基磺胺的共聚物的制備將聚苯乙烯磺酸鈉(114.9毫摩爾，20g)分散在N，N-二甲基甲酰胺(“DMF”，100mL，無水的)中。添加亞硫酰氯(114.9毫摩爾，9.95mL)，然后將混合物在60攝氏度下加熱16小時。將混合物潑到冰上，并且用50％NaOH(水溶液)中和到pH值大約為6.5。溶液通過SpectraPor 6-8K MWCO透析管道系統(tǒng)用4次3加侖的去離子水透析，直到透析液的電導率達到0.00mS/cm。將樣品冷凍干燥，得到白色粉末。
聚(苯乙烯磺酸鹽)w/10mol％辛基磺酰胺聚苯乙烯磺酸鈉(114.9毫摩爾，20g)被分散在DMF(100mL，無水的)中。添加亞硫酰氯(114.9毫摩爾，9.95mL)，然后將混合物在60攝氏度下加熱16小時。添加辛基胺(11.486毫摩爾，1.8980mL)，并且將混合物在室溫下攪拌5.5小時。然后將混合物潑到冰上，并且用50％NaOH(水溶液)中和到pH值為6.1。溶液通過SpectraPor 6-8K MWCO透析管道系統(tǒng)用4次3加侖的去離子水透析，直到透析液的電導率達到0.00mS/cm。將樣品冷凍干燥，得到白色粉末。
聚(苯乙烯磺酸鹽)w/20mol％辛基磺酰胺聚苯乙烯磺酸鈉(114.9毫摩爾，20g)被分散在DMF(100mL，無水的)中。添加亞硫酰氯(114.9毫摩爾，9.95mL)，然后將混合物在60攝氏度下加熱16小時。添加辛基胺(22.97毫摩爾，3.7967mL)，并且將混合物在室溫下攪拌5.5小時。然后將混合物潑到冰上，并且用50％NaOH(水溶液)中和到pH值為6.7。溶液通過SpectraPor 6-8K MWCO透析管道系統(tǒng)用3加侖新鮮的去離子水透析4次，直到透析液的電導率達到0.00mS/cm。將樣品冷凍干燥，得到白色粉末。
聚(苯乙烯磺酸鹽)w/30mol％辛基磺酰胺聚苯乙烯磺酸鈉(114.9毫摩爾，20g)被分散在DMF(100mL，無水的)中。添加亞硫酰氯(114.9毫摩爾，9.95mL)，然后將混合物在60攝氏度下加熱16小時。添加辛基胺(34.457毫摩爾，5.6850mL)，并且將混合物在室溫下攪拌5.5小時。然后將混合物潑到冰上，并且用50％NaOH(水溶液)中和到pH值為6.5。溶液通過SpectraPor 6-8K MWCO透析管道系統(tǒng)用4次3加侖的去離子水透析，直到透析液的電導率達到0.00mS/cm。將樣品冷凍干燥，得到白色粉末。
聚(苯乙烯磺酸鹽)w/40mol％辛基磺酰胺聚苯乙烯磺酸鈉(114.9毫摩爾，20g)被分散在DMF(100mL，無水的)中。添加亞硫酰氯(114.9毫摩爾，9.95mL)，然后將混合物在60攝氏度下加熱16小時。添加辛基胺(55.131毫摩爾，7.5934mL)，并且將混合物在室溫下攪拌5.5小時。然后將混合物潑到冰上，并且用50％NaOH(水溶液)中和到pH值為6.7。溶液通過SpectraPor 6-8K MWCO透析管道系統(tǒng)用4次3加侖的去離子水透析，直到透析液的電導率達到0.00mS/cm。將樣品冷凍干燥，得到白色粉末。
實施例12聚苯乙烯磺酸鈣鹽的合成把2g的聚4-苯乙烯磺酸鈉和100mL的去離子水添加到500mL的圓底三頸瓶中。將混合物攪拌幾分鐘直到獲得均勻的溶液。將6.46mL 0.225M的CaCl2溶液添加到這種聚合物溶液中。將反應混合物在室溫下攪拌15小時。使用截止分子量為3K的過濾器通過膜滲濃集將反應混合物凈化。然后，溶液在70攝氏度的鼓風烘箱中干燥24小時，得到1.4g米黃色固體。實施例13苯乙烯磺酸酯與疏水共聚單體的交聯(lián)共聚物的制備聚苯乙烯磺酸酯/疏水物的凝膠是通過以二乙烯基苯(2％)或N，N′-亞甲基雙丙烯酰胺(8％)作為交聯(lián)劑使苯乙烯磺酸酯與丙烯酰胺。丁基丙烯酰胺、癸基丙烯酰胺或苯乙烯共聚制備的，具體作法如下聚苯乙烯磺酸酯凝膠(2％被交聯(lián))在裝有隔膜帽的40mL小瓶中將聚苯乙烯磺酸酯(29.4毫摩爾，5.119g)和二乙烯基苯(0.6毫摩爾，85.5微升)溶解在10mL乙醇和10mL水中。借助通過溶液鼓泡的氮氣使溶液脫氣，并且將1mol％AIBN溶液添加進去。聚合溶液被進一步脫氣，并且在60攝氏度的加熱反應器中放置18小時。形成無色透明的凝膠。
聚苯乙烯磺酸酯與丙烯酰胺的共聚凝膠(75mol％∶23mol％∶2％被交聯(lián))在裝有隔膜帽的40mL小瓶中將聚苯乙烯磺酸酯(22.5毫摩爾，3.918g)、丙烯酰胺(6.90毫摩爾，0.490g)和二乙烯基苯(0.6毫摩爾，85.5微升)溶解在10mL乙醇和10mL水中。借助通過溶液鼓泡的氮氣使溶液脫氣，并且將1mol％AIBN溶液添加進去。聚合溶液被進一步脫氣，并且在60攝氏度的加熱反應器中放置18小時。形成無色透明的凝膠。
聚苯乙烯磺酸酯與丁基丙烯酰胺的共聚凝膠(75mol％∶23mol％∶2％被交聯(lián))在裝有隔膜帽的40mL小瓶中將聚苯乙烯磺酸酯(22.5毫摩爾，3.918g)、丁基丙烯酰胺(6.90毫摩爾，0.878g)和二乙烯基苯(0.6毫摩爾，85.5微升)溶解在15mL乙醇和5mL水中。借助通過溶液鼓泡的氮氣使溶液脫氣，并且將1mol％AIBN溶液添加進去。聚合溶液被進一步脫氣，并且在60攝氏度的加熱反應器中放置18小時。形成無色透明的凝膠。
聚苯乙烯磺酸酯/丙烯酰胺/丁基丙烯酰胺的凝膠(75mol％∶11.5mol％∶11.5mole％∶2％被交聯(lián))在裝有隔膜帽的40mL小瓶中將聚苯乙烯磺酸酯(22.5毫摩爾，3.918g)、丙烯酰胺(3.45毫摩爾，0.245g)、丁基丙烯酰胺(3.45毫摩爾，0.439g)和二乙烯基苯(0.6毫摩爾，85.5微升)溶解在15mL乙醇和5mL水中。借助通過溶液鼓泡的氮氣使溶液脫氣，并且將1mol％AIBN溶液添加進去。聚合溶液被進一步脫氣，并且在60攝氏度的加熱反應器中放置18小時。形成淡黃色透明的凝膠。
聚苯乙烯磺酸酯/癸基丙烯酰胺的凝膠(75mol％∶23mol％∶2％被交聯(lián))在裝有隔膜帽的40mL小瓶中將聚苯乙烯磺酸酯(22.5毫摩爾，3.918g)、癸基丙烯酰胺(6.90毫摩爾，1.458g)和二乙烯基苯(0.6毫摩爾，85.5微升)溶解在15mL乙醇和5mL水中。借助通過溶液鼓泡的氮氣使溶液脫氣，并且將1mol％AIBN溶液添加進去。聚合溶液被進一步脫氣，并且在60攝氏度的加熱反應器中放置18小時。形成乳黃色透明的凝膠。
