專利名稱：中國人共刺激信號抑制因子的基因工程制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明是一種中國人共刺激信號抑制因子，即細胞毒性T淋巴細胞相關(guān)抗原4的基因工程表達蛋白的制備方法及其用途。
共刺激信號抑制因子是主要表達于成熟T細胞表面的蛋白分子，與T細胞參與的免疫應(yīng)答負調(diào)控有關(guān)，在國際上正在被廣泛地重視，共刺激信號抑制因子不久將被用作免疫耐受劑來治療某些自身免疫疾病及對付器官移植中的排斥現(xiàn)象等。要對共刺激信號抑制因子進行進一步的功能和應(yīng)用研究，首先需要得到共刺激信號抑制因子基因資料，目前有關(guān)共刺激信號抑制因子的分子生物學(xué)資料多為外國人適用，況且均是融合蛋白。中國人共刺激信號抑制因子目前尚無研究報道，不利于適合中國人在該領(lǐng)域的基因工程產(chǎn)品的應(yīng)用。
本發(fā)明的目的是分離中國人共刺激信號抑制因子的DNA序列。
本發(fā)明的目的是研制一種適合中國人的天然的共刺激信號抑制因子的基因工程產(chǎn)品及其制備方法。
中國人共刺激信號抑制因子(即細胞毒性T淋巴細胞相關(guān)抗原4、或CTLA4、或淋細平)，主要表達于成熟T細胞表面的蛋白分子，與T細胞參與的免疫應(yīng)負調(diào)控有關(guān)。T細胞的應(yīng)答、活化同時需要兩種信號，其中第一信號是抗原特異性的，它由T細胞表面的抗原受體(TCR)和抗原遞呈細胞(APC)上的主要組織相容性復(fù)合物(MHC)分子與抗原的復(fù)合物相互作用所提供，第二信號是非抗原依賴性的“共刺激信號”(Costimulatary signal)，它由T細胞表面的CD28和抗原遞呈細胞表面的B7二個分子的相互作用所提供。CTL-4(細胞毒性T淋巴細胞相關(guān)抗原-4，Cytotoxic T lymphocyteassociated antigen 4)是CD28的同源分子，它主要表達在成熟T細胞的表面。CTLA-4基因有4個外顯子，其中第一外顯子為前導(dǎo)序列，第二外顯子編碼膜外功能片段，又稱V區(qū)(V domain)，是B7分子的配體，第三外顯子為穿膜區(qū)，第四外顯子是胞漿內(nèi)區(qū)。CTLA-4與CD28作用不同的是，CD28對于T細胞的活化具有正調(diào)控作用，而CTLA-4對于T細胞的活化具有負調(diào)控作用。當(dāng)缺乏CTLA-4時會導(dǎo)致淋巴細胞的增殖紊亂，出現(xiàn)類似于自身免疫病的癥狀。本發(fā)明分離了中國人共刺激信號抑制因子，用現(xiàn)有的白細胞DNA抽提方法，DNA測序儀為Applied Biosystems Model 373A Version 1.2.0，引物設(shè)計與合成根據(jù)國外發(fā)表的人CTLA-4基因序列，在其V區(qū)兩側(cè)設(shè)計3個寡核苷酸引物上游引物CTL15’ATGCACGTGG CCCA GCCTGCTGT3’下游引物CTL2a5’AATTACATAAATCTGGGTTCCGTTGCC 3’和CTL2b5’AATTACATAAATCTGGGTTCCGCTGCC3’引物由加拿大SANGON生物工程公司合成。擴增時，以人基因組DNA為模板，擴增CTLA-4的V區(qū)。PCR反應(yīng)體系常規(guī)，PCR循環(huán)參數(shù)為94℃ 1min，66℃ 1min，72℃ 1.5min，35個循環(huán)。以1.8％瓊脂糖電泳對PCR產(chǎn)物進行初步鑒定，然后對PCR產(chǎn)物電泳分離條帶進行切膠純化，用Applied Biosystems Model 373A測序儀分析序列。


圖1序列中Hu1和Hu2是已發(fā)表的人CTL-4基因序列，Mouse是小鼠CTL-4基因序列，Hu(Chinese)是中國人CTL-4基因序列。
