專利名稱：：尿酸氧化酶的變體形式及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及遺傳修飾的具有尿酸分解活性的蛋白質(zhì)。更具體的說，本發(fā)明涉及包含截短的尿酸氧化酶的蛋白質(zhì)及其生產(chǎn)方法。
背景技術(shù)：
：術(shù)語尿酸氧化酶(urateoxidase)和尿酸酶(uricase)在本文中可互換使用。尿酸氧化酶(尿酸酶；E.C.1.7.3.3)這種酶能催化尿酸氧化成更具可溶性的產(chǎn)物尿嚢素，尿囊素是更容易排泄的嘌呤代謝物。人不產(chǎn)生有酶活性的尿酸酶，這是因為在高等靈長類的進(jìn)化過程中獲得的尿酸酶基因的幾個突變所致。Wu,X等，(1992)/Mo/34:78-84,該文獻(xiàn)通過引用整體結(jié)合到本文中。因此，在易感個體中，血液中過量濃度的尿酸(高尿酸血癥)會導(dǎo)致疼痛性關(guān)節(jié)炎(痛風(fēng))、毀形性尿酸沉積(結(jié)節(jié)瘤)和腎衰竭。在一些受侵害個體中，可用的藥物如別。票醇(尿酸合成的抑制劑)會產(chǎn)生治療限制性副作用，或者不能充分減輕這些病癥。Hande,KR等，(1984)爿wJA^^76:47-56;Fam,AG,(1990)Saz7/,'e^C//"朋畫ato/4:177-192，每個文獻(xiàn)通過引用整體結(jié)合到本文中。尿酸酶注射能減少高尿酸血癥和高尿酸尿癥，至少是短暫地減少。由于尿酸酶在人體中是異種蛋白，在某些百分比的受治療患者中，即使是第一次注射來自黃曲霉04^^gz〃ws^a，s)的未修飾蛋白質(zhì)就會引起過敏反應(yīng)(Pui,C-H等,(1997)Z^few/a11:1813-1816,該文獻(xiàn)通過引用整體結(jié)合到本文中)，免疫應(yīng)答限制其用于長期或間歇治療的效用。Donadio，D等，(1981)腸v/V薩臉d10:711-712;Leaustic,M等，(1983)尺ev朋謂她/(9W麵W/c50:553-554，每個文獻(xiàn)通過引用整體結(jié)合到本文中。本發(fā)明涉及發(fā)生截短和結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性增強的突變重組尿酸酶蛋白。發(fā)明概述本發(fā)明的目的是提供新型的重組尿酸酶蛋白。所設(shè)想的本發(fā)明蛋白質(zhì)相對于天然尿酸酶蛋白是截短的，且具有突變的氨基酸。本發(fā)明提供包含SEQIDNO.8M酸序列的突變重組尿酸酶。還提供包含SEQIDNO.13氨基酸序列的突變重組尿酸酶。本發(fā)明的另一個目的是提供代謝尿酸的方法，所述方法包括給予具有尿酸分解活性的新型重組尿酸酶蛋白。尿酸分解活性在本文中用以指尿酸向尿嚢素的酶促轉(zhuǎn)化。在一個實施方案中，尿酸酶包含SEQIDN0.7或SEQIDNO.12的8位至287位的氨基酸序列。本發(fā)明還提供了包含SEQIDNO.8或SEQIDNO.13的氨基酸序列的尿酸酶。在一個實施方案中，尿酸酶包含氨基末端氨基酸，其中氨基末端氨基酸是丙氨酸、甘氨酸、脯氨酸、絲氨酸或蘇氨酸。在一個特別實施方案中，氨基末端氨基酸是甲硫氨酸。本發(fā)明還提供分離的核酸，其包含編碼本發(fā)明尿酸酶的核酸序列。在一個具體實施方案中，編碼尿酸酶的核酸有效連接到異源啟動子，例如osmB啟動子。本發(fā)明還提供包含尿酸酶編碼核酸的核酸載體和包含這種載體的宿主細(xì)胞，以及產(chǎn)生尿酸酶的方法，所述方法包括在所述核酸序列得以被宿主細(xì)胞表達(dá)的條件下培養(yǎng)宿主細(xì)胞以及分離表達(dá)的尿酸酶的步驟。附圖簡述圖1說明質(zhì)粒pOUR-P-AN-ks-l的結(jié)構(gòu)。限制位點旁的數(shù)字表示核苷酸位置，該位置相對于指定為1的HaeII位點而言。在克隆過程中丟失的限制位點在括號中標(biāo)出。圖2顯示豬-KS-AN尿酸酶的DNA和推導(dǎo)氨基酸序列(分別為SEQIDNO.9和SEQIDNO.7)。圖2中的氨基酸編號是相對于完全豬尿酸酶序列進(jìn)行的。在起始密碼子曱硫氨酸殘基之后，蘇氨酸置換豬尿酸酶序列中的天冬氨酸7。指出了用于亞克隆的各個步驟的限制位點。3'非翻譯序列用小寫字母顯示。翻譯終止密碼子由星號表示。圖3顯示各種重組豬(SEQIDNO.11)、PBC-ANC(SEQIDNO.12)和豬-KS-AN(SEQIDNO.7)尿酸酶序列的推導(dǎo)氨基酸序列的相對比對。星號表示與公開的豬尿酸酶序列相比豬-KS-AN中氨基酸有差異的位置；圓圈表示與PBC-AN相比豬-KS-AN中氨基酸有差異的位置。虛線表示氨基酸的缺失。圖4顯示根據(jù)實施例1-3產(chǎn)生的豬尿酸酶和高度純化尿酸酶變體的SDS-PAGE。每個樣品的生產(chǎn)日期(月/年)和相關(guān)泳道號碼在下方的圖例(key)中表示。Y軸標(biāo)以分子量標(biāo)記物的重量標(biāo)記，圖的頂部標(biāo)以泳道號碼。各泳道如下泳道l-分子量標(biāo)記；泳道2-豬KS-AN(7/98);泳道3-豬(9/98);泳道4-豬KS(6/99);泳道5-豬KS(6/99);泳道6-豬-AN(6/99);泳道7-豬KS-AN(7/99);泳道8-豬KS-AN(8/99)。圖5描繪PEG化(化10kD)豬-KS-AN尿酸酶在大鼠中IM(肌肉內(nèi))、SC(皮下)和IV(靜脈內(nèi))注射后的藥物動力學(xué)曲線，通過監(jiān)測血液樣品中的酶活性測出。在指定時間點收集的血漿樣品中的尿酸酶活性用比色測定法進(jìn)行測定?；钚灾?mAU-毫吸光度單位)代表每lHl血漿樣品的酶反應(yīng)速度。注射的尿酸酶的生物利用度(相對于IV注射到達(dá)循環(huán)的藥物量)從圖的曲線下面積計算。圖6描繪PEG化(9xl0kD)豬-KS-AN尿酸酶在兔中IM(肌肉內(nèi))、SC(皮下)和IV(靜脈內(nèi))注射后的藥物動力學(xué)曲線，通過監(jiān)測血液樣品中的酶活性測出。在指定時間點收集的血漿樣品中的尿酸酶活性用比色測定法進(jìn)行測定?；钚灾?mAU二毫吸光度單位)代表每lILAl血漿樣品的酶反應(yīng)速度。注射的尿酸酶的生物利用度(相對于IV注射到達(dá)循環(huán)的藥物量)從圖的曲線下面積計算。圖7描繪PEG化(9xl0kD)豬-KS-AN尿酸酶在犬中IM(肌肉內(nèi))、SC(皮下)和IV(靜脈內(nèi))注射后的藥物動力學(xué)曲線，通過監(jiān)測血液樣品中的酶活性測出。在指定時間點收集的血漿樣品中的尿酸酶活性用比色測定法進(jìn)行測定?；钚灾?mAU二毫吸光度單位)代表每lpi血漿樣品的酶反應(yīng)速度。注射的尿酸酶的生物利用度(相對于IV注射到達(dá)循環(huán)的藥物量)從圖的曲線下面積計算。圖8描繪PEG化(9xl0kD)豬-KS-AN尿酸酶在豬中IM(肌肉內(nèi))、SC(皮下)和IV(靜脈內(nèi))注射后的藥物動力學(xué)曲線，通過監(jiān)測血液樣品中的酶活性測出。在指定時間點收集的血漿樣品中的尿酸酶活性用比色測定法進(jìn)行測定?；钚灾?mAU-毫吸光度單位)代表每l^血漿樣品的酶反應(yīng)速度。注射的尿酸酶的生物利用度(相對于IV注射到達(dá)循環(huán)的藥物量)從圖的曲線下面積計算。