專利名稱：Aβ－肽的篩選方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及測定γ-分泌酶活性的方法，本方法的各成分及其應(yīng)用。
阿爾茨海默(Alzheimer)病是一種腦部的神經(jīng)變性疾病，在細(xì)胞水平，其伴隨著外周神經(jīng)系統(tǒng)和中樞大腦皮層內(nèi)大量神經(jīng)元的丟失。在受累的大腦部位，從分子水平來講，蛋白的沉積-通稱為“老年斑”-可在分子水平被檢測到，這是阿爾茨海默病的基本特征。在這些斑塊內(nèi)的主要蛋白為由40-42個(gè)氨基酸組成的多肽，其被稱為Aβ-肽。這種肽是由695-770個(gè)氨基酸組成的大分子蛋白即β-淀粉樣前體蛋白(APP)的裂解產(chǎn)物。
APP是一個(gè)完整的跨膜蛋白，其首先橫跨脂質(zhì)雙層。該蛋白分子的大部分暴露在細(xì)胞外，只有小部分C-末端區(qū)域存在于胞漿內(nèi)(

圖1)。Aβ-肽在圖1被示為暗灰色。大約2/3的Aβ-肽分子來自APP的細(xì)胞外區(qū)域，而余下的1/3來自其跨膜區(qū)。
除了與膜結(jié)合的APP外，可檢測到一種分泌型淀粉樣前體蛋白，其由APP大的細(xì)胞外區(qū)域組成，被稱為APPsec(“分泌型APP”)。APPsec是由APP被蛋白水解斷裂而成，此過程由α-分泌酶完成。這一發(fā)生在APP氨基酸序列內(nèi)部的蛋白水解的斷裂位點(diǎn)處于Aβ-肽氨基酸序列內(nèi)(Aβ-肽第16位氨基酸殘基后)。因此，由α-分泌酶對APP的蛋白水解不能形成Aβ-肽。
那么，Aβ-肽只能由APP其它的加工途徑產(chǎn)生。有一種假說提出，另外兩種蛋白酶參與了這一加工途徑。其中之一為β-分泌酶，在APP分子內(nèi)的Aβ-肽的N-末端斷裂；第二個(gè)蛋白酶被稱為γ-分泌酶，可釋放Aβ-肽的C-末端(Kang，J.等，Nature，325，733)(圖1)。
到目前為止，尚無法鑒別三種分泌酶或蛋白酶(α-分泌酶，β-分泌酶，γ-分泌酶)中的任何一種。然而，對于這些分泌酶的了解和認(rèn)識(shí)是一項(xiàng)很有意義的課題，尤其是對阿爾茨海默病的探討及鑒別參與其中的蛋白質(zhì)，從而作為進(jìn)一步研究的靶蛋白。從一方面講，通過抑制β-分泌酶，尤其是γ-分泌酶可導(dǎo)致Aβ-肽合成減少；另一方面，激活α-分泌酶可增加APP的加工合成APPsec，從而同時(shí)降低Aβ-肽的合成。正是根據(jù)這樣的研究方案，人們發(fā)現(xiàn)了轉(zhuǎn)基因秀麗新小桿線蟲(C.elegans)，這一發(fā)現(xiàn)報(bào)道在未公開的德國專利申請19849 073.9號(hào)中。
大量的實(shí)驗(yàn)證據(jù)表明，Aβ-肽是阿爾茨海默病發(fā)病的關(guān)鍵因素。其中，Aβ-原纖維的神經(jīng)毒性在細(xì)胞培養(yǎng)中得到了證實(shí)(Yankner，B.A等，(1990)，Proc Natl Acad Sci USA，87，9020)。對于患有唐氏綜合征的病人，即此種病人具有一份額外的APP基因拷貝，甚至在30歲的年齡腦內(nèi)就有阿爾茨海默病的神經(jīng)病理學(xué)特征。在這里，有人認(rèn)為是由于APP的過多表達(dá)，從而導(dǎo)致轉(zhuǎn)換合成Aβ-肽增加(Rumble，B等，(1989)，N.Engl.J.Med.，320，1446)。
關(guān)于Aβ-肽重要作用的最強(qiáng)證據(jù)可能要屬家族性阿爾茨海默病了。這里，在APP基因內(nèi)圍繞β-和γ-分泌酶的裂解位點(diǎn)或在另外兩個(gè)阿爾茨海默病相關(guān)基因(presenilins)內(nèi)發(fā)現(xiàn)了多個(gè)突變，從而導(dǎo)致培養(yǎng)細(xì)胞內(nèi)的Aβ-肽的產(chǎn)量明顯增加(Scheuner，D.等，(1996)，Nature Medicine，2，864)。
已有大量的實(shí)驗(yàn)證據(jù)表明，在加工過程中，APP首先被β-分泌酶裂解為Aβ-多肽，然后，后者作為γ-分泌酶的反應(yīng)底物(Maruyama，K.Y.等，(1994)Biochem.Biophys Res Commun，202，1517；Estus，S.等，(1992)，Science，255，726)。因此，γ-分泌酶在Aβ-肽的形成中具有重要作用。為了檢測γ-分泌酶的活性，通常是通過測定Aβ-肽，然而，這通常是很困難的。
這種困難的重要原因是只有小部分的APP被轉(zhuǎn)化成Aβ-肽(SimonsM等，Neurosci(1996)1；16(3)899-908)。此外，Aβ-肽是唯一很小的裂解片段，大約4kDa，同時(shí)，由于它具有疏水性，很易自聚，因此在生理狀態(tài)下很易沉淀(Hilbich，C.等，(1991)J.Mol.Biol.，218，149)。
檢測真核細(xì)胞內(nèi)的Aβ-肽是通過免疫生物學(xué)的方法進(jìn)行的，比如，酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)、免疫沉淀和蛋白雜交(Suzuki，N.等，Science 1994，27，264(5163)1336；Haass，C.等，(1992)Nature，359，322)。這些檢測方法的工作量相對較大，因?yàn)樗鼈儬砍兜揭c合適的抗體溫育和必需破壞所用細(xì)胞，這些細(xì)胞可能來源于培養(yǎng)細(xì)胞或生物體模型(如秀麗新小桿秀麗新小桿線蟲秀麗新小桿線蟲)。
本發(fā)明涉及一種測定γ-分泌酶活性和檢測γ-分泌酶的新方法；本方法的特定實(shí)施方案一方面涉及對γ-分泌酶或編碼γ-分泌酶的cDNA的鑒定方法；另一方面涉及對可抑制γ-分泌酶活性的有效物質(zhì)的鑒定方法。這些物質(zhì)具有特別重要的意義，例如，因?yàn)樗鼈兛杀划?dāng)作藥理學(xué)活性化合物，比如，可用于治療阿爾茨海默病。
本發(fā)明涉及一種檢測γ-分泌酶的方法，其中1.制備和應(yīng)用一種轉(zhuǎn)基因，其編碼一個(gè)融合蛋白和包含下列組成成分a)第一核苷酸序列，其編碼的蛋白包含氨基酸序列
GAIIGLMVGGVVIATVIVITLVML(SEQ ID NO.1)，b)在第一核苷酸序列的5’末端的編碼一個(gè)信號(hào)肽的第二核苷酸序列，c)一個(gè)啟動(dòng)子，和d)如果必要，額外的編碼和/或非編碼性核苷酸序列；2.將該轉(zhuǎn)基因?qū)爰?xì)胞內(nèi)，并表達(dá)融合蛋白；3.該融合蛋白被細(xì)胞內(nèi)的γ-分泌酶在SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列內(nèi)裂解，因此形成包含氨基酸序列GAIIGLMVGGVV(SEQ ID NO.2)的第一片段蛋白，和包含氨基酸序列VIVITLVML(SEQ ID NO.3)的第二片段蛋白，及4.檢測第一片段蛋白和/或第二片段蛋白。本發(fā)明還涉及一種γ-分泌酶活性的測定方法，其中1.制備和應(yīng)用一種轉(zhuǎn)基因，其編碼一個(gè)融合蛋白和包含下列組成成分a)第一核苷酸序列，其編碼包含氨基酸GAIIGLMVGGVVIATVIVITLVML(SEQ ID NO.1)的蛋白，b)在第一核苷酸序列的5’末端的編碼一個(gè)信號(hào)肽的第二核苷酸序列。
c)一個(gè)啟動(dòng)子，和，d)如果必要，額外的編碼和/或非編碼性核苷酸序列；2.將該轉(zhuǎn)基因?qū)爰?xì)胞內(nèi)，并表達(dá)融合蛋白；3.該融合蛋白被細(xì)胞內(nèi)的γ-分泌酶在SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列內(nèi)裂解，因此形成包含氨基酸序列GAIIGLMVGGVV(SEQ ID NO.2)的第一片段蛋白，和包含氨基酸序列VIVITLVML(SEQ ID NO.3)的第二片段蛋白；4.測定第二片段蛋白的含量，且由第二片段蛋白的形成量確定γ-分泌酶活性。
這些方法(“Aβ-肽篩選方法”，“γ-分泌酶測定方法”)適合于在體測定γ-分泌酶或γ-分泌酶活性，并有可能被廣泛應(yīng)用，例如，其甚至可用于高通量篩選技術(shù)(“HTS”)。本系列方法避免了上述常規(guī)檢測方法的弊端，尤其是不需要費(fèi)力的分離和檢測布驟。這一方案的根據(jù)是，APP的C-末端片段被γ-分泌酶裂解成兩個(gè)片段，第一個(gè)片段蛋白包含氨基酸序列GAIIGLMVGGVV(SEQ ID NO.2)，第二個(gè)片段蛋白包含氨基酸序列VIVITLVML(SEQ ID NO.3)，包含氨基酸序列VIVITLVML(SEQ ID NO.3)的第二片段蛋白可擴(kuò)散到細(xì)胞的胞漿中(圖2)。在胞漿內(nèi)的該第二個(gè)片段蛋白很容易被檢測到，比如，借助于一個(gè)報(bào)告基因；從而用于檢測γ-分泌酶或γ-分泌酶的活性。γ-分泌酶的裂解位點(diǎn)位于APP的跨膜區(qū)域(Kang，J.等，(1987)Nature，325，733)。APP跨膜區(qū)域的氨基酸序列為GAIIGLMVGGVV40IA42TVIVITLVML。γ-分泌酶在V40、A42或T43之后的氨基酸位點(diǎn)斷裂。與此相比，培養(yǎng)的真核細(xì)胞產(chǎn)生的Aβ-肽被分泌到上清培養(yǎng)液內(nèi)。
