專利名稱：核酸擴增和磁性檢測的制作方法
核酸擴增和磁性檢測
本發(fā)明涉及定量擴增的核酸序列例如擴增的DNA和RNA或參與擴 增過程的試劑的領(lǐng)域，且特別涉及用于定量擴增的核酸序列例如擴增的 DNA和RNA或參與擴增過程的試劑的方法和裝置。本發(fā)明還涉及生物 分子磁性檢測領(lǐng)域，且特別涉及用于生物分子磁性檢測的方法和裝置。
通過使用生物化學(xué)擴增方法可以非常敏感和特異地測定出核酸 (RNA、 DNA)。核酸擴增和隨后的檢測是復(fù)雜的過程，其一般需要多個 處理步驟。為了檢測出生物材料(例如微生物)，這些步驟通常包括(選 擇性)富集、分離/純化和鑒定。在簡化過程和提高分析性能(例如敏感 性、特異性和速度)方面都做了很大的努力。例如，已經(jīng)顯示可以用配 體蛋白通過分子生物學(xué)技術(shù)和免疫測定法的組合敏感地和特異地檢測 RNA/DNA擴增產(chǎn)物。對于信號發(fā)生，其他檢測法都用熒光、化學(xué)發(fā)光或 多種(免疫)傳感器檢測器取代比色法。但是，絕大多數(shù)所開發(fā)出的檢 測法都是相對復(fù)雜的、昂貴的和/或需要(高精的)儀器。
已經(jīng)開發(fā)出了簡化的提取和擴增方法與側(cè)流免疫測定(LFIA)檢測 法的組合，其比凝膠電泳的敏感度高出數(shù)個數(shù)量級，并且在5到15分鐘 內(nèi)得到結(jié)果。原則上講，LFIA適用于多分析物檢測，即在一個檢測設(shè)備 中篩選最多6個特異的RNA/DNA序列?；诤谀z粒和固定于硝基纖維 素膜上的特異性配體的方法使得能夠在迷你陣列裝置中檢測出5到30個 不同的參數(shù)。通過平臺式掃描和圖像分析可以使得結(jié)果數(shù)字化。
定量方面和測量值的動態(tài)范圍是生物化學(xué)擴增中的一個重要問題。 這在指數(shù)式擴增法例如PCR中尤為突出，指數(shù)式擴增法在亞檢測水平的
擴增子濃度和生物化學(xué)擴增法的飽和狀態(tài)之間有著非常陡峭的轉(zhuǎn)換。結(jié) 果常常是是或否的答案，而不是靶濃度的精確數(shù)值。
改良的方法是實時PCR，其中在指數(shù)式生物化學(xué)擴增過程中可以動 態(tài)地測定(例如用分子標(biāo)記)出擴增子的濃度。在定量實時PCR中，利 用專用探針設(shè)計、過程控制和過程監(jiān)測得出定量數(shù)據(jù)。從發(fā)生特定信號 所需的時間中推導(dǎo)出初始靶濃度。定量實時PCR的缺點是(i)復(fù)雜的測 定過程；(ii)每次測試的昂貴的花費水平，和(iii)難以實施多路測定。
在其所廣泛使用的形式中，上述方法(ELISA、 LFIA、實時PCR) 都涉及光學(xué)檢測。光學(xué)檢測有著一些缺點例如
-高的背景信號(例如來自底物或裝置材料、來自樣品材料或來自測 試裝置中的生物學(xué)材料的自發(fā)熒光)，特別是當(dāng)使用復(fù)雜的生物學(xué)樣品 時。
-標(biāo)記物性質(zhì)取決于生物化學(xué)環(huán)境(例如熒光效率)，其會使得測量 值的定量復(fù)雜化。
-盒(cartridge)和讀取器之間的相互聯(lián)系容易發(fā)生錯誤。 -來自裝置和液體樣品的光散射。
-入射光和發(fā)射光/反射光的吸收取決于液體的光學(xué)性能。 -有時需要昂貴的讀取設(shè)備。
存在不同于基于光的檢測的其他檢測方法。例如，正在研究檢測磁 性納米顆粒的磁性傳感器的生物診斷用途，這是因為其有著下面預(yù)期的 優(yōu)點高分析性能(敏感性(生物材料具有非常低的磁性背景，可以得 到非常敏感的傳感器))、速度(歸功于磁性促動)、特異性(歸功于力鑒 別(force discrimination))、組合測定步驟(例如靶向提取和檢測，兩者 都使用磁性顆粒)、以及容易使用(簡單和可靠的電子互聯(lián)、傳感器和讀 取器都是緊湊的和廉價的)。
在聯(lián)合核酸擴增和磁性檢測方面進行了初步嘗試。WO00/61803公開 了核酸擴增和緊接其后的磁性傳感器芯片檢測的組合。該方法包括通過磁力施加嚴(yán)格性。解決方案特別集中于鏈置換擴增法(SDA)。 EP0781346 公開了一種方法，其中磁性檢測法與PCR擴增交替進行。磁性檢測依據(jù) 于磁性標(biāo)記引物和擴增的DNA之間的遷移差異。
針對基于光的檢測的缺陷，需要基于利用磁性傳感器和磁性顆粒的 其他檢測方法的快速的、敏感的、定量的、高動態(tài)范圍的和實時的核酸 檢測方法。這些方法應(yīng)當(dāng)包括盡可能少的步驟，即具有生物化學(xué)過程和 檢測的最大整合。
本發(fā)明涉及用于擴增核酸即RNA或DNA和測定所擴增的RNA或 DNA或參與擴增過程的試劑的量的方法和工具。在這個方法中，通過磁 性檢測實施確定擴增的核酸或參與擴增過程的試劑的量的步驟，并且在 所述RNA或DNA的擴增過程中至少實施1次所述確定步驟。在本發(fā)明 的方法中，通過其中所擴增的核酸或所述試劑通過一或多種生物分子與 傳感器相結(jié)合的方法實施確定所擴增的核酸或參與擴增過程的試劑的量 的步驟。