發(fā)明詳述先前的研究教導(dǎo)，當(dāng)通過PEG化實現(xiàn)尿酸酶免疫原性和/或抗原性的顯著降低時，總是伴隨著尿酸分解活性的明顯損失。生物藥物的安全性、方便性和成本效益都受到其功效下降和由此所致的需要增加給藥劑量的不利影響。因此，需要有安全有效的用以降低身體流體(包括血液)中高水平尿酸的替代方法。本發(fā)明提供突變重組尿酸酶，其包含氨基酸序列SEQIDNO.7、SEQIDNO.8、SEQIDNO.12或SEQEDN0.13。本文所用的尿酸酶包括單個亞單位以及四聚體，除非另有指明。在一個具體實施方案中，尿酸酶有氨基末端甲硫氨酸。該甲硫氨酸可通過翻譯后修飾除去。在具體實施方案中，氨基末端甲硫氨酸在尿酸酶產(chǎn)生后除去。在具體的實施方案中，甲硫氨酸通過內(nèi)源性細(xì)菌氨基肽酶除去。倒數(shù)笫二個氨基酸可以是允許細(xì)菌甲硫氨酸氨基肽酶除去N-末端曱硫氨酸的氨基酸。允許N-末端曱硫氨酸得以最完全地除去的氨基酸是丙氨酸、甘氨酸、脯氨酸、絲氨酸和蘇氨酸。在一個具體的實施方案中，尿酸酶包含兩個氨基末端氨基酸，其中兩個氨基末端氨基酸是曱硫氨酸和緊接其后的選自丙氨酸、甘氨酸、脯氨酸、絲氨酸和蘇氨酸的氨基酸。本發(fā)明提供編碼尿酸酶的核酸序列。本發(fā)明提供包含該核酸序列的載體。在一個具體的實施方案中，尿酸酶是分離的。在一個具體的實施方案中，尿酸酶是純化的。在具體的實施方案中，尿酸酶是分離且純化的。本發(fā)明提供包含載體的宿主細(xì)胞，該載體包含編碼尿酸酶的核酸序列。本發(fā)明提供編碼尿酸酶的核酸序列的產(chǎn)生方法，包括通過PCR(聚合酶鏈反應(yīng))技術(shù)修飾編碼尿酸酶的核酸序列。本領(lǐng)域技術(shù)人員知道，所需要的核酸序列籍合成寡核苷酸引物通過PCR制備，這些引物與待擴增的靶DNA(每條鏈一個)的各區(qū)域互補。在過量的脫氧核苷酸和Taq聚合酶(一種熱穩(wěn)定DNA聚合物)存在下，將引物加入到草巴DNA(不需要是純的)中。在一系列(通常30個)溫度循環(huán)中，靶DNA反復(fù)進(jìn)行變性(90。C左右)，與引物退火(通常在50-60。C)和從引物延伸出子鏈(72。C)。由于子鏈本身能充當(dāng)后續(xù)各循環(huán)的模板，與兩種引物匹配的DNA片斷以指數(shù)方式而不是線性方式得到擴增。本發(fā)明提供產(chǎn)生突變重組尿酸酶的方法，所述方法包括用該載體轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞表達(dá)該尿酸酶，從宿主細(xì)胞分離突變重組尿酸酶，用例如色i普^支術(shù)分離出純化的突變重組尿酸酶，和純化該突變重組尿酸酶。例如，可按照國際專利出版物WO00/08196和美國專利申請第60/095,489號(其通過引用整體結(jié)合到本文中)描述的方法制備該尿酸酶。在一個優(yōu)選的實施方案中，處理宿主細(xì)胞以導(dǎo)致突變重組尿酸酶的表達(dá)。本領(lǐng)域技術(shù)人員知道，用載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞通常用鉤離子沉淀的DNA來實現(xiàn)，不過也可使用各種其它方法(例如電穿孔)。該尿酸酶可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的任何方法進(jìn)行分離和/或純化。本發(fā)明的表達(dá)多肽通常分離成基本上純的形式。優(yōu)選地，該多肽分離至純度為至少80%重量，更優(yōu)選至純度為至少95%重量，最優(yōu)選至純度為至少99%重量。一般來說，這種純化可用例如硫酸銨分級分離、SDS-PAGE電泳和親和層析的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)來實現(xiàn)。該尿酸酶優(yōu)選按照2005年4月11日提交的共同待審美國專利申請(申請?zhí)枮?0/670,520，代理人案號為103864.146644,標(biāo)題為"用陽離子型表面活性劑純化蛋白質(zhì)"，其通過引用整體結(jié)合到本文中)中描述的方法，用陽離子型表面活性劑例如氯化十六烷基呲啶鏡(CPC)來分離。在本發(fā)明的一個實施方案中，載體在滲透壓敏感啟動子的控制之下。啟動子是DNA的一個區(qū)域，RNA聚合酶在啟動DNA向RNA的轉(zhuǎn)錄之前與它結(jié)合。滲透壓敏感啟動子由于細(xì)胞所感受到的滲透壓的增加而啟動轉(zhuǎn)錄。本發(fā)明的尿酸酶包含與聚合物綴合的尿酸酶，例如綴合至聚乙二醇的尿酸酶，即PEG化尿酸酶。在本發(fā)明的一個實施方案中，提供包含該尿酸酶的藥物組合物。在一個實施方案中，該組合物是尿酸酶的溶液。在一個優(yōu)選的實施方案中，該溶液是無菌的，適合于注射。在一個實施方案中，這種組合物包含作為磷酸緩沖鹽水溶液的尿酸酶。在一個實施方案中，該組合物在小瓶中提供，該小瓶任選具有橡膠注射塞。在具體的實施方案中，該組合物包含在溶液中的尿酸酶，溶液濃度為2-16毫克尿酸酶每毫升溶液、4-12毫克尿酸酶每毫升溶液或6-10毫克尿酸酶每毫升溶液。在一個優(yōu)選的實施方案中，該組合物包含濃度為8毫克每毫升溶液的尿酸酶。優(yōu)選地，尿酸酶的質(zhì)量相對于蛋白質(zhì)質(zhì)量來測量。本發(fā)明組合物的有效給藥方案可由本領(lǐng)域技術(shù)人員來確定。評估給定方案的有效性的合適指標(biāo)是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。這種指標(biāo)的實例包括血漿尿酸水平(PUA)的正?；蚪档?，和PUA降低或維持在6.8mg/dL或以下，優(yōu)選6mg/dL或以下。在一個優(yōu)選的實施方案中，接受本發(fā)明組合物處理的受試者在總治療時間的至少70%、至少80%或至少90%中，其PUA為6mg/dL或以下。例如，對于24周的治療時間，受試者優(yōu)選在24周治療時間的至少80%中，即在至少等于134.4天(24周x7天/周x0.8=134.4天)的時間中，其PUA為6mg/dL或以下。在具體的實施方案中，每2-4周給予一次0.5-24mg的尿酸酶溶液。尿酸酶可用本領(lǐng)域技術(shù)人員^^知的任何適當(dāng)方式給予，例如靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)或皮下給予。優(yōu)選地，當(dāng)進(jìn)行靜脈內(nèi)給予時，給予0.5mg-12mg的尿酸酶。優(yōu)選地，當(dāng)進(jìn)行皮下給予時，給予4mg-24mg的尿酸酶。在一個優(yōu)選的實施方案中，尿酸酶通過靜脈輸注在30-240分鐘時間內(nèi)給予。在一個實施方案中，每兩周給予一次8mg尿酸酶。在具體的實施方案中，輸注可用100-500mL的鹽水溶液來進(jìn)行。在一個優(yōu)選的實施方案中，每2周一次或每4周一次在120分鐘時間里給予8mg的尿酸酶溶液；優(yōu)選該尿酸酶溶于250mL鹽水溶液中進(jìn)行輸注。在具體的實施方案中，尿酸酶給予在3個月、6個月、8個月或12個月的治療時間里進(jìn)行。在其它實施方案中，治療時間是12周、24周、36周或48周。在一個具體的實施方案中，治療時間是長時間治療，例如2年或更長時間，直至受治療的受試者的一生。