借助于適當(dāng)?shù)膱?bào)告系統(tǒng)，釋放的第二片斷蛋白可激活報(bào)告蛋白的表達(dá)，這一蛋白在真核細(xì)胞內(nèi)可被檢測到。通過對報(bào)告蛋白的檢測，可以證明在APP分子中發(fā)生了γ-分泌酶裂解作用。結(jié)果，γ-分泌酶或γ-分泌酶的活性可被定性或定量地測定。
這一測量方法的組成可更為詳細(xì)地描述如下第一核苷酸序列編碼淀粉樣前體蛋白(APP)或其部分。優(yōu)選地，第一核苷酸序列編碼的蛋白包含氨基酸序列SEQ ID NO.4；SEQ IDNO.4包含SEQ ID NO.1。
第二核苷酸序列編碼一個(gè)信號(hào)肽，優(yōu)選APP的信號(hào)肽(此后縮寫為SP”)。例如，這個(gè)信號(hào)肽(SP)包含氨基酸序列SEQ IDNO.5。
作為啟動(dòng)子，最可能使用可調(diào)節(jié)的或組成型啟動(dòng)子。比如，可為適合在哺乳細(xì)胞、秀麗新小桿線蟲、酵母或果蠅細(xì)胞內(nèi)表達(dá)蛋白的啟動(dòng)子。比如適合于哺乳細(xì)胞的啟動(dòng)子有CMV(如，Clontech，Heidelberg，德國)、HSV TK(如，Clontech)、RSV(如，Invitrogen，NV Leek，荷蘭)、SV40(如，Clontech)和LTR(如，Clontech)。再如，用于秀麗新小桿線蟲的啟動(dòng)子有uncl19，unc54，hsp16-2，GOA1和sel-12。對于酵母表達(dá)，啟動(dòng)子ADH1(組成型)(Vlckova等(1994)Gene，25(5)，472-4)，Gal1(條件性可誘導(dǎo)的)(Selleck等(1987)Nature 325，173-7)，MET3(條件性)(Cherest等，(1987)Mol Gen Genet 210，307-13)和Met25更為合適。對于果蠅，舉例說明，可能用啟動(dòng)子MT(金屬硫蛋白)(如，Invitrogen)，Ac5(Invitrogen)或Ds47(Invitrogen)。
優(yōu)選地，真核細(xì)胞被用于本檢測方法，如人類細(xì)胞或非人類的細(xì)胞，如猴、倉鼠、小鼠、果蠅、斑馬魚或酵母。比如，使用HeLa，293，H4，SH-SY5Y，H9，Cos，CHO，N2A，SL-2或釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)細(xì)胞。本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方案中使用了秀麗新小桿線蟲細(xì)胞。這個(gè)細(xì)胞可以是一個(gè)轉(zhuǎn)基因的非人動(dòng)物的組成部分。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)基因細(xì)胞可以是轉(zhuǎn)基因秀麗新小桿線蟲的組成部分。本發(fā)明特別涉及使用酵母細(xì)胞的檢測方法，如來自MAV203菌株(Life Technologies公司，Rockville鎮(zhèn)，馬里蘭州，美國)或EGY48(OriGene Technologies，Inc.，Rockville鎮(zhèn)，馬里蘭州，美國)的細(xì)胞。
所述轉(zhuǎn)基因編碼一個(gè)融合蛋白；這個(gè)融合蛋白由第一和第二核苷酸序列和必要時(shí)的額外的核苷酸序列編碼的部分蛋白組成。因此，這個(gè)融合蛋白包含了第一片段蛋白和第二片段蛋白及適當(dāng)時(shí)的其它片段蛋白。這個(gè)融合蛋白的氨基酸序列例如為SEQ ID NO.6。
詳細(xì)地講，具有核苷酸序列SEQ ID NO.8的轉(zhuǎn)基因可用于本測定方法。在本發(fā)明方法的一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，這個(gè)轉(zhuǎn)基因存在于一個(gè)表達(dá)載體上。該重組表達(dá)載體上有核苷酸序列SEQ ID NO.9。本發(fā)明的該具體方案也被稱為SP-C100-Gal 4-VP16系統(tǒng)。此時(shí)，一個(gè)由APP信號(hào)肽、APP的C100片段、Gal4和VP16組成的融合蛋白被表達(dá)。這個(gè)蛋白位于跨膜區(qū)域，在C100片段和第二片段蛋白-即包含部分C100片段、Gal4和VP16的融合蛋白部分-內(nèi)被裂解，在報(bào)告質(zhì)粒的協(xié)助下可被檢測。
除了轉(zhuǎn)基因構(gòu)建體SPC100-Gal4-VP16外，其它報(bào)告基因構(gòu)建體也是很可行的，例如，轉(zhuǎn)錄激活域可被插到SPC100跨膜區(qū)和胞漿區(qū)之間，或一個(gè)標(biāo)簽(Tag，如MYC，F(xiàn)LAG)插在N-和C-末端及在SPC100跨膜區(qū)和胞漿區(qū)之間。
所述額外的編碼核苷酸序列可編碼例如一種蛋白，且這個(gè)蛋白可用于第二片段蛋白的檢測。優(yōu)選該額外的編碼核苷酸序列位于第一核苷酸序列的3’末端。該額外的編碼核苷酸序列例如編碼一種嵌合蛋白或另一蛋白，這一蛋白由數(shù)個(gè)不同功能域構(gòu)成，如包含DNA-結(jié)合域和轉(zhuǎn)錄激活域的蛋白。在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方案中，該額外的編碼核苷酸序列編碼一個(gè)由Gal4-結(jié)合域和VP16的轉(zhuǎn)錄激活域(Gal4-VP16)組成的蛋白，該另外的片段蛋白優(yōu)選具有氨基酸序列SEQ IDNO.7。對于酵母細(xì)胞，這個(gè)額外蛋白還有LexA-結(jié)合域(即，LexA-VP16)。這個(gè)額外蛋白特別適合于應(yīng)用酵母細(xì)胞株EGY48的本檢測方法。
特別是，本發(fā)明涉及其中所用細(xì)胞共轉(zhuǎn)染了報(bào)告質(zhì)粒的檢測方法。報(bào)告質(zhì)粒包含的報(bào)告基因是在可調(diào)控啟動(dòng)子控制之下的。舉例說明，這個(gè)報(bào)告基因可編碼綠色熒光蛋白(GFP)和它的衍生物，如增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(Enhanced Green Fluorescent Protein，EGFP)、EBFP、EYFP、d2EGFP、GFPuv或熒光素酶(如，Promega，Mannheim，德國)、CAT(如，Promega)、SEAP(如Clontech)、βGal(如Clontech)或細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)因子，如Fas、TNF-R1、死亡域和類似物(Tartaglia等(1993)Cell 74，845-53)、ced3、ced4、ced9。對于可調(diào)啟動(dòng)子，報(bào)告質(zhì)粒可包含例如HIV的最小啟動(dòng)子、CD4啟動(dòng)子或mec7啟動(dòng)子。對于最適合的可調(diào)啟動(dòng)子的選擇主要取決于所用的轉(zhuǎn)錄-激活域。
本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方案涉及測定方法的具體執(zhí)行，所用細(xì)胞為酵母細(xì)胞。作為酵母表達(dá)載體pDBTRP(Life Technologies Inc.)(SEQ ID NO.11)-其中在一具體方案中使用MET-25啟動(dòng)子(見SEQ IDNO.12)-的替代，可以選擇帶有不同啟動(dòng)子(如誘導(dǎo)型Gal1啟動(dòng)子和MET-25啟動(dòng)子或組成性活性ADH1啟動(dòng)子)和不同選擇標(biāo)記(ADE，LEU，TRP，HIS，LYS，PHE)的其它大量表達(dá)載體。
一個(gè)具體實(shí)施方案中，使用酵母細(xì)胞，其包含穩(wěn)定地整合在基因組或存在于染色體外的Gal4或Lex可誘導(dǎo)性報(bào)告基因。
對于這些實(shí)施方案，優(yōu)選使用酵母細(xì)胞株MaV203(LifeTechnologies，Rockville，MD，U.S.A.)或EGY48(OrigeneTechnologies，Inc.Rockville，MD，U.S.A.)。
