酶復(fù)合物在養(yǎng)殖型動物的飼料中的用圖
【專利說明】酶復(fù)合物在養(yǎng)殖型動物的飼料中的用途
[0001] 本發(fā)明的技術(shù)領(lǐng)域?qū)儆趧游餇I養(yǎng)領(lǐng)域。
[0002] 已知弗氏鏈霉菌（Streptomyces fradiae)菌株可以產(chǎn)生至少五種類型的稱為 Ia、Ib、II、III、IV的蛋白酶和兩種肽酶（專利GB 1133579)。
[0003] 在其專利申請WO 87/07905中，申請人描述了用于獲得專一地由II、III和IV型 蛋白酶（其中Π 型蛋白酶占優(yōu)勢）組成的蛋白水解復(fù)合物的方法。該復(fù)合物是從WAKSMN 3535類型的弗氏鏈霉菌菌株開始通過下述過程而獲得的：發(fā)酵，通過過濾來提取復(fù)合物， 然后在具有相應(yīng)于2, 000至12, 000的分子量的截止閾值的膜上進行超濾，和最后粉化。如 此獲得的以粉末形式的復(fù)合物具有至少2, 000安森單位（Anson unit)/mg蛋白質(zhì)的滴度。
[0004] 在該申請中，II型蛋白酶以接近18kDa的分子量和接近9. 0的等電點為特征。
[0005] 在動物飼料中所使用的該復(fù)合物允許動物有效地同化富含粗蛋白質(zhì)的食物并因 此刺激其生長。此外，在妊娠母豬中所使用的該復(fù)合物使得能夠獲得在出生時豬崽體重的 增加，伴隨有飼料消耗的減少和健康狀況的改善。
[0006] 然而，該方法并不能使得能夠有效地去除污染性的副產(chǎn)物。
[0007] 在專利申請WO 97/37681中，提供了改進，其使得能夠?qū)⒌味葹橹辽?, 000安森單 位/mg蛋白質(zhì)的產(chǎn)品用于治療性應(yīng)用。因此，占優(yōu)勢的蛋白酶具有大于100, 000安森單位 /mg蛋白質(zhì)的比活性，具有30至36kDa的分子量和接近7. 0的等電點。
[0008] 后來進行的分析顯示，所述蛋白酶的分子量為18_20kDa。
[0009] 所描述的治療性應(yīng)用主要在于：減少對于某些疾病來說特征性的粘液分泌過多的 正面作用；腸吸收和血液循環(huán)的改善；還有針對感染性疾病的對抗。此外，所述組合物被描 述為有利于腸粘膜的經(jīng)萎縮的或被破壞的絨毛的再生。
[0010] 鑒于從弗氏鏈霉菌的培養(yǎng)物中提取的酶復(fù)合物的重大的治療特性，重要的是使用 更加完全地擺脫了可能影響其活性的生物學(xué)雜質(zhì)的酶復(fù)合物。
[0011] 因此，本發(fā)明旨在提供上面所描述的酶復(fù)合物的改善，以尤其是有利于在工業(yè)養(yǎng) 殖背景下的良好的養(yǎng)殖條件和動物健康。
[0012] 因此，本發(fā)明的目標(biāo)在于通過培養(yǎng)弗氏鏈霉菌菌株而獲得的包含蛋白酶混合物的 酶復(fù)合物用于對養(yǎng)殖型動物的飼料進行補充的用途，其特征在于，在所述混合物的這些蛋 白酶之中，一種蛋白酶具有7. 0左右的等電點，和另一種蛋白酶具有8. 0左右的等電點。
[0013] 所述復(fù)合物占非常多數(shù)地包含這兩種類型的蛋白酶，即這兩種蛋白酶的比例超過 所述混合物的活性的80%。
[0014] 根據(jù)本發(fā)明的一個特征，等電點為7.0左右的蛋白酶具有大約150, 000安森單位 /mg蛋白質(zhì)的比活性。