經(jīng)對PCR產(chǎn)物進行DNA序列分析，確證PCR產(chǎn)物是CTLA-4的第二外顯子，并且發(fā)現(xiàn)中國人群的序列有兩處與國外報道的不一致，其中第54位密碼子處中國人為ATG(甲硫氨酸)，而現(xiàn)有報道為ACG(絲氨酸)，第110位密碼子處中國人為ACC(蘇氨酸)，而現(xiàn)有報道為GCC(丙氨酸)，推測在不同人群中存在著等位基因差異性。本發(fā)明取5ul PCR產(chǎn)物加入8ul電泳上樣液(含0.05％溴酚蘭，0.05％二甲苯青FF，96％甲酰胺，20mmol/LEDTA)，并2ulTE(pH8.0)加熱至97℃變性10min后立即置0℃冰水浴中，用12％聚丙烯酰胺變性凝膠(丙烯酰胺與甲叉雙丙烯酰胺比例為49∶1，5％甘油，0.5×TBE)電泳，250V 4℃電泳3h。將凝膠置37℃固定液(10％乙醇，0.5％冰乙酸)中浸泡10min用雙蒸水洗4次，再浸泡于銀染液(0.2％硝酸銀)中7min，再用雙蒸水洗4次后置顯色液(1.5％氫氧化鈉，0.4％甲醛)中顯色觀察結(jié)果，完成SSCP分析。分析結(jié)果未發(fā)現(xiàn)有多態(tài)性，與已測序的PCR-SSCP電泳格局完全一致，說明該基因非常保守。分子具有重要的生物學(xué)功能。
本發(fā)明分離了中國人共刺激信號抑制因子的基因，并且對中國人基因密碼子的DNA進行改造，選擇采用宿主優(yōu)勢密碼子，在設(shè)計上游引物時將部分位點的密碼子改為宿主的最適密碼子。
真核酵母用克隆引物有Y1.1E；Y1.2Tapa；Y1.3Apa；Y2.1cla；Y2.2Txba；Y2.3Xba用于在真核中表達，引物中已對中國人基因密碼子的DNA進行改造，選擇采用在宿主(真核酵母)中優(yōu)勢密碼子，上游引物中前6個密碼子被改造為宿主的最適密碼子G9→T，C12→T，G15→A，T18→A。引物并含有EcoRI和ApaI克隆用接頭。上游引物特征’EcoRI-ATG---G9→T，C12→T，G15→A，T18→A----；’下游引物特征(反意)’------TAA-ApaI’。
原核大腸桿菌克隆引物有PCTL1PN；PCTL2B；PCTL2H；CTL2；PBV-CTL1；PXE-CTL2，用于在原核中表達，引物中已對中國人基因密碼子的DNA進行改造，選擇采用在宿主(原核)中優(yōu)勢密碼子，上游引物中前6個密碼子被改造為宿主的最適密碼子G9→T，C12→T，T18→G。引物并含有XhoI，EcoRI，NdeI和BamHI克隆用接頭。上游引物特征(1)5’-XhoI-EcoRI-ATG--G9→T，C12→T，T18→G--3’；(2)5’-NdeI-ATG-T9-T12-T18-T24-T27----------3’。下游引物特征(反意)(1)5’---------TGA-EcoRI-XhoI 3’；(2)5’-------------TAA-BamHI 3’。
本發(fā)明轉(zhuǎn)化用質(zhì)粒的構(gòu)建是以相同內(nèi)切酶水解質(zhì)粒和目的基因，純化后以連接酶連接構(gòu)建轉(zhuǎn)化用質(zhì)粒pPICLA，pPBCTLA，pETCTLA，具體結(jié)構(gòu)見圖2，3，4。圖5、6質(zhì)粒上游引物特征5’-XhoI-EcoRI-ATG--G9→T，C12→T，T18→G--3’；下游引物特征(反意)5’--------------TGA-’EcoRI-XhoI 3’。圖2質(zhì)粒上游引物特征5’-NdeI-ATG-T9-T12-T18-T24-T27---------3’；下游引物特征(反意)5’------------------TAA-BamHI 3’。
將已構(gòu)建的載體PPICLA，PETCTLA，PPBCTLA轉(zhuǎn)化至宿主菌，經(jīng)培養(yǎng)，并以PCR擴增鑒定相應(yīng)的菌株，獲得了陽性轉(zhuǎn)化克隆。
上述構(gòu)建的質(zhì)粒載體可以在真核中表達，如酵母，X33，GS115，Km71等。
上述構(gòu)建的質(zhì)粒載體可以在原核中表達，如大腸桿菌，BL21，DH5α等。
上述構(gòu)建的質(zhì)粒載體在酵母中表達更好。
上述構(gòu)建的質(zhì)粒載體在大腸桿菌中表達更好。