本發(fā)明的具體實施方式
涉及用于實施所述的這些方法的方法和工 具，其中用于結(jié)合擴增的核酸的一或多種生物分子是DNA、肽核酸(PNA)
或RNA，其與擴增核酸或擴增子特異結(jié)合?；蛘?，生物分子可以是蛋白、 維生素、脂質(zhì)或碳水化合物或者可以是核酸和蛋白的組合，所述蛋白確 保擴增子與傳感器表面結(jié)合。
本發(fā)明的具體實施方式
涉及用于實施這些方法的方法和工具，其中 用等溫法或熱循環(huán)法擴增核酸。
本發(fā)明的另一個具體實施方式
涉及用于實施這些方法的方法和工 具，其中用磁性顆粒標(biāo)記用于擴增的引物(擴增引物)。本發(fā)明的另一個 實施方式涉及用于實施這些方法的方法和工具，其中通過特異性雜交探 針的方式檢測擴增子，所述探針被標(biāo)記(在這個實施方式中，擴增引物 沒有用磁性顆粒標(biāo)記)。 本發(fā)明還提供了用于測定樣品中是否存在核酸例如寡核苷酸或參與 擴增過程的試劑的試劑盒，其中所述試劑盒至少包括 一個具有傳感器 表面的裝置，其中一或多種生物分子與所述傳感器表面相連； 一或多種
寡核苷酸(DNA或RNA)，其中至少一種寡核苷酸與磁性顆粒至少間歇 性偶聯(lián)；和一或多種DNA或RNA聚合酶。試劑盒還任選地包括具有缺 口活性的酶或者可以包括具有核糖核酸酶活性的酶例如RNAseH。
根據(jù)本發(fā)明的試劑盒的一個實施方式，與磁性顆粒偶聯(lián)的核苷酸例 如寡核苷酸是用于擴增的引物，據(jù)此保證能在擴增期間實施擴增子的標(biāo) 記。
根據(jù)本發(fā)明的試劑盒的另一個實施方式，與磁性顆粒偶聯(lián)的一個核 苷酸是雜交探針，其與擴增子特異性雜交，并通過與擴增子的結(jié)合容許 磁性傳感器對其實施檢測。
本發(fā)明的方法和工具容許以改良的分析性能進行多核苷酸測定，例 如改良的速度、敏感性和特異性。本發(fā)明的方法和工具容許以改良的使 用舒適性進行多核苷酸濃度測定，例如更高的穩(wěn)固性、更低的錯誤率、 更簡單的相互聯(lián)系和更低的花費。
在本發(fā)明的一個方面，為了測定出樣品中的核酸濃度，聯(lián)合了磁性 顆粒循環(huán)和核酸擴增，其優(yōu)點是磁性循環(huán)和核酸擴增循環(huán)過程(例如溫 度循環(huán)和試劑循環(huán))的整合及同步。
本發(fā)明的方法可以包括以下步驟任選的核酸提取步驟、任選的確 定起始核酸量的磁性擴增前步驟、核酸擴增步驟和檢測步驟，其中使用 生物分子(例如DNA或RNA)將擴增的核酸與傳感器表面或另一個物 體結(jié)合。
本發(fā)明的方法包括通過結(jié)合其本身與傳感器結(jié)合的生物分子來檢測 擴增的核酸或參與擴增過程的試劑。生物分子與傳感器表面的結(jié)合可以 是共價結(jié)合。
根據(jù)一個實施方式，本方法包括下面的步驟
-用與磁性顆粒和/或傳感器芯片表面相連的引物擴增本體溶液
(bulk solution)中的核酸；
-作為時間的函數(shù)測定磁性傳感器附近的納米顆粒(例如通過生物分 子與傳感器表面相結(jié)合的顆粒)；和
-應(yīng)用磁性顆粒循環(huán)，以便容許高效地發(fā)生第一個本體擴增過程和第 二個表面檢測過程。
更具體地，當(dāng)使用PCR方法時，本發(fā)明的方法的特點是應(yīng)用溫度循 環(huán)和磁力促動，以確保近實時模式地檢測擴增進展。
總之，本發(fā)明提供了組合了核酸擴增和敏感及實時的磁性檢測的方 法。本系統(tǒng)在實時檢測、速度、過程控制、過程監(jiān)測、多路分析、緊湊 性、使用舒適度和低費用等方面都有其優(yōu)勢。


圖1顯示了用于本發(fā)明的實施方式的實時檢測的用于檢測擴增核酸 序列的磁性傳感器的可替代的構(gòu)型。
圖2顯示了根據(jù)本發(fā)明的實施方式用于檢測擴增的核酸序列的具有 擴增和游離引物純化模塊以及隨后的磁性傳感器芯片檢測的兩步構(gòu)型的 磁性傳感器實例。在檢測之后，將擴增的核酸重新引入到擴增模塊中。
圖3顯示了根據(jù)本發(fā)明的實施方式的用于檢測擴增核酸序列的實時 構(gòu)型的磁性傳感器實例，其具有單個的三室模塊，用于擴增、純化和檢 測(在檢測之后，擴增的核酸被重新引入到擴增模塊中)(A)，或具有單 個的一室模塊，用于擴增和檢測(B)。
圖4顯示了根據(jù)本發(fā)明的實施方式的具有反應(yīng)室和磁性納米顆粒的 裝置的示意圖(沒有顯示出入口和出口)。顆粒被促動進行與生物擴增過 程同步的磁性顆粒循環(huán)過程。
圖5顯示了作為時間函數(shù)的傳感器信號的圖。
圖6顯示了根據(jù)本發(fā)明的一個實施方式的示意方法。在傳感器芯片 上面的孵育室中實施PCR擴增。在每個循環(huán)中，都應(yīng)用溫度和磁場促動 的特殊組合，以便測定出擴增過程的近實時狀態(tài)。
擴增引物指的是用作DNA或RNA聚合酶的引物的核苷酸例如DNA 或RNA寡核苷酸。PCR反應(yīng)中的擴增引物一般被稱作正向引物和反向引 物。標(biāo)記擴增引物指的是與磁性微粒、或納米顆粒和/或生物分子共價連 接的擴增引物，所述生物分子的不受限的實例是生物素和熒光素。