另外，可采用穿插不治療時間的多個治療周期，例如6個月的治療后是3個月的不治療，接著又是6個月的治療，等等。在某些實施方案中，可將抗炎化合物進(jìn)行預(yù)防性給予，以消除或減少因給予尿酸酶引起的輸注反應(yīng)的出現(xiàn)。在一個實施方案中，如此給予至少一種皮質(zhì)類固醇、至少一種抗組胺劑、至少一種NSAID或它們的組合?？捎玫钠べ|(zhì)類固醇包括倍他米松、布地奈德、可的松、地塞米松、氬化可的松、曱基潑尼松龍、潑尼松龍、潑尼松和曲安西龍?？捎玫腘SAID包括布洛芬、吲咮美辛、萘普生、阿司匹林、乙酰氨基酚、塞來考昔和伐地考昔?？捎玫目菇M胺劑包括阿扎他定、溴苯那敏、西替力嗪、氯苯那敏、氯馬斯汀、賽庚啶、地氯雷他定、右氯苯那敏、茶苯海明、苯海拉明、多西拉敏、非索非那定、羥溱、氯雷他定和苯茚胺。在一個優(yōu)選的實施方案中，抗組胺劑是非索非那定，NSAID是對乙酰氨基酚，皮質(zhì)類固醇是氬化可的松和/或潑尼松。優(yōu)選地，在輸注尿酸酶溶液前給予所有三類的組合(不一定伴隨在一起)。在一個優(yōu)選的實施方案中，在尿酸酶輸注前1-4小時口服給予NSAID和抗組胺劑。非索非那定的合適劑量包括約30至約180mg、約40至約150mg、約50至約120mg、約60至約90mg、約60mg,優(yōu)選60mg。對乙酰氨基酚的合適劑量包括約500至約1500mg、約700至約1200mg、約800至約1100mg、約1000mg，優(yōu)選1000mg。氫化可的松的合適劑量包括約100至約500mg、約150至約300mg、約200mg,優(yōu)選200mg。在一個實施方案中，抗組胺劑不是苯海拉明。在另一個實施方案中，NSAID不是對乙酰氨基酚。在一個優(yōu)選的實施方案中，在尿酸酶輸注前一天晚上口服給予60mg非索非那定；在第二天早上口服給予60mg非索非那定和1000mg對乙酰氨基酚，最后，在就要輸注尿酸酶溶液前給予200mg氫化可的松。在一個實施方案中，在給予尿酸酶前一天、優(yōu)選在晚上給予潑尼松。潑尼松的適當(dāng)劑量包括5-50mg，優(yōu)選20mg。在某些實施方案中，將這些用于消除或減少輸注反應(yīng)出現(xiàn)的預(yù)防性治療應(yīng)用于接受或?qū)⒁邮苣蛩崦?包括PEG化尿酸酶和非PEG化尿酸酶)的受試者。在具體的實施方案中，將這些預(yù)防性治療應(yīng)用于接受或?qū)⒁邮芙邮苣蛩崦钢獾闹委熜噪牡氖茉囌?，其中所述其它治療性肽是PEG化的或非PEG化的。在本發(fā)明的一個實施方案中，藥物組合物包含已與聚合物綴合的尿酸酶，該修飾的尿酸酶保持尿酸分解活性。在一個優(yōu)選實施方案中，尿酸酶為PEG化的尿酸酶。在本發(fā)明的一個實施方案中，藥物組合物包含已通過與聚合物綴合進(jìn)行修飾的尿酸酶，該修飾的尿酸酶保持尿酸分解活性。在一個具體的實施方案中，聚合物-尿酸酶綴合物按國際專利出版物WO01/59078和美國專利申請第09/501730號(它們通過引用整體結(jié)合到本文中)的描述進(jìn)行制備。在本發(fā)明的一個實施方案中，聚合物選自聚乙二醇、葡聚糖、聚丙二醇、鞋丙基曱基纖維素、羧曱基纖維素、聚乙烯吡咯烷酮和聚乙烯醇。在一個優(yōu)選實施方案中，聚合物是聚乙二醇，尿酸酶是PEG化尿酸酶。在本發(fā)明的實施方案中，該組合物在每個尿酸酶亞單位上包含2-12個聚合物分子，優(yōu)選每個尿酸酶亞單位3-10個聚合物分子。在本發(fā)明的一個實施方案中，每個聚合物分子的分子量在約1kD至約層kD之間。在本發(fā)明的另一個實施方案中，每個聚合物分子的分子量在約1kD至約50kD之間。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，每個聚合物分子的分子量在約5kD至約20kD之間、約8kD至約15kD之間、約10kD至約12kD之間，優(yōu)選約10kD。在一個優(yōu)選的實施方案中，每個聚合物分子的分子量為約5kD或約20kD。在本發(fā)明一個特別優(yōu)選的實施方案中，每個聚合物分子的分子量為10kD。在本發(fā)明的一個實施方案中，該組合物適合于反復(fù)給予。本發(fā)明提供用尿酸酶代謝尿酸的方法。本發(fā)明提供尿酸酶的組合物用于減少生物流體中的尿酸水平的用途。在本發(fā)明的一個實施方案中，將尿酸酶的組合物用于減少包括血液的生物流體中的尿酸水平。本發(fā)明還提供編碼本發(fā)明尿酸酶的新型核酸分子。導(dǎo)致這些核酸分子產(chǎn)生的操作是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。例如，尿酸酶核酸序列可通過任何本領(lǐng)域/^知的多種策略進(jìn)行修飾(Maniatis,T.,1990,MolecularCloning,ALaboratoryManual,2ded.,ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarbor,N.Y.)。該序列可在體外用限制性內(nèi)切核酸酶在適當(dāng)位點進(jìn)行切割，然后如有需要進(jìn)一步進(jìn)行酶促修飾，分離，連接。在產(chǎn)生編碼尿酸酶的基因時，應(yīng)注意確保修飾的基因保持在適當(dāng)?shù)姆g閱讀框當(dāng)中，不被翻譯終止信號所間斷?？蓪⒕幋a尿酸酶蛋白的核苷酸序列插入到適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)栽體，即含有插入的蛋白質(zhì)編碼序列的轉(zhuǎn)錄和翻譯必需元件的載體?？衫酶鞣N宿主-載體系統(tǒng)來表達(dá)蛋白質(zhì)編碼序列。這些系統(tǒng)包括但不限于用病毒(例如疸苗病毒、腺病毒等)轉(zhuǎn)染的哺乳動物細(xì)胞系統(tǒng)；用病毒(例如桿狀病毒)轉(zhuǎn)染的昆蟲細(xì)胞系統(tǒng)；微生物如含酵母載體的酵母或用嗟菌體DNA、質(zhì)粒DNA或黏粒DNA轉(zhuǎn)化的細(xì)菌。這些載體的表達(dá)元件其強度和特異性各不相同。取決于所采用的宿主-載體系統(tǒng)，可使用多種合適的轉(zhuǎn)錄和翻譯元件中的任何一種。可使用任何公知用以將DNA片斷插入到載體中的方法，來構(gòu)建含有由適當(dāng)轉(zhuǎn)錄/翻譯控制信號和蛋白質(zhì)編碼序列組成的嵌合基因的表達(dá)載體。這些方法可包括體外重組DNA和合成技術(shù)以及體內(nèi)重組(遺傳重組)。編碼尿酸酶蛋白的核酸序列的表達(dá)可通過第二種核酸序列來調(diào)節(jié)，使得尿酸酶蛋白在用重組DNA分子轉(zhuǎn)化的宿主中得到表達(dá)。例如，尿酸酶的表達(dá)可通過本領(lǐng)域公知的任何啟動子/增強子元件來控制?？捎脕砜刂颇蛩崦副磉_(dá)的啟動子包括但不限于SV40早期啟動子區(qū)域(Beraoist和Chambon,1981,Nature290:304-310)、Rous肉瘤病毒的3'長末端重復(fù)序列中所含的啟動子(Yamamoto等，1980,Cell22:787-797)、皰滲胸普激酶啟動子(Wagner等，1981,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.78:144-1445)、金屬硫蛋白(metallothionine)基因的調(diào)節(jié)序列(Brinster等，1982,Nature296:39-42);原核生物表達(dá)載體如(3-內(nèi)酰胺酶啟動子(Villa-Kamaroff等，1978,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.75:3727-3731)、tac啟動子(DeBoer等，1983,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.80:21-25)和osmB啟動子。