上述構(gòu)建的質(zhì)粒載體在大腸桿菌中能增殖。
上述構(gòu)建的質(zhì)粒載體在在酵母中能增殖。增殖的質(zhì)粒用作基因探針，檢測效果良好。
本發(fā)明構(gòu)建的質(zhì)粒表達的蛋白具有中國人共刺激信號抑制因子基因的相同功能。
以上述已構(gòu)建的載體轉(zhuǎn)化相應(yīng)的菌株，培養(yǎng)并提取質(zhì)粒，以相應(yīng)的內(nèi)切酶水解，電泳鑒定，結(jié)果從相應(yīng)的陽性轉(zhuǎn)化克隆中獲得了與導(dǎo)入的目的基因一致的DNA片段。
本發(fā)明對上述陽性轉(zhuǎn)化克隆進行誘導(dǎo)表達，以含空白質(zhì)粒的受體菌作為對照，經(jīng)過SDS-PAGE之后，用考馬斯亮藍染色并觀察結(jié)果，發(fā)現(xiàn)其中多個樣品有一個條帶在空白對照中未見到，參照標(biāo)準低分子量蛋白條帶的位置可以看出該條帶略小于13,700D(RNA酶條帶)，這與理論預(yù)期值的11,400相符，所以這條新的條帶應(yīng)該就是所克隆的目的基因的表達產(chǎn)物，見圖9，經(jīng)過電腦分子生物學(xué)圖象分析系統(tǒng)(BCA)對表達產(chǎn)物分析分子量分析與理論預(yù)期值相符，見圖10，陽性克隆中目基因的蛋白表達量可達5％，表達量為5.4-28.0mg/L目的蛋白產(chǎn)物，見圖11。
本發(fā)明克隆、表達了中國人共刺激信號抑制因子基因編碼的天然蛋白分子，使該蛋白可以生產(chǎn)，是一種很有前途的生物工程免疫耐受誘導(dǎo)藥物，可用于各種自身免疫性疾病治療，還可用于各種動物和人的各種器官移植后排異反應(yīng)以及用于各種過敏性疾病的治療和預(yù)防，并可作為抗原用于免疫各種動物以制備抗體用于科研和臨床的相關(guān)基因分析探針用作檢測分析。
本發(fā)明分離了中國人基因共刺激信號抑制因子DNA基因，用基因工程技術(shù)采用宿主優(yōu)勢密碼子，構(gòu)建天然蛋白表達載體系列，并且克隆表達，獲得含有中國人基因共刺激信號抑制因子的陽性菌株。與國外含共刺激信號抑制因子融合蛋白相比，它更適合于中國人，并且成本大大降低。該基因工程產(chǎn)物用于免疫疾病的治療，不僅有科學(xué)價值，還有廣闊的市場前景。
圖1是中國人CTLA-4第二外顯子PCR產(chǎn)物的電泳結(jié)果圖。
圖2是中國人共刺激抑制因子CTLA-4第二外顯子PCR-SSCP的分析結(jié)果圖。
圖3是DNA自動分析儀對中國人CTLA-4基因測序結(jié)果圖。
圖4是中國人共刺激信號抑制因子測序圖。
圖5是本發(fā)明構(gòu)建質(zhì)粒pPICLA圖。
圖6是本發(fā)明構(gòu)建質(zhì)粒pPBCTLA圖。
圖7是本發(fā)明構(gòu)建質(zhì)粒pETCTLA圖。
圖8是含目的基因重組質(zhì)粒pPICLA，pPBCTLA，pETCTLA轉(zhuǎn)化宿主菌后的PCR鑒定圖。
圖9是質(zhì)粒pPBCTLA轉(zhuǎn)化宿主菌后質(zhì)粒DNA酶切鑒定圖。
圖10是轉(zhuǎn)化子經(jīng)誘導(dǎo)后的SDS-PAGE結(jié)果圖。
實施例1以人工合成的特異性引物對中國人白細胞DNA的CTLA-4基因進行體外擴增，將擴增產(chǎn)物進行1.5％瓊脂糖電泳，切膠純化所要目的基因DNA片段，以0.3M醋酸鈉(pH5.3)和80％乙醇沉淀目的基因DNA片段，用相應(yīng)內(nèi)切酶水解，與載體連接構(gòu)建成pPICLA質(zhì)粒，并在4℃和0.1M CaCl2存在情況下轉(zhuǎn)化KM71及X33菌株，以MGYH培養(yǎng)基在30℃培養(yǎng)，培養(yǎng)至OD600＝2-6，離心分離細胞重懸于100倍的AIGYH中，培養(yǎng)至OD600＝2-6，每天加入甲醇至終濃度達0.5％，培養(yǎng)1-5天，離心收集細胞，破碎細胞，以2M尿素洗滌，離心沉淀，再以8M尿素溶解沉淀，PBS透析，聚乙二醇濃縮，進一步以8％PAGE(pH8.8)純化和HPLC純化，收集目的蛋白，經(jīng)Western blot鑒定及MLR抑制試驗和抗原特異性LTT抑制試驗作活性測定。