擴增子指的是通過擴增過程獲得的核酸。
雜交探針或雜交引物指的是用于檢測擴增的DNA或RNA (即擴增 子)的核苷酸例如DNA或RNA寡核苷酸。在本發(fā)明的特定實施方式中， 雜交探針可以與磁性微?；蚣{米顆粒和/或生物分子共價連接。
傳感器探針或傳感器引物指的是與傳感器表面(即位于磁性檢測系 統(tǒng)近端的裝置部分)直接或間接結(jié)合的、并且能夠結(jié)合擴增子的核苷酸 例如DNA或RNA寡核苷酸。在其中擴增子包括RNA的擴增技術(shù)中， 可以用RNA傳感器探針結(jié)合擴增RNA。傳感器探針與傳感器表面的結(jié) 合可以是共價的?；蛘?，傳感器探針可以通過一或多種與生物分子共價 連接的生物分子(配體、抗體)與傳感器表面相連。
參照具體實施方式
和特定附圖描述本發(fā)明，但本發(fā)明并不受限于此， 其僅受限于權(quán)利要求書的范圍。權(quán)利要求書中的任何附圖標(biāo)號不應(yīng)當(dāng)作 為對本發(fā)明的限制。在此所述的附圖只是舉例說明的，而非限制性的。 在附圖中，為了舉例說明的目的， 一些元件的尺寸可能被夸大。在本說 明書和權(quán)利要求書中所用的術(shù)語"包括"并不排除其他的元件或步驟。 當(dāng)表示單數(shù)名詞使用不定冠詞或定冠詞例如"一 (a或an)"或"該(the)"
時，其包括復(fù)數(shù)名詞，除非另有特別說明。
此外，術(shù)語第一、第二、第三等在說明書和權(quán)利要求書中被用于區(qū) 分相似的元件，并不一定用于描述連續(xù)的或時間的次序。要明白所用的術(shù)語在合適的情況下是可以互換的，且在此所述的本發(fā)明的實施方式能 夠以不同于在此所述或舉例說明的其他次序而進行。
此外，術(shù)語上方、下方、上、下等在說明書和權(quán)利要求書中被用作 描述性目的，并非一定用于描述相對位置。要明白所用的術(shù)語在合適的 情況下是可以互換的，且在此所述的本發(fā)明的實施方式能夠以不同于在 此所述或舉例說明的其他次序的進行。
在一個方面，本發(fā)明涉及方法，其中核酸擴增與利用磁性檢測對擴
增的DNA的定性和定量的測定相互交替，并涉及用于實施這些方法的工 具。
本發(fā)明的方法包括以下步驟
-核酸擴增過程(分步或連續(xù))，
-擴增過程中和/或之后的一或多種檢測步驟，其中用DNA、PNA或 RNA傳感器探針將擴增的核酸結(jié)合于傳感器表面或另一個物體。傳感器 探針和傳感器表面的結(jié)合可以是共價結(jié)合。
任選地，本發(fā)明的方法還包括，在擴增之前
-核酸提取步驟，和/或
-磁性擴增前步驟，以便測定出起始核酸的量。 根據(jù)一個實施方式，通過將探針摻入到擴增子內(nèi)來確保實施對擴增 的核酸或擴增子的檢測。根據(jù)一個實施方式，本發(fā)明的方法包括以下步
驟
-用與磁性納米顆粒或微粒相連的引物擴增本體溶液中的核酸。 -將擴增核酸和與傳感器表面相連的傳感器探針接觸。引物與傳感器 表面的連接可以是共價連接。
-在擴增過程中和/之后至少實施1次對磁性納米顆粒或微粒的檢測
或測定。
任選地，應(yīng)用磁性顆粒循環(huán)，以便容許高效地實施(第一個)大量 擴增過程和(第二個)表面檢測過程。 在本發(fā)明的一個特異實施方式中，應(yīng)用溫度循環(huán)和磁力促動，以便 能夠?qū)嵤U增進程的近實時模式的檢測。
如上所述，本發(fā)明的方法包括例如本體液體中的核酸擴增步驟。本 領(lǐng)域己知的不同的擴增方法都可以被整合到本發(fā)明的方法中。擴增方案
常常被分成靶向類型和探針類型的擴增(Hill， CS. (1996) Journal of Clinical Ligand Assay 19， 43-52.)。
"靶向"擴增利用靶向核酸分子作為模板通過各個核苷酸的合成生成 了所需靶序列的拷貝。實例是聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)、轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)擴增 (TMA)、核酸序列依賴性擴增(NASBA)和鏈置換擴增(SDA) (Saikiet al. (1988) Science 239， 487-491; Compton， J. (1991) Nature 350， 91-92; Walker et al. (1992) Nucl. Acids Res. 20, 1691-1696; McDonough et al. (1997) In: Nucleic acid amplification technologies, Eds. Lee， H., Morse, S. and Olsvik， O., Natick, MA: Biotechniques Books, 113-123.)。這種方法的變體 是非對稱性PCR，其中只擴增了與傳感器探針互補的特異性DNA鏈。在 這個方法中，加入不等量的引物，以指引擴增成為單鏈擴增過程。該方 法的一個變體是Linear-After-The-Exponential (LATE)-PCR (Pierce et al. (2005) PNAS ， 102， 24, 8609-8614)，其中引物對被故意設(shè)計成使用不相同 的濃度。本發(fā)明的特異實施方式涉及利用PCR擴增特異DNA或RNA。 在另一方面，"探針類型"的擴增生成了被放入反應(yīng)的起始探針的修飾版 本。這個方法的實例是連接酶鏈反應(yīng)(LCR) (Laffleretal.(1993)Annales de Biologie Clinique 50， 821-826)。
