專利名稱：絲狀真菌宿主領(lǐng)域的轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的制作方法
發(fā)明摘述本發(fā)明涉及一種用于表達(dá)和分泌異源蛋白或多肽的絲狀真菌宿主領(lǐng)域的新的轉(zhuǎn)化系統(tǒng)。本發(fā)明也包括以一種非常經(jīng)濟(jì)的方式大量制備多肽或蛋白的方法。本發(fā)明的系統(tǒng)包括金孢子菌屬，特別是Chrysporium lucknowense的轉(zhuǎn)化的或轉(zhuǎn)染的真菌菌株和其突變體或衍生物。本發(fā)明也包括含有金孢子菌屬真菌編碼序列的轉(zhuǎn)化體。還公開了新的突變金孢子菌屬菌株以及由其衍生的新的酶。
本發(fā)明背景現(xiàn)有技術(shù)已經(jīng)公開了許多用于基因表達(dá)的宿主和轉(zhuǎn)化方法。經(jīng)常提到細(xì)菌如大腸桿菌。但是大腸桿菌不能分泌許多種蛋白質(zhì)或多肽，因此要在工業(yè)水平上生產(chǎn)蛋白質(zhì)和多肽它是一種的不合需要的宿主細(xì)胞。大腸桿菌的另外一個(gè)同樣適用于普通細(xì)菌的缺點(diǎn)是原核生物不能提供對(duì)于眾多所生成的真核蛋白質(zhì)或多肽活性形式所必需的另外的修飾。確保產(chǎn)生活性形式的蛋白或多肽必需的加工有如蛋白質(zhì)的糖基化和蛋白質(zhì)的正確折疊。為確保這樣的加工人們有時(shí)也可以使用哺乳動(dòng)物細(xì)胞；但是，這些細(xì)胞的不利之處在于細(xì)胞很難維持并且培養(yǎng)基非常昂貴。因此要在工業(yè)水平上生產(chǎn)蛋白質(zhì)或多肽這樣的轉(zhuǎn)化系統(tǒng)是不合實(shí)際的。它們可被有效用于生產(chǎn)需求量相對(duì)較低但價(jià)格昂貴的藥物化合物，但當(dāng)然不能用于工業(yè)上生產(chǎn)酶。
已經(jīng)發(fā)展了許多真菌表達(dá)系統(tǒng)，如黑曲霉、泡盛曲霉、構(gòu)巢曲霉、T.reesei等。此外也提出了一些其它的真菌表達(dá)系統(tǒng)，但由于各種不同的原因位被廣泛接受或使用。一般而言，理想的宿主必須符合以下標(biāo)準(zhǔn)的大部分—理想的宿主必須易于發(fā)酵并且使用價(jià)格低廉的培養(yǎng)基。
—理想的宿主必須有效使用培養(yǎng)基。
—理想的宿主必須高產(chǎn)量地生產(chǎn)蛋白質(zhì)或多肽，即必須表現(xiàn)出高的蛋白質(zhì)/生物量比。
—理想的宿主應(yīng)該能夠有效分泌蛋白質(zhì)或多肽。
—理想的宿主必須保證所需要的蛋白質(zhì)或多肽易于分離和純化。
—理想的宿主必須對(duì)所需要的蛋白質(zhì)或多肽進(jìn)行加工，以使它們以不需要另外活化或修飾步驟的活性形式被生產(chǎn)出來(lái)。
—理想的宿主應(yīng)該易于被轉(zhuǎn)化。
—理想的宿主應(yīng)該使用廣泛范圍的表達(dá)調(diào)控因子從而確保易于運(yùn)用和多功能性。
—理想的宿主應(yīng)該使用易于選擇并且用起來(lái)很便宜的標(biāo)記。
—理想的宿主應(yīng)該產(chǎn)生穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化體。
—理想的宿主應(yīng)該允許在對(duì)所表達(dá)出的蛋白質(zhì)或多肽無(wú)害的條件下培養(yǎng)，如低粘性、低剪切等。
Berka等人在美國(guó)專利5578463中提出的但至今仍未被廣泛使用的真菌系統(tǒng)有鏈孢霉屬、柄孢殼屬、內(nèi)座殼屬、毛霉菌屬、旋孢腔菌屬和梨孢霉屬以及曲霉屬和木霉屬。但是只有曲霉屬和木霉屬提供了轉(zhuǎn)化和表達(dá)的例證，其它一些被提出的宿主未提供任何詳細(xì)資料。
WO 96/02563以及Novo Nordisk的美國(guó)專利5602004、5604129和5695985敘述了曲霉屬和木霉屬真菌系統(tǒng)的缺陷，并且提出其它真菌的培養(yǎng)條件或許會(huì)更適于大規(guī)模生產(chǎn)蛋白質(zhì)。任何一種轉(zhuǎn)化的培養(yǎng)唯一的例子是嗜熱毀絲霉、阿拉巴門支頂孢、土生梭孢霉和cellulophilum側(cè)孢霉。據(jù)報(bào)道側(cè)孢霉屬菌株在對(duì)其它菌株不造成同樣結(jié)果的發(fā)酵條件下裂解并且產(chǎn)生綠色素。也描述了土生梭孢霉的一種由于形態(tài)學(xué)而被選擇的不形成孢子的突變體。但是也表明梭孢霉屬和支頂孢屬(由此所使用的支頂孢屬菌株是所使用的梭孢霉屬菌株的未完成體)的原生質(zhì)體效率很低并且潮霉素不是一種有用的選擇標(biāo)記。許多其它真菌也憑借其形態(tài)而被認(rèn)為是潛在有用的但未敘述它們的轉(zhuǎn)化情況。這些真菌菌株是Corynascus、嗜熱子囊菌屬、毛殼屬、節(jié)霉屬、柱頂孢霉和Talaromyces。轉(zhuǎn)化的宿主因?yàn)樗氲腍umicola木聚糖酶產(chǎn)量很低而被提及，梭孢霉屬的產(chǎn)量最低；但是，這些信息不很明確并且實(shí)際上能夠推斷梭孢霉屬是最佳的實(shí)施方案。對(duì)這些參考菌株的命名是基于1994年ATCC對(duì)工業(yè)真菌命名的基礎(chǔ)之上的。因而很明顯未能獲得高程度的異源表達(dá)并且實(shí)際上在假定的形態(tài)學(xué)和表達(dá)程度之間不存在正相關(guān)。根據(jù)1996年的ATCC真菌分類，嗜熱側(cè)孢霉ATCC 20493是一種嗜熱毀絲霉菌株。現(xiàn)在這個(gè)菌株仍然被鑒定為嗜熱毀絲霉。從這些最近的說(shuō)明中可以看出本技術(shù)領(lǐng)域的不可預(yù)知性是明顯的。
通過(guò)使用醋酸鋰方法和Humicola酶編碼序列，Allison等人(現(xiàn)代遺傳學(xué)21225-229，1992)也敘述了對(duì)Humicola grisea突變體thermoidae的轉(zhuǎn)化，但未提供這一菌株表達(dá)異源蛋白的報(bào)道。
1997年，夏威夷生物技術(shù)研究小組被授予了一項(xiàng)用轉(zhuǎn)化的鏈孢霉屬真菌表達(dá)哺乳動(dòng)物肽如凝乳酶的專利。營(yíng)養(yǎng)缺陷的粗糙脈孢霉的轉(zhuǎn)化是和原生質(zhì)體一起發(fā)生的。引入內(nèi)源性的轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)并實(shí)施共轉(zhuǎn)化。并未提供其它宿主和其它轉(zhuǎn)化方案。關(guān)于表達(dá)水平此說(shuō)明并不明確。由于免疫學(xué)技術(shù)(用于檢測(cè)少量蛋白質(zhì))是所使用的證明蛋白質(zhì)存在的唯一技術(shù)，表達(dá)水平是否高是難以預(yù)料的。并未透漏是否在事實(shí)上分離出了此種蛋白質(zhì)。
Novo Nordisk的專利WO 97/26330提出了一種獲得用于生產(chǎn)異源多肽的具有改進(jìn)特征的絲狀真菌親本細(xì)胞突變體的方法。此方法包含首先發(fā)現(xiàn)一個(gè)特定的形態(tài)學(xué)改變，然后評(píng)價(jià)轉(zhuǎn)化體是否比親本菌株生產(chǎn)出更多的異源多肽。僅就鏈孢屬A3/5菌株和米曲霉舉例說(shuō)明了此方法。此方法可適用于曲霉、木霉、梭孢霉、鐮孢霉、鏈孢霉、支頂孢屬、Tolyplocadium、Humicola、柱頂孢屬、毀絲霉屬或毛霉屬的真菌。如上所述，由于本技術(shù)領(lǐng)域的不可預(yù)知性以及所引用的方法的不可預(yù)知性，并未提出一種帶有合理的成功預(yù)期的普遍適用的方法。