本發(fā)明方法的的一個(gè)具體實(shí)施方案涉及使用被額外的重組載體轉(zhuǎn)染了的細(xì)胞。優(yōu)選，這些實(shí)施方案中所用細(xì)胞正常情況下沒有或幾乎沒有內(nèi)源性γ-分泌酶或用上述提到的測定方法不能檢測到內(nèi)源性γ-分泌酶的活性。這類細(xì)胞可被額外的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化，這個(gè)表達(dá)載體含有編碼γ-分泌酶的核苷酸序列-優(yōu)選cDNA。例如，可以使用cDNA文庫。此外，本發(fā)明方法的該實(shí)施方案可特別用于鑒定γ-分泌酶或編碼γ-分泌酶的cDNA。用于搜索γ-分泌酶的cDNA文庫可從細(xì)胞或組織制備，如，B淋巴細(xì)胞、神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、腦海馬細(xì)胞、全腦、胎盤、腎臟。優(yōu)選，由人類細(xì)胞或人類組織制備cDNA，但也可由其動(dòng)物生物體(如，豚鼠、大鼠、小鼠、狗、猴)制備。
如果在細(xì)胞未被轉(zhuǎn)染的情況下不表現(xiàn)γ-分泌酶的活性，而轉(zhuǎn)染cDNA文庫后可表現(xiàn)γ-分泌酶活性，則存在于細(xì)胞內(nèi)的cDNA可編碼γ-分泌酶。通過已知的方法可從表現(xiàn)上述行為的細(xì)胞內(nèi)分離和鑒別cDNA。
本發(fā)明還涉及一種編碼一個(gè)融合蛋白并包含如下組成成分的轉(zhuǎn)基因a)第一編碼包含氨基酸序列GAIIGLMVGGVVIATVIVITLVML(SEQID NO.1)之蛋白的第一核苷酸序列，b)在第一核苷酸序列的5’末端的編碼信號(hào)肽的第二核苷酸序列，c)啟動(dòng)子，和d)在第一核苷酸序列的3’-末端、編碼一個(gè)DNA-結(jié)合域和一個(gè)轉(zhuǎn)錄激活域的至少一個(gè)額外的核苷酸序列。
優(yōu)選第一核苷酸序列編碼APP或部分APP。舉例說明，這個(gè)轉(zhuǎn)基因擁有的核苷酸序列SEQ ID NO.8。這個(gè)轉(zhuǎn)基可構(gòu)建到一個(gè)表達(dá)載體上。例如，這個(gè)表達(dá)載體的核苷酸序列為SEQ ID NO.9。
本發(fā)明方法涉及轉(zhuǎn)基因和/或表達(dá)載體用于生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因細(xì)胞的應(yīng)用。這類細(xì)胞可以是非人生物體的組成部分。例如，該轉(zhuǎn)基因和/或表達(dá)載體可用于產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因秀麗新小桿線蟲。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，該轉(zhuǎn)基因和/或表達(dá)載體可用于產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因酵母細(xì)胞，如釀酒酵母細(xì)胞。
本發(fā)明還涉及一種產(chǎn)生非人類生物如轉(zhuǎn)基因秀麗新小桿線蟲的方法，其中轉(zhuǎn)基因和/或包含一個(gè)轉(zhuǎn)基因的表達(dá)載體被微注射到生物體的性細(xì)胞內(nèi)，例如秀麗新小桿線蟲的性細(xì)胞。本發(fā)明還涉及含有本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因的細(xì)胞和含有本發(fā)明轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)基因秀麗新小桿線蟲。本發(fā)明還涉及含有本發(fā)明轉(zhuǎn)基因(優(yōu)選存在于適當(dāng)?shù)妮d體中)的細(xì)胞，尤其是酵母細(xì)胞。本發(fā)明尤其涉及含有本發(fā)明轉(zhuǎn)基因還有cDNA文庫的細(xì)胞，優(yōu)選酵母細(xì)胞。
本發(fā)明涉及轉(zhuǎn)基因或重組細(xì)胞、優(yōu)選酵母細(xì)胞或轉(zhuǎn)基因秀麗新小桿線蟲在測定γ-分泌酶或γ-分泌酶活性方法中的應(yīng)用；這些細(xì)胞或轉(zhuǎn)基因秀麗新小桿線蟲在鑒定γ-分泌酶活性抑制劑中的應(yīng)用和該測定方法本身。
尤其是，本發(fā)明涉及鑒定γ-分泌酶活性抑制劑的方法，該方法包含如下步驟1.產(chǎn)生非人類轉(zhuǎn)基因生物如轉(zhuǎn)基因秀麗新小桿線蟲或釀酒酵母或產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因細(xì)胞，該非人類轉(zhuǎn)基因生物或轉(zhuǎn)基因細(xì)胞包含一個(gè)具有如下組成成分的轉(zhuǎn)基因a)第一編碼包含氨基酸序列GAIIGLMVGGVVIATVIVITLVML(SEQ ID NO.1)之蛋白的第一核苷酸序列，b)在第一核苷酸序列5’-末端的第二編碼信號(hào)肽的第二核苷酸序列，和c)啟動(dòng)子，及非人類轉(zhuǎn)基因生物體或轉(zhuǎn)基因細(xì)胞還含有一個(gè)報(bào)告質(zhì)粒，該報(bào)告質(zhì)粒載有一個(gè)蛋白結(jié)合位點(diǎn)、一個(gè)最小啟動(dòng)子和一個(gè)報(bào)告基因，及，如果適宜，一個(gè)編碼γ-分泌酶的cDNA，其中該非人類轉(zhuǎn)基因生物體或轉(zhuǎn)基因細(xì)胞表達(dá)該轉(zhuǎn)基因及適當(dāng)時(shí)所述cDNA編碼的γ-分泌酶；2.將該非人類轉(zhuǎn)基因生物體或轉(zhuǎn)基因細(xì)胞與被研究的物質(zhì)一起保溫，及3.檢測第二片段蛋白的含量。本發(fā)明還涉及一種鑒別γ-分泌酶活性抑制物的方法，其中1.制備包含如下成分的轉(zhuǎn)基因a)第一編碼包含氨基酸序列GAIIGLMVGGVVIATVIVITLVML(SEQ ID NO.1)之蛋白的第一核苷酸序列，b)在第一核苷酸序列的5’-末端的編碼信號(hào)肽的第二核苷酸序列，和c)啟動(dòng)子，及，d)適當(dāng)時(shí)額外的編碼和/或非編碼性核苷酸序列；2.將該轉(zhuǎn)基因和一個(gè)報(bào)告質(zhì)粒及適當(dāng)時(shí)一個(gè)編碼γ-分泌酶的cDNA引入到細(xì)胞內(nèi)，且在被研究物質(zhì)存在的情況下表達(dá)由轉(zhuǎn)基因編碼的融合蛋白和適當(dāng)時(shí)cDNA編碼的γ-分泌酶，3.該融合蛋白被，A)裂解或B)不被細(xì)胞內(nèi)的γ-分泌酶在氨基酸序列SEQ ID NO.1內(nèi)裂解，這是由于下列原因之一，a)形成了含有氨基酸序列GAIIGLMVGGVV(SEQ ID NO.2)的第一片段蛋白和含有氨基酸序列VIVITLVML(SEQ ID NO.3)的第二片段蛋白，或b)沒有形成可檢測的第一和/或第二片段蛋白。
4.確定第二片段蛋白是否形成。
本發(fā)明還涉及可抑制γ-分泌酶活性的物質(zhì)的鑒別方法，其中編碼含有一個(gè)信號(hào)肽和氨基酸序列SEQ ID NO.1的蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)基因在被研究物質(zhì)和報(bào)告質(zhì)粒存在下表達(dá)，確定研究物質(zhì)對第二片段蛋白形成量的影響，第二片段蛋白包含氨基酸序列VIVITLVML(SEQ ID NO.3)。
本發(fā)明還涉及由本發(fā)明方法鑒別的γ-分泌酶抑制劑。
本發(fā)明還涉及一種藥物生產(chǎn)方法，將利用上述方法鑒定出的藥物活性化合物通過配制和/或與藥學(xué)上可接受的載體混合進(jìn)一步加工。
本發(fā)明還涉及一個(gè)用于實(shí)施上述方法的檢驗(yàn)試劑盒。
本發(fā)明方法尤其可與例如C100-Gal4-VP16系統(tǒng)(即一個(gè)由C100，Gal4和VP16組成的融合蛋白或用編碼此融合蛋白的核苷酸序列)聯(lián)合使用，用于1.γ-分泌酶活性的鑒定和測定(定性和/或定量)。
2.在不同組織、細(xì)胞和生物體或物種中對γ-分泌酶的鑒定。編碼γ-分泌酶的有關(guān)cDNA的鑒定和分離，及這一cDNA的進(jìn)一步應(yīng)用。
3.對例如酵母細(xì)胞(釀酒酵母)或秀麗新小桿線蟲的在體篩選，且可能在不用免疫生物學(xué)方法的情況下測定γ-分泌酶活性。
4.本發(fā)明方法可用于鑒定和分離一些物質(zhì)，如藥理活性化合物，這類化合物可調(diào)節(jié)γ-分泌酶的活性，如γ-分泌酶的抑制劑。尤其是，本發(fā)明方法可用于高通量篩選(HTS，High ThroughputScreening)。比如，可鑒定一些物質(zhì)，這類物質(zhì)可用于阿爾茨海默病的治療和/或預(yù)防性治療。