對于PCR和LCR而言，用熱循環(huán)儀變性雙鏈中間物。其他方案(例 如TMA、 NASBA和SDA)是等溫的， 一般只需要一個恒定溫度的加熱 設(shè)備(例如水浴箱或恒溫箱)。
轉(zhuǎn)錄方法例如TMA與PCR/LCR有著一些不同。TMA可以將RNA 或單鏈DNA直接作為耙點。理論上，這些方法比PCR/LCR更快，它們 能在15分鐘內(nèi)生成十億倍的擴增，而PCR/LCR需要3到4個小時才能
生成相似的量。另一方面，TMA比PCR可能更不特異，因為該過程是在 更低的溫度下實施的。用特異探針補償這種差異。
最近的技術(shù)(EXPAR)使用熱穩(wěn)定缺口酶和聚合酶的組合(VanNess et al. (2003) Proc. Natl. Acad. Sci 100， 4504-4509)。這是等^顯的分子鏈反 應(yīng)，其中生成了短的寡核苷酸。這個方法是高敏感的，并且可以獲得>106 倍擴增。指數(shù)方法的穩(wěn)固性、速度和敏感性在快速檢測樣品中是否存在 少量特異性DNA序列方面都是有用的。
上面的不同的擴增技術(shù)一般都被稱作擴增過程，即從開始擴增樣品 到獲得了所需量的擴增子或者到耗竭了擴增引物和/或參與擴增的酶已經(jīng) 喪失其活性的過程。
對熱循環(huán)擴增過程而言，該過程包括多個分離的擴增步驟。對于等 溫過程而言，擴增是連續(xù)的過程。通過磁性循環(huán)和探針標(biāo)記的顆粒以及 另一種被固定于傳感器表面的探針，擴增材料(例如對于NASBA而言 就是單鏈RNA寡核苷酸)可以與表面結(jié)合，以便使得能夠檢測近實時定 性或定量的數(shù)據(jù)。優(yōu)選地，與擴增材料的序列雜交的探針與擴增引物序 列有所不同。
或者，通過處理溫度或者通過物理地分開模板和擴增引物可以將這 個過程分成擴增步驟。當(dāng)本發(fā)明的方法被稱作兩步法時，其中在所用裝 置的不同的單元、模塊或室內(nèi)實施擴增(和任選的純化)和檢測的方法。 通常在裝置中實施本發(fā)明的兩步法，所述裝置包括其中實施擴增的擴增 模塊和包括傳感器(芯片)表面的孵育室(圖2)。任選地，裝置包括第 三個室，其中純化出游離引物。
根據(jù)本發(fā)明的具體實施方式
，在(第一個)擴增之前，用RNA禾口/ 或DNA提取步驟預(yù)處理樣品。在分子克隆的參考手冊(例如Sambrook et al. 1989)中描述了合適的方案。 一些類型的DNA或RNA提取試劑盒是 可商品化獲得的(Pharmacia, Dynal, Waters)。這些提取方法(通常使用 磁性顆粒)去除了干擾化合物例如多糖和多酚。
也可以使用簡單的提取方法，其中提取出rRNA，所述rRNA在單個 細(xì)胞中有著數(shù)千個拷貝(Kohne et al. 1984) In Thomsberry et al. (Ed): Legionella: Proceedings of the 2nd International Symposium, Washington D.C., American Society for Microbiology, 107-108)。特定預(yù)處理的應(yīng)用取 決于樣品的參數(shù)例如復(fù)雜性和濃度。
在另一個任選的步驟中，最初用磁性顆粒提取出的核酸可以被直接 用于磁性傳感器芯片的檢測，以便測定出擴增前步驟中的原材料的量。
本發(fā)明的方法還包括利用磁性傳感器的檢測步驟。根據(jù)本發(fā)明的特 異實施方式，生物分子被用于將擴增的核酸結(jié)合到傳感器表面。在擴增 過程中(以及也任選地在擴增過程結(jié)束之時)至少實施檢測步驟1次。 在連續(xù)擴增過程中，可以在擴增過程的特定時間點實施檢測。在分步擴 增過程例如PCR中，通常在延伸步驟之后實施檢測步驟。可以在擴增過 程的每個擴增循環(huán)之后實施檢測步驟。在其中需要定量測定的特定實施 方式中，在PCR反應(yīng)的對數(shù)期階段實施檢測步驟，通常是在約15個循 環(huán)到約25個循環(huán)之間。
被用于結(jié)合擴增子和傳感器、或容許被所述傳感器檢測到的分子上 的生物分子可以是蛋白、核酸，也可以是其他的生物學(xué)化合物例如碳水 化合物或維生素(例如生物素)。
根據(jù)本發(fā)明的具體實施方式
，通過傳感器探針的方式將擴增子與傳 感器表面直接地或間接地連接，所述傳感器探針是特異于擴增子的寡核 苷酸。任選地，該傳感器探針與傳感器表面共價連接。