本發(fā)明的詳細(xì)描述我們現(xiàn)在敘述了僅僅使用上面提及的曲霉和木霉就可滿足上面要求的另外的真菌表達(dá)系統(tǒng)。在本領(lǐng)域尚未提出或教授此新的表達(dá)系統(tǒng)。與經(jīng)常使用的T.reesei系統(tǒng)相比，本發(fā)明的新系統(tǒng)具有轉(zhuǎn)化率較高的額外優(yōu)點(diǎn)。此外，培養(yǎng)條件有利于所表達(dá)的多肽。在本詳細(xì)說(shuō)明及附錄的權(quán)利要求中“多肽”或“感興趣的多肽”是指本發(fā)明表達(dá)系統(tǒng)的產(chǎn)物，此術(shù)語(yǔ)也包括蛋白質(zhì)，即具有特定功能和/或二級(jí)結(jié)構(gòu)和/或三級(jí)結(jié)構(gòu)的多肽。
培養(yǎng)基的酸堿度可以是中性或堿性的，這樣所產(chǎn)生的蛋白質(zhì)或多肽就不再經(jīng)受侵害性的和可能導(dǎo)致失活的酸性pH。當(dāng)產(chǎn)生的蛋白質(zhì)或多肽更適于酸性環(huán)境時(shí)，也可能在酸性pH例如pH4中培養(yǎng)。適于培養(yǎng)的pH范圍是4.0—10.0之間。但是，當(dāng)宿主菌株在中性或堿性的pH范圍內(nèi)生長(zhǎng)較好時(shí)，則有限考慮此pH范圍，例如pH6到pH9。在某些情況下，在pH8以上甚至是pH10的堿性環(huán)境下生長(zhǎng)也是一種好的選擇。同樣，這些宿主菌株的培養(yǎng)溫度對(duì)于某些類型的所產(chǎn)生的多肽的穩(wěn)定性也是有利的。合適的培養(yǎng)溫度在25—43℃之間。有利的適用溫度范圍是從40℃到23或30℃。很明顯，對(duì)于生產(chǎn)哺乳動(dòng)物多肽來(lái)說(shuō)這樣的條件是尤其讓人感興趣的。所選擇的溫度取決于培養(yǎng)的成本效率和多肽或培養(yǎng)菌株的密度。這些條件將由本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員決定。
也已經(jīng)確定生物量與粘性之間的關(guān)系并且所產(chǎn)生的蛋白量對(duì)于本發(fā)明宿主也是非常有利的。已經(jīng)將Trichoderma longibrachiatum(以前認(rèn)為是T.reesei)和黑曲霉進(jìn)行了比較。在它們各自優(yōu)化條件下，Trichoderma longibrachiatum的生物量是2.5—5克/升，黑曲霉的生物量是5—10克/升并且根據(jù)本發(fā)明宿主的生物量是0.5—1克/升，因此，商業(yè)上所用的菌株的生物量提高了5—10倍。這些商業(yè)菌株在本領(lǐng)域中本身就被認(rèn)為是高蛋白產(chǎn)量的并且它們已經(jīng)被成功用于商業(yè)生產(chǎn)蛋白質(zhì)。它們已經(jīng)被在各自最佳條件下培養(yǎng)、發(fā)展并且成功地進(jìn)行了大規(guī)模商業(yè)發(fā)酵。相同的菌株被用于舉例說(shuō)明本發(fā)明宿主培養(yǎng)物粘度值的極大改進(jìn)，在發(fā)酵過(guò)程的末尾階段Trichodermalongibrachiatum的粘度值為200—600cP(厘泊)，黑曲霉的粘度值為1500—2000cP，而本發(fā)明宿主的粘度值低達(dá)10cP。因此本發(fā)明宿主提供了比商業(yè)菌株的粘度值至少改進(jìn)了20—200倍。另外一個(gè)非常令人驚奇的特點(diǎn)是本發(fā)明的宿主細(xì)胞的蛋白水平要比商業(yè)菌株曲霉和T.reesei高得多，即使它們具有上面所提到的令人驚奇的低生物量和粘度值?？傊?，本發(fā)明引入了一個(gè)培養(yǎng)條件改進(jìn)了的、易于使用的、多用途的改良的轉(zhuǎn)化系統(tǒng)和表達(dá)系統(tǒng)。本發(fā)明的菌株在改進(jìn)的條件下令人驚奇地高水平生產(chǎn)蛋白質(zhì)，并且它們的發(fā)酵時(shí)間更短。
本發(fā)明涉及包含一段編碼異源蛋白或多肽的核酸序列的金孢子菌突變株，上述的核酸片段與表達(dá)調(diào)控區(qū)連接并且任選地與編碼分泌信號(hào)的序列和/或編碼載體蛋白的序列可操作連接。本發(fā)明優(yōu)選的重組菌株將分泌感興趣的多肽。這就避免了為分離感興趣的多肽而破碎細(xì)胞的必要，并且降低了宿主細(xì)胞其它組分降解表達(dá)產(chǎn)物的危險(xiǎn)性。
可根據(jù)由Burgess出版公司1972年出版的Barnett和Hunter所著的《舉例說(shuō)明的缺陷真菌屬》(第三版)一書中的形態(tài)學(xué)知識(shí)對(duì)金孢子菌屬真菌進(jìn)行準(zhǔn)確地描述。其它提供關(guān)于金孢子菌屬真菌分類的詳細(xì)資料的來(lái)源有例如Sutton分類法(Van Oorschot，C.A.N(1980)“金孢子菌屬及相關(guān)屬的修訂版”，荷蘭Baam CBS的真菌學(xué)研究第20期1—36頁(yè))。CBS是布達(dá)佩斯條約的菌種保藏機(jī)構(gòu)之一。根據(jù)這些教科書，金孢子菌屬真菌是屬于絲孢目叢梗孢科的一種。所用的標(biāo)準(zhǔn)如下1.絲孢目的跡象分生孢子直接產(chǎn)生在菌絲體、單獨(dú)的造孢細(xì)胞和不同的分生孢子梗上。
2.叢梗孢科的跡象分生孢子和分生孢子梗(如果有的話)都是無(wú)色透明的或亮色的；分生孢子梗是單個(gè)的或松散成簇。
3.金孢子Corda1833屬的跡象菌落呈擴(kuò)散狀生長(zhǎng)，白色，有時(shí)呈奶油色、淡褐色或黃色；氈狀或粉末狀。菌絲通常是無(wú)色透明和表面光滑的，不規(guī)則，或多或少帶有直生分枝?？煞敝车木z顯示出很少差別或幾乎沒有差別。分生孢子是頂孢子、側(cè)生孢子和產(chǎn)孢孢子，遍布于菌絲之上，無(wú)?；蛭挥诙掏换騻?cè)枝上，近于無(wú)色或淡黃色，薄壁或厚壁，近球形、棍棒狀、梨形或倒卵形，單細(xì)胞，很少呈雙細(xì)胞，以截短形式存在。有時(shí)有居間分生孢子，呈單生，偶爾成串，近于無(wú)色或淡黃色，比支持菌絲要寬，通常是單細(xì)胞的，兩端截短。偶爾也有厚垣孢子存在。
另外一個(gè)提供真菌命名信息的來(lái)源是ATCC(美國(guó))，它的網(wǎng)址是http//www.atcc.org。CBS也有一個(gè)提供相關(guān)信息的網(wǎng)址(http//www.cbs.knaw.n1)。位于莫斯科的VKM也是一個(gè)提供這些信息的可靠來(lái)源，VKM的網(wǎng)址是http//www.bdt.org.br.bdt.msdn.vkm/general。另外一個(gè)來(lái)源是http//NT.ars-grin.gov/fungaldatabases。所有這些機(jī)構(gòu)都能提供區(qū)分金孢子菌屬真菌特征的教導(dǎo)。
根據(jù)本發(fā)明的定義，已經(jīng)明確為嗜熱毀絲霉的菌株不再屬于金孢子菌屬。過(guò)去在一些毀絲霉屬菌株的命名上一直存在相當(dāng)大的混淆。本發(fā)明所優(yōu)選的金孢子菌屬菌株是可以明顯分辨出的，并且不會(huì)與毀絲霉屬、側(cè)孢霉屬或Phanerochaete chrysosporium混淆。