聚苯乙烯磺酸酯/丙烯酰胺/癸基丙烯酰胺的凝膠(75mol％∶11.5mol％∶11.5mole％∶2％被交聯(lián))在裝有隔膜帽的40mL小瓶中將聚苯乙烯磺酸酯(22.5毫摩爾，3.918g)、丙烯酰胺(3.45毫摩爾，0.245g)、癸基丙烯酰胺(3.45毫摩爾，0.729g)和二乙烯基苯(0.6毫摩爾，85.5微升)溶解在15mL乙醇和5mL水中。借助通過溶液鼓泡的氮氣使溶液脫氣，并且將1mol％AIBN溶液添加進去。聚合溶液被進一步脫氣，并且在60攝氏度的加熱反應器中放置18小時。形成乳黃色透明的凝膠。
聚苯乙烯磺酸酯/苯乙烯的共聚凝膠(75mol％∶23mol％∶2％被交聯(lián))在裝有隔膜帽的40mL小瓶中將聚苯乙烯磺酸酯(22.5毫摩爾，3.918g)、苯乙烯(6.90毫摩爾，0.7906mL)和二乙烯基苯(0.6毫摩爾，85.5微升)溶解在10mL乙醇和10mL水中。借助通過溶液鼓泡的氮氣使溶液脫氣，并且將1mol％AIBN溶液添加進去。聚合溶液被進一步脫氣，并且在60攝氏度的加熱反應器中放置18小時。形成無色透明的凝膠。
聚苯乙烯磺酸酯/丙烯酰胺/苯乙烯的共聚凝膠(75mo1％∶11.5mol％∶11.5mol％∶2％被交聯(lián))在裝有隔膜帽的40mL小瓶中將聚苯乙烯磺酸酯(22.5毫摩爾，3.918g)、丙烯酰胺(3.45毫摩爾，0.245g)、苯乙烯(3.45毫摩爾，0.3953mL)和二乙烯基苯(0.6毫摩爾，85.5微升)溶解在10mL乙醇和10mL水中。借助通過溶液鼓泡的氮氣使溶液脫氣，并且將1mol％AIBN溶液添加進去。聚合溶液被進一步脫氣，并且在60攝氏度的加熱反應器中放置18小時。形成無色透明的凝膠。
聚苯乙烯磺酸酯/丙烯酰胺的共聚凝膠(50mol％∶48mol％∶2％被交聯(lián))在裝有隔膜帽的40mL小瓶中將聚苯乙烯磺酸酯(15.0毫摩爾，2.612g)、丙烯酰胺(14.4毫摩爾，1.024g)和二乙烯基苯(0.6毫摩爾，85.5微升)溶解在5mL乙醇和15mL水中。借助通過溶液鼓泡的氮氣使溶液脫氣，并且將1mol％AIBN溶液添加進去。聚合溶液被進一步脫氣，并且在60攝氏度的加熱反應器中放置18小時。形成無色透明的凝膠。
聚苯乙烯磺酸酯/丙烯酰胺/丁基丙烯酰胺的共聚凝膠(50mol％∶24mol％∶24mol％∶2％被交聯(lián))在裝有隔膜帽的40mL小瓶中將聚苯乙烯磺酸酯(15.0毫摩爾，2.612g)、丙烯酰胺(7.2毫摩爾，0.512g)、丁基丙烯酰胺(7.2毫摩爾，0.916g)和二乙烯基苯(0.6毫摩爾，85.5微升)溶解在5mL乙醇和15mL水中。借助通過溶液鼓泡的氮氣使溶液脫氣，并且將1mol％AIBN溶液添加進去。聚合溶液被進一步脫氣，并且在60攝氏度的加熱反應器中放置18小時。形成無色透明的凝膠。
聚苯乙烯磺酸酯/丙烯酰胺/苯乙烯的共聚凝膠(50mol％∶24mol％∶24mol％∶2％被交聯(lián))在裝有隔膜帽的40mL小瓶中將聚苯乙烯磺酸酯(15.0毫摩爾，2.612g)、丙烯酰胺(7.2毫摩爾，0.512g)、苯乙烯(7.2毫摩爾，0.8250mL)和二乙烯基苯(0.6毫摩爾，85.5微升)溶解在10mL乙醇和10mL水中。借助通過溶液鼓泡的氮氣使溶液脫氣，并且將1mol％AIBN溶液添加進去。聚合溶液被進一步脫氣，并且在60攝氏度的加熱反應器中放置18小時。形成無色透明的凝膠。
聚苯乙烯磺酸酯/丙烯酰胺的共聚凝膠(25mol％∶73mol％∶2％被交聯(lián))在裝有隔膜帽的40mL小瓶中將聚苯乙烯磺酸酯(7.5毫摩爾，1.306g)、丙烯酰胺(21.9毫摩爾，1.557g)和二乙烯基苯(0.6毫摩爾，85.5微升)溶解在5mL乙醇和15mL水中。借助通過溶液鼓泡的氮氣使溶液脫氣，并且將1mol％AIBN溶液添加進去。聚合溶液被進一步脫氣，并且在60攝氏度的加熱反應器中放置18小時。形成無色透明的凝膠。
所有的樣品都通過在兩個50mL的離心管中把凝膠分裂成兩個部分進行凈化。凝膠至少用乙醇洗滌3次，或者洗滌到上層清液變成無色透明的。所用的乙醇的總體積大體上在75mL和100mL之間，取決于凝膠的溶脹指數(shù)。凝膠在60攝氏度的鼓風烘箱中干燥兩天。
凝膠用咖啡豆磨具碾碎，并且通過140目、230目篩網(wǎng)篩分。將0.5-1g的140-230目的凝膠顆粒樣品放在50mL的離心管中用水洗滌3次。一些樣品吸收本領高，不得不在多個離心管上分裂。一般地說，每個管里的材料都用總量為20-80mL的水洗滌。然后，樣品用MeOH洗滌1次，用離心機分離，輕輕地潷掉液體，在70攝氏度下干燥兩天。凝膠是用總量為20-80mL的水洗滌的。
實施例14聚磺酸4-乙烯基聯(lián)苯酯的制備4-乙烯基聯(lián)苯的聚合將4-乙烯基聯(lián)苯(166.4毫摩爾，30g)添加到配備了回流冷凝器、J-Kem熱電偶和隔膜的500mL的圓底三頸瓶中。添加甲苯(60mL)，并且讓溶液脫氣1小時。添加AIBN(1mol％，0.294毫摩爾，0.2733g)，并且讓溶液進一步脫氣15分鐘。聚合混合物在60℃下加熱21小時。由此產(chǎn)生的褐色透明溶液被倒進2L的甲醇中，并且被攪拌幾小時。棕色的細粉末被過濾出來，并且用500mL新鮮的甲醇洗滌3次，然后在70℃的鼓風烘箱中干燥過夜。得到棕色的細粉末(28.02g，93.40％的得率)。
聚4-乙烯基聯(lián)苯的磺化將聚2-乙烯基聯(lián)苯與濃硫酸(100mL)混合，并且在100℃下加熱8小時?；旌衔镒罱K變成粘稠的棕色透明的溶液。聚合物溶液被倒在冰上，并且用50％NaOH水溶液中和到pH值為6.4。該溶液用5L新鮮的去離子水通過截止分子量為3.5K的透析膜透析4次。透析液的電導率小于0.1mS/cm。在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上通過蒸餾將水除去，得到薄片狀褐色透明的固體。
實施例15聚磺酸2-乙烯基萘酯的制備2-乙烯基萘的聚合將2-乙烯基萘(194.5毫摩爾，30g)添加到配備了回流冷凝器、J-Kem熱電偶和隔膜的500mL的圓底三頸瓶中。添加甲苯(60mL)并且讓溶液脫氣1小時。添加AIBN(1mol％，0.294毫摩爾，0.3195g)，并且讓溶液進一步脫氣15分鐘。聚合混合物在60℃下加熱21小時。由此產(chǎn)生的褐色透明溶液被倒進2L的甲醇中，并且被攪拌幾小時。棕色的細粉末被過濾出來，并且用500mL新鮮的甲醇洗滌3次，然后在70℃的鼓風烘箱中干燥過夜。得到棕色的細粉末(28.45g，94.83％的得率)。