所有類型的在此定義的探針包括傳感器探針或雜交探針也可以與其 他分子例如蛋白或有機分子相連，或者與寡核苷酸直接相連，或者經(jīng)與 磁性顆粒的附著與寡核苷酸間接相連，所述磁性顆粒與寡核苷酸相結(jié)合。 對于某些應(yīng)用預(yù)期了可裂解的連接物(例如可被還原劑裂解的化學(xué)連接 物或者可以被酶裂解的蛋白或DNA片段)。保證本發(fā)明所需的生物分子 之間的結(jié)合的生物學(xué)相互作用是例如DNA/DNA結(jié)合、DNA/RNA結(jié)合、 抗原/抗體結(jié)合、配體-受體結(jié)合、底物-酶結(jié)合、抑制物-酶結(jié)合、親和結(jié)
合(例如生物素-(鏈菌素)抗生物素蛋白、Zinc-His-Tag、 GST-GST結(jié)
合蛋白等)。
根據(jù)一個實施方式，將作為捕獲分子的生物分子固定于傳感器表面 上，例如抗體、特殊的吸引蛋白或聚合物表面等。這些捕獲分子例如通 過與引物相結(jié)合的標(biāo)簽(傳感器探針)特異地結(jié)合擴增子。圖1的項目1 顯示了可以用于本發(fā)明的各種捕獲方案。例如，捕獲分子16例如抗體可 以被結(jié)合于傳感器10的表面上，所述傳感器10包括包埋于基材14中的 磁場發(fā)生器12例如磁條或電磁鐵。捕獲分子16可以與傳感器表面共價 結(jié)合。捕獲分子16至少與磁場發(fā)生器12附近的傳感器表面相結(jié)合?；?材14可以是半導(dǎo)體基材例如"生物芯片"。抗體16直接地或通過與特異 于擴增子的探針相連的標(biāo)簽與擴增步驟生成的擴增子18特異性結(jié)合。磁 性顆粒20通過配體蛋白22或者另一個方式例如直接方式(擴增期間摻 入)或者通過雜交探針與擴增子18相結(jié)合。
在本發(fā)明的另一個實施方式中，傳感器-探針與傳感器表面直接相連， 即傳感器所固定的配體實際上是特異的寡核苷酸序列24，其與位于圖1 項目2所示的磁性顆粒20相連的擴增子18的末端雜交。磁性顆粒20通 過配體蛋白22或者另一個方式例如直接方式(擴增期間摻入)或者通過 雜交探針與擴增子18相結(jié)合。
本發(fā)明所用的磁性顆粒20通常是在2nm到5微米范圍內(nèi)即磁性納米 顆?；蛭⒘?。磁性顆粒20的尺寸不應(yīng)當(dāng)太小，以方便檢測以及使得能夠 用所應(yīng)用的磁場促動顆粒。尺寸也不應(yīng)當(dāng)太大，因為這可能會導(dǎo)致非特 異性結(jié)合和沉積。優(yōu)選地，顆粒尺寸是在10nm和l微米之間的范圍內(nèi)。 顆粒結(jié)構(gòu)和形狀可以是任一合適的結(jié)構(gòu)和形狀例如單磁性核心、多磁性 核心、球形、棒狀等。還可以用(生物)聚合物涂敷磁性顆粒20，以增 強穩(wěn)定性以及提供用于連接如上面所提及的生物分子的功能基團。
本發(fā)明所用的傳感器IO檢測或測定附近是否存在磁性微?；蚣{米顆
粒20，例如在100pm范圍內(nèi)，更優(yōu)選的是在10|im范圍內(nèi)。"根據(jù)一個 具體的實施方式，傳感器對傳感器表面^m范圍內(nèi)的納米顆粒比距離傳 感器表面10pm的納米顆粒敏感10倍以上"。傳感器可以是能檢測出是否 存在磁性顆粒的任一電磁傳感器例如電極、金屬絲、線圈、磁阻傳感器、 磁致伸縮傳感器、Hall傳感器、平面Hall傳感器、SOUID、磁共振傳感 器等。傳感器10優(yōu)選地是磁阻傳感器例如巨磁阻(GMR)傳感器，以便 在磁場低于lkA/m時達(dá)到高的信號噪音比。傳感器可以被任選地整合到 芯片內(nèi)。
優(yōu)選地在傳感器表面上或者在傳感器表面的近端盡可能地整合了多 種功能，例如溫度感受、加熱和磁性檢測。冷卻元件(例如Peltier元件) 可以被整合到盒(cartridge)內(nèi)或者可以是讀取裝置的一部分。當(dāng)需要快 速加熱和冷卻(例如PCR)時，樣品液體和加熱器或冷卻元件的接觸面 積優(yōu)選地是盡可能大的。
通過液體轉(zhuǎn)移磁性顆粒所需的磁場強度和磁場梯度取決于一些參 數(shù)，例如顆粒的磁化率和磁矩、顆粒的均勻性和濃度、顆粒-顆粒相互作 用例如成簇或鏈形成的存在、和介質(zhì)中的流動阻力。通過在讀取器內(nèi)、 盒(cartridge)內(nèi)和芯片中組合磁場產(chǎn)生裝置(電流金屬絲和磁性材料) 可以產(chǎn)生磁場。在我們的系統(tǒng)中，選出這些參數(shù)，使得能夠在測定期間 進行生物室中顆粒的反復(fù)轉(zhuǎn)運。
通過在顆粒和其他元件之間產(chǎn)生力或扭矩可以探測或斷裂磁性顆粒 和另一種元件(例如傳感器表面)之間的生物學(xué)鍵(見例如 WO2005010527)。在反應(yīng)混合物中引入(例如標(biāo)記的引物和探針)并生 成(例如標(biāo)記擴增子)磁性標(biāo)記的生物分子，然后實施加工處理。在具 體實施方式中，通過應(yīng)用磁場斷裂和/或混合該混合物內(nèi)的磁性標(biāo)記的生 物分子。例如，如最近在通過平板線圈檢測顆粒的免疫測定法中所述的那樣(Luxton et al, (2004) Anal. Chem. 76， 1715.)，在生物化學(xué)檢測中使用 磁性顆粒表面/本體循環(huán)(surface/bulk cycling)。