實施例2以人工合成的特異性引物對中國人白細胞DNA的CTLA-4基因進行體外擴增，將擴增產(chǎn)物進行1.5％瓊脂糖電泳，切膠純化所要目的基因DNA片段，以0.3M醋酸鈉(pH5.3)和80％乙醇沉淀目的基因DNA片段，用相應(yīng)內(nèi)切酶水解與載體連接構(gòu)建成pPBCTLA質(zhì)粒，在4℃和0.1M CaCl2存在情況下，轉(zhuǎn)感受態(tài)DH 5α菌，轉(zhuǎn)化陽性菌在LB培養(yǎng)基中于30℃培養(yǎng)至OD600＝0.5，迅速轉(zhuǎn)至42離℃培養(yǎng)4hr，離心收集菌體，常規(guī)方法破菌，離心分離包涵體，以2M尿素洗滌離心測定，再以8M尿素溶解沉淀，PBS透析，聚乙二醇濃縮后，以8％PAGE(pH8.8)純化或HPLC純化，收集目的蛋白，經(jīng)Western blot進行分子鑒定和MLR抑制試驗及抗原特異性LTT抑制試驗作活性測定。
權(quán)利要求
1.一種中國人共刺激信號抑制因子的基因工程制備方法，通過基因分離、克隆、表達過程，其特征是分離中國人共刺激信號抑制因子基因并測序(圖4)，設(shè)計克隆引物(圖5、6、7)，構(gòu)建轉(zhuǎn)化質(zhì)pPICLA、pPBCTLA、pETCTLA，轉(zhuǎn)化宿主菌。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的中國人共刺激信號抑制因子的基因工程制備方法，其特征是上述質(zhì)粒在真核中表達。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的中國人共刺激信號抑制因子的基因工程制備方法，其特征是上述質(zhì)粒在真核酵母中表達。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的中國人共刺激信號抑制因子的基因工程制備方法，其特征是上述質(zhì)粒在原核中表達。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的中國人共刺激信號抑制因子的基因工程制備方法，其特征是上述質(zhì)粒在原核大腸桿菌中表達。
6.一種大腸桿菌中增殖的如權(quán)利要求1所述的質(zhì)粒。
7.一種酵母菌中增殖的如權(quán)利要求1所述的質(zhì)粒。
8.一種含有權(quán)利要求1所述質(zhì)粒的菌株。
9.一種含有權(quán)利要求1所述質(zhì)粒的蛋白。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的中國人共刺激信號抑制因子的基因工程制備方法，其特征是該基因工程產(chǎn)品用作免疫抑制劑。
11.根據(jù)權(quán)利要求1所述的中國人共刺激信號抑制因子的基因工程制備方法，其特征是該基因工程產(chǎn)品用作免疫耐受誘導(dǎo)劑。
12.根據(jù)權(quán)利要求1所述的中國人共刺激信號抑制因子的基因工程制備方法，其特征是該基因工程產(chǎn)品用作相關(guān)基因分析探針。
全文摘要
一種中國人共刺激信號抑制因子的基因工程制備方法。目前有關(guān)共刺激信號抑制因子的生物學(xué)研究僅適合外國人,且是非自然產(chǎn)品。本發(fā)明分離了中國人共刺激信號抑制因子基因,對中國人基因密碼子的DNA進行改造,采用宿主優(yōu)勢密碼子,構(gòu)建天然蛋白表達載體系列,適合在真核生物和原核生物中表達。經(jīng)鑒定,上述表達產(chǎn)物具有中國人共刺激信號抑制因子基因的陽性菌株。該天然蛋白分子能大量生產(chǎn),是一種前景廣闊的生物工程免疫耐受劑。
文檔編號A61P37/00GK1268563SQ00115408
公開日2000年10月4日 申請日期2000年4月18日 優(yōu)先權(quán)日2000年4月18日
發(fā)明者朱乃碩 申請人:復(fù)旦大學(xué)