在具體的實施方案中，核酸包含有效連接到異源啟動子的尿酸酶編碼核酸序列。一旦制備和分離出包含尿酸酶編碼核酸序列的特定重組DNA分子，可用本領(lǐng)域公知的幾種方法來使它增殖。一旦確立了合適的宿主系統(tǒng)和生長條件，可大量增殖和制備重組表達(dá)載體。如前文所說明，可使用的表達(dá)載體包括但不限于以下載體或其衍生物人或動物病毒如痘苗病毒或腺病毒；昆蟲病毒如桿狀病毒；酵母載體；噬菌體載體(例如X噬菌體)、質(zhì)粒和黏粒DNA載體，在此僅舉幾例。另外，可選擇宿主細(xì)胞林，其調(diào)節(jié)插入序列的表達(dá)，或者以所需的特定方式修飾或加工基因產(chǎn)物。在某些誘導(dǎo)物的存在下可提高來自某些啟動子的表達(dá)；由此，遺傳工程改造的尿酸酶蛋白的表達(dá)可得以控制。此外，不同的宿主細(xì)胞對蛋白質(zhì)翻譯以及翻譯后加工和修飾(例如糖基化、切割)具有特征性和特異性的機制?？蛇x擇適當(dāng)?shù)募?xì)胞系或宿主系統(tǒng)來確保所需的對所表達(dá)異種蛋白的修飾和加工。不同的載體/宿主表達(dá)系統(tǒng)可實現(xiàn)不同程度的加工反應(yīng)如蛋白水解切割。在本發(fā)明的具體實施方案中，尿酸酶在大腸桿菌中的表達(dá)優(yōu)選用包含osmB啟動子的栽體來進(jìn)行。實施例實施例l.用于尿酸酶表達(dá)的基因和表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建將重組豬尿酸酶(尿酸氧化酶)、豬-KS-AN(氨基末端截短的豬尿酸酶蛋白，氨基酸291和301分別用賴氨酸和絲氨酸置換)在大腸桿菌K-12林W3110F-中表達(dá)。構(gòu)建終止于pOUR-P-AN-ks-1的一系列質(zhì)粒，它們在大腸桿菌宿主細(xì)胞的轉(zhuǎn)化時能夠指導(dǎo)尿酸酶的有效表達(dá)。從豬和狒狒肝臟分離和亞克隆尿酸酶cDNA通過相關(guān)RNA的分離和亞克隆從豬和狒狒肝臟制備尿酸酶cDNA。從豬和狒狒肝臟提取總細(xì)胞RNA(Erlich,H.A.(1989).PCRTechnology;PrinciplesandApplicationforDNAAmplification;Sambrook,丄等(1989).MolecularCloning:ALaboratoryManual,2ndedition;Ausubel,F.M.等(1998).CurrentprotocolsinmolecularBiology),然后用首鏈cDNA合成試劑盒(PharmaciaBiotech)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。用TaqDNA聚合酶(GibcoBRL,LifeTechnologies)進(jìn)行PCR擴增。用于豬和狒狒尿酸氧化酶(尿酸酶)的PCR擴增的合成寡核苷酸引物在表l中顯示。表1.尿酸酶cDNA的PCR擴增用引物豬肝臟尿酸^~正義5'gcgcgaattccATGGCTCATTACCGTAATGACTACA3'(SEQIDNO.1)反義5'gcgctctagaagcttccatggTCACAGCCTTGAAGTCAGC3'(SEQIDNO.2)狒狒(D3H)肝臟尿酸酶正義5'gcgcgaattccATGGCCCACTACCATAACAACTAT3'(SEQIDNO.3)反義5'gcgcccatggtctagaTCACAGTCTTGAAGACAACTTCCT3'(SEQIDNO.4)在各引物的末端引入的、在表1中用小寫字母顯示的限制性內(nèi)切核酸酶序列為正義EcoRI和NcoI(豬和狒狒)及反義Ncol、Hindlll和XbaI(豬)、XbaI和NcoI(狒狒)。在狒狒正義引物中，存在于狒狒尿酸酶中的第三密碼子GAC(天冬氨酸)被CAC(組氨酸)置換，CAC密碼子存在于人尿酸氧化酶假基因的編碼序列中的這個位置。用這些引物產(chǎn)生的重組狒狒尿酸酶構(gòu)建物命名為D3H狒狒尿酸酶。將豬尿酸酶PCR產(chǎn)物用EcoRI和HindIII消化并克隆到pUC18中，產(chǎn)生pUC18-豬尿酸酶。將D3H狒狒尿酸酶PCR產(chǎn)物用TACloning(Invitrogen,Carlsbad,CA)直接克隆到pCRTMII載體中，產(chǎn)生pCRTMII-D3H狒狒尿酸。用連接的cDNA轉(zhuǎn)化大腸桿菌XLl-Blue株(Stratagene，LaJolla,CA)。制備含有克隆的尿酸酶cDNA的質(zhì)粒DNA,選擇并分離出具有公開的尿酸酶DNA編碼序列(除表1所示的狒狒尿酸酶中的D3H置換外)的克隆。在所選出的pCRTMII-D3H狒狒尿酸酶克隆中，pCRTMI1序列鄰接尿酸酶終止密碼子，這由PCR引入的序列缺失所致。因此，3'非翻譯區(qū)的Xbal和Ncol限制位點被消除，從而使得可以用PCR產(chǎn)物5'末端的Ncol和衍自pCRII載體的BamHI進(jìn)行定向克隆。尿酸酶cDNA向pET表達(dá)栽體中的亞克隆狒狒尿酸酶亞克隆將含有全長尿酸酶編碼序列的D3H狒狒cDNA引入到pET-3d表達(dá)載體(Novagen,Madison,WI)中。用Ncol和BamHI消化pCRTMII-D3H狒狒尿酸酶，分離960bp片斷。用Ncol和BamHI消化表達(dá)質(zhì)粒pET-3d，分離4600bp片斷。將兩個片斷連接，產(chǎn)生pET-3d-D3H-狒狒。豬-狒狒嵌合尿酸酶亞克隆構(gòu)建豬-狒狒嵌合(PBC)尿酸酶，以獲得重組基因的更高表達(dá)、穩(wěn)定性和活性。這樣構(gòu)建PBC:從pET-3d-D3H-狒狒克隆分離出4936bpNcol-Apal片斷，將分離的片斷與從pUC18-豬尿酸酶分離的624bpNcol-Apal片斷連接，導(dǎo)致pET-3d-PBC的形成。PBC尿酸酶cDNA由豬尿酸酶密碼子1-225和框內(nèi)連接的狒狒尿酸酶密碼子226-304組成。豬-KS尿酸酶亞克隆構(gòu)建豬-KS尿酸酶，以加入一個賴氨酸殘基，該殘基可提供另外的PEG化位點。KS指豬尿酸酶291位處賴氨酸置換精氨酸(R291K)的氨基酸插入。另外，301位的蘇氨酸被絲氨酸置換(T301S)。如下構(gòu)建豬KS尿酸酶質(zhì)粒分離pET-3d-D3H-狒狒的4696bpNcol-Ndel片斷，然后將其與從pU18C-豬尿酸酶分離的864bpNcol-Ndel片斷連接，導(dǎo)致pET-3d-豬KS的形成。所得的豬KS尿酸酶序列由豬尿酸酶密碼子1-288和框內(nèi)連接的狒狒尿酸酶密碼子289-304組成。在osmB啟動子調(diào)節(jié)下的尿酸酶序列的亞克隆將尿酸酶基因亞克隆到含有osmB啟動子的表達(dá)載體中(按照美國專利第5，795,776號的教導(dǎo)，該專利通過引用整體結(jié)合到本文中)。