下列的菌株被界定為金孢子菌屬菌株，但金孢子菌屬的定義并不局限于這些菌株C.botryoides，C.carmichaelii，C.crassitunicatum，C.europae，C.evolceannui，C.farinicola，C.fastidium，C.filiforme，C.georgiae，C.globiferum，C.globiferum var.articulatum，C.globiferumvar.nivenum，C.hirundo，C.hispanicum，C.holmmii，C.indicum，C.inops，C.keratinophilum，C.kreiselii，C.kuzurovianum，C.lignoium，C.lobatum，C.lucknowense，C.lucknowense Grag 27K，C.medium，C.medium var.spissescens，C.mephiticum，C.merdarium，C.merdarium var.roseum，C.minor，C.pannicola，C.parvum，C.parvum var.crescens，C.pilosum，C.pesudomerdarium，C.pyriformis，C.queenslandicum，C.sigleri，C.sulfureum，C.synchronum，C.tropicum，C.undulatum，C.vallenarense，C.vespertilium，C.zonatum。
C.lucknowense構(gòu)成了金孢子菌屬的一個(gè)種，由于它天然高產(chǎn)纖維素酶蛋白(WO 98/15633和相關(guān)的美國(guó)專利5811381)，所以我們對(duì)其尤其感興趣。Chrysosporium lucknowense的特征如下在沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上生長(zhǎng)14天后菌落直徑達(dá)到55毫米，呈奶油色，氈狀蓬松；中心致密并且3到5毫米厚；邊緣清晰、規(guī)則并且有傘緣；顏色從淡黃色到奶油色。菌絲是無(wú)色透明和表面光滑的并且薄壁，很少分枝。氣生菌絲通常是能育的并且密集分隔，大約1到3.5毫米寬；水下菌絲是不能育的，大約1到4.5毫米寬，最薄的菌絲通常被扭曲。分生孢子通常是頂孢子和側(cè)生孢子，大多數(shù)是無(wú)梗的或位于短的頻繁出現(xiàn)的圓錐形突起上或短側(cè)枝上。分生孢子是單生的但相互之間靠得很近；在一個(gè)菌絲細(xì)胞上生有1到4個(gè)分生孢子，近于無(wú)色，薄壁或厚壁，大多數(shù)近球形，也有棍棒狀和倒卵形的，單細(xì)胞，2.5×11×1.5-6毫米大小，帶有較寬的基板芽痕(1-2毫米)。無(wú)居間分生孢子，也無(wú)厚垣孢子存在。Chrysosporiumlucknowense菌株的例子有ATCC44006，CBS251.72，CBS143.77和CBS272.77等，在WO 98/15633和相關(guān)的美國(guó)專利5811381中提供了其它的例子。
從此菌種中分離得到了一株具有更高的產(chǎn)纖維素酶能力的菌株。內(nèi)部命名為C1菌株，此菌株根據(jù)布達(dá)佩斯條約于1996年8月29日保藏于位于莫斯科Bakrushina街8號(hào)郵編為113184的俄羅斯微生物保藏中心，其保藏編號(hào)為VKM F-3500D。此菌株被命名為Chrysosporium lucknowense Garg 27K。C1菌株的特征如下在馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上生長(zhǎng)7天菌落直徑達(dá)到大約55-66毫米；乳白色，氈狀。中心厚度為2-3毫米厚，邊緣清晰，規(guī)則并且有傘緣；菌落顏色從淡色到奶油色；菌絲是無(wú)色透明和表面光滑的，薄壁或厚壁，很少分枝。氣生菌絲是能育的，分隔，大約2-3毫米寬；水下菌絲是不能育的。分生孢子是頂孢子或側(cè)生孢子；無(wú)?；蛭挥诙虃?cè)枝上。分生孢子是單生的但相互之間靠得很近；近于無(wú)色，薄壁切光滑，近球形，棍棒狀或倒卵形，單細(xì)胞，4-10毫米大小。無(wú)厚垣孢子，也無(wú)居間分生孢子存在。
在WO 98/15633和相關(guān)的美國(guó)專利5811381中描述了分離C1菌株的方法。具有以上形態(tài)學(xué)特征的菌株被包括在本發(fā)明的金孢子菌屬的定義之內(nèi)。那些來(lái)源于金孢子菌屬前體菌株包括已經(jīng)自然誘變或人工誘變的菌株也在金孢子菌屬的范圍之內(nèi)。奔發(fā)明尤其包括那些通過(guò)引入誘變，特別是通過(guò)組合輻射誘變和化學(xué)誘變而獲得的金孢子菌屬突變株。
例如C1菌株經(jīng)紫外線照射產(chǎn)生了UV13-6菌株，UV13-6菌株進(jìn)一步經(jīng)N-甲基-N’-硝基-亞硝基胍的誘變產(chǎn)生了NG7c-19菌株。NG7c-19菌株經(jīng)紫外線照射突變導(dǎo)致生成UV18-25菌株。突變過(guò)程中在液體培養(yǎng)基中或培養(yǎng)皿上以及顯微鏡下培養(yǎng)物的形態(tài)學(xué)特征變化很大。隨著連續(xù)誘變，作為金孢子菌屬特征的在培養(yǎng)皿上菌落呈絨毛狀或氈狀生長(zhǎng)的形態(tài)學(xué)特征逐漸喪失，最后得到一個(gè)扁平的無(wú)光澤的菌落。野生型菌株在某些培養(yǎng)基中產(chǎn)生棕色色素的現(xiàn)象在突變株中也不是很明顯。顯著的是UV18-25突變株在液體培養(yǎng)基中的粘性要比野生型C1菌株和UV13-6和NG7c-19突變株低得多。在所有菌株都維持金孢子菌屬總顯微特征的情況下，經(jīng)連續(xù)突變后菌絲體變窄，并且UV18-25菌株可以明顯觀察到斷裂菌絲。菌絲體斷裂可能是引起UV18-25菌株相關(guān)的低粘度的原因。每個(gè)誘變步驟之后菌株形成孢子的能力降低。以上表明金孢子菌屬的每一菌株與上面的形態(tài)學(xué)定義都有一定的偏差。此外，每一突變步驟之后纖維素酶和細(xì)胞外蛋白的產(chǎn)量增加了，但一些突變導(dǎo)致蛋白酶表達(dá)降低。真菌分類學(xué)標(biāo)準(zhǔn)可以從例如CBS、VKMF和ATCC處得到。
現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)金孢子菌屬菌株無(wú)性型尤其適于本發(fā)明的生產(chǎn)應(yīng)用。無(wú)性型的代謝使之特別適合于大量表達(dá)。由于有性型及無(wú)性型的遺傳組成是相同的，有性型也適于應(yīng)用。無(wú)性型與有性型之間的區(qū)別在于一個(gè)是無(wú)性狀態(tài)而另一個(gè)是有性狀態(tài)。兩種狀態(tài)顯示出在某些條件下的不同形態(tài)學(xué)特征。
優(yōu)選使用本領(lǐng)域已知的一些無(wú)毒性的金孢子菌屬菌株，這可以降低大規(guī)模生產(chǎn)對(duì)環(huán)境造成的危害并且簡(jiǎn)化了生產(chǎn)程序同時(shí)節(jié)約了成本。