本發(fā)明包括用于磁阻傳感器上的磁性顆粒循環(huán)的附加方法和使得本 體及表面過程更有效的方法，例如使用附加的試劑或WO2005010527所 述的專用促動方法。
與微粒或納米顆粒的生物學(xué)相互作用可以強烈地增加解鏈曲線的陡 峭度并增強檢測的特異性，可能是因為協(xié)同效應(yīng)。
不同的裝置都適用于實施本發(fā)明的方法。裝置可以具有流過式 (flow-over)或流經(jīng)式(flow-through)設(shè)計。例如DE040286 EPP (2004
年11月提交)描述了流經(jīng)式包裝。需要小心地避免死角或不必要的再循 環(huán)，例如具有平滑過渡和避免帶銳角的流體邊緣。在使用洗滌溶液的洗 滌步驟中，室的設(shè)計優(yōu)選地通過縮小傳感器位置上的流體深度來確保傳 感器表面上的高更新率。盒(cartridge)優(yōu)選地是由具有低的非特異的生 物材料結(jié)合力的材料制成的，以便避免因盒(cartridge)壁而丟失靶材料 和/或試劑。
圖2舉例說明了本發(fā)明的一個實施方式，其施用擴增30、純化32和 檢測34單元的連續(xù)排列。擴增過程與傳感器檢測步驟分開。避免了游離
引物和傳感器表面上的特異性配體之間的不需要的相互作用，如果需要， 在由例如硅材料組成的純化模塊32中去除了擴增過程后仍殘留的游離引
物和其他反應(yīng)污染物。根據(jù)特定的實施方式，擴增室中的液體被再循環(huán)， 其中純化模塊被設(shè)計成容許擴增子通過并將所有其他材料(例如游離引 物)保留在擴增室內(nèi)。
圖3A舉例說明了本發(fā)明的一個實施方式，其中使用具有三個室 30-34的單一裝置，用可控的閥門系統(tǒng)分開每個轉(zhuǎn)換，以便容許溶液可控 地和及時地進入到下一個室內(nèi)。三個室30-34和傳感器芯片IO實現(xiàn)了與 圖1所述的構(gòu)建體中的模塊30-34和傳感器芯片10相似的作用。但是液 體在此可以在室30-34之間進行來回轉(zhuǎn)移。
在另一個優(yōu)選的實施方式中，加工處理和檢測裝置是如圖3B所示 的，即在單個裝置36中實施擴增和檢測或測定，優(yōu)選地在傳感器芯片IO 附近的單個室內(nèi)，其容許直接檢測所形成的擴增子。更具體地，裝置包 括熱穩(wěn)定傳感器表面(優(yōu)選地具有與之相連的固定的配體)，以及具有在 如所用擴增方法所需的不同溫度(例如PCR)或恒定溫度(例如NASBA) 下實施擴增方案的能力。另外，裝置適用于容許去除競爭性游離引物(如 果存在)，以便避免發(fā)生非特異性反應(yīng)例如引物-引物復(fù)合物并兼顧到所用 磁性顆粒的特異表征。
如圖4圖解所示，本發(fā)明包括用于磁阻傳感器上的磁性顆粒循環(huán)的 附加方法和使得本體及表面過程更有效的方法，例如使用附加的試劑或 WO2005010527所述的專用促動方法。
對加工處理和檢測裝置的變化被包含于本發(fā)明的范圍之內(nèi)。具體地， 其他可能的裝置幾何學(xué)包括使用用作傳感器表面的高表面積材料。此外， 可以施用側(cè)流和流經(jīng)式結(jié)構(gòu)。
本發(fā)明適用于多種應(yīng)用。非受限的應(yīng)用列表是例如檢測微生物(檢 測食品變質(zhì)和中毒，和農(nóng)業(yè)-食品-環(huán)境領(lǐng)域的檢測編碼毒素的基因；評價 農(nóng)作物和水果(品質(zhì)指示物)的活性基因("基因組"研究中的mRNA)); 檢測GMO (食品安全和鑒定)；評價偽造/欺詐(測定外源DNA);檢測 過敏原性產(chǎn)品/污染；檢測帶來環(huán)境后果的微生物例如MRSA、軍團菌、 李斯特菌；鑒定細(xì)胞培養(yǎng)物中的微生物。臨床診斷中的應(yīng)用是例如檢 測感染、腦膜炎、呼吸道疾病、結(jié)核、肝炎、AIDS等相關(guān)的微生物；鑒 定細(xì)胞培養(yǎng)物中的微生物，例如與上述疾病相關(guān)的微生物。
現(xiàn)在用下面的實施例舉例說明本發(fā)明。
實施例l:禾U用沒有磁性標(biāo)記的擴增引物的PCR擴增
在任選的核酸提取步驟之后，根據(jù)PCR方案用兩個特異擴增引物溶 液在上面所提及的任一加工處理和檢測裝置中實施核酸的擴增。擴增過 程生成了擴增子18，其一條鏈與雜交探針雜交，所述探針與磁性納米顆 粒或微粒20共價結(jié)合。擴增子的這條鏈的另一部分與另一個互補探針即 傳感器探針(與傳感器芯片表面相連接)雜交。所述連接可以是共價連 接。當(dāng)雜交探針和傳感器探針與非互補于擴增過程所用的擴增引物的延 伸鏈內(nèi)的核酸序列雜交時，獲得了最小的干擾。在這個實施例中，在特 定的時間點重復(fù)序列(循環(huán))地間歇測定己經(jīng)被連接于傳感器的微?；?納米微粒的濃度。
3個下面的步驟描述了常用的PCR循環(huán)
加熱模板雙鏈DNA，以便解離單個鏈，通常是在卯和99。C之間(變性)。