5.對于阿爾茨海默病發(fā)病機(jī)理的探討，如，利用APP的突變體或C100。
6.所描述的融合蛋白/轉(zhuǎn)基因如SP-C100-Gal4-VP16內(nèi)的C100可被完整的APP和γ-分泌酶所替代，可利用本方法類似地研究其活性和調(diào)節(jié)。
圖1圖1所示為淀粉樣前體蛋白(同形體APP695和同形體APP770或APP751)和分泌酶的裂解產(chǎn)物。
圖2圖解顯示本發(fā)明方法所基于的原理β-分泌酶的裂解位點(diǎn)在N-末端；γ-分泌酶的裂解位點(diǎn)在跨膜區(qū)域內(nèi)；C100＝APP的C100片段；Gal4-V16＝DNA-結(jié)合域、轉(zhuǎn)錄激活域(由DNA-結(jié)合域和轉(zhuǎn)錄激活子組成)，其可與報(bào)告質(zhì)粒DNA上的蛋白-結(jié)合域結(jié)合。
圖3表達(dá)質(zhì)粒SP-C100-Gal4-VP16的構(gòu)建aa＝氨基酸；SacI，Hind III和Kpn I限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)所示為質(zhì)粒上斷裂位點(diǎn)的位置。
圖4表達(dá)質(zhì)粒pDBTRP-MET25-SP-C100-Ga14-VP16在酵母細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行轉(zhuǎn)基因表達(dá)的表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建。
實(shí)施例實(shí)施例1表達(dá)質(zhì)粒SP-C100-Gal4-VP16的構(gòu)建這個(gè)質(zhì)粒編碼APP的信號(hào)肽，即融入了APP C-末端的100個(gè)氨基酸殘基(C100)。C100開始于Aβ-肽的N-末端，結(jié)束于APP的C-末端。它必須被γ-分泌酶進(jìn)一步裂解才可釋放出Aβ-肽。
將Gal4-VP16融入了SP-C100的C-末端。Gal4-VP16是由酵母細(xì)胞轉(zhuǎn)錄激活因子Gal4的頭147個(gè)氨基酸殘基和單純皰疹病毒的轉(zhuǎn)錄激活因子VP16的C-末端78個(gè)氨基酸殘基組成。作為一個(gè)融合蛋白，Gal4蛋白片段接管與DNA結(jié)合的功能，而VP16蛋白片段激活轉(zhuǎn)錄(Sadowski等，(1988)Sciences 335，563)。pcDNA3.1+購自荷蘭Invitrogen，作為一個(gè)載體質(zhì)粒。
實(shí)施例2報(bào)告質(zhì)粒pGL2 MRG5 EGFP的構(gòu)建報(bào)告質(zhì)粒pGL2 MRG5在HIV-TATA盒前有5個(gè)Gal4結(jié)合位點(diǎn)。為了便于在細(xì)胞培養(yǎng)物內(nèi)檢測，pGL2 MRG5上的熒光素酶基因與購自Clontech，Heidelberg的pEGFP N1載體上的EGFP(增強(qiáng)型綠色熒光蛋白)基因進(jìn)行了互換。
實(shí)施例3人成神經(jīng)細(xì)胞瘤細(xì)胞(SH-SY5Y細(xì)胞)用上述兩種質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染，然后，在波長480nm的光照射下，通過其所激發(fā)的EGFP在顯微鏡下進(jìn)行了分析。在某些情況下，可以檢測到細(xì)胞所發(fā)射出的強(qiáng)綠色光。
因?yàn)樵跊]有特異激活的情況下，這種效應(yīng)也可能基于報(bào)告質(zhì)粒對EGFP的表達(dá)，所以還只用該報(bào)告質(zhì)粒轉(zhuǎn)染了SH-SY5Y細(xì)胞。在這些細(xì)胞內(nèi)，檢測不到綠色熒光。因此，EGFP的表達(dá)必須被Gal4-VP16激活，它預(yù)示APP C-末端被蛋白水解后釋放。到目前為止，除了γ-分泌酶，未提到其它的蛋白水解活性能在跨膜區(qū)域或在胞質(zhì)內(nèi)部分進(jìn)行蛋白水解加工APP。因此，我們認(rèn)為與Gal4-VP16融合的APP C-末端的釋放系基于γ-分泌酶的活性。
實(shí)施例4應(yīng)用C100-Gal4-VP16系統(tǒng)在cDNA文庫中檢測編碼γ-分泌酶的cDNA將SPC100-Gal4-VP16克隆到由MET25啟動(dòng)子控制的酵母表達(dá)載體pDBTRP(Life Technologies，Rockville，MD，U.S.A.)中，并用這一表達(dá)載體轉(zhuǎn)化了酵母細(xì)胞株MaV203(Life Technologies)。酵母細(xì)胞株MaV203已在基因水平上被修飾，且包含三個(gè)穩(wěn)定地整合到基因組內(nèi)的GAL4-誘導(dǎo)性報(bào)告基因(URA3，HIS3，LacZ)。在MaV203內(nèi)，SPC100-Gal4-VP16 cDNA的表達(dá)只提供低水平的報(bào)告蛋白的活性，因此本系統(tǒng)適合于在cDNA文庫內(nèi)搜尋γ-分泌酶。
實(shí)施例5由實(shí)施例4構(gòu)建的重組MaV203細(xì)胞可應(yīng)用于例如鑒定γ-分泌酶或篩選人類B淋巴細(xì)胞cDNA文庫(American Type Culture Collection，Manassas，VA，U.S.A.)。類似地，整合到酵母表達(dá)載體p415-MET25(ATCC，Nucleic Acid Research，1994，Vol.22，No.25，5767)或p415-ADH1(ATCC，GENE，1995，158119-122)中的人類海馬細(xì)胞cDNA文庫也可用于篩選編碼γ-分泌酶的cDNA或具有γ-分泌酶活性的蛋白。(SEQ lD NO.1)GAIIGLMVGGVVIATVIVITLVML第一片段蛋白(SEQ ID NO.2)GAIIGLMVGGVV第二片段蛋白(SEQ ID NO.3)VIVITLVMLC100片段的氨基酸序列(SEQ ID NO.4)LDAEFRHDSG YEVHHQKLVF FAEDVGSNKG AIIGLMVGGV VIATVIVITLVMLKKKQYTS IHHGVVEVDA AVTPEERHLS KMQQNGYENP TYKFFEQMQNAPP信號(hào)肽的氨基酸序列(SEQ ID NO.5)MLPGLALFLL AAWTARASP-C100片段的氨基酸序列(SEQ ID NO.6)MLPGLALFLL AAWTARALDA EFRHDSGYEV HHQKLVFFAE DVGSNKGAIIGLMVGGVVIA TVIVITLVML KKKQYTSIHH GVVEVDAAVT PEERHLSKMQQNGYENPTYK FFEQMQN轉(zhuǎn)錄-激活域VP16和Gal4結(jié)合域(Gal4-VP16)(SEQ ID NO.7)MKLLSSIEQA CDICRLKKLK CSKEKPKCAK CLKNNWECRY SPKTKRSPLTRAHLTEVESR LERLEQLFLL IFPREDLDMI LKMDSLQDIK ALLTGLFVQDNVNKDAVTDR LASVETDMPL TLRQHRISAT SSSEESSNKG QRQLTVSPEFPGIWAPPTDV SLGDELHLDG EDVAMAHADA LDDFDLDMLG DGDSPGPGFTPHDSAPYGAL DMADFEFEQM FTDALGIDEY GG編碼SP-C100-Gal4-VP16的轉(zhuǎn)基因核苷酸序列(SEQ ID NO.8)GGCAAGGCTTGACCGACAATTGCATGAAGAATCTGCTTAGGGTTAGGCGTTTTGCGCTGCTTCGCGATGTACGGGCCAGATATACGCGTTGACATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGACTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTCTCTGGCTAACTAGAGAACCCACTGCTTACTGGCTTATCGAAATTAATACGACTCACTATAGGGAGACCCAAGCTGGCTAGCGTTTAAACTTAAGCTTCACAGCTAGCGCACTCGGTGCCCCGCGCAGGGTCGCGATGCTGCCCGGTTTGGCACTGTTCCTGCTGGCCGCCTGGACGGCTCGGGCGCTGGATGCAGAATTCCGACATGACTCAGGATATGAAGTTCATCATCAAAAATTGGTGTTCTTTGCAGAAGATGTGGGTTCAAACAAAGGTGCAATCATTGGACTCATGGTGGGCGGTGTTGTCATAGCGACAGTGATCGTCATCACCTTGGTGATGCTGAAGAAGAAACAGTACACATCCATTCATCATGGTGTGGTGGAGGTTGACGCCGCTGTCACCCCAGAGGAGCGCCACCTGTCCAAGATGCAGCAGAACGGCTACGAAAATCCAACCTACAAGTTCTTTGAGCAGATGCAGAACGCGCGGGGTACCCCGGCG