表達(dá)調(diào)控區(qū)是用于表達(dá)的金孢子菌屬菌株所識(shí)別的一段DNA序列。它含有一段與編碼待表達(dá)的多肽的核酸序列可操作連接的啟動(dòng)子序列。啟動(dòng)子的連接使得待表達(dá)序列起始密碼子的相對(duì)位置可以表達(dá)。密碼子序列可以是組成型的或誘導(dǎo)型的。任何能夠允許金孢子菌屬菌株多肽表達(dá)的表達(dá)調(diào)控序列或其組合形式均包括在本發(fā)明中。表達(dá)調(diào)控序列優(yōu)選是真菌表達(dá)調(diào)控區(qū)例如子囊菌調(diào)控區(qū)。合適的真菌表達(dá)調(diào)控區(qū)來(lái)自于下列真菌菌屬任何之一表達(dá)調(diào)控區(qū)曲霉、木霉、金孢子菌屬、漢遜酵母、毛霉、畢赤酵母、鏈孢霉、Tolyplocadium、根毛霉、鐮孢霉、青霉、酵母屬、Talaromyces或其另外的有性形式如裸殼孢屬、Hypocrea等，例如來(lái)自木霉的纖維二糖水解酶啟動(dòng)子，來(lái)自曲霉的葡糖淀粉酶啟動(dòng)子、甘油醛磷酸脫氫酶啟動(dòng)子、醇脫氫酶A和醇脫氫酶R啟動(dòng)子、TAKA淀粉酶啟動(dòng)子，來(lái)自鏈孢霉的磷酸甘油酸和交叉旁路控制啟動(dòng)子，來(lái)自曼赫根毛霉的天冬氨酸蛋白激酶啟動(dòng)子、脂酶啟動(dòng)子和來(lái)自變灰青霉的β-半乳糖苷酶啟動(dòng)子。來(lái)自與宿主菌株同屬的表達(dá)調(diào)控序列尤其適合，這是因?yàn)樗芸赡芴貏e適應(yīng)特定的宿主。因此，優(yōu)選的表達(dá)調(diào)控序列是來(lái)自金孢子菌屬真菌的表達(dá)調(diào)控序列。
我們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)以極大量表達(dá)蛋白質(zhì)的特別的金孢子菌屬真菌菌株，這些菌株的天然表達(dá)調(diào)控序列是我們尤其感興趣的。這些菌株被內(nèi)部命名為金孢子菌屬C1菌株，UV13-6菌株，NG7C-19菌株和UV18-25菌株。已經(jīng)根據(jù)布達(dá)佩斯條約將它們保藏在莫斯科的俄羅斯微生物保藏中心(VKM)中。根據(jù)布達(dá)佩斯條約，野生型C1菌株的保藏號(hào)為VKM F-3500D，保藏日期是1996年8月29日；C1UV13-6突變株的保藏號(hào)為VKM F-3632D，保藏日期是1998年9月2日；C1 NG7c-19突變株的保藏號(hào)為VKM F-3633D，保藏日期是1998年9月2日；C1 UV18-25突變株的保藏號(hào)為VKM F-3631D，保藏日期是1998年9月2日。
優(yōu)選應(yīng)用能在選擇的宿主內(nèi)高表達(dá)的表達(dá)調(diào)控區(qū)。這也可以是一個(gè)來(lái)自于異源宿主的高表達(dá)調(diào)控區(qū)，如本領(lǐng)域眾所周知的。因此要大量表達(dá)的蛋白質(zhì)和為本發(fā)明提供合適的表達(dá)調(diào)控序列的特定的例子不僅僅局限于疏水蛋白、蛋白酶、淀粉酶、木聚糖酶、果膠酶、酯酶、β-半乳糖苷酶、纖維素酶(例如內(nèi)切葡聚糖酶；纖維二糖水解酶)和多聚半乳糖醛酸酶。已經(jīng)明確在固體狀態(tài)下以及水下發(fā)酵條件下都可以高表達(dá)。評(píng)價(jià)這些蛋白質(zhì)產(chǎn)生和產(chǎn)量的方法是本領(lǐng)域所眾所周知的，例如Sigma和Megazyme公司的產(chǎn)品目錄里有無(wú)數(shù)的例子。Megezyme公司位于愛爾蘭Wicklow縣的Bray商業(yè)區(qū)內(nèi)。Sigma公司在全世界范圍內(nèi)有許多分支機(jī)構(gòu)例如密蘇里州圣路易絲市的14508信箱。對(duì)于纖維素酶的分析我們使用商用分析方法如羧甲基纖維素酶分析法、內(nèi)粘度計(jì)分析法、微晶纖維素酶分析法、β-葡萄糖酶分析法、RBB羧甲基纖維素酶分析法、Cellazyme C分析法。另外的方法是本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員眾所周知的并且可以從關(guān)于這個(gè)主題的一般文獻(xiàn)中查到，這些信息引入本文做參考。我們參考“酶學(xué)方法1995第一卷直至1998第297-299卷”作為例子。為確保宿主能夠很好地識(shí)別我們應(yīng)用了金孢子菌屬真菌的啟動(dòng)子序列。
我們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在金孢子菌屬真菌中異源表達(dá)調(diào)控序列像天然的金孢子菌屬真菌序列一樣有效地工作。這就允許眾所周知的構(gòu)建物和載體被用于轉(zhuǎn)化金孢子菌屬真菌以及為在這種新的表達(dá)和分泌宿主中構(gòu)建高表達(dá)的載體提供眾多其他的可能性。例如可以使用如Christiansen等在Bio/Technol 61419-1422(1998)中所描述的標(biāo)準(zhǔn)的曲霉轉(zhuǎn)化技術(shù)。其它文獻(xiàn)例如美國(guó)專利4816405，5198345，5503991，5364770和5578463，EP-B-215.594(也用于木霉)中提供了曲霉轉(zhuǎn)化載體的詳細(xì)資料，這些文獻(xiàn)以及它們的內(nèi)容引入本文做參考。由于已經(jīng)明確金孢子菌屬真菌可以以極高水平表達(dá)纖維素酶，所以這些蛋白的表達(dá)調(diào)控區(qū)是優(yōu)選的。我們把前面提到的保藏的金孢子菌屬真菌作為特定的例子。
與含有和待表達(dá)的多肽可操作連接的核酸表達(dá)調(diào)控區(qū)的金孢子菌屬突變株一樣，含有來(lái)自金孢子菌屬真菌，優(yōu)選來(lái)自Chrysosporiumlucknowense的核酸表達(dá)調(diào)控區(qū)或其衍生物的核酸構(gòu)建體組成了本發(fā)明的一個(gè)單獨(dú)的實(shí)施方案。這樣的合適的核酸構(gòu)建體是與纖維素酶或木聚糖酶表達(dá)，優(yōu)選與纖維二糖水解酶，特別是55kD纖維二糖水解酶表達(dá)有關(guān)的金孢子菌屬真菌的表達(dá)調(diào)控區(qū)。作為實(shí)施例提供了金孢子菌屬真菌25kDa(C1-EG5)內(nèi)切葡聚糖酶和43kDa(C1-EG6)內(nèi)切葡聚糖酶的啟動(dòng)子序列，其中分子量是根據(jù)SDS-PAGE電泳確定的(根據(jù)氨基酸序列數(shù)據(jù)分子量為21.9-39.5kDa)。因此，金孢子菌屬真菌的疏水蛋白、蛋白酶、淀粉酶、木聚糖酶、酯酶、果膠酶、β-半乳糖苷酶、纖維素酶(例如內(nèi)切葡聚糖酶；纖維二糖水解酶)和多聚半乳糖醛酸酶的啟動(dòng)子序列也被認(rèn)為在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。在表A或B中任何一種酶表達(dá)的啟動(dòng)子或調(diào)控區(qū)都適于應(yīng)用。本發(fā)明的核酸序列可從本發(fā)明的金孢子菌屬真菌中得到。確定啟動(dòng)子序列的方式有很多種，并且是本領(lǐng)域眾所周知的。在相關(guān)基因ATG起始密碼子上游區(qū)進(jìn)行核酸缺失實(shí)驗(yàn)可以提供這樣的序列。例如分析一致序列也可以發(fā)現(xiàn)感興趣的基因。本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員使用雜交或擴(kuò)增技術(shù)可以很容易地得到相應(yīng)的啟動(dòng)子序列。