降低溫度，以便容許引物退火成游離鏈，通常是在45到65。C之間， 取決于擴增引物長度和序列(退火)。
提高溫度，通常提高到72。C。沿著模板鏈延伸引物(延伸)。 為了檢測和測定擴增引物例如DNA、 RNA，實施了下面的步驟 在完成DNA擴增之后，提高溫度，以解離雙鏈DNA。 利用磁力將雜交探針和磁性微?；蚣{米顆粒從本體溶液中吸引到傳 感器表面，所述磁力來自磁場發(fā)生器12所生成的磁場梯度。將與雜交探 針和檢測探針互補的DNA鏈(通過雜交)與這些探針形成三明治結(jié)構(gòu)。 因此，DNA鏈被固定到了傳感器表面并被磁性顆粒所標(biāo)記。
隨后通過施加磁力例如通過磁場和/或具有正確斜率的磁場梯度可以 去除傳感器表面上的未結(jié)合的雜交探針，但要使得最大的磁力不會斷裂 鏈-雜交探針-傳感器探針復(fù)合物中的DNA-DNA雜合體。常用的磁力數(shù)值 是在pN范圍內(nèi)，nN范圍內(nèi)的力將會斷裂特異鍵(如WO2005010527所 述)。
測定與雜交探針相連的磁性顆粒的磁場強度，該數(shù)值與PCR擴增中 所形成的擴增子的量有關(guān)。該方法容許近實時PCR檢測。 在測定步驟之后，再次提高溫度，以便解離探針擴增子鏈相互作用。 通過逆轉(zhuǎn)磁場方向可以將納米顆粒重新分布到本體溶液中，之后它們通 過所施加的磁力促動再次參與生物化學(xué)反應(yīng)。在這個時候，將樣品變性， 并準(zhǔn)備進入到下一個擴增循環(huán)。
圖5顯示了作為時間函數(shù)的傳感器信號的圖。
對于本領(lǐng)域人員而言，很明顯的是對上述過程中的特殊步驟的修飾 是可能的。例如，在每個擴增步驟后實施檢測步驟，或者低頻率地實施
檢測步驟或者僅僅在己經(jīng)實施初始數(shù)目的PCR循環(huán)且沒有實施檢測步驟 之后才實施檢測步驟。
上述過程被稱作"磁性顆粒和溫度循環(huán)"，因為磁性顆粒和溫度都被 循環(huán)。這容許微粒和納米顆粒有效地參與本體及表面過程。在這個實施 方式中，擴增子形成和生成發(fā)生在本體溶液，而顆粒檢測發(fā)生在傳感器 表面。這是一種間歇檢測形式，單個檢測之間的時間等同于PCR方法的 循環(huán)時間。通過縮短PCR循環(huán)時間，擴增過程的近實時狀態(tài)變得更加準(zhǔn) 確。就目前的技術(shù)水平而言，最小型擴增的每個循環(huán)需要15到30秒鐘。
通過向過程中加入內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)物即已知量的參照模板和用于比較目的的 專用引物，也可以使得該近實施擴增是定量的。優(yōu)選地，傳感器表面上 的分離的點(統(tǒng)計學(xué)隨機的)特異于該內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)物。通過記錄擴增效率(例 如每個時間間隔的量)，計算出未知模板DNA的初始量是可能的。
在更優(yōu)選的設(shè)定中實施檢測，其中微粒或納米顆粒的雜交引物的量 具有低的擴增子覆蓋率，即平均值小于每個納米顆粒一個擴增子。這保 證了每個微?；蚣{米顆粒超過1個擴增子的可能性是非常低的，以及傳 感器上的微?；蚣{米顆粒的數(shù)目可以被定量地和準(zhǔn)確地翻譯成為原始樣 品中的靶濃度。
根據(jù)本發(fā)明，也可以通過具有不同捕獲分子的傳感器10的陣列實施 多路分析。在一些情況中，可以使用相同的引物，而在另一些情況中， 需要不同的引物。 實施例2:利用具有磁性標(biāo)記的擴增引物的PCR擴增
在任選的核酸提取步驟之后，根據(jù)PCR方案，用其中一個引物與磁
性顆粒共價結(jié)合以及另一個引物未被磁性標(biāo)記的擴增引物實施核酸的擴
增。圖6圖解說明了本實施例。擴增過程造成了其中一條延伸鏈通過相 連的引物被標(biāo)記成磁性微?；蚣{米顆粒。
在這個實施方式中，在特定的時間點，重復(fù)序列(循環(huán))地間歇測 定與傳感器IO相連的微?；蚣{米微粒的濃度。
描述優(yōu)選設(shè)計和方法的步驟以及本實施例所示的附加方案與實施例 l所述的方法基本上相同，除了擴增引物外，只需要一個與傳感器芯片表 面共價相連的附加探針(傳感器探針)。該傳感器探針可以包括與擴增引 物寡核苷酸相同的序列或者可以覆蓋擴增引物寡核苷酸的序列，如圖6 所示?；蛘?，傳感器探針可以與擴增DNA的不同于擴增引物結(jié)合序列的 序列雜交。
作為上面方案的另一個可選方案檢測步驟期間與傳感器結(jié)合的磁 性顆粒的濃度與初始靶濃度有關(guān)。換句話說，對于給定的檢測時間和檢 測過程時間，結(jié)合到所形成的擴增子鏈的傳感器上的顆粒濃度指示出了 初始靶濃度。測定所形成的擴增子量的另一個方法是檢測在特定檢測時 間內(nèi)仍殘留的擴增引物的量。如果結(jié)合顆粒的擴增引物靶向于該方法， 所結(jié)合的顆粒的濃度將隨著擴增過程中所形成的擴增子濃度的增加而降
低。在此給出了這種檢測的一個實例