這個載體能夠響應(yīng)高滲透壓或培養(yǎng)物衰老而誘導(dǎo)蛋白質(zhì)表達(dá)。表達(dá)質(zhì)粒pMFOA-18含有osmB啟動子、核糖體結(jié)合位點序列(rbs)和轉(zhuǎn)錄終止子序列(ter)。它賦予氨千青霉素抗性(AmpR)和表達(dá)重組人乙酰膽堿酯酶(AChE)。D3H-狒狒尿酸酶的亞克隆用Ncol和BamHI消化質(zhì)粒pMFOA-18,分離大片斷。用Ncol和Bamffl消化構(gòu)建物pET-3d-D3H-狒狒，分離包括D3H狒狒尿酸酶基因的960bp片斷。將這兩個片斷連接，產(chǎn)生pMFOU18。表達(dá)質(zhì)粒pMFXT133含有osmB啟動子、rbs(大腸桿菌deo操縱子)、ter(大腸桿菌TrypA)、重組因子Xa抑制劑多肽(FxaI),其賦予四環(huán)素抗性基因(TetR)。將狒狒尿酸酶基因插入到這個質(zhì)粒中，以交換抗生素抗性基因。用Ncol消化質(zhì)粒pMFOU18,補平，然后用Xhol消化，分離1030bp片斷。用Ndel消化質(zhì)粒pMFXT133,補平，然后用Xhol消化，分離大片斷。將兩個片斷連接，產(chǎn)生狒狒尿酸酶表達(dá)載體pURBA16。豬狒狒嵌合尿酸酶的亞克隆用Apal和AlwNI消化質(zhì)粒pURBA16,分離2320bp片斷。用Ndel消化質(zhì)粒pMFXT133，補平，然后用AlwNI消化，分離620bp片斷。用Xbal消化構(gòu)建物pET-3d-PBC,補平，然后用Apal消化，分離710bp片斷。將三個片斷連接產(chǎn)生pUR-PB,這個質(zhì)粒在osmB啟動子和rbs以及T7rbs(衍自pET-3d載體)的控制下表達(dá)PBC尿酸酶。T7rbs在另外的步驟中切除。用Ncol消化pUR-PB，補平，然后用AlwNI消化，分離3000bp片斷。用Ndel消化質(zhì)粒pMFXT133,補平，然后用AlwNI消化，分離620bp片斷。將兩個片斷連接形成pDUR-PB，它在osmB啟動子的控制下表達(dá)PBC。pOUR-PB-ANC的構(gòu)建向尿酸酶cDNA中引入幾個變化，這些變化導(dǎo)致重組酶穩(wěn)定性的大大提高。構(gòu)建質(zhì)粒pOUR-PBC-ANC,其中去除N末端六殘基成熟肽(maturationpeptide)和在體內(nèi)起到過氧化物酶體耙向信號作用的C末端三肽。這通過采用質(zhì)粒pDUR-PB中的PBC序列和表2所列的特異性寡核苷酸引物用PCR擴增進(jìn)行。表2，用于PCR擴增PBC-ANC尿酸酶的引物PBC-ANC尿酸酶:正義5'gcgcatATGACTTACAAAAAGAATGATGAGGTAGAG3'(SEQIDNO.5)反義5'ccgtctagaTTAAGACAACTTCCTCTTGACTGTACCAGTAATTTTTCCGTATGG3'(SEQIDNO.6)在表2中，在引物末端引入的限制性內(nèi)切核酸酶序列用粗體顯示，非編碼區(qū)用小寫字母顯示。Ndel為正義，Xbal為反義。反義引物還通過引入不會影響氨基酸序列的點突變(下劃線處)用來去除內(nèi)部Ndel限制位點，從而促進(jìn)用Ndel進(jìn)4亍的亞克隆。pDUR-PB的PCR擴增所產(chǎn)生的900堿基對片斷用Ndel和Xbal切割，分離。然后將所獲得的片斷插入到deo表達(dá)質(zhì)粒pDBAST-RAT-N中，該質(zhì)粒含有衍自大腸桿菌的deo-PlP2啟動子和rbs,負(fù)g組成型表達(dá)人重組胰島素前體。用NdeI和XbaI消化該質(zhì)粒，分離4035bp片斷，連接到PBC-尿酸酶PCR產(chǎn)物。用所得的構(gòu)建物pDUR-PB-△NC轉(zhuǎn)化大腸桿菌K-12S())733(F-cytRstrA),該菌表達(dá)高水平的活性截短尿酸酶。雙重截短的PBC-ANC序列也在osmB啟動子控制下表達(dá)。用AlwNI-NdeI消化質(zhì)粒pDUR-PB-ANC,分離3459bp片斷。用Ndel-AlwNI消化上述質(zhì)粒pMFXT133，分離660bp片斷。然后將各片斷連接產(chǎn)生pOUR-PB-ANC,將其引入到大腸桿菌K-12抹W3110F,表達(dá)高水平的活性截短尿酸酶。尿酸酶表達(dá)質(zhì)粒pOUR-P-AN-ks-l的構(gòu)建構(gòu)建這個質(zhì)粒，以改進(jìn)重組酶的活性和穩(wěn)定性。豬-KS-AN尿酸酶只在N末端截短(AN),此處去除六殘基N末端成熟肽，它還含有突變S46T、R291K和T301S。由于PCR擴增和克隆過程中出現(xiàn)的保守突變，在46位處是蘇氨酸殘基而不是絲氨酸。在291位，賴氨酸置換精氨酸，在301位，插入了絲氨酸置換蘇氨酸。兩者均衍自狒狒尿酸酶序列。R291K和T301S修飾表示為KS，討論如上。額外的賴氨酸殘基提供另外的潛在PEG化位點。為構(gòu)建pOUR-P-AN-ks-l(圖1)，用Apal-Xbal消化質(zhì)粒pOUR-PB-認(rèn)C，分離3873bp片斷。用Apal-Spel消化質(zhì)粒pET-3d-PKS(構(gòu)造在圖4中顯示)，分離270bp片斷。Spel切割留下5'CTAG突出端，將其有效地連接到Xbal所產(chǎn)生的DNA片斷。將兩個片斷連接，產(chǎn)生pOUR-P-AN-ks-l。連接后，Spel和Xbal識別位點丟失(它們的位點在圖9中用括號顯示)。將構(gòu)建物pOUR-P-AN-ks-l引入到大腸桿菌K-12林W3110F-(原養(yǎng)型，ATCC存27325)中。在osmB啟動子控制下表達(dá)的豬-KS-AN尿酸酶產(chǎn)生出具有優(yōu)越活性和穩(wěn)定性的高水平重組酶。圖1說明質(zhì)粒pOUR-P-AN-ks-l的結(jié)構(gòu)。限制位點旁的數(shù)字表示核苷酸位置，該位置相對于指定為1的HaeII位點而言；在克隆過程中丟失的限制位點在括號中標(biāo)出。編碼豬-KS-AN尿酸酶的質(zhì)粒pOUR-P-AN-ks-l有4143堿基對(bp)長，由以下元件組成1.113bp長的DNA片斷，其從核苷酸號碼1延伸到Ndel位點(l13位)，包括osmB啟動子和核糖體結(jié)合位點(rbs)。2.932bp長的DNA片斷，其從Ndel位點(113位)延伸到Spel/Xbal連接處(1045位)，包括900bp的豬-KS-AN(氨基末端截短的豬尿酸酶蛋白的核酸序列，其中氨基酸291和301分別被賴氨酸和絲氨酸置換)編碼區(qū)和衍自pCRII的32bp側(cè)翼序列，自Spel/Xbal限制位點上游的TA克隆位點。3.從Spel/Xbal連接處(1045位)到HindIII(1070位)的25bp多克隆位點序列(MCS)。4.含有TrpA轉(zhuǎn)錄終止子(ter)的合成40bp寡核苷酸，其具有HindIII(1070位)和AatII(1110位)末端。5.1519bp長的DNA片斷，其從AatII(1110位)延伸到包括四環(huán)素抗性基因(TetR)的pBR322上的Mscl/Scal(2629位)位點。、6.1514bp長的DNA片斷，其從Seal(2629位)延伸到包括DNA復(fù)制原點的pBR322上的HaeII(4143位)位點。圖2顯示豬-KS-AN尿酸酶的DNA和推導(dǎo)氨基酸序列。