[0015] 根據(jù)本發(fā)明的一個特征，等電點為8. 0左右的蛋白酶具有大約38, 000安森單位/ mg蛋白質(zhì)的比活性。
[0016] 根據(jù)本發(fā)明的另一個特征，將所述酶復(fù)合物作為飼料補充物用于改善工業(yè)養(yǎng)殖型 動物的總體狀況，所述飼料補充物以粉末、液體或任何其他適合于與飼料組合物相混合的 形式存在。
[0017] 根據(jù)本發(fā)明的一個特征，在旋轉(zhuǎn)式滾筒中將以粉末形式的酶復(fù)合物與飼料組合物 進行干法混合直至均勻。
[0018] 根據(jù)本發(fā)明的另一個特征，在流化床中將以液體形式的酶復(fù)合物噴霧在飼料組合 物上，然后粒化。
[0019] 根據(jù)本發(fā)明的一個特征，在家禽的飼料中使用所述酶復(fù)合物。
[0020] 根據(jù)本發(fā)明的另一個特征，在豬的飼料中使用所述酶復(fù)合物。
[0021] 根據(jù)本發(fā)明的另一個特征，在魚的飼料中使用所述酶復(fù)合物。
[0022] 本發(fā)明的目標(biāo)還在于用于養(yǎng)殖型動物的飼料組合物，其包含本發(fā)明的酶復(fù)合物， 和任選地，具有營養(yǎng)目的的賦形劑或載體，或其他添加劑。
[0023] 最后，本發(fā)明的目標(biāo)在于用于制備根據(jù)本發(fā)明的酶復(fù)合物的方法，其特征在于，培 養(yǎng)弗氏鏈霉菌菌株，過濾發(fā)酵液，然后著手進行通過超濾和離子交換色譜法以及隨后的等 電聚焦來提取酶復(fù)合物，和最后將所獲得的復(fù)合物凍干。
[0024] 該發(fā)明使得能夠提供其特征受到嚴(yán)格限定的飼料補充物。
[0025] 本發(fā)明首先使得能夠精確地調(diào)整待施用到飼料組合物中的劑量，以便獲得所希望 的治療效果。
[0026] 本發(fā)明還具有在工業(yè)養(yǎng)殖中改善動物的健康狀況的優(yōu)點。
[0027] 此外，本發(fā)明還提供了在工業(yè)養(yǎng)殖中動物的總體狀況的改善，這提高了經(jīng)營的贏 利性。
[0028] 本發(fā)明還允許動物生長的增加，同時引起飼料消耗的下降。
[0029] 通過與圖解說明了腸絨毛的圖片相關(guān)聯(lián)地閱讀下面的對于作為實例而給出的實 施方案進行的補充描述，將會更好地理解本發(fā)明的其他特征、細(xì)節(jié)和優(yōu)點。
[0030] 已知以名稱 Panstimase# (PANcreatic STIMulating diastASE)進行銷售的 酶混合物是來自弗氏鏈霉菌發(fā)酵的酶復(fù)合物。該復(fù)合物被描述為占多數(shù)地包含三種蛋白 酶，其中的一些特異地作用于硬化蛋白（膠原、彈性蛋白、角蛋白），但也作用于由霍亂弧菌 或某些大腸桿菌（Escherichia coli)致病菌株所釋放的蛋白質(zhì)性質(zhì)的某些毒素。
[0031] 在畜牧學(xué)領(lǐng)域中，重要的是擁有在技術(shù)上明確的、十分恒定的且其特性因此清楚 地確定的產(chǎn)品。
[0032] 為了獲得根據(jù)本發(fā)明的酶復(fù)合物，培養(yǎng)弗氏鏈霉菌菌株并過濾發(fā)酵液。然后，著手 進行通過超濾、離子交換色譜法和等電聚焦來提取和表征酶復(fù)合物。最后，著手進行將所獲 得的復(fù)合物凍干。
[0033] 對于弗氏鏈霉菌菌株的培養(yǎng)，使用例如WAKSMAN 3535類型的菌株，并且所述菌株 可以是在遺傳上經(jīng)改進的，以便尤其是獲得蛋白水解活性的增加或任何抗生素分泌的取 消。