一型擴增引物與磁性顆粒共價偶聯(lián)。在傳感器上，固定探針，其己 經(jīng)被選定與該擴增引物結(jié)合。因此，具有該共價偶聯(lián)的擴增引物的顆粒 最初可以以高結(jié)合率與傳感器結(jié)合。當(dāng)擴增過程進展時，更多結(jié)合顆粒 的擴增引物將被延伸成全長擴增子。因此，顆粒與傳感器結(jié)合的可能性 減小，這是因為顆粒上更少的可接近的擴增引物的數(shù)目和/或是因為與顆 粒結(jié)合的擴增子的立體阻礙。
實施例3:本發(fā)明的微陣列應(yīng)用
先前實施例所述的方法使得能夠通過磁場循環(huán)以及一些情況中的溫 度循環(huán)來檢測擴增遺傳物質(zhì)。所有這些方法都非常適用于微陣列應(yīng)用。 固定于陣列的傳感器表面的探針和樣品溶液的擴增子(在這種情況中， 其與磁性納米顆粒相連接)之間的相互作用強度與探針和擴增子之間的 互補性程度或多或少是成比例的。通過在陣列上施加不同的力(例如取 決于陣列位置的不同的磁力)或通過改變作為時間函數(shù)的力，可以鑒定 出不同類型的陣列亞點，例如在弱力下釋放相連的擴增子和磁性納米顆 粒的點(例如非特異的或高度退化的雜交)到具有非常強的探針和擴增 子之間的結(jié)合力的點(例如高互補性)。在后一情況中，作為固定于這些 特殊點的磁性顆粒的結(jié)果，磁性信號仍是可被記錄的。
在微陣列設(shè)置中，其中特異探針被固定到傳感器表面的非常小的和 分離的部分，特殊探針和具有相連的或相結(jié)合的特異互補的擴增子/配體 的標(biāo)記磁性顆粒之間的碰撞機會是非常小的。具有垂直于傳感器表面的
速度成分(velocity component)的磁力循環(huán)將增加傳感器表面上的小體 積中的特異性結(jié)合對(即表面探針和擴增子/配體標(biāo)記的磁性顆粒)的濃 度。但是，顆粒平行于傳感器表面的運動是受限的(也是磁場的結(jié)果)。 因此，與必需產(chǎn)生可測定的結(jié)果的擴增過程相關(guān)的特異結(jié)合對的相互作 用在微陣列設(shè)置中是一個低效的過程。
為了克服這個缺陷，給出了微陣列格式的另一個實施方式，其中間 歇地或按與垂直成分協(xié)調(diào)的方式施加具有與傳感器表面平行的成分的磁 力和速度，以便在傳感器表面上水平地移動顆粒，使得顆粒更為接近， 進一步增加碰撞性接觸。
除了通過調(diào)整溫度來影響結(jié)合效率外，還可以使用磁場促動，以便 給特定溫度下重分相互作用提供附加值。這使得能夠檢測出核酸序列的 SNP或其他變化，因此可以在沒有序列分析時檢測出基因差異(注意序列分析可以用作驗證測定)。這也使得能夠?qū)ι险{(diào)和下調(diào)的基因進行更 為敏感的和更為準(zhǔn)確的描述，即更少數(shù)目的在微陣列試驗中所研究的與 特殊生理學(xué)參數(shù)相關(guān)的關(guān)鍵基因。這也使得能夠更精確地鑒定出微生物、 病原體或其他生物學(xué)材料。
權(quán)利要求
1.一種用于利用一或多種擴增引物擴增RNA或DNA核酸并確定所述擴增的RNA或DNA核酸或參與擴增過程的試劑的量的方法，其中通過磁性檢測實施確定所述擴增的核酸或所述試劑的量的步驟，并且所述步驟在所述RNA或DNA的擴增過程中至少實施1次，其特征在于通過以下方法實施確定所述擴增的RNA或DNA或所述試劑的量的步驟，在所述方法中，所述擴增的核酸或所述試劑通過生物分子與傳感器結(jié)合。
2. 權(quán)利要求1的方法，其中所述生物分子是DNA。
3. 權(quán)利要求l的方法，其中用等溫法擴增所述RNA或DNA。
4. 權(quán)利要求l的方法，其中用熱循環(huán)法擴增所述RNA或DNA。
5. 權(quán)利要求1的方法，其中用磁性顆粒標(biāo)記一種擴增引物。
6. 權(quán)利要求1的方法，其中用磁性標(biāo)記的雜交探針檢測所述擴增子。
7. 前述權(quán)利要求中任一項的方法，還包括具有與傳感器表面垂直的 速度成分的磁力循環(huán)。
8. 用于確定樣品中核酸的量或參與擴增過程的試劑的量的試劑盒， 所述試劑盒至少包括-具有傳感器表面的裝置，其中一或多種生物分子與所述傳感器表面 相連；-寡核苷酸，其中至少一種寡核苷酸與磁性顆粒相偶聯(lián)，以及一或多 種DNA或RNA聚合酶。
9. 權(quán)利要求8的試劑盒，還包括具有缺口活性的酶。
10. 權(quán)利要求8的試劑盒，還包括具有RNA酶活性的酶。
11. 權(quán)利要求8的試劑盒，其中所述至少一種寡核苷酸是擴增引物。
12. 權(quán)利要求8的試劑盒，其中所述至少一種寡核苷酸是雜交探針。
13.權(quán)利要求8到12中任一項的試劑盒，其中傳感器表面是微陣列 的一部分。
全文摘要
本發(fā)明描述了擴增核酸并用磁性檢測確定所擴增的核酸的量的方法?？稍诤怂釘U增過程中實施所述檢測。在檢測期間，所擴增的核酸通過生物分子與傳感器相結(jié)合。
文檔編號C12Q1/68GK101194024SQ200680020457
公開日2008年6月4日 申請日期2006年6月7日 優(yōu)先權(quán)日2005年6月9日
發(fā)明者A·范阿梅龍根, M·W·J·普林斯, M·科特斯 申請人:皇家飛利浦電子股份有限公司