在這個圖中，氨基酸編號按照完全豬尿酸酶序列進(jìn)行。在起始密碼子曱硫氨酸殘基之后，插入蘇氨酸置換豬尿酸酶序列中的天冬氨酸。這個蘇氨酸殘基使得曱硫氨酸能被細(xì)菌氨基肽酶除去。氨基酸序列中的缺口說明缺失的N末端成熟肽。指出了用于不同尿酸酶序列亞克隆的各個步驟的限制位點(ApaI、Ndel、BamHI、EcoRI和Spel)。小寫字母顯示的3'非翻譯序列衍自pCRTMII序列。翻譯終止密碼子由星號表示。圖3顯示各種重組尿酸酶序列的氨基酸序列的比對。上面一行代表豬尿酸酶，其包括全長氨基酸序列。第二行是雙重截短的豬-狒狒嵌合尿酸酶(PBC-ANC)的序列。笫三行顯示豬-KS-AN尿酸酶的序列，該酶只在N末端截短，且含有突變S46T和氨基酸變化R291K和T301S，這兩個變化都反映尿酸酶編碼序列的羧基末端的狒狒起源。星號表示與公開的豬尿酸酶序列相比豬-KS-AN中氨基酸有差異的位置；圓圈表示與豬-狒狒嵌合體PBC-AN相比豬-KS-AN中氨基酸有差異的位置；虛線表示氨基酸的缺失。構(gòu)建了具有Y97H突變的天然狒狒、豬和兔尿酸酶以及豬/狒狒嵌合體(PBC)的cDNA,用以克隆到大腸桿菌中。構(gòu)建并選擇表達(dá)高水平尿酸酶變體的克隆，使得所有克隆均為W3110F大腸桿菌，且表達(dá)受osmB調(diào)節(jié)。分離質(zhì)粒DNA,通過DNA測序和限制性內(nèi)切核酸酶分析進(jìn)行驗證，培養(yǎng)細(xì)胞。截短的尿酸酶(包括豬-AN和豬-KS-AN)的構(gòu)建如下進(jìn)行PBC-△NC和豬-KS之間交叉連接，然后分別用限制性內(nèi)切核酸酶Apal和Xbal以及Apal加Spel切割。合理的是這些截短突變體會保持活性，因為N末端六個殘基"成熟肽，，(l-2)和C末端三肽"過氧化物酶體把向信號，，(3-5)不具有顯著影響酶活性的功能，有可能這些序列可具有免疫原性。選擇出表達(dá)高水平尿酸酶變體的克隆。實施例2.表達(dá)質(zhì)粒向細(xì)菌宿主細(xì)胞中的轉(zhuǎn)化將表達(dá)質(zhì)粒pOUR-P-AN-ks-l引入到大腸桿菌K-12抹W3110F-中。制備轉(zhuǎn)化用細(xì)菌細(xì)胞，包括在Luria肉湯(LB)中使細(xì)胞生長至對數(shù)中期，然后離心收獲細(xì)胞，在冷水中洗滌，懸浮于10%甘油水溶液中，濃度為約3x101Q個細(xì)胞/ml。將細(xì)胞分等份保存于-70。C。在乙醇中沉淀出質(zhì)粒DNA,溶于水中。將細(xì)菌細(xì)胞和質(zhì)粒DNA混合，用BIO-RAD的GenePulserII通過高壓電穿孔進(jìn)行轉(zhuǎn)化(Trevorsetal(1992).ElectrotransformationofbacteriabyplasmidDNA,GuidetoElectroporationandElectrofusion(D.C.Chang,B.M.Chassy,J.A.Saunders和A.E.Sowers編)中，笫265-290頁，AcademicPressInc.,SanDiego;Hanahan等(1991)Meth.Enzymol.,204,63-113)。將轉(zhuǎn)化的細(xì)胞懸浮在SOC培養(yǎng)基(2%胰蛋白胨、0.5%酵母膏、10mMNaCl、2.5mMKCl、10mMMgCl2、10mMMgS04、20mM葡萄糖)中，37。C下溫育l小時，用四環(huán)素抗性進(jìn)行選擇。選出高表達(dá)克隆。實施例3.重組尿酸酶制品將細(xì)菌例如轉(zhuǎn)化的細(xì)菌(見上)在含葡萄糖培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)；pH維持在7.2士0.2，溫度大約37。C。接近培養(yǎng)的最后5-6小時時，培養(yǎng)基補加KC1至最終濃度為0.3M。繼續(xù)進(jìn)行培養(yǎng)，以讓尿酸酶積累。重組尿酸酶在細(xì)菌細(xì)胞當(dāng)中積累為類似于內(nèi)含體(IB)的不溶性沉淀。離心洗滌細(xì)胞懸浮物，懸浮于50mMTris緩沖液(pH8.0)和10mMEDTA中，使最終體積達(dá)干細(xì)胞重量的大約40倍。用溶菌酶和高壓裂解細(xì)菌細(xì)胞后，離心分離含重組尿酸酶的內(nèi)含體(IB)。溶菌酶(2000-3000單位/ml)處理在pH8.0和7士3。C下攪拌進(jìn)行16-20小時。用水洗滌粒狀沉淀，-20。C下保藏備用。富集的IB懸浮于50mMNaHC03緩沖液(pH10.3土0.1)后作進(jìn)一步的加工。將懸浮液在室溫下溫育過夜，以讓IB衍生的尿酸酶溶解，f^進(jìn)行離心澄清。尿酸酶通過幾個色譜步驟作進(jìn)一步的純化。首先，在Q-SepharoseFF柱上進(jìn)行色鐠。用含150mMNaCl的碳酸氫鹽緩沖液洗滌已加樣的柱，用含250mMNaCl的碳酸氬鹽緩沖液洗脫尿酸酶。然后，用黃噪呤-瓊脂糖樹脂(Sigma)除去尿酸酶制品中的少量雜質(zhì)。用50mM甘氨酸緩沖液(pH10.3±0.1)將Q-SepharoseFF洗脫液稀釋至蛋白質(zhì)濃度為大約0.25mg/ml，加樣。用含100mMNaCl的碳酸氫鹽緩沖液(pH10.3士0.1)洗滌柱，用補充有60jiM黃。票呤的同一緩沖液洗脫尿酸酶。在這個階段，通過Q-Sepharose色譜再純化尿酸酶，以除去聚集體形式。各尿酸酶制品的純度由大小排阻層析測出大于95%。用Superdex200柱檢測出各制品中聚集體形式少于0.5%。表3總結(jié)了來自25L發(fā)酵液的IB的豬-KSAN尿酸酶的純化。表3,豬-KSAN尿酸酶的純化<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>實施例4.重組尿酸酶的特性SDS-PAGE高度純化的尿酸酶變體的SDS-PAGE分析(圖4)顯示了相當(dāng)獨特的模式。樣品在碳酸鹽緩沖液(pH10.3)中4。C下保藏直至幾個月。全長變體豬、豬-KS和PBC顯示有兩種分子量約20和15kD的主要降解產(chǎn)物積累。這個觀察結(jié)果提示，至少有單個切口裂解了尿酸酶亞單位分子。在氨基末端縮短的克隆中以及在兔尿酸酶中檢測到不同的降解模式，但比例較低。兔的氨基末端類似于縮短的克隆的氨基末端。測定了在純化和保藏過程中產(chǎn)生的尿酸酶片斷的氨基末端序列。肽測序用Edman降解方法進(jìn)行主體(bulk)尿酸酶制品的N末端測序。進(jìn)行了10個循環(huán)。與豬-KS-AN相比重組豬尿酸酶(全長克隆)產(chǎn)生了更為豐富的降解片斷。導(dǎo)致降解片斷的推導(dǎo)切割位點如下1)168位處具有以下序列的主要位點-QSG氺FEGFI—2)142位處具有以下序列的次要位點國-IRN;GPPVI—以上序列并不顯出任何已知的蛋白酶解切割。不過，切割可能源于蛋白酶解或一些化學(xué)反應(yīng)。氨基截短的尿酸酶意外地比非氨基截短的尿酸酶更穩(wěn)定。PBC-ANC的穩(wěn)定性還類似于其它AN分子，小于非氨基截短的PBC。功效用uv方法測量尿酸酶的活性。酶促反應(yīng)速度通過測量由尿酸氧化成尿嚢素所致的292nm處吸光度減少來測定。一活力單位定義為25°C下在指定條件下每分鐘氧化一微摩爾尿酸所需的尿酸酶的量。尿酸酶功效以每mg蛋白質(zhì)的活力單位(U/mg)表示。1mM尿酸在292nm處的消光系數(shù)為12.2mM"cm-1。