通過(guò)克隆相應(yīng)基因這種方式鑒定了C1內(nèi)切葡聚糖酶的啟動(dòng)子序列，分別見SEQ ID NO.2(EG5)和SEQ ID NO.1(EG6)。本發(fā)明的其它優(yōu)選的啟動(dòng)子是55kDa的纖維二糖水解酶(CBH1)啟動(dòng)子和30kDa的木聚糖酶(XylF)啟動(dòng)子，因?yàn)檫@些酶通過(guò)它們自己的啟動(dòng)子高水平地表達(dá)。利用分別在SEQ ID NO4(為CBH1)和SEQ ID NO5(為XylF)中提供的部分信息，通過(guò)如下所述的直接克隆內(nèi)切葡聚糖酶的方式可以鑒定相應(yīng)的啟動(dòng)子序列。金孢子菌屬真菌的碳水化合物降解酶啟動(dòng)子特別是C1啟動(dòng)子可被優(yōu)選用于在宿主有機(jī)體特別是真菌或其它微生物宿主機(jī)體內(nèi)表達(dá)想要的多肽。與SEQ ID NO.1和2，或與金孢子菌屬真菌其它基因序列具有至少60％，優(yōu)選至少70％，最優(yōu)選至少80％核苷酸序列相同性的啟動(dòng)子序列也是本發(fā)明的一部分。
我們把本發(fā)明的重組菌株和核酸序列的特別的實(shí)施方案作為例子。我們也利用重組菌株敘述本領(lǐng)域高表達(dá)的啟動(dòng)子序列特別是那些在真菌例如曲霉和木霉中提供高表達(dá)的啟動(dòng)子序列。本領(lǐng)域提供了許多可用于曲霉的表達(dá)調(diào)控區(qū)，如Novo的美國(guó)專利5252726和Unilever的美國(guó)專利5705358。這些內(nèi)容引入文中做參考。
疏水蛋白基因是一個(gè)高表達(dá)的真菌基因。因此提議疏水蛋白基因，優(yōu)選來(lái)自金孢子菌屬真菌的疏水蛋白基因的啟動(dòng)子序列可能適合于在本發(fā)明合適的實(shí)施方案中用做表達(dá)調(diào)控序列。本領(lǐng)域已經(jīng)公開了Trichoderma reesei和Trichoderma harzianum疏水蛋白的基因序列以及煙曲霉和構(gòu)巢曲霉的基因序列，相關(guān)的序列信息引入文中做參考(Munoz等，現(xiàn)代遺傳學(xué)1997，32(3)225-230；Nakari-SetalaT等，歐洲生物化學(xué)雜志1996，15235(1-2)248-255；M.Parta等，傳染免疫學(xué)1994 62(10)4389-4395和Stringer MA.等，分子微生物學(xué)1995，16(1)33-44)。利用這些序列信息，本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員使用上面已經(jīng)提到的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)就可以很容易地得到金孢子菌屬真菌疏水蛋白基因的表達(dá)調(diào)控序列。本發(fā)明的金孢子菌屬重組菌株包含與編碼感興趣的多肽的序列可操作連接的疏水蛋白調(diào)控區(qū)。
表達(dá)調(diào)控序列也可以另外包含增強(qiáng)子或沉默子。這些也是本領(lǐng)域眾所周知的并且它們通常都位于離啟動(dòng)子有一段距離的地方。表達(dá)調(diào)控序列也可以包含帶有激活劑結(jié)合位點(diǎn)和阻遏蛋白結(jié)合位點(diǎn)的啟動(dòng)子。在一些情況下也可以修飾這些位點(diǎn)以消除這種類型的調(diào)控。已經(jīng)描述了帶有creA位點(diǎn)的絲狀真菌啟動(dòng)子?？梢酝蛔冞@樣的creA位點(diǎn)確保阻抑葡萄糖，通常情況下去除未突變的creA位點(diǎn)可導(dǎo)致這種結(jié)果。Gist Brocades的WO 94/13820舉例說(shuō)明了這種原理。使用這樣的啟動(dòng)子可以使由核酸序列所編碼的多肽的表達(dá)能夠在葡萄糖存在的情況下受此啟動(dòng)子調(diào)節(jié)。WO 97/09438中也說(shuō)明了此原理。帶有或不帶有creA位點(diǎn)的這些啟動(dòng)子都可以使用。creA位點(diǎn)已經(jīng)被突變的突變株可被用做本發(fā)明的重組菌株的表達(dá)調(diào)控序列，這樣它所調(diào)節(jié)的核酸序列就可以在葡萄糖存在的情況下表達(dá)。這些金孢子菌屬真菌啟動(dòng)子可以以WO 97/09438中所例證的類似方式脫阻抑。creA位點(diǎn)的鑒定是本領(lǐng)域眾所周知的。另外，可以在阻遏系統(tǒng)帶有突變例如creA基因本身突變的宿主菌株中應(yīng)用帶有creA結(jié)合位點(diǎn)的啟動(dòng)子，因此盡管此菌株帶有creA結(jié)合位點(diǎn)，它仍然可以在有葡萄糖存在的情況下產(chǎn)生蛋白質(zhì)或多肽。
終止子序列也是表達(dá)調(diào)控序列，它們與待表達(dá)基因的3’端可操作連接。任何真菌終止子在本發(fā)明的金孢子菌屬真菌中都是有功能的，例如構(gòu)巢曲霉trpC終止子(1)，構(gòu)巢曲霉α-葡糖苷酶(2)、構(gòu)巢曲霉葡糖淀粉酶(3)、曼赫氏毛霉羧基蛋白酶(美國(guó)專利5578463)和T.reesei纖維二糖水解酶終止子。天然的終止子序列如EG6終止子在金孢子菌屬真菌中也是有功能的并且是相配的。
本發(fā)明的合適的金孢子菌屬真菌重組株的待表達(dá)的核酸序列與編碼信號(hào)序列氨基酸序列的核酸序列可操作連接。信號(hào)序列是與待表達(dá)多肽的氨基酸序列可操作連接從而使之分泌到宿主真菌外的氨基酸序列。這樣的信號(hào)序列可以是與異源多肽有關(guān)的，也可以是宿主本身的。它也可以對(duì)宿主和多肽來(lái)說(shuō)都是異源的。編碼信號(hào)序列的核酸序列必須位于讀碼框內(nèi)以允許信號(hào)序列和異源多肽的翻譯。我們?cè)O(shè)想了任何一種能夠使金孢子菌屬真菌分泌多肽的信號(hào)序列。合適的這樣的序列是真菌的信號(hào)序列，優(yōu)選子囊菌信號(hào)序列。
合適的信號(hào)序列的例子可以來(lái)自普通酵母或下列特定的真菌菌屬的任何之一曲霉、木霉、金孢子菌屬、畢赤酵母、鏈孢霉、根毛霉、Humicola、漢遜酵母、毛霉、Tolyplocadium、鐮孢霉、青霉、酵母屬、Talaromyces或其另外的有性形式如裸殼孢屬、Hypocrea等。特別有用的信號(hào)序列通常與下列蛋白質(zhì)天然有關(guān)纖維二糖水解酶、內(nèi)切葡聚糖酶、β-半乳糖苷酶、木聚糖酶、果膠酶、酯酶、疏水蛋白、蛋白酶或淀粉酶。例如曲霉或Humicola的淀粉酶(4)、米曲霉的TAKA淀粉酶、黑曲霉的α淀粉酶、毛霉的羧基肽酶(美國(guó)專利5578463)、曼赫氏根毛霉的脂酶、木霉的纖維二糖水解酶(5)、變灰青霉的β-半乳糖苷酶以及酵母的α交配因子。
或者，信號(hào)序列可以來(lái)自于芽孢桿菌的淀粉酶或枯草蛋白酶基因。來(lái)自與宿主菌株同屬的信號(hào)序列是最合適的，這是因?yàn)樗芸赡芴禺愋赃m應(yīng)宿主菌株，因此優(yōu)選的信號(hào)序列是金孢子菌屬真菌的信號(hào)序列。我們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)以極大量分泌蛋白質(zhì)的特別的金孢子菌屬真菌菌株，這些菌株的天然信號(hào)序列是我們尤其感興趣的。這些菌株被內(nèi)部命名為金孢子菌屬C1菌株，UV13-6菌株，NG7C-19菌株和UV18-25菌株。如本文其它地方所描述的一樣這些菌株也已經(jīng)根據(jù)布達(dá)佩斯條約被保藏。來(lái)自于絲狀真菌、酵母和細(xì)菌的信號(hào)序列也是有用的。非真菌來(lái)源的信號(hào)序列也是有用的，特別是來(lái)自于細(xì)菌、植物和哺乳動(dòng)物的信號(hào)序列。