聚2-乙烯基萘的磺化將聚2-乙烯基萘與濃硫酸(100mL)混合，并且在100℃下加熱8小時?；旌衔镒罱K變成粘稠的棕色透明的溶液。聚合物溶液被倒在冰上，并且用50％NaOH水溶液中和到pH值為6.4。該溶液用5L新鮮的去離子水通過截止分子量為3.5K的透析膜透析4次。透析液的電導率小于0.1mS/cm。在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上通過蒸餾將水除去，得到薄片狀褐色透明的固體。
實施例164-苯乙烯磺酸鈉與(-)-孟基-4-苯乙烯磺酸酯的共聚物，5％(-)-薄荷醇在室溫下邊攪拌邊將亞硫酰氯(17.3g，0.145摩爾)添加到用300mL無水DMF配制的聚4-苯乙烯磺酸鈉(30.0g，0.145摩爾磺酸鹽)的混合物中。添加是緩慢地進行的，從而保證溫度不升高到50℃以上。繼續(xù)攪拌過夜，然后將三分之一的反應混合物用吡啶(0.764g，00966摩爾)處理。在室溫下攪拌2.5小時之后，添加(-)-孟醇(0.375g，0.00240摩爾)，由此產(chǎn)生的反應混合物在室溫下攪拌過夜，然后在50℃下攪拌3小時。然后，將混合物慢慢地倒入包含碳酸氫鈉(5g)的1立升的水中。在完成添加之后，把更多的碳酸氫鈉添加進去，直到停止起泡和pH值呈中性。徹底地透析之后用空氣流干燥，得到白色的固體。
實施例164-苯乙烯磺酸鈉/石膽酸/4-苯乙烯磺酸酯的共聚物，5％石膽酸在室溫下邊攪拌邊將亞硫酰氯(17.3g，0.145摩爾)添加到用300mL無水DMF配制的聚4-苯乙烯磺酸鈉(30.0g，0.145摩爾磺酸鹽)的混合物中。添加是緩慢地進行的，從而保證溫度不升高到50℃以上。繼續(xù)攪拌過夜，然后將三分之一的反應混合物用吡啶(0.764g，00966摩爾)處理。在室溫下攪拌2.5小時之后，添加石膽酸(0.904g，0.00240摩爾)，由此產(chǎn)生的反應混合物在室溫下攪拌過夜，然后在50℃下攪拌3小時。然后，將混合物慢慢地倒入包含碳酸氫鈉(5g)的1立升的水中。在完成添加之后，把更多的碳酸氫鈉添加進去，直到停止起泡和pH值呈中性。徹底地透析之后用空氣流干燥，得到白色的固體。
如同前面介紹的那樣，倉鼠的體內(nèi)鑒定也被用于評估下述聚合物的功效，如表1所示。
實施例18帶40％滅滴靈的聚3-苯乙烯磺酸鈉在使用磁性攪拌板的3立升的塑料桶中將聚4-苯乙烯磺酸鈉(160-246-001，25g)溶解到去離子水(500mL)中。在獨立的尺寸適當?shù)拇罂诒?，把滅滴靈(8.32g)溶解在去離子水(600mL)和1M的HCl(0.75當量)中。把這種滅滴靈溶液緩慢地倒入聚4-苯乙烯磺酸鈉溶液。由此產(chǎn)生的溶液在室溫下攪拌大約17小時。把它放在透析袋(6K-8K MWCO)中，直到獲得小于0.05的電導率。聚合物溶液在70℃的鼓風烘箱中干燥。獲得大約22g的聚合物。用HPLC分析的結(jié)果表明滅滴靈的填充量為13.8％。
實施例19聚4-甲氧基苯乙烯的磺化把聚4-甲氧基苯乙烯(1g)放在30mL的小瓶中。把濃硫酸(5mL)添加到該小瓶中。邊攪拌邊將這種混合物在100℃下加熱8小時。8小時之后，聚合物被溶解(深色的透明溶液)。添加去離子水(50mL)。通過滴加NaOH(50％的溶液)將樣品中和。將它放在透析袋(6K-8K MWCO)中，直到電導率小于0.1。聚合物溶液被過濾，然后在真空離心蒸發(fā)濃縮器上干燥。
實施例20聚二苯氧基膦嗪的磺化把聚二苯氧基膦嗪(1g)放在30mL的小瓶中。把濃硫酸(5mL)添加到該小瓶中。邊攪拌邊將這種混合物在100℃下加熱8小時。8小時之后，聚合物被溶解(黃色的透明溶液)。添加去離子水(50mL)。通過滴加NaOH(50％的溶液)將樣品中和。將它放在透析袋(6K-8K MWCO)中，直到電導率小于0.1。聚合物溶液被過濾，然后在真空離心蒸發(fā)濃縮器上干燥。
實施例21環(huán)氧乙烷/苯乙烯/環(huán)氧乙烷的嵌段共聚物的磺化把環(huán)氧乙烷/苯乙烯/環(huán)氧乙烷的嵌段共聚物(900mg)放在30mL的小瓶中。把濃硫酸(5mL)添加到該小瓶中。邊攪拌邊將這種混合物在100℃下加熱8小時。8小時之后，聚合物未被溶解。把更多的濃硫酸添加到小瓶中。然后邊攪拌邊在110℃下加熱另一個8小時。這被重復2次以上?？偭繛?0mL的濃硫酸被添加進去(5mL，100℃，8小時；15mL，110℃，24小時)。添加去離子水(50mL)。通過滴加NaOH(50％的溶液)將樣品中和。將它放在透析袋(6K-8K MWCO)中，直到電導率小于0.1。聚合物被過濾(許多不溶解的材料被留下)，然后在真空離心蒸發(fā)濃縮器上干燥。
實施例22聚苯乙烯磺酸酯和聚二烯丙基甲基胺的協(xié)同給藥可溶的聚苯乙烯磺酸酯和交聯(lián)的被C8烷基取代的聚二烯丙基甲基胺(PDMA)是兩種能夠在大腸炎難辯梭菌的倉鼠模型中降低來源于難辯梭菌感染的死亡率的聚合物。這些聚合物在體外呈現(xiàn)不同的結(jié)合毒素性質(zhì)。聚苯乙烯磺酸酯結(jié)合難辯梭菌的毒素A，并且在培養(yǎng)中保護細胞免受毒素A的媒介細胞變圓(cell rounding)的影響。交聯(lián)的被C8烷基取代的PDMA在體外結(jié)合毒素A和B，并且能夠在培養(yǎng)中保護細胞免受毒素媒介細胞變圓的影響。這種聚合物在體外結(jié)合毒素B的效力比結(jié)合毒素A的效力大約強5倍。為了獲得對毒素A和B的最佳結(jié)合效果，在大腸炎難辯梭菌的倉鼠模型中這些聚合物被結(jié)合起來進行試驗。用聚合物處理在感染難辯梭菌前24小時就開始了。倉鼠每天服用3劑聚合物分別在每天的上午8點、中午12點和下午4點。用鹽水(對照標準)、單獨的聚苯乙烯磺酸酯、單獨的交聯(lián)的被C8烷基取代的PDMA或兩種聚合物分開給藥(兩劑聚苯乙烯磺酸酯、一劑C8PDMA)的兩種聚合物的組合給倉鼠群總共治療7天。動物群總共被觀察7天。用鹽水處理的動物的沒有一只在治療中幸存。用聚苯乙烯磺酸酯處理的動物在第7天有80％的幸存者，這些生還者表現(xiàn)出輕微的或適度的疾病。用C8烷基取代的PDMA處理的動物在第7天有50％的幸存者，這些生還者表現(xiàn)出適度的或沒有疾病。聚苯乙烯磺酸酯與C8烷基取代的PDMA的組合導致在第7天有90％的幸存者，其中80％的動物表現(xiàn)出沒有疾病。所以，可溶性的聚苯乙烯磺酸酯和被C8烷基取代的PDMA看來是對活體內(nèi)大腸炎難辯梭菌有效的療法。