[0034] 在工業(yè)生產(chǎn)型發(fā)酵罐中在合適的培養(yǎng)基中進行所述培養(yǎng)。該培養(yǎng)基可以例如基 于：15g/l大豆磨粉；30g/l葡萄糖；lg/Ι磷酸氫二鉀；10g/l碳酸鈣。
[0035] 所述反應(yīng)在7. 0至7. 5的pH下，在大約28°C的發(fā)酵溫度下，以0. 3體積的無菌空 氣/培養(yǎng)基體積/分鐘的通氣來進行。
[0036] -旦培養(yǎng)結(jié)束，就通過在澄清劑存在下過濾發(fā)酵液來去除菌絲體。
[0037] 酶復(fù)合物的提取需要使用幾項技術(shù)，包括超濾、離子交換色譜法和等電聚焦。
[0038] 軺濾
[0039] 濾液的超濾借助于具有50kDa的截止閾值的膜來進行。
[0040] 在3小時的過濾后，所收集的濾液（起始體積的71 % )具有通過明膠薄膜測試而 揭示的蛋白水解活性。該測試在于用銀進行染色且放置在固體支持物上的明膠薄膜的降 解。
[0041] 離子奪換色譜法
[0042] 采用使用具有合適尺寸的Cellufine C-500羧甲基凝膠柱（Amicon)來進行的陽 離子交換色譜法。
[0043] 色譜法緩沖液為pH 5. 5的IOmM檸檬酸鹽緩沖液，并且洗脫通過0至1.0 M的NaCl 梯度來進行。洗脫流速根據(jù)柱的大小來調(diào)整，例如對于直徑為2. 5cm且高度為27cm的柱子， 它為10至15ml/分鐘。
[0044] 等電聚隹
[0045] 在Phast-system上，對于從3至9的pH，用Pharmacia公司的即用型凝膠來進行 分析型等電聚焦。用考馬斯藍(lán)來進行揭示。
[0046] 在固體介質(zhì)中的制備型等電聚焦的情況下，將酶溶液逆蒸餾水（95ml)進行透析， 并且與5ml的具有4. 7g Ultrodex凝膠和0. 5g甘氨酸的3-9的兩性電解質(zhì)相混合。將凝 膠在40°C下干燥6小時。在3W的恒定功率下，在整夜或等價的時間段期間進行迀移。用考 馬斯藍(lán)來進行揭示。
[0047] 取出各種不同的凝膠條帶，用3ml水進行漂洗，過濾，然后用3ml Tris-HCl緩沖液 進行漂洗。
[0048] 然后，就其蛋白水解活性容量和其蛋白質(zhì)含量來對如此獲得的級分進行分析。然 后，將樣品逆0.3M Tris-HCKpH 8.0)緩沖液進行透析。
[0049] 在液體介質(zhì)中的制備型等電聚焦的情況下，將逆蒸餾水進行透析的酶溶液與兩性 電解質(zhì)（3.5ml)相混合。迀移在8W的恒定功率下進行4小時。
[0050] 對所取得的級分進行分析，然后將其逆0. 3M Tris-HCl (pH 8. 0)緩沖液進行透析。
[0051] 上面所指出的實驗條件將可根據(jù)希望獲得的產(chǎn)品的量和在工業(yè)條件下的使用來 進行調(diào)整。
[0052] 因此，在所述混合物中獲得：占多數(shù)的具有7.0左右的等電點（pi)的蛋白酶，和以 較少比例，具有8.0左右的pi的蛋白酶。
[0053] 在9ml的體積中獲得占多數(shù)的pi為大約7. 0的蛋白酶，其中具有0. 49mg/ml的蛋 白質(zhì)濃度。由于該蛋白酶在其等電點處沉淀，因而關(guān)于純化的特別預(yù)防措施可能是必需的。 所獲得的溶液具有75, 000A. U. /ml左右的滴度。
[0054] 在均質(zhì)化后，以4mg的規(guī)模