根據(jù)本發(fā)明任何一個(gè)實(shí)施方案重組的金孢子菌屬真菌可另外包含一個(gè)選擇標(biāo)記。這樣的選擇標(biāo)記將允許易于挑選轉(zhuǎn)化的或轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。選擇標(biāo)記通常編碼一種基因產(chǎn)物，此基因產(chǎn)物對(duì)未轉(zhuǎn)化的菌株提供了一種異源的特定類型的抗性。這可以是對(duì)重金屬、抗生素和殺蟲劑的抗性。原養(yǎng)型對(duì)于非抗生素品種來(lái)說(shuō)也是一種有用的選擇標(biāo)記。當(dāng)著眼于這種產(chǎn)物更快或較不復(fù)雜的調(diào)控將感興趣的蛋白質(zhì)或多肽用于食品或藥物中時(shí)，優(yōu)選非抗生素選擇標(biāo)記。GRAS指標(biāo)常常用于這樣的標(biāo)記。本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員可用許多這樣的標(biāo)記。例如FDA提供了一系列這樣的標(biāo)記。最常用的選擇標(biāo)記來(lái)自于賦予抗藥性或減輕營(yíng)養(yǎng)缺陷的amdS(乙酰胺酶)、hph(潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶)、pyrG(乳清酸核苷-5’-磷酸脫羧酶)、trpC(色氨酸合酶)、argB(鳥氨酸氨甲酰基轉(zhuǎn)移酶)、sC(硫酸腺嘌呤轉(zhuǎn)移酶)、bar(膦絲菌素乙酰轉(zhuǎn)移酶)、glufosinate抗性、niaD(硝酸還原酶)、博來(lái)霉素抗性基因，更特別的是Sh ble、磺酰脲抗性如乙酰乳酸合成酶ilv1突變。也可以通過(guò)共轉(zhuǎn)化選擇，其中選擇標(biāo)記在另一個(gè)載體上或與編碼感興趣的多肽的多肽編碼序列在同一個(gè)核酸片段上。
本文中所用的術(shù)語(yǔ)異源多肽是通常情況下不被本發(fā)明用于表達(dá)的金孢子菌屬真菌表達(dá)和分泌的蛋白質(zhì)或多肽。多肽可以是植物或動(dòng)物(脊椎動(dòng)物或無(wú)脊椎動(dòng)物)起源的例如哺乳動(dòng)物、魚、昆蟲或微生物起源的，但限制條件是此多肽不能出現(xiàn)在宿主菌株中。哺乳動(dòng)物包括人。微生物包含病毒、細(xì)菌、古細(xì)菌和真菌即絲狀真菌和酵母。伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)提供了許多系列的細(xì)菌和古細(xì)菌。為藥物應(yīng)用的目的優(yōu)先選擇人體蛋白，因此構(gòu)成本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案的重組宿主是其中帶有人體起源的多肽的宿主。為例如食品生產(chǎn)的目的，合適的異源多肽是動(dòng)物、植物或藻類起源的。因此，這些實(shí)施方案也考慮到本發(fā)明合適的實(shí)施例。其他有用的實(shí)施方案也包括細(xì)菌、酵母、病毒、古細(xì)菌和真菌任何之一起源的異源多肽。真菌起源的多肽是最優(yōu)選的。
本發(fā)明的合適的實(shí)施方案包含帶有合適的密碼子使用的異源核酸序列。這樣的序列編碼其所起源的宿主的天然的氨基酸序列，但具有不同核酸序列，即某些密碼子已經(jīng)被其他編碼相同氨基酸的密碼子替換以使之更易于被用于表達(dá)的宿主菌株所使用的核酸序列。這可導(dǎo)致異源核酸序列的更好地表達(dá)。對(duì)于本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員來(lái)說(shuō)這是很普通的。這種合適的密碼子可以在已知的真菌密碼子使用對(duì)應(yīng)于非真菌的密碼子使用的基礎(chǔ)上得到。它也可以更特異地適應(yīng)于金孢子菌屬真菌本身的密碼子使用。相似之處是所觀察到的木霉、Humicola和曲霉的密碼子使用可以在不改變密碼子的情況下進(jìn)行這些有機(jī)體之間的序列交換。關(guān)于這些真菌密碼子使用的詳細(xì)資料是本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員可利用的，并且引入本文做參考。
本發(fā)明不僅僅局限于上面所提到的金孢子菌屬真菌菌株，也包括含有編碼金孢子菌屬真菌菌株同源多肽的核酸片段的重組菌株，上述的核酸片段與一表達(dá)調(diào)控區(qū)可操作連接并且上述的重組菌株比相應(yīng)的非重組菌株在同樣的條件下產(chǎn)生更多的上述的蛋白。所感興趣的同源多肽優(yōu)選是中性或堿性酶如在本文其它地方已經(jīng)描述的水解酶、蛋白酶或碳水化合物降解酶。多肽也可以是酸性的。優(yōu)選的重組菌株比非重組菌株表達(dá)更多量的多肽。所有提到的關(guān)于異源多肽的評(píng)論也同樣適用于同源多肽纖維素酶。
因此，本發(fā)明也包括金孢子菌屬真菌基因工程菌株，其中所引入的序列是金孢子菌屬起源的。但是，由于以下原因例如用于轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染金孢子菌屬真菌存在于核酸序列中的異源序列，由于存在編碼所感興趣的多肽的核酸序列的多重拷貝這個(gè)事實(shí)或由于在同等條件下所表達(dá)的多肽的量多于非工程菌這個(gè)事實(shí)或由于在通常不表達(dá)的條件下發(fā)生表達(dá)這個(gè)事實(shí)，工程菌可以與原始自然菌株區(qū)分開來(lái)。后一情況可能是在與非重組菌相反的條件下誘導(dǎo)型啟動(dòng)子調(diào)節(jié)所感興趣的序列或著是另外的因子誘導(dǎo)表達(dá)的結(jié)果。正如在前述的實(shí)施方案中所定義的本發(fā)明不包括天然金孢子菌屬真菌。本發(fā)明旨在通過(guò)使用經(jīng)典的基因工程或基因工程方法而獲得的菌株。
本發(fā)明所有的重組菌株都含有一段編碼選自下列物質(zhì)的核酸片段碳水化合物降解酶(纖維素酶、木聚糖酶、甘露聚糖酶、甘露糖酶、果膠酶、淀粉酶例如葡糖淀粉酶、α淀粉酶、α和β半乳糖苷酶、α和β葡(萄)糖苷酶、β葡聚糖酶、幾丁質(zhì)酶、聚N-乙酰葡糖胺酶)、蛋白酶(內(nèi)切蛋白酶、氨基蛋白酶、氨基和羧基肽酶)、其它水解酶(脂酶、酯酶、植酸酶)、氧化還原酶(過(guò)氧化氫酶、葡萄糖氧化酶)和轉(zhuǎn)移酶(轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶、轉(zhuǎn)糖基酶、異構(gòu)酶和轉(zhuǎn)化酶)。
表A酶保持活性和/或穩(wěn)定性的pH范圍
*分子量(MALDI方法)注*所有其它分子量都是用SDS-PAGE方法得到的*酶都具有相等的蛋白質(zhì)含量*xyl指木聚糖酶*endo指內(nèi)切葡聚糖酶*gal指半乳糖苷酶*gluc指葡糖苷酶*CBH指纖維二糖水解酶*PGU指多聚半乳糖醛酸酶表B從18-25菌株超濾液分離的酶對(duì)不同底物的酶活性(pH5)，單位/毫克蛋白質(zhì)