實施例23毒素結(jié)合特性分析ELISA酶鏈接的免疫吸附劑分析(ELISA)在商業(yè)上可用于大便樣品中的難辯梭菌毒素水平的診斷。這種分析用涂有經(jīng)過凈化的難辯梭菌毒素A和B的單克隆抗體的微量滴定板來結(jié)合溶液中的毒素。然后，被結(jié)合的毒素用已經(jīng)與酶山葵過氧化物酶(“HRP”)鏈接的經(jīng)過親和純化的多克隆抗血情進行檢測。不受結(jié)合的抗體被沖掉，而受抗體結(jié)合的毒素隨后用適合HRP的有色的酶作用物進行檢測。這種分析對毫微克量的毒素A和B是敏感的。這種ELISA分析被用來確定在經(jīng)過凈化的毒素A或B與各種聚合物一起溫育之后在倉鼠盲腸的內(nèi)容物中出現(xiàn)的游離毒素水平，該游離毒素水平被用來提供預示活體內(nèi)毒素結(jié)合狀況的生理上相應的狀態(tài)。
為了完成ELISA分析，稱出10mg的聚合物放到每個1.5mL的Eppendorf管中(總共4個1.5mL的Eppendorf管)。然后，把500微升的盲腸的內(nèi)容物添加到每個管中，然后讓這些管在渦流混合機上混合，然后在盤旋饋入裝置上放置1小時。然后，把500微升用磷酸鹽緩沖液配制的200ng/mL或2000ng/mL的毒素A或毒素B的溶液添加到每個管中，以使最終的毒素濃度為1000ng/mL或100ng/mL。然后，這些管再次在渦流混合機上混合，并且再次在盤旋饋入裝置上放置1小時。然后，用離心機處理這些管。
將來自每個管的稀釋的上層清液100微升添加到板上每個培養(yǎng)皿中，從而避開固體材料。把100微升軛合物1添加到每個培養(yǎng)皿中。這些培養(yǎng)皿用平板密封件覆蓋，并且在37℃下溫育1小時。這些培養(yǎng)皿被抽吸到防生物危害容器(裝有聚乙烯吡咯烷酮碘或10％漂白劑的水溶液的貯器)中。用板式洗滌機(plate washer)洗滌板，從而用300微升洗滌緩沖液填充這些培養(yǎng)皿。在最后一次洗滌之后，板被翻過來在紙巾上猛敲，以便除掉任何殘留的洗滌緩沖液。把稀釋步驟2的軛合物100微升添加到每個培養(yǎng)皿中。板被覆蓋，并且在室溫下溫育20分鐘。這些培養(yǎng)皿用板式洗滌機洗滌5次，然后猛敲，以便除掉殘留的緩沖液。把酶作用物的混合物100微升添加到每個培養(yǎng)皿中，然后把板密封并且在室溫下溫育15分鐘。然后，把150微升中止溶液添加到每個培養(yǎng)皿中，并且通過在長工作臺上使板形成漩渦使板被逐漸地混合。立即在450nm下讀出吸光度。
細胞培養(yǎng)分析難辯梭菌毒素在培養(yǎng)中引起細胞變圓。這種性質(zhì)可以被用來對聚合物抑制毒素活性的性能進行篩選。在不同的細胞系當中對毒素A和B的敏感性也不同。在現(xiàn)在的案例中，使用Vero細胞(ATCC細胞系)。這些細胞對600pg的毒素A和2pg以下的毒素B是敏感的。分析是通過在12培養(yǎng)皿的轉(zhuǎn)移培養(yǎng)皿板(transwell plates)或96培養(yǎng)皿的微量滴定板上平鋪接種Vero細胞運行的。這些細胞在試驗前已被接種24小時并且在添加毒素的時刻是融合的單層。聚合物(5mg/ml)在室溫下在帶毒素A或毒素B的組織培養(yǎng)基(帶10％牛胎血清的最低限度的基本培養(yǎng)基)中在搖擺條件下溫育1小時。溫育后，根據(jù)樣品究竟是不可溶解的凝膠還是或可溶解的聚合物采用不同的方式處理樣品。不可溶解的凝膠被添加到轉(zhuǎn)移培養(yǎng)皿(0.5毫升/培養(yǎng)皿)中，因為直接把凝膠添加到單層上將使細胞變得模糊不清，從而防礙細胞變圓的檢測。可溶解的聚合物被直接添加到96培養(yǎng)皿的微量滴定板上的細胞單層上(0.1毫升/培養(yǎng)皿)。細胞在37℃下被溫育18小時，并且對細胞變圓進行觀察。分析的終點作為能夠保護50％和100％的細胞單層在 8小時溫育中免受細胞變圓影響的最低的聚合物濃度被記錄下來。對照標準包括用毒素A和B溫育的活性聚合物、單獨的毒素A和B和在沒有毒素的情況下單獨的每種聚合物。
老鼠回腸袢模型分析這個分析的目標是測定聚合物的化合物防止毒素媒介流體積累的能力和老鼠回腸結(jié)扎部分的滲透性。將老鼠麻醉，并且用絲線縫合將一段5cm長的老鼠回腸結(jié)扎。把聚合物(1-5毫克)和5微克凈化的毒素A注射到這段回腸中。老鼠還接受靜脈內(nèi)注射10μCi的3H甘露醇作為腸內(nèi)滲透性的標記。毒素A增加腸中血管的滲透性，從而允許甘露醇進入回腸袢。注射毒素A和聚合物之后4小時，切除回腸袢部分，秤重，并且測定流體的總積累。3H甘露醇的積累是用液體閃爍計數(shù)測定的。結(jié)合毒素A的聚合物的化合物將防礙腸內(nèi)流體的積累和對3H甘露醇的滲透性。分析的終點是完全抑制毒素媒介流體的積累和滲透的聚合物的濃度。這種分析的修改涉及聚合物的口服給藥。在準備回腸袢之前90分鐘給老鼠口服250毫克/公斤的聚合物溶液。如上所述，把毒素注射到回腸袢中。
結(jié)果針對各種各樣的聚合物進行的ELISA、細胞培養(yǎng)、老鼠回腸袢試驗和倉鼠模型的分析結(jié)果都用表1提交。已被臨床用于中和難辯梭菌毒素的消膽胺(一種陽離子型聚合物)的相應的數(shù)據(jù)也被包括在內(nèi)。
表1生物學分析的結(jié)果
針對倉鼠模型提出的數(shù)據(jù)表明接種難辯梭菌后第5天的存活百分率。
用表1提交的結(jié)果表明每種被試驗的聚苯乙烯磺酸酯的聚合物在每種分析中都比消膽胺更有效。
活體內(nèi)試驗基本方案倉鼠對難辯梭菌感染是非常敏感的，并且在通過用抗生素處理引發(fā)疾病時將發(fā)展成致命的大腸炎。各種化合物就它們抑制難辯梭菌毒素的活性的能力用大腸炎難辯梭菌的倉鼠模型進行評估。雄性倉鼠(80-100g)是從Biobreeders公司(FalmouthMA)購買的。所有的動物都按5個一組圈養(yǎng)在鋪著經(jīng)過高壓滅菌的β墊(Beta Chips)的小隔離籠子中并且可以自由地獲得經(jīng)過高壓滅菌的食物和經(jīng)過高壓滅菌和過濾的水。這些動物在到達之后和開始研究之前休息大約1星期。用來感染動物的難辯梭菌菌株最初是從人類大腸炎的難辯梭菌菌株中分離出來的。這種菌株(HUC2-4)在活體外和活體內(nèi)產(chǎn)生中等到高水平的毒素。106-107個細菌細胞/毫升的懸浮液是用過夜的肉湯培養(yǎng)基制備的并且在第一天通過口服給藥0.1mL。24小時后，每只動物都按10mg/kg的劑量皮下注射了氯林可霉素磷酸酯IV。聚合物每天三次(t.i.d)對10只一組的數(shù)組動物通過填喂給藥。聚合物的劑量是25-100毫克/天，分成3次給藥，每次劑量為0.75mL。按照下述的治療法改變服藥的開始和持續(xù)時間。每天都觀察動物的發(fā)病率和死亡率。附加的評估參數(shù)是一般的表現(xiàn)、臨床癥狀的發(fā)作時間和有無腹瀉(“濕尾巴”)。在研究結(jié)束時被判斷為瀕死的和幸免的動物都通過吸入100％的CO2從容地安樂死。在一些研究中獲得了盲腸的內(nèi)容物，并且為了進行后面的毒素分析將它們凍結(jié)。
