純化出了該蛋白酶，其具有150, 000A. U. /mg蛋白質(zhì)的 比活性。
[0055] -個安森單位（A. U.)在此被定義為這樣的酶量，其當(dāng)在25°C下和在pH 7. 5下在 變性血紅蛋白存在下溫育10分鐘時，從該底物中釋放出1微克酪氨酸的等價量，這通過對 于用三氯乙酸不可沉淀的濾液的在280nm處的分光光度吸收來測定。
[0056] pi為大約8. 0的蛋白酶與前一種蛋白酶一起被回收，但在更大的體積（例如35ml 的體積）中，并且具有I. 48mg/ml的蛋白質(zhì)濃度。該溶液的滴度為56, 000A. U. /ml左右。
[0057] 在均質(zhì)化后，以50mg的規(guī)模純化出了該蛋白酶，其具有38, 000A. U. /mg蛋白質(zhì)左 右的比活性。
[0058] 上面所描述的經(jīng)純化的酶復(fù)合物主要包含蛋白酶和其他蛋白質(zhì)。所進(jìn)行的純化和 所采用的電泳技術(shù)證明了額外的純化和沒有蛋白水解活性的負(fù)載物質(zhì)的去除。
[0059] 所產(chǎn)生的各種不同蛋白酶可以通過測定其對于蛋白質(zhì)例如膠原、角蛋白、彈性蛋 白或血紅蛋白的活性來更好地進(jìn)行表征。
[0060] 不幸的是，這些測定是復(fù)雜的，因為其缺乏靈敏度和其缺乏特異性。因此需要運(yùn)用 多種活性測試，其構(gòu)成了檢測方法，主要為安森方法。
[0061] 活性測試：
[0062] 安森測試:
[0063] 該測試使得能夠無特異性地測定蛋白水解活性的水平。它在于通過包含在所釋放 出的寡肽中的酪氨酸的分光光度法測定來測定變性血紅蛋白的水解的水平。
[0064] 用偶氮酪蛋白講行的測試:
[0065] 該測試在于在440nm處通過分光光度法測定在其上固著有橙色染料的酪蛋白的 水解。該測試不是特異性的。在與酶一起進(jìn)行溫育之后，用三氯乙酸使剩余的偶氮酪蛋白 沉淀。光密度的測量反映了所釋放出的肽的存在，因此反映了酶活性。
[0066] 彈性蛋白分解活性測試：
[0067] 用弾件蛋白-剛果紅講行的測試
[0068] 該測試在于在495nm處用分光光度法測定通過在其上固著有紅色染料的彈性蛋 白的水解而釋放出的經(jīng)染色的肽的水平。
[0069] 該水平測定的可能問題來自底物的不溶性，因此其靈敏度依賴于底物取樣的精確 度、溫育介質(zhì)的攪拌和底物在溫育容器的壁上的粘附。
[0070] 所進(jìn)行的試驗顯示在活性與酶量之間缺乏線性。確實在活性與溫育時間之間觀察 到線性，但代表其的直線不通過原點。
[0071] 因此，可以測量兩個溫育時間（20和40分鐘）之間的吸光度差異。用10 μ 1的經(jīng) 稀釋10倍的復(fù)合物，測量到〇. 049 μ OD/分鐘的變化。因此，本發(fā)明的酶復(fù)合物確實具有針 對彈性蛋白的蛋白水解活性。
[0072] 用NBA (N-Boc-L-丙氨酸-對硝基苯酚酷）講行的測試
[0073] 該測試在于在347. 5nm處用分光光度法測定存在于彈性蛋白酶中的酯酶活性 的水平，這通過測定所釋放出的對硝基苯酷來進(jìn)行（Visser L.等人，Biochim, Biophys Acta, 268(1972)207. 260) 〇
[0074] 該水平測定對于彈性蛋白分解活性來說不是特異性的，但它是非常快的（3分鐘 的動力學(xué)）并且具有良好的靈敏度。
[0075] 這是因為，用50 μ 1的經(jīng)稀釋100倍的復(fù)合物，測量到0. 235 μ OD/分鐘的變化。因 此，所述酶復(fù)合物具有允許對硝基苯酚釋放的活性。
[0076] 膠原分解活性測試：
[0077] 用azocoll講行的測試
[0078] 該測試在于在520nm處用分光光度法測定通過azocoll (經(jīng)研磨的并且在其上固 著有波爾多紅染料的膠原）的水解而釋放出的肽的水平（Chavira, Analytical Biochemis try, 136(1984)446-450) 〇
[0079] 該測試具有與彈性蛋白-剛果紅（不可溶的底物）相同的缺點，但具有良好的靈 敏度：用50 μ 1的經(jīng)稀釋50倍的復(fù)合物，在10分鐘的溫育之后測量到0. 398的0D。因此， 本發(fā)明的酶復(fù)合物具有針對azocoll的蛋白水解活性。
[0080] 如此，證實了根據(jù)本發(fā)明的酶復(fù)合物的蛋白水解活性。所述復(fù)合物的純化并不改 變其活性。
[0081] 如此獲得的且經(jīng)表征的蛋白質(zhì)復(fù)合物可用于動物治療，尤其是作為免疫刺激試劑 和作為派爾淋巴集結(jié)的再生試劑，特別是在年老的受試者中。
[0082] 此外，所述酶復(fù)合物使得能夠在年老的動物（大鼠、雞等）中使腸絨毛再生，并因 此大大地改善目的營養(yǎng)物的腸吸收。
[0083] 根據(jù)本發(fā)明的酶復(fù)合物主要旨在畜牧學(xué)，和更特別地，旨在改善家畜（牛、豬、 羊）、家禽、兔子和魚以及任何其他單胃動物的飼料。
[0084] 當(dāng)以從0. 025至lg/kg的劑量摻入到飼料組合物中時，該酶復(fù)合物改善了這些動 物的代謝并且有助于確保它們具有更好的健康狀況。優(yōu)選地，引入到飼料組合物中的復(fù)合 物的劑量為0.05至0.2g/kg。