*分子量(MALDI法)**對(duì)染色的酪蛋白的活性以任意單位/毫克表示本發(fā)明所要表達(dá)的最令人感興趣的產(chǎn)品是纖維素酶、木聚糖酶、果膠酶和蛋白酶。其中纖維素酶和果膠酶帶有β-1，4-鍵，纖維素酶包含內(nèi)切葡聚糖酶、纖維二糖水解酶和β-葡糖苷酶。在本領(lǐng)域已知的各種不同的工業(yè)過(guò)程中這些蛋白質(zhì)是非常有用的。特別是纖維素酶我們參考了敘述纖維二糖水解酶和內(nèi)切葡聚糖酶使用的WO98/15633。上述應(yīng)用的內(nèi)容引入文中做參考。我們也參閱了進(jìn)一步提供金孢子菌屬蛋白質(zhì)詳細(xì)資料的表A和表B。
根據(jù)本發(fā)明發(fā)現(xiàn)可以制備蛋白酶表達(dá)量降低的金孢子菌屬突變株，從而使之更適于生產(chǎn)蛋白質(zhì)產(chǎn)物，特別是對(duì)蛋白酶敏感的蛋白質(zhì)產(chǎn)物。因此本發(fā)明也包括與未突變菌株例如C.lucknowense C1菌株(VKM F-3500D)相比蛋白質(zhì)沒產(chǎn)量降低的金孢子菌屬突變株。特別是這些菌株的蛋白酶活性小于C1菌株蛋白酶活性的一半，甚至小于30％?？梢杂靡阎姆椒y(cè)量降低的蛋白酶活性如通過(guò)測(cè)量在脫脂乳平板上所形成的暈的大小或通過(guò)BSA降解。
本發(fā)明尤其感興趣的一個(gè)實(shí)施方案是本模仿的重組金孢子菌屬真菌，其中編碼感興趣多肽的核酸序列編碼一種在酸性pH下即pH低于6，甚至pH低于5.0，更適合甚至pH低于5和甚至pH4或低于pH4的情況下失活或不穩(wěn)定的蛋白質(zhì)或多肽。這是一個(gè)特別令人感興趣的實(shí)施方案，因?yàn)檫@個(gè)真菌表達(dá)系統(tǒng)并不是在中性到堿性的條件下培養(yǎng)而是在酸性條件下培養(yǎng)的。因此，本發(fā)明的這個(gè)系統(tǒng)提供了一種表達(dá)在酸性pH下易于失活或不穩(wěn)定的蛋白質(zhì)或多肽的安全的真菌表達(dá)系統(tǒng)。
正如在本發(fā)明任一實(shí)施方案中所詳細(xì)說(shuō)明的那樣，一個(gè)更為特別的重組菌株被認(rèn)為是本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案，其中編碼感興趣多肽的核酸序列編碼一種在pH5以上，優(yōu)選中性或堿性pH(即大于7)和/或在pH大于6的情況下具有最佳活性和/或穩(wěn)定性的蛋白質(zhì)或多肽。在這樣的pH值下最佳活性大于50％，大于70％甚至大于90％被認(rèn)為是特別有用的實(shí)施方案。在培養(yǎng)條件下所表達(dá)的多肽在此條件下沒有必要必須有活性，由于其活性形式可能對(duì)宿主有損害，所以實(shí)際上在其失活的條件下培養(yǎng)對(duì)它也是有利的。例如蛋白酶就是這種情況。但是，蛋白質(zhì)或多肽在此培養(yǎng)條件下必須穩(wěn)定。穩(wěn)定可以是熱穩(wěn)定。它也可以是針對(duì)某些組合物或化學(xué)制品的穩(wěn)定，例如存在于組合物中或生產(chǎn)過(guò)程中或在所感興趣的蛋白質(zhì)或多肽的應(yīng)用中。在含有纖維素酶或脂酶的去垢劑組合物中的LAS等是通常對(duì)蛋白質(zhì)有損害的化學(xué)制品的例子。在應(yīng)用中使用時(shí)間可能從短到長(zhǎng)不等，因此對(duì)于每次應(yīng)用來(lái)說(shuō)穩(wěn)定性的時(shí)間長(zhǎng)短可能不同。熟練技術(shù)人員在各種情況的基礎(chǔ)上將能夠確保正確的條件。我們可以使用商用分析方法來(lái)確定不同的酶產(chǎn)物的最佳活性。例如Sigma和Megazyme公司的產(chǎn)品目錄上有這些分析方法。在本敘述的其它地方也都提到了特定的實(shí)施例。制造商提供了應(yīng)用指導(dǎo)。
我們驚奇地發(fā)現(xiàn)能適合被所要表達(dá)的感興趣的序列轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的金孢子菌屬真菌菌株其生物量相當(dāng)?shù)?。我們已?jīng)發(fā)現(xiàn)當(dāng)培養(yǎng)至發(fā)酵的末尾階段粘度值為200-600cP時(shí)金孢子菌屬真菌菌株的生物量比T.reesei低2-3倍，當(dāng)在相應(yīng)條件下培養(yǎng)至粘度值為1500-2000cP時(shí)其生物量比黑曲霉低10-20倍，即它們各自最佳的培養(yǎng)條件能夠提供高水平的表達(dá)。表達(dá)水平極大地超過(guò)了兩個(gè)商用菌株并且其生物量和粘度值相當(dāng)?shù)?。這意味著這個(gè)金孢子菌屬真菌菌株的表達(dá)產(chǎn)量要比黑曲霉和T.reesei稍微高一些。這樣的一株轉(zhuǎn)化的或轉(zhuǎn)染的金孢子菌屬真菌菌株構(gòu)成了本發(fā)明的一個(gè)合適的實(shí)施方案。
我們發(fā)現(xiàn)在上面所敘述的條件下金孢子菌屬C1菌株(18-25)的生物量是0.5-1.0克/升，而T.reesei的生物量是2.5-5.0克/升，黑曲霉的生物量是5-10克/升。在實(shí)施例中我們提供了這個(gè)過(guò)程的詳細(xì)資料。
在本發(fā)明的一個(gè)合適的實(shí)施方案中本發(fā)明的金孢子菌屬真菌重組菌株所產(chǎn)生的蛋白質(zhì)或多肽的量至少應(yīng)該等同于由UV13-6或C-19菌株所產(chǎn)生的摩爾每升纖維素酶的量，最優(yōu)選的情況是至少應(yīng)該等同于或高于由UV18-25菌株在相應(yīng)條件或相同條件即在它們各自最佳的培養(yǎng)條件下產(chǎn)生的纖維素酶的量。
所未預(yù)料到的是，我們也發(fā)現(xiàn)當(dāng)使用顯示UV18-25菌絲體形態(tài)的金孢子菌屬菌株即短的菌絲體片段時(shí)表達(dá)和分泌率非常高。因此本發(fā)明的重組菌株優(yōu)選顯示這樣的形態(tài)。但是本發(fā)明也包括顯示這種新的和創(chuàng)造性特征的非重組菌株或其它金孢子菌屬真菌的工程菌株。本發(fā)明也包括在本發(fā)明任一實(shí)施方案中所描述的與C1菌株相比進(jìn)一步表現(xiàn)出在相同的發(fā)酵條件下產(chǎn)生孢子能力降低，優(yōu)選低于UV13-6菌株產(chǎn)孢能力，優(yōu)選低于NG7C-19菌株產(chǎn)孢能力，優(yōu)選低于UV18-25菌株產(chǎn)孢能力的金孢子菌屬真菌重組菌株。本發(fā)明也包括在本發(fā)明任一實(shí)施方案中所描述的與C1菌株相比，優(yōu)選在相同的發(fā)酵條件下與UV13-6，NG7C-19和UV18-25菌株相比顯示出至少蛋白質(zhì)產(chǎn)量與生物量比的金孢子菌屬真菌重組菌株。但是，本發(fā)明同樣也包括或與其它任一實(shí)施方案結(jié)合顯示這種新的和創(chuàng)造性特征的非重組菌株或其它金孢子菌屬真菌的工程菌株。
本發(fā)明的另一個(gè)吸引人的實(shí)施方案也包括在相應(yīng)或等同的發(fā)酵條件下顯示出粘度值比NG7C-19菌株低，優(yōu)選比UV18-25菌株的金孢子菌屬真菌重組菌株。但是，本發(fā)明同樣也包括顯示一種或幾種新的和創(chuàng)造性特征的非重組菌株或其它金孢子菌屬真菌的工程菌株。我們已經(jīng)確定在它們各自的最佳培養(yǎng)條件下發(fā)酵過(guò)程的末期階段UV18-25培養(yǎng)物的粘度值為10cP，而T.reesei的粘度值為200-600cP，黑曲霉的粘度值為1500-2000cP。在實(shí)施例中提供了這些測(cè)量過(guò)程。