氯林霉素的給藥(在第0天)由于消滅正常的結(jié)腸菌叢和允許難辯梭菌增生擴散可預見地在受難辯梭菌感染(在第1天)倉鼠群中誘發(fā)疾病。難辯梭菌使90-100％受感染的倉鼠在2-4天之內(nèi)患上致命的大腸炎。分析的第一終點是保護倉鼠避免死亡率。這是一個非常嚴格和富于挑戰(zhàn)性的模型，而倉鼠群中的CDAD與人的疾病形式相比較在嚴重性和時間進程兩個方面是攻擊性強得多的疾病。本發(fā)明的藥物組合物已利用CDAD的倉鼠模型用兩種不同的處理范例進行評估。在預防模型中，研究是為了確定不論產(chǎn)毒的難辯梭菌感染如何發(fā)展用毒素結(jié)合劑進行預處理在預防CDAD方面的潛力而設計的。在治療模型中，這些組合物是在CDAD發(fā)展之后給藥的。
預防模型在這個模型中，倉鼠在第0天接受氯林霉素處理，在第1天接種難辯梭菌(Onderdonk strain(G69))，從第2天到第5天給雄性的Syrian金色倉鼠(每個試驗組10只動物和每個試驗組10只動物)口服7天四種不同劑量(按3個0.750ml劑量口服給藥的25、50、75或100毫克/天)的聚苯乙烯磺酸酯(或?qū)φ諛藴墅}水)。接受對照標準安慰劑的動物，100％使疾病得到發(fā)展，并且在第3天死亡。反之，用組合物預防導致在劑量分別為50毫克/天和100毫克/天的試驗組中有70％和90％的動物幸存。雖然所有的動物都經(jīng)歷產(chǎn)生毒素的難辯梭菌感染，但是包含聚苯乙烯磺酸酯的組合物在改變結(jié)腸菌叢期間有效地抑制毒素并且使大腸炎減少到最小。當正常的菌叢恢復時，難辯梭菌似乎無法參與競爭，并且被減少到不致病的水平。因此，在毒素暴露的最初階段，板上有毒素結(jié)合劑，并且在大腸炎發(fā)展之前起預防作用。
治療模型聚合物療法是在第1天以25、50、75或100毫克/天的劑量開始的。從第1天到第7天每天三次用0.7-1.5mL消過毒的鹽水完成聚合物給藥，總共處理7天。處理結(jié)束后，動物繼續(xù)被觀察7-14天，以確定疾病的發(fā)病率、死亡率和臨床癥狀。
組合物治療模型從第1天(服用病原體后48小時)到第5天用總體積為0.75mL的鹽水給動物服用聚合物和抗菌素的組合物，每天50-100毫克。抗生素是滅滴靈或萬古霉素。滅滴靈的劑量是21毫克/天。萬古霉素的劑量是3毫克/天。繼組合物療法之后，給動物繼續(xù)單獨服用4天聚合物，每天50到100毫克。結(jié)束治療后，對動物繼續(xù)觀察7到14天，以確定疾病的發(fā)病率、死亡率和臨床癥狀。
只要被積極地用藥，滅滴靈在防止倉鼠因CDAD死亡方面是有效的。但是，按療法的結(jié)論，80-90％動物有CDAD的復發(fā)/再次發(fā)生并且在停用滅滴靈的3-6天之內(nèi)死亡。實驗表明在CDAN發(fā)作之后的治療期間和在防止復發(fā)方面服用聚苯乙烯磺酸酯(PSS)的組合物的效果。在用大劑量的包含聚苯乙烯磺酸酯的組合物處理的動物中，90％沒有因滴靈停藥后難辯梭菌故態(tài)復萌引起死亡。在用小劑量聚苯乙烯磺酸酯的試驗組中70％的動物沒有復發(fā)。用鹽水處理的對照組沒有一只存活。單獨用滅滴靈處理的動物在服用最后一劑抗菌素之后16天只有20％存活(存活的動物包括在第21天腹瀉者)。因此，PSS組合物對毒素的抑制作用在滅滴靈療法似乎防止復發(fā)的發(fā)展之后恢復正常菌叢必不可少的時間里防止了大腸炎和其它相關(guān)聯(lián)的病理學。
用PSS組合物的單一療法(monotherapy)單獨使用PSS組合物的處理也曾經(jīng)研究過，并且與當前的護理標準(單獨使用滅滴靈)進行過比較。依據(jù)本發(fā)明的PSS組合物優(yōu)于滅滴靈，與單獨使用滅滴靈的試驗組中的20％相比較防止40％的動物。這個結(jié)果在嚴格的模型中意味著PSS組合物作為單一療法優(yōu)于滅滴靈。PSS組合物似乎不影響抗生素的活性。
用于Vero細胞培養(yǎng)分析的方法就所有的篩選而言，在每個培養(yǎng)皿100微升的情況下，Vero細胞都是按96培養(yǎng)皿的格式使用的，每個培養(yǎng)皿4×104個細胞。板在37℃下溫育過夜以備第二天使用。所有用于培養(yǎng)的培養(yǎng)基、板、吸移管和設備都保持消過毒的。板在放進溫育器之前被覆蓋并且噴涂乙醇。
毒素A和B的規(guī)則篩選聚合物是用開始有10mg/mL的15mL的錐形管稱出，培養(yǎng)皿中的最終濃度為5mg/mL。通常，這些管有作為稀釋劑的大約40mg對4mL的培養(yǎng)基。在希望再次試驗的情況下，過剩物被保存在4℃的冷藏箱中。培養(yǎng)基經(jīng)過消毒用吸移管移轉(zhuǎn)到管中，然后讓管充分形成旋渦。如果聚合物不是在溶液中，管在37℃的水浴中持續(xù)放置5-20分鐘。就這個實驗而言，最終毒素A的濃度是10ng/mL，而毒素B的濃度是1ng/mL。毒素和聚合物都被制成2X的并且按1∶1混合，以便對兩者給出1X的最終濃度。這些溶液都是在錐形管中制作的并且被放在冰上。
一旦聚合物被徹底溶解，消過毒的96-培養(yǎng)皿板就被聚集起來，而培養(yǎng)基按100微升/培養(yǎng)皿放在G-H行以及A-F行的2-6和8-12列中。每塊板篩選四種聚合物，每種聚合物占3行，聚合物和培養(yǎng)基單獨占1行，毒素A和聚合物占1行、毒素B和聚合物占1行。具體編排如下聚合物1聚合物單獨…行A，列1-6聚合物+A…行B，列1-6聚合物+B…行C，列1-6
聚合物2聚合物單獨…行D，列1-6聚合物+A…行E，列1-6聚合物+B…行F，列1-6聚合物3聚合物單獨…行A，列7-12聚合物+A…行B，列7-12聚合物+B…行C，列7-12聚合物4聚合物單獨…行D，列7-12聚合物+A…行E，列7-12聚合物+B…行F，列7-12在添加培養(yǎng)基之后，200微升的聚合物溶液被添加到每個部分的第一列(列1或7)中，并且跨過板到這個部分的末端(列6或12)被稀釋2倍。培養(yǎng)基被添加到行A、D和H中，而毒素A被添加到行B、E和G(列1-6)中。毒素B被添加到行C、F和G(列7-12)中。毒素和培養(yǎng)基兩者是按100微升/培養(yǎng)皿添加的，因此培養(yǎng)皿中的總體積達到200微升。最后一行(H)在分析中不使用。然后，板被放在搖動器上并且在室溫下溫育1小時。