ATGAAGC TACTGTCTTC TATCGAACAA GCATGCGATA TTTGCCGACTTAAAAAGCTC AAGTGCTCCA AAGAAAAACC GAAGTGCGCC AAGTGTCTGA AGAACAACTGGGAGTGTCGC TACTCTCCCA AAACCAAAAG GTCTCCGCTG ACTAGGGCAC ATCTGACAGAAGTGGAATCA AGGCTAGAAA GACTGGAACA GCTATTTCTA CTGATTTTTC CTCGAGAAGACCTTGACATG ATTTTGAAAA TGGATTCTTT ACAGGATATA AAAGCATTGT TAACAGGATTATTTGTACAA GATAATGTGA ATAAAGATGC CGTCACAGAT AGATTGGCTT CAGTGGAGACTGATATGCCT CTAACATTGA GACAGCATAG AATAAGTGCG ACATCATCAT CGGAAGAGAGTAGTAACAAA GGTCAAAGAC AGTTGACTGT ATCG CCGGAATTCCCGGGGATCTGGGC CCCCCCGACCGATGTCAGC CTGGGGGACG AGCTCCACTT AGACGGCGAG GACGTGGCGA TGGCGCATGCCGACGCGCTA GACGATTTCG ATCTGGACAT GTTGGGGGAC GGGGATTCCC CGGGGCCGGGATTTACCCCC CACGACTCCG CCCCCTACGG CGCTCTGGAT ATGGCCGACT TCGAGTTTGAGCAGATGTTT ACCGATGCCC TTGGAATTGA CGAGTACGGT GGGTAG哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)載體pcDNA3.1+(荷蘭Invitrogen公司)的核苷酸序列(SEQ ID NO.9)GACGGATCGGGAGATCTCCCGATCCCCTATGGTCGACTCTCAGTACAATCTGCTCTGATGCCGCATAGTTAAGCCAGTATCTGCTCCCTGCTTGTGTGTTGGAGGTCGCTGAGTAGTGCGCGAGCAAAATTTAAGCTACAACAAGGCAAGGCTTGACCGACAATTGCATGAAGAATCTGCTTAGGGTTAGGCGTTTTGCGCTGCTTCGCGATGTACGGGCCAGATATACGCGTTGACATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGACTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTCTCTGGCTAACTAGAGAACCCACTGCTTACTGGCTTATCGAAATTAATACGACTCACTATAGGGAGACCCAAGCTGGCTAGCGTTTAAACTTAAGCTTGGTACCGAGCTCGGATCCACTAGTCCAGTGTGGTGGAATTCTGCAGATATCCAGCACAGTGGCGGCCGCTCGAGTCTAGAGGGCCCGTTTAAACCCGCTGATCAGCCTCGACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGATGCGGTGGGCTCTATGGCTTCTGAGGCGGAAAGAACCAGCTGGGGCTCTAGGGGGTATCCCCACGCGCCCTGTAGCGGCGCATTAAGCGCGGCGGGTGTGGTGGTTACGCGCAGCGTGACCGCTACACTTGCCAGCGCCCTAGCGCCCGCTCCTTTCGCTTTCTTCCCTTCCTTTCTCGCCACGTTCGCCGGCTTTCCCCGTCAAGCTCTAAATCGGGGCATCCCTTTAGGGTTCCGATTTAGTGCTTTACGGCACCTCGACCCCAAAAAACTTGATTAGGGTGATGGTTCACGTAGTGGGCCATCGCCCTGATAGACGGTTTTTCGCCCTTTGACGTTGGAGTCCACGTTCTTTAATAGTGGACTCTTGTTCCAAACTGGAACAACACTCAACCCTATCTCGGTCTATTCTTTTGATTTATAAGGGATTTTGGGGATTTCGGCCTATTGGTTAAAAAATGAGCTGATTTAACAAAAATTTAACGCGAATTAATTCTGTGGAATGTGTGTCAGTTAGGGTGTGGAAAGTCCCCAGGCTCCCCAGGCAGGCAGAAGTATGCAAAGCATGCATCTCAATTAGTCAGCAACCAGGTGTGGAAAGTCCCCAGGCTCCCCAGCAGGCAGAAGTATGCAAAGCATGCATCTCAATTAGTCAGCAACCATAGTCCCGCCCCTAACTCCGCCCATCCCGCCCCTAACTCCGCCCAGTTCCGCCCATTCTCCGCCCCATGGCTGACTAATTTTTTTTATTTATGCAGAGGCCGAGGCCGCCTCTGCCTCTGAGCTATTCCAGAAGTAGTGAGGAGGCTTTTTTGGAGGCCTAGGCTTTTGCAAAAAGCTCCCGGGAGCTTGTATATCCATTTTCGGATCTGATCAAGAGACAGGATGAGGATCGTTTCGCATGATTGAACAAGATGGATTGCACGCAGGTTCTCCGGCCGCTTGGGTGGAGAGGCTATTCGGCTATGACTGGGCACAACAGACAATCGGCTGCTCTGATGCCGCCGTGTTCCGGCTGTCAGCGCAGGGGCGCCCGGTTCTTTTTGTCAAGACCGACCTGTCCGGTGCCCTGAATGAACTGCAGGACGAGGCAGCGCGGCTATCGTGGCTGGCCACGACGGGCGTTCCTTGCGCAGCTGTGCTCGACGTTGTCACTGAAGCGGGAAGGGACTGGCTGCTATTGGGCGAAGTGCCGGGGCAGGATCTCCTGTCATCTCACCTTGCTCCTGCCGAGAAAGTATCCATCATGGCTGATGCAATGCGGCGGCTGCATACGCTTGATCCGGCTACCTGCCCATTCGACCACCAAGCGAAACATCGCATCGAGCGAGCACGTACTCGGATGGAAGCCGGTCTTGTCGATCAGGATGATCTGGACGAAGAGCATCAGGGGCTCGCGCCAGCCGAACTGTTCGCCAGGCTCAAGGCGCGCATGCCCGACGGCGAGGATCTCGTCGTGACCCATGGCGATGCCTGCTTGCCGAATATCATGGTGGAAAATGGCCGCTTTTCTGGATTCATCGACTGTGGCCGGCTGGGTGTGGCGGACCGCTATCAGGACATAGCGTTGGCTACCCGTGATATTGCTGAAGAGCTTGGCGGCGAATGGGCTGACCGCTTCCTCGTGCTTTACGGTATCGCCGCTCCCGATTCGCAGCGCATCGCCTTCTATCGCCTTCTTGACGAGTTCTTCTGAGCGGGACTCTGGGGTTCGAAATGACCGACCAAGCGACGCCCAACCTGCCATCACGAGATTTCGATTCCACCGCCGCCTTCTATGAAAGGTTGGGCTTCGGAATCGTTTTCCGGGACGCCGGCTGGATGATCCTCCAGCGCGGGGATCTCATGCTGGAGTTCTTCGCCCACCCCAACTTGTTTATTGCAGCTTATAATGGTTACAAATAAAGCAATAGCATCACAAATTTCACAAATAAAGCATTTTTTTCACTGCATTCTAGTTGTGGTTTGTCCAAACTCATCAATGTATCTTATCATGTCTGTATACCGTCGACCTCTAGCTAGAGCTTGGCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCACAATTCCACACAACATACGAGCCGGAAGCATAAAGTGTAAAGCCTGGGGTGCCTAATGAGTGAGCTAACTCACATTAATTGCGTTGCGCTCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAGCTGCATTAATGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCAATGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGGACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAATCTAAAGTATATATGAGTAAACTTGGTCTGACAGTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCTATCTCAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCATAGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTAGATAACTACGATACGGGAGGGCTTACCATCTGGCCCCAGTGCTGCAATGATACCGCGAGACCCACGCTCACCGGCTCCAGATTTATCAGCAATAAACCAGCCAGCCGGAAGGGCCGAGCGCAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCCATCCAGTCTATTAATTGTTGCCGGGAAGCTAGAGTAAGTAGTTCGCCAGTTAATAGTTTGCGCAACGTTGTTGCCATTGCTACAGGCATCGTGGTGTCACGCTCGTCGTTTGGTATGGCTTCATTCAGCTCCGGTTCCCAACGATCAAGGCGAGTTACATGATCCCCCATGTTGTGCAAAAAAGCGGTTAGCTCCTTCGGTCCTCCGATCGTTGTCAGAAGTAAGTTGGCCGCAGTGTTATCACTCATGGTTATGGCAGCACTGCATAATTCTCTTACTGTCATGCCATCCGTAAGATGCTTTTCTGTGACTGGTGAGTACTCAACCAAGTCATTCTGAGAATAGTGTATGCGGCGACCGAGTTGCTCTTGCCCGGCGTCAATACGGGATAATACCGCGCCACATAGCAGAACTTTAAAAGTGCTCATCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGAAAACTCTCAAGGATCTTACCGCTGTTGAGATCCAGTTCGATGTAACCCACTCGTGCACCCAACTGATCTTCAGCATCTTTTACTTTCACCAGCGTTTCTGGGTGAGCAAAAACAGGAAGGCAAAATGCCGCAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAATACTCATACTCTTCCTTTTTCAATATTATTGAAGCATTTATCAGGGTTATTGTCTCATGAGCGGATACATATTTGAATGTATTTAGAAAAATAAACAAATAGGGGTTCCGCGCACATTTCCCCGAAAAGTGCCACCTGACGTCAPP的核苷酸序列(SEQ ID NO.10)AGTTTCCTCG GCAGCGGTAG GCGAGAGCAC GCGGAGGAGC GTGCGCGGGG GCCCCGGGAGACGGCGGCGG TGGCGGCGCG GGCAGAGCAA GGACGCGGCG GATCCCACTC GCACAGCAGCGCACTCGGTG CCCCGCGCAG GGTCGCGATG CTGCCCGGTT TGGCACTGCT CCTGCTGGCCGCCTGGACGG CTCGGGCGCT GGAGGTACCC ACTGATGGTA ATGCTGGCCT GCTGGCTGAACCCCAGATTG CCATGTTCTG TGGCAGACTG AACATGCACA TGAATGTCCA GAATGGGAAGTGGGATTCAG ATCCATCAGG GACCAAAACC TGCATTGATA CCAAGGAAGG CATCCTGCAGTATTGCCAAG AAGTCTACCC TGAACTGCAG ATCACCAATG TGGTAGAAGC CAACCAACCAGTGACCATCC AGAACTGGTG CAAGCGGGGC CGCAAGCAGT GCAAGACCCA TCCCCACTTTGTGATTCCCT ACCGCTGCTT AGTTGGTGAG TTTGTAAGTG ATGCCCTTCT CGTTCCTGACAAGTGCAAAT TCTTACACCA GGAGAGGATG GATGTTTGCG AAACTCATCT TCACTGGCACACCGTCGCCA AAGAGACATG CAGTGAGAAG AGTACCAACT TGCATGACTA CGGCATGTTGCTGCCCTGCG GAATTGACAA GTTCCGAGGG GTAGAGTTTG TGTGTTGCCC ACTGGCTGAAGAAAGTGACA ATGTGGATTC TGCTGATGCG GAGGAGGATG ACTCGGATGT CTGGTGGGGCGGAGCAGACA CAGACTATGC AGATGGGAGT GAAGACAAAG TAGTAGAAGT AGCAGAGGAGGAAGAAGTGG CTGAGGTGGA AGAAGAAGAA GCCGATGATG ACGAGGACGA TGAGGATGGTGATGAGGTAG AGGAAGAGGC TGAGGAACCC TACGAAGAAG CCACAGAGAG AACCACCAGCATTGCCACCA CCACCACCAC CACCACAGAG TCTGTGGAAG AGGTGGTTCG AGTTCCTACAACAGCAGCCA GTACCCCTGA TGCCGTTGAC AAGTATCTCG AGACACCTGG GGATGAGAATGAACATGCCC ATTTCCAGAA AGCCAAAGAG AGGCTTGAGG CCAAGCACCG AGAGAGAATGTCCCAGGTCA TGAGAGAATG GGAAGAGGCA GAACGTCAAG CAAAGAACTT GCCTAAAGCTGATAAGAAGG CAGTTATCCA GCATTTCCAG GAGAAAGTGG AATCTTTGGA ACAGGAAGCAGCCAACGAGA GACAGCAGCT GGTGGAGACA CACATGGCCA GAGTGGAAGC CATGCTCAATGACCGCCGCC GCCTGGCCCT GGAGAACTAC ATCACCGCTC TGCAGGCTGT TCCTCCTCGGCCTCGTCACG TGTTCAATAT GCTAAAGAAG TATGTCCGCG CAGAACAGAA GGACAGACAGCACACCCTAA AGCATTTCGA GCATGTGCGC ATGGTGGATC CCAAGAAAGC CGCTCAGATCCGGTCCCAGG TTATGACACA CCTCCGTGTG ATTTATGAGC GCATGAATCA GTCTCTCTCCCTGCTCTACA ACGTGCCTGC AGTGGCCGAG GAGATTCAGG ATGAAGTTGA TGAGCTGCTTCAGAAAGAGC AAAACTATTC AGATGACGTC TTGGCCAACA TGATTAGTGA ACCAAGGATCAGTTACGGAA ACGATGCTCT CATGCCATCT TTGACCGAAA CGAAAACCAC CGTGGAGCTCCTTCCCGTGA ATGGAGAGTT CAGCCTGGAC GATCTCCAGC CGTGGCATTC TTTTGGGGCTGACTCTGTGC CAGCCAACAC AGAAAACGAA 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NO.11)GACGAAAGGGCCTCGTGATACGCCTATTTTTATAGGTTAATGTCATGATAATAATGGTTTCTTAGGACGGATCGCTTGCCTGTAACTTACACGCGCCTCGTATCTTTTAATGATGGAATAATTTGGGAATTTACTCTGTGTTTATTTATTTTTATGTTTTGTATTTGGATTTTAGAAAGTAAATAAAGAAGGTAGAAGAGTTACGGAATGAAGAAAAAAAAATAAACAAAGGTTTAAAAAATTTCAACAAAAAGCGTACTTTACATATATATTTATTAGACAAGAAAAGCAGATTAAATAGATATACATTCGATTAACGATAAGTAAAATGTAAAATCACAGGATTTTCGTGTGTGGTCTTCTACACAGACAAGATGAAACAATTCGGCATTAATACCTGAGAGCAGGAAGAGCAAGATAAAAGGTAGTATTTGTTGGCGATCCCCCTAGAGTCTTTTACATCTTCGGAAAACAAAAACTATTTTTTCTTTAATTTCTTTTTTTACTTTCTATTTTTAATTTATATATTTATATTAAAAAATTTAAATTATAATTATTTTTATAGCACGTGATGAAAAGGACCCAGGTGGCACTTTTCGGGGAAATGTGCGCGGAACCCCTATTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTATCCGCTCATGAGACAATAACCCTGATAAATGCTTCAATAATCTGCAGCTCTGGCCCGTGTCTCAAAATCTCTGATGTTACATTGCACAAGATAAAAATATATCATCATGAACAATAAAACTGTCTGCTTACATAAACAGTAATACAAGGGGTGTTATGAGCCATATTCAACGGGAAACGTCTTGCTGGAGGCCGCGATTAAATTCCAACATGGATGCTGATTTATATGGGTATAAATGGGCTCGCGATAATGTCGGGCAATCAGGTGCGACAATCTTTCGATTGTATGGGAAGCCCGATGCGCCAGAGTTGTTTCTGAAACATGGCAAAGGTAGCGTTGCCAATGATGTTACAGATGAGATGGTCAGACTAAACTGGCTGACGGAATTTATGCCTCTTCCGACCATCAAGCATTTTATCCGTACTCCTGATGATGCATGGTTACTCACCACTGCGATCCGCGGGAAAACAGCATTCCAGGTATTAGAAGAATATCCTGATTCAGGTGAAAATATTGTTGATGCGCTGGCAGTGTTCCTGCGCCGGTTGCATTCGATTCCTGTTTGTAATTGTCCTTTTAACAGCGATCGCGTATTTCGTCTCGCTCAGGCGCAATCACGAATGAATAACGGTTTGGTTGATGCGAGTGATTTTGATGACGAGCGTAATGGCTGGCCTGTTGAACAAGTCTGGAAAGAAATGCATACGCTTTTGCCATTCTCACCGGATTCAGTCGTCACTCATGGTGATTTCTCACTTGATAACCTTATTTTTGACGAGGGGAAATTAATAGGTTGTATTGATGTTGGACGAGTCGGAATCGCAGACCGATACCAGGATCTTGCCATCCTATGGAACTGCCTCGGTGAGTTTTCTCCTTCATTACAGAAACGGCTTTTTCAAAAATATGGTATTGATAATCCTGATATGAATAAATTGCAGTTTCATTTGATGCTCGATGAGTTTTTCTAATCAGAATTGGTTAATTGGTTGTAACACTGGCAGAGCATTACGCTGACTTGACGGGACGGCGCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCGTTCCACTGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAGATCAAAGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATACCAAATACTGTCCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAACTGAGATACCTACAGCGTGAGCATTGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGGAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCCGAGCCTATGGAAAAACGCCAGCAACGCGGCCTTTTTACGGTTCCTGGCCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCACATGTTCTTTCCTGCGTTATCCCCTGATTCTGTGGATAACCGTATTACCGCCTTTGAGTGAGCTGATACCGCTCGCCGCAGCCGAACGACCGAGCGCAGCGAGTCAGTGAGCGAGGAAGCGGAAGAGCGCCCAATACGCAAACCGCCTCTCCCCGCGCGTTGGCCGATTCATTAATGCAGCTGGCACGACAGGTTTCCCGACTGGAAAGCGGGCAGTGAGCGCAACGCAATTAATGTGAGTTACCTCACTCATTAGGCACCCCAGGCTTTACACTTTATGCTTCCGGCTCCTATGTTGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGCTATGACCATGATTACGCCAAGCTCGGAATTAACCCTCACTAAAGGGAACAAAAGCTGGTACCGATCCCGAGCTTTGCAAATTAAAGCCTTCGAGCGTCCCAAAACCTTCTCAAGCAAGGTTTTCAGTATAATGTTACATGCGTACACGCGTCTGTACAGAAA 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權(quán)利要求
1.一種γ-分泌酶活性的檢測方法，其中1)應(yīng)用一個(gè)轉(zhuǎn)基因，其編碼一個(gè)融合蛋白并包含如下組成成分a)第一編碼包含氨基酸序列GAIIGLMVGGVVIATVIVITLVML(SEQID NO.1)之蛋白的第一核苷酸序列，b)在第一核苷酸序列的5’-末端的編碼信號(hào)肽的第二核苷酸序列，c)啟動(dòng)子，及d)適當(dāng)時(shí)的額外編碼和/或非編碼性核苷酸序列；2)將該轉(zhuǎn)基因引入細(xì)胞，并表達(dá)所述融合蛋白；3)該融合蛋白在氨基酸序列SEQ ID NO.1內(nèi)被細(xì)胞內(nèi)γ-分泌酶裂解，從而形成包含氨基酸序列GAIIGLMVGGVV(SEQ ID NO.2)的第一片段蛋白和含有氨基酸序列VIVITLVML(SEQ ID NO.3)的第二片段蛋白，及4)檢測第一片段蛋白和/或第二片段蛋白。
2.一種γ-分泌酶活性的檢測方法，如下，1)應(yīng)用一個(gè)轉(zhuǎn)基因，其編碼一個(gè)融合蛋白并包含如下組成成分a)編碼包含氨基酸序列GAIIGLMVGGVVIATVIVITLVML(SEQ IDNO.1)之蛋白的第一核苷酸序列，b)在第一核苷酸序列的5’-末端的編碼信號(hào)肽的第二核苷酸序列，c)啟動(dòng)子，及d)適當(dāng)時(shí)的額外編碼和/或非編碼性核苷酸序列；2)將該轉(zhuǎn)基因引入細(xì)胞，并表達(dá)所述融合蛋白；3)該融合蛋白在氨基酸序列SEQ ID NO.1內(nèi)被細(xì)胞內(nèi)γ-分泌酶裂解，從而形成包含氨基酸序列GAIIGLMVGGVV(SEQ ID NO.2)的第一片段蛋白和含有氨基酸序列VIVITLVML(SEQ ID NO.3)的第二片段蛋白，及4)測定第二片段蛋白的量，由第二片段蛋白的形成量確定γ-分泌酶的活性。
3.如權(quán)利要求1和2之一所述的方法，其中第一核苷酸序列編碼淀粉樣前體蛋白(APP)或其部分。
4.如權(quán)利要求1至3之一所述的方法，，其中第一核苷酸序列編碼一個(gè)氨基酸序列為SEQ ID NO.4的蛋白。
5.如權(quán)利要求1至4之一所述的方法，其中第二核苷酸序列編碼APP的信號(hào)肽(SP)。
6.如權(quán)利要求1至5之一所述的方法，其中信號(hào)肽具有氨基酸序列SEQ ID NO.5。
7.如權(quán)利要求1至6之一所述的方法，其中啟動(dòng)子是用于在哺乳動(dòng)物細(xì)胞、秀麗新小桿線蟲、酵母或果蠅內(nèi)表達(dá)的啟動(dòng)子。
8.如權(quán)利要求1至7之一所述的方法，其中啟動(dòng)子為CMV、HSVTK、RSV、SV40、LTR、unc119、unc54、hsp16-2、GoA1、sel-12、ADH1、Gal1、MET3、MET25、MT、Ac5或Ds47啟動(dòng)子。
9.如權(quán)利要求1至8之一所述的方法，其中細(xì)胞為真核細(xì)胞。
10.如權(quán)利要求1至9之一所述的方法，其中細(xì)胞為人類細(xì)胞。
11.如權(quán)利要求1至9之一所述的方法，其中細(xì)胞為非人類細(xì)胞。
12.如權(quán)利要求11中所述的方法，其中細(xì)胞為HeLa，293，H4，SH-SY5Y，H9，Cos，CHO，N2A，SL-2或釀酒酵母細(xì)胞。
13.如權(quán)利要求11中所述的方法，其中細(xì)胞為秀麗新小桿線蟲細(xì)胞。
14.如權(quán)利要求12中所述的方法，其中細(xì)胞為轉(zhuǎn)基因秀麗新小桿線蟲細(xì)胞。
15.如權(quán)利要求11中所述的方法，其中細(xì)胞為酵母細(xì)胞。
16.如權(quán)利要求1至15之一所述的方法，其中融合蛋白具有或包含氨基酸序列SEQ ID NO.6。
17.如權(quán)利要求1至16之一所述的方法，其中所述額外編碼核苷酸序列位于第一核苷酸序列的3’-末端。