[0085] 在成組養(yǎng)殖的情況下，健康狀況的保持發(fā)揮了重要的作用，因為它避免了由于混 雜或禁閉而引起的疾病傳播。如此，明顯地降低了由細(xì)菌污染引起的養(yǎng)殖型動物的發(fā)病率， 尤其是死亡率。
[0086] 基于該酶混合物的飼料組合物包含一種或多種具有營養(yǎng)目的的賦形劑或載體，例 如谷物（小麥、優(yōu)質(zhì)小麥、玉米、黑麥、大米、黍、高粱）磨粉、大豆磨粉、糖類（乳糖、甘露 糖）、負(fù)載成分（酪蛋白、麩皮、纖維素、纖維素衍生物）和/或礦物成分（白堊、粘土、膨潤 土、硅石）以及任何其他在動物營養(yǎng)中所使用的成分。
[0087] 在旋轉(zhuǎn)式滾筒中將這些組合物與復(fù)合物進(jìn)行干法混合直至均勻，或者在流化床中 將以液體形式的（特別地，水性形式的）酶復(fù)合物噴霧在飼料組合物上，然后?；?。此類操 作可以在從15°C至60°C的可變溫度下進(jìn)行。
[0088] 因此，更純的和更具活性的酶復(fù)合物的使用使得能夠更精確地測定根據(jù)本發(fā)明的 營養(yǎng)組合物的生物學(xué)活性水平，并且確保所獲得的結(jié)果的令人滿意的均一性。
[0089]因此，根據(jù)本發(fā)明的飼料組合物具有清楚地確定的和非常恒定的酶復(fù)合物含量。 [0090] 因此，下面是旨在用于養(yǎng)殖型動物的飼料組合物的幾個非限制性實例，所述飼料 組合物包含與具有營養(yǎng)目的的合適的賦形劑或載體相混合的根據(jù)本發(fā)明的酶復(fù)合物。
[0091] 用于家倉的飼料組合物:
[0092] 對于IOkg的批次，通過添加酶復(fù)合物制備了組合物：
[0093]
【主權(quán)項】
1. 通過培養(yǎng)弗氏鏈霉菌菌株而獲得的包含蛋白酶混合物的酶復(fù)合物用于對養(yǎng)殖型動 物的飼料進(jìn)行補(bǔ)充的用途，其特征在于，在所述混合物的這些蛋白酶之中，一種蛋白酶具有 7. O左右的等電點，和另一種蛋白酶具有8. O左右的等電點。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1的用途，其中等電點為7. O左右的蛋白酶具有大約150, OOO安森單 位/mg蛋白質(zhì)的比活性。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1的用途，其中等電點為8. 0左右的蛋白酶具有大約38, 000安森單位 /mg蛋白質(zhì)的比活性。
4. 根據(jù)前述權(quán)利要求之一的用途，其中所述酶復(fù)合物作為飼料補(bǔ)充物用于改善工業(yè)養(yǎng) 殖型動物的總體狀況，所述飼料補(bǔ)充物以粉末、液體或任何其他適合于與飼料組合物相混 合的形式存在。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4的用途，其中在旋轉(zhuǎn)式滾筒中將以粉末形式的酶復(fù)合物與飼料組合 物進(jìn)行干法混合直至均勻。
6. 根據(jù)權(quán)利要求4的用途，其中在流化床中將以液體形式的酶復(fù)合物噴霧在飼料組合 物上，然后?；?。
7. 根據(jù)前述權(quán)利要求之一的用途，所述用途是在家禽的飼料中的用途。
8. 根據(jù)前述權(quán)利要求之一的用途，所述用途是在豬的飼料中的用途。
9. 根據(jù)前述權(quán)利要求之一的用途，所述用途是在魚的飼料中的用途。
10. 用于養(yǎng)殖型動物的飼料組合物，其包含根據(jù)前述權(quán)利要求之一的酶復(fù)合物，和任選 地，具有營養(yǎng)目的的賦形劑或載體。
11. 用于制備根據(jù)前述權(quán)利要求之一的酶復(fù)合物的方法，其特征在于，培養(yǎng)弗氏鏈霉菌 菌株，過濾發(fā)酵液，然后著手進(jìn)行通過超濾和離子交換色譜法以及隨后的等電聚焦來提取 酶復(fù)合物，和最后將所獲得的復(fù)合物凍干。
【專利摘要】本發(fā)明涉及通過培養(yǎng)弗氏鏈霉菌(Streptomyces fradiae)菌株而獲得的包含蛋白酶混合物的酶復(fù)合物用于對養(yǎng)殖型動物的飼料進(jìn)行補(bǔ)充的用途，在所述蛋白酶混合物中，一種蛋白酶具有7.0左右的等電點，和另一種蛋白酶具有8.0左右的等電點。本發(fā)明還涉及包含所述酶復(fù)合物的用于養(yǎng)殖型動物的飼料組合物，以及生產(chǎn)該復(fù)合物的方法。
【IPC分類】C12P1-04, A23K1-165, C12R1-54, A23K1-18
【公開號】CN104837360
【申請?zhí)枴緾N201380061450
【發(fā)明人】多米尼克·霍爾曼
【申請人】多米尼克·霍爾曼, 德尼·霍爾曼, 讓-諾埃爾·霍爾曼, 埃爾韋·霍爾曼
【公開日】2015年8月12日
【申請日】2013年11月22日
【公告號】CA2834538A1, EP2735235A1, US20140147550, WO2014080094A1