然后，把帶細胞的已在溫育器中保存過夜的板拿出來，并且利用真空抽吸裝置把培養(yǎng)基從培養(yǎng)皿中用吸移管取出。當單元傾向于在這個過程中變干枯時，每次只除掉一塊板上的培養(yǎng)基。除掉培養(yǎng)基之后，將毒素/聚合物的混合物用吸移管吸移到細胞上。溶液是按每個培養(yǎng)皿100微升添加的，從毒素數(shù)量最少的培養(yǎng)皿到濃度最高的培養(yǎng)皿，在整個過程中使用同樣的吸移管尖頭。吸移管的尖頭對于每種新聚合物的操作規(guī)程是改變的。行H被保留不被觸及，而且隨后在顯微鏡下檢查板，以保證單層細胞在抽吸過程中沒有被破壞。然后，把板放回37℃的溫育器，并且在聚合物/毒素處理后18小時對它進行檢查并且就細胞變圓、沒有細胞變圓或部分(50％)細胞變圓的情況作記錄。
毒素B的劑量遞減聚合物按10mg/mL(最后5mg/mL)用錐形管稱量。通常，大約70mg對7mL培養(yǎng)基(所用的稀釋劑)適合完成一次運行。它們通過渦流混合變成溶液。不在溶液中的聚合物在37℃的水浴中放置15至20分鐘。仍然不能完全溶解的溶液受到注意，而凝膠是用凝膠法操作的。毒素B開始時按2微克/毫升制作(最終為1微克/毫升)并且被保存在冰上。使用消過毒的96個培養(yǎng)皿的板，并且把培養(yǎng)基按每個培養(yǎng)皿100微升的量添加到除第一列之外所有的培養(yǎng)皿中。每種聚合物都在3個不同的行上進行試驗(每塊板兩種聚合物)，第一行供沒有毒素的聚合物單獨使用，接下來兩行有聚合物和毒素。行G是毒素B的劑量遞減，而行H被保留未經(jīng)處理。具體編排如下聚合物1行A(1-12)…聚合物，單獨行B(1-12)…聚合物與毒素B行C(1-12)…聚合物與毒素B聚合物2行D(1-12)…聚合物，單獨行E(1-12)…聚合物與毒素B行F(1-12)…聚合物與毒素B編外行行(1-12)…毒素B單獨的劑量遞減行H …未經(jīng)處理200微升的培養(yǎng)基或毒素B被放在第一列(只有聚合物的行放培養(yǎng)基)，而且這在整個板上被稀釋兩倍，從而把100微升帶給每個新列。聚合物的混合物按100微升的量被添加到除行G和H之外所有的培養(yǎng)皿中。被100微升培養(yǎng)基取代的行和行H被保留空著。這些板在搖動器上放置1小時，并且從這個步驟開始遵循前面介紹的操作規(guī)程。
當毒素和聚合物添加到細胞上時，板隨后被噴涂乙醇，放進37℃的溫育器過夜，并且在18小時之后被記錄。就細胞變圓而言記錄是正的，就正常細胞而言記錄是負的，就形態(tài)學上至少50％正常的培養(yǎng)皿而言記錄為+/-。
用于凝膠的方法凝膠是按兩種不同的聚合物濃度操作的，濃度分別為5mg/mL和10mg/mL。就毒素A和B而言，毒素的濃度為100、10、1。這些濃度變化取決于聚合物的類型。12個Eppendorf管為了每種聚合物而被稱重。毒素是按1X稀釋制作的，并且將1mL毒素添加到適當?shù)腅ppendorf管中。對照管只與單獨的聚合物(在所有的濃度下)或單獨的毒素一起使用。然后，在室溫下使這些管章動1小時，再以14,000rpm的轉(zhuǎn)速離心5分鐘。每個樣品200微升，在消過毒的96個培養(yǎng)皿的板上被放到培養(yǎng)皿中。把帶Vero細胞的板從溫育器中取出，并且借助抽吸把培養(yǎng)基除掉(每次一塊板)。100微升的毒素/聚合物混合物被直接添加到帶細胞的板上，這些板被覆蓋后放進溫育器過夜，準備第二天作記錄。記錄采用上述的方法。
老鼠的回腸袢實驗這個方案介紹在被麻醉的老鼠體內(nèi)準備回腸袢的方法。這個實驗模型可以用來試驗諸如細菌毒素之類的腸毒素制劑對腸結(jié)構(gòu)和功能的影響，公認的保護性制劑的效果也能被確定。
兩種大約5cm長的腸袢是通過絲線縫合結(jié)扎回腸在每個動物體內(nèi)準備的。為了防止甘露醇的排泄，腎蒂被結(jié)扎，并且把帶放射性跟蹤標記的甘露醇(3H-甘露醇)注射到活體內(nèi)。然后，把試驗制劑(±毒素±聚合物)注入了這些袢。4小時后，動物死了，收割這些袢。腸內(nèi)流體的分泌(分泌性腹瀉的指標)是通過稱量袢的重量和測定它們的長度評估的。腸粘膜的滲透性是通過測定進入袢的帶放射性標記的甘露醇(3H-甘露醇)的積累評估的。組織的樣品也被放在固定液中，以便用于后面的粘膜損傷和炎癥的形態(tài)學評估。
動物的準備200至250克的雄性Wistar鼠在金屬絲底的籠子里被禁食過夜(18至22小時)，以便將食糞癖減小到最低限度。水是可以隨意利用的。回腸袢本質(zhì)上沒有可能結(jié)合毒素或所用的試驗制劑或者使它們失去本性的腔內(nèi)內(nèi)容(食物和膽汁)。
溶液的制備每個回腸袢接受0.5mL體積的試驗制劑或PBS中的制劑。準備4組帶標記的管和帶標記的注射器(±毒素±聚合物)。毒素A粘附在塑料器具上，因此降低其有效濃度。為此，管和注射器應該在數(shù)個袢之間被重復使用。
毒素A毒素A上是TechLab公司為商業(yè)目的制備的并且是用0.5mL的小瓶提供的，每毫升包含2毫克毒素。每個接受毒素A的袢都按5微克總量或2.5微升上述溶液用藥。
聚合物接受聚合物的袢按0.5mL(20mg/ml)體積接受總量為10毫克的PBS。新聚合物溶液/懸浮液是在每個實驗前制備的。
3H-甘露醇1mCi/mL的3H-甘露醇常備溶液(甘露醇，D-[1-3H(N)]-，NEN Catalog No.NET101)是冷藏的。接受10μCi的3H的每只動物都接受200微升體積的活體內(nèi)注射(即每只動物10微升3H-甘露醇+190微升PBS)。
麻醉動物用35至60mg/kg的戊巴比妥(50mg/mL的溶液)腹膜內(nèi)麻醉。因此，腹膜內(nèi)注射0.2至0.3mL將使200至250g的老鼠麻醉。作為替代品，可以使用氯胺酮/xylazine合劑。這種合劑是通過將5.4mL氯胺酮(100mg/mL)與0.45mL的甲苯噻嗪(100mg/mL)混合制備的。動物是用0.25至0.3mL這種合劑麻醉的。誘發(fā)麻醉花費10至15分鐘是允許的。外科階段麻醉是通過缺乏來自疼痛刺激(足尖扎痛)的響應得以證實的。
外科準備做腹部中線切口，并且將盲腸和小腸從腹中取出。用一段3.0絲線圍繞著左側(cè)腎臟的蒂和脈管系統(tǒng)結(jié)扎。然后，把內(nèi)臟這樣放置，以使右側(cè)腎臟暴露在外并且結(jié)扎腎臟的蒂，注意不要損傷大動脈。然后，把盲腸放在適當?shù)奈恢?，以便露出小腸和為它供血的脈管系統(tǒng)。兩段5cm長的回腸被看成是沒有腔內(nèi)內(nèi)容(食物和膽汁)的，而結(jié)扎線是這樣打結(jié)的，以至形成兩個盲袢。然后，給袢注射想要試驗的制劑。制劑在連接盲腸的結(jié)扎線末梢下面注射到袢中。然后，把內(nèi)臟放在適當?shù)奈恢?，以便顯現(xiàn)大動脈，并且把200微升3H-甘露醇溶液注射到活體內(nèi)。抽回針之后對針孔輕輕地施加壓力以便促進凝結(jié)。注射甘露醇之后，把內(nèi)臟放回腹腔，并且把傷口的肌肉和皮膚層用外科專用縫合線縫合。
回腸袢的注射把用0.5mL的PBS(±聚合物)溶解5微克的毒素A，把混合物裝進注射器，然后給回腸袢注射。于是注射器的內(nèi)容被迅速地注射到腸袢中。
動物的供養(yǎng)外科手術(shù)之后，動物被放在有木頭碎片的鞋盒籠子里，并且讓它恢復4小時。在這個時間周期里動物恢復了意識。任何表現(xiàn)出明顯的痛苦或苦惱征兆的動物都被立即實施安樂死。
袢的收獲和處理完成試驗物質(zhì)的給藥之后4小時，收割回腸袢。用100％的CO2將動物殺死。憑肉眼觀察或利用縫合標記識別回腸袢。回腸袢被修整和外科手術(shù)般地切除多余的組織，從而保證不失去環(huán)內(nèi)的任何內(nèi)容物。把回腸袢放在一片稱量紙上，測定它們的長度和測定回腸袢的重量。然后，回腸袢的遠端放被在預先稱重的小瓶中，并且被切開，以便收集其內(nèi)容物。然后，把500微升的PBS注入回腸袢的近端，以便幫助沖洗內(nèi)容物通過。然后，回腸袢被切成兩半，并且把0.5cm長的一段隔離、打開和放進固定液。
用于閃爍計數(shù)的樣品制備為了確定回腸袢內(nèi)容物的體積，管被再次稱重。管形成強勁的旋渦，并且把200微升樣品等分到7mL的塑料閃爍瓶中。這些樣品與5mL最終的金色閃爍合劑攙混并且形成旋渦。樣品被允許平衡過夜(使化學發(fā)光減少到最低限度)，并且在第二天被形成旋渦和計數(shù)。
MIC分析最低的抑制濃度(MIC)分析確定抑制試驗生物體的生長所需要的抗微生物制劑的最低濃度。MIC分析是針對作為識別具有抗微生物活性的化合物的篩選工具的生物體標準名冊完成的。隨后，MIC分析將針對其它專業(yè)化的微生物名冊重復進行；為了確定化合物的殺生活性、殺死的時程、對在活體外生長的組織培養(yǎng)細胞的毒性以及在某些情況下為了確定其在活體內(nèi)的抗微生物活性將對化合物逐項進行試驗。
MIC分析是根據(jù)“用于抗微生物感受性試驗的性能標準(Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing，1998，vol.M100-S8，Eighth Informational Supplement，NCCLS，940 West Valley Road，Suite 1400，Wayne，PA 19087)”完成的。
簡單地說，被試驗的聚合物用0.85％的鹽水溶解，最終濃度達到5000微克/毫升，pH值被調(diào)整到7.0，并且讓溶液通過0.22微米的濾膜進行過濾滅菌的。聚合物的一系列兩倍稀釋物是用Mueller-Hinton肉湯制備的，陽離子被等分到96培養(yǎng)皿的微量滴定板中。給這些板接種目標生物體，5×105個細胞/培養(yǎng)皿，并且在35℃下溫育18-24小時。在590nm下讀光學密度(OD)，然后記錄微生物的生長(OD＞0.1被認為是生長，OD＜0.1被認為是生長受到抑制)。MIC值被定義為化合物抑制成長的最低濃度。
被試驗的生物體包括有臨床意義的需氧性呈革蘭氏陰性和革蘭氏陽性的菌株、單一的厭氧微生物種(難辯梭菌)以及幾種念珠菌屬的菌株。
盡管這項發(fā)明已參照其優(yōu)選的實施方案被具體地展示和描述，但是熟悉這項技術(shù)的人將理解不脫離權(quán)利要求書定義的本發(fā)明的精神和范圍可以在形式和細節(jié)上作各種各樣的變化。
權(quán)利要求
1.一種用來抑制患者體內(nèi)致病毒素的方法，該方法包括給患者服用有效治療劑量的包含酸性官能團側(cè)基或其包含藥物學上可接受的陽離子的鹽的聚合物的步驟，所述的聚合物不包含酸酐基團。
2.一種用來抑制患者體內(nèi)致病毒素的方法，該方法包括給患者服用有效治療劑量的包含磺酸類官能團側(cè)基或其包含藥物學上可接受的陽離子的鹽的聚合物的步驟。
3.一種用來抑制患者體內(nèi)致病毒素的方法，該方法包括給患者服用有效治療劑量的包含酸性官能團側(cè)基或其包含藥物學上可接受的陽離子的鹽的聚合物的步驟，所述的聚合物以具有一個酸性官能團側(cè)基的重復單元為特征。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中患者是哺乳動物。
5.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中聚合物進一步包括疏水的基團。
6.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中酸性官能團是羧酸、磺酸、膦酸、硼酸、硫酸氫鹽或磷酸二氫鹽的基團。
7.根據(jù)權(quán)利要求6的方法，其中聚合物包含式I給出的單體， 其中X是間隔基或直接鍵；R1和R2各自獨立地是氫或烷基基團；或R1是氫原子或烷基基團，R2是酸性官能團；Y是酸性官能團。
8.根據(jù)權(quán)利要求7的方法，其中X是直鏈的、支鏈的或環(huán)形的、被取代的或未被取代的、飽和的或不飽和的亞烴基基團，或者是其中至少一個碳原子被雜原子取代的直鏈的、支鏈的或環(huán)形的、被取代的或未被取代的、飽和的或不飽和的亞烴基基團。
9.根據(jù)權(quán)利要求8的方法，其中X是C2-C20的亞烷基基團、C2-C20的亞鏈烯基基團、在一個或多個點插入雜原子的C2-C20的亞烷基基團或在一個或多個點插入雜原子的C2-C20的亞鏈烯基基團。
10.根據(jù)權(quán)利要求9的方法，其中雜原子是氮原子、氧原子或硫原子。
11.根據(jù)權(quán)利要求7的方法，其中聚合物是以式II給出的重復單元為特征的， 其中R1和R2各自獨立地是氫原子或烷基基團；或者R1是氫原子或烷基基團，R2是酸性官能團；Z是O或NH；X是間隔基；而Y是酸性官能團。
12.根據(jù)權(quán)利要求11的方法，其中X是直鏈的、支鏈的或環(huán)形的、被取代的或未被取代的、飽和的或不飽和的亞烴基基團，或者是其中至少一個碳原子被雜原子取代的直鏈的、支鏈的或環(huán)形的、被取代的或未被取代的、飽和的或不飽和的亞烴基基團。