18.如權(quán)利要求1至17之一所述的方法，其中所述額外的編碼核苷酸序列編碼一個(gè)蛋白，該蛋白與第一片段蛋白和第二片段蛋白一起作為融合蛋白表達(dá)，并可用于第二片段蛋白的檢測。
19.如權(quán)利要求1至18之一所述的方法，其中所述額外的編碼核苷酸序列編碼一種含有DNA-結(jié)合域和轉(zhuǎn)錄-激活域的蛋白。
20.如權(quán)利要求1至19之一所述的方法，其中所述額外的編碼核苷酸序列編碼一種由Gal4-結(jié)合域和VP16的轉(zhuǎn)錄-激活域(Gal4-VP16)組成的蛋白。
21.如權(quán)利要求1至20之一所述的方法，其中由報(bào)告質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染所述細(xì)胞，該報(bào)告質(zhì)粒包含一個(gè)受可調(diào)節(jié)啟動(dòng)子控制的報(bào)告基因。
22.如權(quán)利要求21所述的方法，其中方法所述可調(diào)節(jié)啟動(dòng)子可被轉(zhuǎn)錄-激活域激活。
23.如權(quán)利要求22所述的方法，其中所述報(bào)告質(zhì)粒編碼一個(gè)EGFP(增強(qiáng)型綠色熒光蛋白)報(bào)告基因，和所述可調(diào)節(jié)啟動(dòng)子含有Gal4結(jié)合位點(diǎn)和HIV的最小啟動(dòng)子。
24.如權(quán)利要求1至23之一所述的方法，其中所述轉(zhuǎn)基因具有核苷酸序列SEQ ID NO.8。
25.如權(quán)利要求1至24之一所述的方法，其中轉(zhuǎn)基因存在于載體上。
26.如權(quán)利要求1至25之一所述的方法，其中所述重組載體具有核苷酸序列SEQ ID NO.9。
27.如權(quán)利要求1至26之一所述的方法，其中所述細(xì)胞中沒有可檢測的內(nèi)源性γ-分泌酶活性。
28.如權(quán)利要求1至27之一所述的方法，其中細(xì)胞用cDNA文庫共轉(zhuǎn)染。
29.如權(quán)利要求28所述的方法，其中從人類或非人類組織、或人類或非人類細(xì)胞制備的cDNA存在于cDNA文庫。
30.權(quán)利要求27至29之一的方法在鑒別編碼γ-分泌酶之cDNA中的應(yīng)用，其中a)鑒別在其中可檢測到γ-分泌酶活性的細(xì)胞，和b)從該細(xì)胞分離編碼γ-分泌酶的cDNA。
31.一種轉(zhuǎn)基因，其含有a)編碼含氨基酸序列GAIIGLMVGGVVIATVIVITLVML(SEQ IDNO.1)之蛋白的第一核苷酸序列，b)在第一核苷酸序列的5’-末端的編碼一個(gè)信號(hào)肽的第二核苷酸序列，c)啟動(dòng)子，及d)在第一核苷酸序列的3’-末端的編碼DNA-結(jié)合域和轉(zhuǎn)錄-激活域的至少一個(gè)額外核苷酸序列。
32.如權(quán)利要求31中所述的轉(zhuǎn)基因，其中第一核苷酸序列編碼APP或APP的一部分。
33.如權(quán)利要求31和32之一所述的轉(zhuǎn)基因，其中所述轉(zhuǎn)基因具有核苷酸序列SEQ ID NO.12。
34.含有如權(quán)利要求31至33之一所述轉(zhuǎn)基因的載體。
35.權(quán)利要求34所述的載體，其具有核苷酸序列SEQ ID NO.9或SEQ ID NO.12。
36.一種轉(zhuǎn)基因細(xì)胞的產(chǎn)生方法，其中用權(quán)利要求34和35之一所述的載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞。
37.一種轉(zhuǎn)基因秀麗新小桿線蟲的產(chǎn)生方法，其中將權(quán)利要求31至33之一所述的轉(zhuǎn)基因微注射到秀麗新小桿線蟲的性細(xì)胞中。
38.含有權(quán)利要求31至33之一所述轉(zhuǎn)基因的細(xì)胞。
39.含有秀麗新小桿線蟲權(quán)利要求31至33之一所述轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)基因秀麗新小桿線蟲。
40.含有權(quán)利要求31至33之一所述轉(zhuǎn)基因的酵母細(xì)胞。
41.一種含有如下成分的細(xì)胞a)權(quán)利要求31至33之一所述的轉(zhuǎn)基因b)cDNA文庫，和c)報(bào)告質(zhì)粒。
42.權(quán)利要求41的細(xì)胞在鑒別編碼γ-分泌酶的cDNA中的應(yīng)用。
43.一種鑒別γ-分泌酶cDNA的方法，其中1)制備如權(quán)利要求41所述的細(xì)胞，及2)測定是否有第二片段蛋白形成。
44.權(quán)利要求41中所述的細(xì)胞在γ-分泌酶活性抑制劑鑒別方法中的應(yīng)用。
45.抑制γ-分泌酶活性物質(zhì)的鑒別方法，該方法包括下列步驟1)制備非人類轉(zhuǎn)基因生物體或轉(zhuǎn)基因細(xì)胞，該非人類轉(zhuǎn)基因生物體或轉(zhuǎn)基因細(xì)胞包含具有下列成分的轉(zhuǎn)基因a)編碼包含氨基酸序列GAIIGLMVGGVVIATVIVITLVML(SEQ IDNO.1)的第一核苷酸序列，b)在第一核苷酸序列的5’-末端的編碼信號(hào)肽的第二核苷酸序列，c)啟動(dòng)子，及d)適當(dāng)時(shí)額外的非編碼和/或編碼性核苷酸序列；包含報(bào)告質(zhì)粒，該報(bào)告質(zhì)粒攜帶蛋白結(jié)合位點(diǎn)、一個(gè)最小啟動(dòng)子、和一個(gè)報(bào)告基因，以及適當(dāng)時(shí)編碼γ-分泌酶的cDNA，其中，該非人類轉(zhuǎn)基因生物體或轉(zhuǎn)基因細(xì)胞表達(dá)該轉(zhuǎn)基因，和適當(dāng)時(shí)的由所述cDNA編碼的γ-分泌酶；2)將所述非人類轉(zhuǎn)基因生物體或轉(zhuǎn)基因細(xì)胞與被研究的物質(zhì)溫育，及3)測定第二片段蛋白的含量。
46.抑制γ-分泌酶活性物質(zhì)的鑒別方法，其中1)使用一種轉(zhuǎn)基因，其包括下列成分a)編碼包含氨基酸序列GAIIGLMVGGVVIATVIVITLVML(SEQ IDNO.1)之蛋白的第一核苷酸序列，b)在第一核苷酸序列的5L末端的編碼信號(hào)肽的第二核苷酸序列，和c)啟動(dòng)子，及d)適當(dāng)時(shí)額外的編碼和/或非編碼性核苷酸序列；2)將該轉(zhuǎn)基因和一個(gè)報(bào)告質(zhì)粒及適當(dāng)時(shí)編碼γ-分泌酶的cDNA引入到細(xì)胞中，在所研究的物質(zhì)存在下表達(dá)由所述轉(zhuǎn)基因編碼的融合蛋白及適當(dāng)時(shí)由所述cDNA編碼的γ-分泌酶，3)該融合蛋白被a)裂解，因此形成包含氨基酸序列GAIIGLMVGGVV(SEQ IDNO.2)的第一片段蛋白和含有氨基酸序列VIVITLVML(SEQ IDNO.3)的第二片段蛋白，或b)未被細(xì)胞內(nèi)存在的γ-分泌酶在氨基酸序列SEQ ID NO.1內(nèi)裂解可，因此沒有可檢測到的第一和/或第二片段蛋白的形成，4)測定第二片段蛋白的含量。
47.鑒別抑制γ-分泌酶活性之物質(zhì)的方法，其中將編碼一個(gè)含有信號(hào)肽和氨基酸序列SEQ ID NO.1的融合蛋白的轉(zhuǎn)基因在所研究物質(zhì)存在下表達(dá)，并鑒定這種被研究物質(zhì)對第二片段蛋白形成量的影響，所述第二片段蛋白含有氨基酸序列VIVITLVML(SEQ IDNO.3)。
48.藥物的生產(chǎn)方法，包括如權(quán)利要求45至47之一所述的方法，且最后將鑒定出的抑制劑與藥學(xué)上可接受的載體混合。
49.如權(quán)利要求45至47之一項(xiàng)或多項(xiàng)所述的方法，還包括方法將所鑒定出的抑制劑配制成制藥學(xué)上可接受的形式。
50.用于定性和/或定量檢測γ-分泌酶活性的試劑盒，包括一個(gè)含有氨基酸序列SEQ ID NO.1的融合蛋白。
全文摘要
本發(fā)明涉及γ－分泌酶活性的測定方法,該方法的各成分及其應(yīng)用。本發(fā)明提供了一種測定γ－分泌酶活性及檢測γ－分泌酶的新穎方法;該方法的具體實(shí)施方案涉及γ－分泌酶或編碼γ－分泌酶的cDNA的鑒定方法和對可抑制γ－分泌酶活性的有效物質(zhì)的鑒定方法。此類物質(zhì)具有特殊的意義,因?yàn)樗鼈兛勺鳛樗幬锘钚晕镔|(zhì),比如用于阿爾茨海默病的治療。
文檔編號(hào)C12N1/15GK1329674SQ99814204
公開日2002年1月2日 申請日期1999年11月27日 優(yōu)先權(quán)日1998年12月7日
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