因此，1|umol尿酸/ml反應(yīng)混合物的氧化導(dǎo)致吸光度減少12.2mA292。吸光度隨時間的變化(AA放每分鐘)從曲線的線性部分導(dǎo)出。蛋白質(zhì)濃度用改進(jìn)的Bradford方法(Macart和Gerbaut(1%2)ClinChimActa122:93-101)測定。尿酸酶的比活性(功效)通過將活性(U/ml)除以蛋白質(zhì)濃度(mg/ml)來計算。各種重組尿酸酶的酶活性結(jié)果在表4中總結(jié)。該表中包括市售制品的結(jié)果作為參考值。從這些結(jié)果顯現(xiàn)，尿酸酶蛋白的截短對其酶活性沒有顯著影響。表4.重組和天然尿酸酶的動力學(xué)參數(shù)總結(jié)<table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table>表4注釋(1)蛋白質(zhì)濃度通過278nm處測量的吸光度來測定，對于10mg/ml尿酸酶溶液使用11.3的消光系數(shù)(Mahler，1963)。(2)1單位的尿酸酶活性定義為25°C下每分鐘氧化lpmol尿酸成尿嚢素的酶量。(3)比活性值從Lineweaver-Burk圖導(dǎo)出，底物濃度等于60nM。(4)反應(yīng)混合物由以下儲備溶液的各種組合所組成lOOmM硼酸鈉緩沖液，pH9.2300nM尿酸的50mM硼酸鈉緩沖液溶液，pH9.21mg/mlBSA的50mM硼酸鈉緩沖液溶液，pH9.2(5)K。at通過將Vmax(從各個Lineweaver-Burk圖求出)除以尿酸酶在反應(yīng)混合物中的濃度(以摩爾當(dāng)量表示，基于尿酸酶的四聚體分子量)來計算。實施例5.尿酸酶與m-PEG的綴合(PEG化)用m-PEG-NPC(—曱氧基-聚乙二醇-硝基苯基碳酸酯)綴合豬-KS-AN尿酸酶。確立能導(dǎo)致每尿酸酶亞單位2-12個5、10或20kDPEG鏈的條件。將m-PEG-NPC逐漸加入到蛋白質(zhì)溶液中。PEG加入結(jié)束后，接著將尿酸酶/m-PEG-NPC反應(yīng)混合物在2-8°C下溫育16-18小時，直到最多的未結(jié)合m-PEG鏈綴合到尿酸酶。每個PEG-尿酸酶單體的PEG鏈數(shù)用PEG和尿酸酶標(biāo)準(zhǔn)品通過Superose6大小排阻層析(SEC)進(jìn)行測定。每亞單位的結(jié)合PEG鏈數(shù)由以下方程式確定3.42x注射樣品中PEG的量Og)PEG鏈數(shù)/亞單位=-注射樣品中蛋白質(zhì)的量(lig)PEG-尿酸酶樣品中PEG和蛋白質(zhì)部分的濃度用串聯(lián)排列的紫外(UV)檢測器和折光指數(shù)(RI)檢測器(Kunitam等，1991所開發(fā))通過大小排阻層析(SEC)測定。產(chǎn)生三個校準(zhǔn)曲線蛋白質(zhì)曲線(在220nm處測量吸收)；蛋白質(zhì)曲線(通過RI測量)和PEG曲線(通過RI測量)。然后，用相同的系統(tǒng)分析PEG-尿酸酶樣品。用實驗樣品的所得UV和RI峰面積值計算PEG和蛋白質(zhì)相對于校準(zhǔn)曲線的濃度。3.42的指數(shù)是尿酸酶單體的分子量(34,192道爾頓)與10kDPEG的分子量之間的比。連接的PEG改進(jìn)了尿酸酶在具有生理pH值的溶液中的溶解度。表5指出了各批PEG化豬-KS-AN尿酸酶產(chǎn)物之間的差異。一般來說,所連接的PEG鏈數(shù)和所保留的酶比活性(SA)之間存在反比關(guān)系。表5.PEG化豬-KS-AN尿酸酶綴合物的酶活性<table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table>實施例6.用1000D和100,000DPEG對尿酸酶的PEG化用1000D和100,000Dm-PEG-NPC按實施例5的描述綴合豬-KS-AN尿酸酶。使用能導(dǎo)致每尿酸酶亞單位2-11個PEG鏈的條件。PEG加入結(jié)束后，接著將尿酸酶/m-PEG-NPC反應(yīng)混合物在2-8°C下溫育16-18小時，直到最多的未結(jié)合m-PEG鏈綴合到尿酸酶。每PEG-尿酸酶單體的PEG鏈數(shù)如上所述測定。連接的PEG改進(jìn)了尿酸酶在具有生理pH值的溶液中的溶解度。實施例7.與PEG綴合的豬-KS-AN尿酸酶的藥物動力學(xué)進(jìn)行生物學(xué)實驗，以確定為提供療效所需的PEG化的最佳程度和數(shù)量。在大鼠藥物動力學(xué)研究中，在第1天和第8天靜脈內(nèi)注射給予0.4mg(2U)/kg體重的未修飾尿酸酶，產(chǎn)生約IO分鐘的循環(huán)半壽期。但是，每周一次注射共9次后，用2-llxl0kDPEG-豬-KS-AN尿酸酶進(jìn)行的大鼠清除速度研究表明，清除不取決于PEG鏈數(shù)(在這個范圍內(nèi))，在整個研究期間保持相對恒定(見表6;半壽期約30小時)。周與周的差異在實驗誤差范圍內(nèi)。9次注射10x5kDPEG和10x20kDPEG-尿酸酶綴合物后，也顯現(xiàn)相同的;f莫式。此結(jié)果表明，不管尿酸酶PEG化的程度如何，在這個范圍內(nèi)在大鼠模型中觀察到相似的生物效應(yīng)。表6.PEG化豬-KS-AN尿酸酶制品在大鼠中的半壽期<table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table>表6注釋結(jié)果作為平均值士標(biāo)準(zhǔn)誤差以小時表示。括號中的數(shù)字表示試驗的動物數(shù)量。如表中所示大鼠每周一次接受靜脈內(nèi)注射0.4mg/kg體重的修飾豬-KS-AN尿酸酶。每組一開始包括15只大鼠，以5只為亞組輪流放血。有幾只大鼠在研究過程中因麻醉致死。通過測量注射后5分鐘及6、24和48小時收集的血漿樣品中的尿酸酶活性(比色測定)來測定半壽期。表5描述研究中所用的各批PEG化尿酸酶。用6x5kDPEG-豬-KS-AN尿酸酶在兔中進(jìn)行的生物利用度研究表明，首次注射后，循環(huán)半壽期為98.2±1.8小時(靜脈內(nèi))，肌肉內(nèi)和皮下注射后的生物利用度分別為71%和52%。但是，在第二次肌肉內(nèi)和皮下注射后，在所有兔中檢測出顯著的抗尿酸酶抗體滴度，隨后各次注射后清除加速。用相同的綴合物注射大鼠，導(dǎo)致的半壽期為26土1.6小時(靜脈內(nèi))，肌肉內(nèi)和皮下注射后的生物利用度分別為33%和22%。用9xl0kDPEG-豬-KS-AN尿酸酶在大鼠中進(jìn)行的研究表明，首次注射后的循環(huán)半壽期為42.4小時(靜脈內(nèi))，肌肉內(nèi)和皮下注射后的生物利用度分別為28.9%和14.5%(見圖5和表7)。在第四次注射后，循環(huán)半壽期為32.1士2.4小時，肌肉內(nèi)和皮下注射后的生物利用度分別為26.1%和14.9%。用9x10kDPEG-豬-KS-AN尿酸酶在兔中進(jìn)^f亍的類似藥物動力學(xué)研究表明，在注射此綴合物(每兩周注射一次共4次)后沒有觀察到加速清除。在這些動物中，第一次注射后的循環(huán)半壽期為88.5小時(靜脈內(nèi))，肌肉內(nèi)和皮下注射后的生物利用度分別為98.3%和84.4%(見圖6和表7)。在第四次注射后，循環(huán)半壽期為141.1±15.4小時，肌肉內(nèi)和皮下注射后的生物利用度分別為85%和83%。