13.根據(jù)權(quán)利要求1 2的方法，其中X是C2-C20的亞烷基基團、C2-C20的亞鏈烯基基團、在一個或多個點插入雜原子的C2-C20的亞烷基基團或在一個或多個點插入雜原子的C2-C20的亞鏈烯基基團。
14.根據(jù)權(quán)利要求7的方法，其中聚合物是均聚物。
15.根據(jù)權(quán)利要求7的方法，其中聚合物是共聚物。
16.根據(jù)權(quán)利要求13的方法，其中共聚物是三聚物。
17.根據(jù)權(quán)利要求7的方法，其中單體選自丙烯酸、甲基丙烯酸、乙烯基磺酸、乙烯基膦酸、3-烯丙氧基-2-羥基-1-丙磺酸、乙烯基乙酸、乙烯基硫酸氫鹽、乙烯基磷酸二氫鹽、烯丙基硫酸氫鹽、烯丙基磷酸二氫鹽、十一碳烯酸、十一碳烯基硫酸氫鹽、十一碳烯基磺酸、苯乙烯磺酸鹽和乙烯基苯甲酸；以及它們與藥物學上可接受的陽離子組合的共軛堿。
18.根據(jù)權(quán)利要求7的方法，其中聚合物是進一步以具有疏水基團側(cè)基的單體為特征的共聚物。
19.根據(jù)權(quán)利要求18的方法，其中疏水基團是直鏈的或支鏈的、被取代或未被取代的、環(huán)形的或非環(huán)形的C3-C24的烷基基團、芳基基團、或芳烷基基團。
20.根據(jù)權(quán)利要求19的方法，其中疏水的單體選自苯乙烯、N-異丙基丙烯酰胺、N-叔丁基丙烯酰胺、N-丁基丙烯酰胺、丙烯酸七氟丁酯、N-癸基烯丙胺、N-癸基丙烯酰胺、七氟苯乙烯、丙烯酸丁酯、丙烯酸叔丁酯、丙烯酸癸酯、N-叔丁基甲基丙烯酰胺、甲基丙烯酸癸酯、甲基丙烯酸丁酯、甲基丙烯酸己酯、N-己基乙烯胺、N-己基烯丙胺、N-芐基烯丙胺、N-環(huán)己甲基烯丙胺和N-癸基烯丙胺。
21.根據(jù)權(quán)利要求16的方法，其中聚合物進一步包含中性的親水單體。
22.根據(jù)權(quán)利要求21的方法，其中中性的親水單體選自丙烯酰胺、甲基丙烯酰胺、N-(2-羥乙基)丙烯酰胺和2-羥乙基甲基丙烯酰胺。
23.根據(jù)權(quán)利要求7的方法，其中致病毒素是與選自鏈球菌屬、沙門氏菌屬、彎曲桿菌屬、埃舍利希氏桿菌屬、梭狀芽胞桿菌屬、孤菌屬、葡萄球菌屬、志賀氏桿菌屬、假單胞菌屬、博德特氏菌屬、李氏桿菌屬、耶爾森氏菌屬、軍團菌屬、芽胞桿菌屬、螺桿菌屬、棒狀桿菌屬、放線桿菌屬、氣單胞菌屬、擬桿菌屬和巴斯德氏菌屬的微生物相關(guān)聯(lián)的毒素。
24.根據(jù)權(quán)利要求23的方法，其中微生物選自肺炎鏈球菌、釀膿鏈球菌、腸炎沙門氏菌、空腸炎彎曲桿菌、大腸埃舍利希氏桿菌、肉毒梭菌、金黃色釀膿葡萄球菌、志賀氏痢疾桿菌、綠膿桿菌、百日咳博德特氏菌、單核細胞增多性李氏桿菌、小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌、侵肺軍團菌和炭疽桿菌。
25.根據(jù)權(quán)利要求23的方法，其中微生物是難辯梭菌。
26.根據(jù)權(quán)利要求24的方法，其中微生物是大腸埃舍利希氏桿菌菌株。
27.根據(jù)權(quán)利要求7的方法，其中致病的毒素是與選自霍亂孤菌、痢疾內(nèi)變形蟲和棘變形蟲的生物體相關(guān)聯(lián)的毒素。
28.一種用來治療哺乳動物中與難辯梭菌相關(guān)聯(lián)的腹瀉的方法，該方法包括給所述的哺乳動物服用包含(聚)苯乙烯磺酸鹽的藥物組合物。
29.一種用來治療哺乳動物中與抗菌素相關(guān)聯(lián)的腹瀉的方法，該方法包括給所述的哺乳動物服用有效治療劑量的包含聚苯乙烯磺酸鹽的組合物。
30.一種用來治療哺乳動物中與難辯梭菌相關(guān)聯(lián)的腹瀉的方法，該方法包括給所述的哺乳動物服用有效治療劑量的包含聚苯乙烯磺酸鹽的組合物。
31.一種用來預防易感染的哺乳動物發(fā)作與難辯梭菌相關(guān)聯(lián)的腹瀉的方法，該方法包括給所述的易感染的哺乳動物按足以預防與難辯梭菌相關(guān)聯(lián)的腹瀉發(fā)作的劑量服用包含聚苯乙烯磺酸鹽的組合物。
32.一種用來預防易感染的哺乳動物發(fā)作與難辯梭菌相關(guān)的腹瀉的治療法，該治療法包括作為一次治療事件把廣譜抗菌素和有效治療劑量的包含聚苯乙烯磺酸鹽的組合物結(jié)合起來同時或先后投藥。
33.一種用來預防易感染的哺乳動物復發(fā)與難辯梭菌相關(guān)聯(lián)的腹瀉的方法，該方法包括按足以預防與難辯梭菌相關(guān)聯(lián)的腹瀉復發(fā)的劑量給所述的哺乳動物服用包含聚苯乙烯磺酸鹽的組合物。
34.一種用來預防易感染的哺乳動物復發(fā)與難辯梭菌相關(guān)的腹瀉的治療法，該治療法包括作為一次治療事件把對難辯梭菌有效的抗菌素和有效治療劑量的包含聚苯乙烯磺酸鹽的組合物結(jié)合起來同時或先后投藥。
35.根據(jù)權(quán)利要求34的治療法，其中所述的抗菌素是滅滴靈和萬古霉素。
36.一種用來治療哺乳動物中與活性的難辯梭菌相關(guān)的腹瀉的治療法，該治療法包括作為一次治療事件把對難辯梭菌有效的抗菌素和有效治療劑量的包含聚苯乙烯磺酸鹽的組合物結(jié)合起來同時或先后投藥。
37.根據(jù)權(quán)利要求34的治療法，其中所述的抗菌素是滅滴靈和萬古霉素。
38.根據(jù)權(quán)利要求29的方法，其中聚合物是可溶性的。
39.根據(jù)權(quán)利要求38的方法，其中聚合物具有在大約400,000至1,000,000道爾頓范圍內(nèi)變化的分子量。
40.根據(jù)權(quán)利要求38的方法，其中聚合物具有在大約600,000道爾頓的分子量。
41.一種供醫(yī)學上使用的包含聚苯乙烯磺酸鹽和抗菌素的藥物組合物。
42.在制造用來治療與抗菌素相關(guān)聯(lián)的腹瀉或與難辯梭菌相關(guān)聯(lián)的腹瀉的藥物時使用聚苯乙烯磺酸鹽。
全文摘要
這項發(fā)明涉及通過給動物服用有效治療劑量的有眾多酸性官能團側(cè)基直接附著到聚合物主鏈上或者通過間隔基附著到聚合物主鏈上的聚合物來抑制動物(例如,人)體內(nèi)的毒素的方法。間隔基可以具有在從0到大約20個原子的范圍內(nèi)變化的長度。毒素通常是由致病的微生物(例如,細菌)分泌的外毒素。
文檔編號A61P31/04GK1358097SQ00807536
公開日2002年7月10日 申請日期2000年5月11日 優(yōu)先權(quán)日1999年5月13日
發(fā)明者卡羅琳·庫爾茨, 理查德·菲茨帕特里克 申請人:吉爾特藥品公司