用9xl0kDPEG-豬-KS-AN進(jìn)行了類似的研究，以評估在小獵犬(每組兩雄兩雌)中的生物利用度。笫一次靜脈內(nèi)注射后記錄到的循環(huán)半壽期為70±11.7小時，肌肉內(nèi)和皮下注射后的生物利用度分別為69.5%和50.4%(見圖7和表7)。用豬進(jìn)行9x10kDPEG-豬-KS-AN制品的研究。每組三只動物用于通過靜脈內(nèi)、皮下和肌肉內(nèi)途徑給予。第一次靜脈內(nèi)注射后記錄到的循環(huán)半壽期為178±24小時，肌肉內(nèi)和皮下注射后的生物利用度分別為71.6%和76.8%(見圖8和表7)。表7.Shd0kDPEG-豬-KS-AN尿酸酶的藥物動力學(xué)研究<table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table>用1251按Bolton&Hunter方法碘化9xl0kDPEG-豬-KS-AN尿酸酶后，進(jìn)行吸收、分布、代謝和排泄(ADME)研究。將標(biāo)記的綴合物注射到7組的每組4只大鼠(2雄2雌)中。在1小時后和每24小時分析放射性的分布，持續(xù)7天(除第5天外)。將每組依次處死，切除不同器官進(jìn)行分析。將第7組保持在代謝籠中，由其收集尿液和糞便。通過測量可獲自TCA沉淀(即結(jié)合的蛋白質(zhì)，歸一化到器官大小)的每個器官(腎、肝、肺和脾)中的總放射性和計數(shù)分?jǐn)?shù)，評估(放射性)材料在動物全部身體內(nèi)的分布。在所切除的器官中，沒有器官的比放射性高于其它器官，因此例如在肝臟或腎臟中未見顯著積累。到第7天為止，有70%的放射性被排泄。實施例8.臨床試驗結(jié)果進(jìn)行了隨機化、非盲、多中心、平行組研究，以評估在對常規(guī)療法無響應(yīng)或不耐受的高尿酸血癥和嚴(yán)重痛風(fēng)人患者中PEG-尿酸酶(Puricase，SavientPharmaceuticals)的尿酸響應(yīng)以及藥物動力學(xué)和安全曲線。疾病的平均持續(xù)時間是14年，.70%的研究群體有一個或多個結(jié)節(jié)瘤。在;W究中，將41名患者(平均年齡58.1歲)隨機至采取以下四種給藥方案之一的12周靜脈內(nèi)PEG-尿酸酶治療每兩周4mg(7名患者)；每兩周8mg(8名患者)；每四周8mg(13名患者)或每四周12mg(13名患者)。在確定的時間間隔測量血漿尿酸酶活性和尿酸水平。藥物動力學(xué)參數(shù)、平均血漿尿酸濃度和血漿尿酸小于或等于6mg/dL的時間百分比從尿酸酶活性和尿酸水平的分析結(jié)果得出。每兩周接受8mg的PEG-尿酸酶的患者其PUA降低最大，92%的治療時間其水平低于6mg/dL(處理前血漿尿酸為9.1mg/dL，與此對比，12周期間的平均血漿尿酸為1.4mg/dL)。在其它PEG-尿酸酶治療劑量組中也觀察到顯著和持續(xù)的較低血漿尿酸水平在每四周8mg的組中86%的治療時間PUA低于6mg/ml(處理前血漿尿酸為9.1mg/dL，與此對比，12周期間的平均血漿尿酸為2.6mg/dL);在每四周12mg的組中84%的治療時間PUA低于6mg/ml(處理前血漿尿酸為8.5mg/dL,與此對比，12周期間的平均血漿尿酸為2.6mg/dL);在每兩周4mg的組中73%的治療時間PUA低于6mg/ml(處理前血漿尿酸為7.6mg/dL，與此對比，12周期間的平均血漿尿酸為4.2mg/dL)。在給予PEG-尿酸酶的笫一個24小時內(nèi)血漿尿酸從基線的最大降低百分比，對于接受4mg/2周的受試者為72%(p=0.0002);對于接受8mg/2周的受試者為94%(p小于0.0001);對于接受8mg/4周的受試者為87%(p小于0.0001);對于接受12mg/4周的受試者為93%(p小于0.0001)。在12周治療周期內(nèi)血漿尿酸從基線的降低百分比，對于接受4mg/2周的受試者為38%(p=0.0002);對于接受8mg/2周的受試者為86%(p小于0.0001);對于接受8mg/4周的受試者為58%(p=0.0003);對于接受12mg/4周的受試者為67%(p小于0.0001)。意外地，一些接受PEG-尿酸酶的受試者經(jīng)歷了輸注相關(guān)的不利事件，即輸注反應(yīng)。這些反應(yīng)在總輸注中出現(xiàn)14%。本文引述的所有參考文獻(xiàn)對于所有目的通過引用整體結(jié)合到本文中，引用的程度如同每個單獨的出版物或?qū)＠驅(qū)＠暾埦唧w地和個別地被指明對于所有目的通過引用整體結(jié)合到本文中。本領(lǐng)域技術(shù)人員知道，可對本發(fā)明作出許多修改和變化而不偏離本發(fā)明的精神和范圍。本文描述的具體實施方案只是通過舉例方式提供，本發(fā)明只受到所附權(quán)利要求的條款以及這些權(quán)利要求享有的等效要求全部范圍的限定。權(quán)利要求1.一種分離的尿酸酶，所述尿酸酶包含SEQIDNO.7的8位至287位的氨基酸序列。2.權(quán)利要求1的尿酸酶，所述尿酸酶包含SEQIDNO.8的氨基酸序列。3.權(quán)利要求1的尿酸酶，所述尿酸酶進(jìn)一步包含氨基末端氨基酸，其中所述氨基末端氨基酸是丙氨酸、甘氨酸、脯氨酸、絲氨酸或蘇氨酸。4.權(quán)利要求1的尿酸酶，所述尿酸酶進(jìn)一步包含氨基末端氨基酸，其中氨基末端氨基酸是曱硫氨酸。5.—種分離的尿酸酶，所述尿酸酶包含SEQIDNO.12的8位至287位的氨基酸序列。6.權(quán)利要求5的尿酸酶，所述尿酸酶包含SEQIDNO.13的氨基酸序列。7.權(quán)利要求5的尿酸酶，所述尿酸酶進(jìn)一步包含氨基末端氨基酸，其中所述氨基末端氨基酸是丙氨酸、甘氨酸、脯氨酸、絲氨酸或蘇氨酸。8.權(quán)利要求5的尿酸酶，所述尿酸酶進(jìn)一步包含氨基末端氨基酸，其中氨基末端氨基酸是曱硫氨酸。9.權(quán)利要求l的尿酸酶，其中所述尿酸酶是PEG化尿酸酶。10.—種分離的核酸，所述核酸包含編碼尿酸酶的核酸序列，所述尿酸酶選自權(quán)利要求1的尿酸酶；權(quán)利要求2的尿酸酶；權(quán)利要求3的尿酸酶；權(quán)利要求5的尿酸酶，權(quán)利要求6的尿酸酶；和權(quán)利要求7的尿酸酶。11.權(quán)利要求10的分離的核酸，其中所述核酸序列有效連接到異源啟動子。12.權(quán)利要求10的核酸，其中所述啟動子是osmB啟動子。13.—種核酸載體，所述核酸載體包含權(quán)利要求11的核酸。14.一種宿主細(xì)胞，所述宿主細(xì)胞包含權(quán)利要求13的載體。15.—種產(chǎn)生尿酸酶的方法，所述方法包括在宿主細(xì)胞表達(dá)所述核酸序列的條件下培養(yǎng)權(quán)利要求14的宿主細(xì)胞的步驟，以及分離所表達(dá)的尿酸酶的步驟。全文摘要本發(fā)明涉及具有尿酸分解活性的遺傳修飾蛋白質(zhì)。更具體的說，本發(fā)明涉及包含截短的尿酸氧化酶的蛋白質(zhì)及其生產(chǎn)方法，包括包含截短的尿酸氧化酶的PEG化蛋白質(zhì)。文檔編號C12N9/72GK101194016SQ200680020689公開日2008年6月4日申請日期2006年4月11日優(yōu)先權(quán)日2005年4月11日發(fā)明者J·哈特曼,S·門德洛維茨申請人:薩文特醫(yī)藥公司