在許多情況下粘度值可以通過(guò)視覺監(jiān)測(cè)。物質(zhì)的流動(dòng)性變化程度很大，它可以呈近乎固體狀、醬狀或液體狀。粘性也很容易通過(guò)使用運(yùn)動(dòng)粘性管的Brookfield旋轉(zhuǎn)粘度計(jì)、降珠粘度計(jì)或杯形粘度計(jì)確定。這樣的低粘度值培養(yǎng)物每個(gè)時(shí)間單位和每個(gè)細(xì)胞的產(chǎn)量比已知的高粘度值的商業(yè)培養(yǎng)物要高。
對(duì)本發(fā)明的這些低粘度的培養(yǎng)物進(jìn)行處理是有利的，特別是測(cè)量培養(yǎng)物時(shí)。低粘度的金孢子菌屬真菌目標(biāo)菌株在體積大至150000升的培養(yǎng)物中表現(xiàn)得非常好。因此任何一個(gè)體積至150000升的培養(yǎng)都是本發(fā)明的有用的實(shí)施方案。使用本發(fā)明的菌株任何其它傳統(tǒng)體積大小的發(fā)酵也應(yīng)該能夠很好地實(shí)施。其后的原因是在大規(guī)模生產(chǎn)中出現(xiàn)的問(wèn)題隨著聚集物的形成菌絲體太致密和/或不均勻分布。其結(jié)果是培養(yǎng)基在培養(yǎng)過(guò)程中不能被有效利用，因此導(dǎo)致生產(chǎn)過(guò)程低效，特別是在大規(guī)模發(fā)酵即體積大于150000升的情況下。通氣或混合導(dǎo)致了氧氣和營(yíng)養(yǎng)饑餓因此降低了產(chǎn)物生物量的濃度和減少了培養(yǎng)過(guò)程中的多肽產(chǎn)量和/或?qū)е掳l(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)。此外，在商業(yè)發(fā)酵過(guò)程中高粘度和高剪切是我們所不希望發(fā)生的，并且在現(xiàn)在的商業(yè)發(fā)酵過(guò)程中它們是生產(chǎn)限制因素。從這一點(diǎn)上來(lái)說(shuō)使用本發(fā)明的金孢子菌屬真菌菌株可以克服所有這些負(fù)面特征，因?yàn)榇司瓯壬逃肨reesei、黑曲霉和米曲霉顯示出更好的特征即蛋白質(zhì)生產(chǎn)水平較高、更好的粘度特征和生物量數(shù)值。
選自C1、UV13-6、NG7C-19和UV18-25的金孢子菌屬真菌菌株非常好地顯示出各種不同的特征。但是，本發(fā)明也包括來(lái)自這四種保藏的菌株的也顯示出任何一種新的和創(chuàng)造性特征或幾種特征的金孢子菌屬重組菌株和工程菌株。這些菌株的保藏?cái)?shù)據(jù)在本文各處隨處可見。本發(fā)明的金孢子菌屬菌株也包含一種在相應(yīng)的培養(yǎng)條件下顯示生物量低于T.reesei生物量至少2倍，合適的甚至低于T.reesei，特別是在實(shí)施例條件下顯示粘度為200-600cP的T.reesei的生物量超過(guò)5倍的菌株。本發(fā)明的金孢子菌屬菌株也包含在相應(yīng)或等同條件下產(chǎn)生多肽的量至少是C1、UV13-6、NG7C-19或UV18-25所產(chǎn)生的摩爾每升纖維素酶的數(shù)量。
如果本發(fā)明的金孢子菌屬真菌在中性至堿性pH和25-43℃溫度范圍內(nèi)顯示出最佳的生長(zhǎng)條件，那么此菌株是進(jìn)一步優(yōu)選的。優(yōu)選的菌株能在中性甚至堿性pH下存在。這樣的條件對(duì)于許多蛋白質(zhì)和多肽有利，特別是那些易于受到酸性pH侵害或在低溫度下失活或不穩(wěn)定的多肽和蛋白。但是，本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案也包括在酸性pH下培養(yǎng)金孢子菌屬真菌，因?yàn)檫@對(duì)于某些蛋白質(zhì)和多肽來(lái)說(shuō)是有用的。合適的酸性pH值是7以下，低于6.5的酸性pH被視作本發(fā)明的一個(gè)好的實(shí)施方案。PH在5.0-7.0之間的也是合適的實(shí)施方案。中性pH可以是7或7左右如6.5-7.5。正如在本文其他地方所表明的感興趣的最佳pH值取決于許多因素，這些因素對(duì)于本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是顯而易見的。大于7.5的pH值是堿性的，可以利用的合適的堿性pH值是7.5-9.0之間。
當(dāng)比較本發(fā)明菌株以及其它具有最佳條件的菌株(如曲霉或木霉)的測(cè)量粘度值時(shí)，也應(yīng)該使用相關(guān)的最佳條件下的相關(guān)菌株進(jìn)行生物量和蛋白質(zhì)產(chǎn)量的比較。這對(duì)于本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員是明顯的。
根據(jù)本發(fā)明的任何一個(gè)上面提到的實(shí)施方案，金孢子菌屬菌株被認(rèn)為是本發(fā)明最有用的實(shí)施方案，上述的菌株生產(chǎn)上面所提到的選自碳水化合物降解酶、蛋白酶、其它水解酶、氧化還原酶和轉(zhuǎn)移酶的一種或多種真菌酶。特別是纖維素酶、木聚糖酶、果膠酶、脂酶和蛋白酶是最令人感興趣的產(chǎn)品。但是作為本發(fā)明的實(shí)施方案，生產(chǎn)一種或多種在中性或堿性優(yōu)選堿性條件下顯示出最佳活性和/或穩(wěn)定性的真菌酶的金孢子菌屬菌株也是有用的，上述的酶選自碳水化合物降解酶、水解酶和蛋白酶，優(yōu)選水解酶和碳水化合物降解酶。在非重組金孢子菌屬菌株中，像WO 98/15633所公開的那樣這些酶是除纖維素酶以外的其它合適的酶。我們所特別感興趣的酶是木聚糖酶、蛋白酶、酯酶、α半乳糖苷酶、β半乳糖苷酶、β葡聚糖酶和果膠酶。這些酶不僅僅限于上面所提到的酶。本文中關(guān)于穩(wěn)定性和活性的討論也同樣用于此處。
本發(fā)明也包括生產(chǎn)所感興趣的多肽的方法，上述的方法包含培養(yǎng)本發(fā)明任一實(shí)施方案中所表達(dá)和優(yōu)選分泌感興趣的多肽的金孢子菌屬菌株，并隨后回收產(chǎn)生的多肽。
當(dāng)提到蛋白質(zhì)或多肽時(shí)，天然蛋白質(zhì)的變種或突變體例如替換、插入或確實(shí)突變體被包括在顯示非突變體活性的蛋白或多肽中。相應(yīng)的核酸序列也是如此。通過(guò)基因改組、蛋白質(zhì)工程和定向進(jìn)化定點(diǎn)突變和隨機(jī)突變等方法可以得到這樣的多肽、變種或突變體。美國(guó)專利5223409、5780279和5770356提供了定向進(jìn)化的方法。利用這些方法例如通過(guò)易錯(cuò)聚合酶鏈反應(yīng)進(jìn)行基因改組可在任何細(xì)胞類型中產(chǎn)生隨機(jī)突變的基因序列庫(kù)。每一基因都帶有分泌區(qū)和一固定區(qū)，從而使產(chǎn)物蛋白分泌出來(lái)并且固著在宿主表面。隨后創(chuàng)造此特定蛋白生物活性所必須的條件。經(jīng)過(guò)許多循環(huán)之后最終導(dǎo)致具有所希望特征的終基因產(chǎn)生。換一句話說(shuō)一個(gè)加速的定向進(jìn)化過(guò)程。美國(guó)專利5763192也敘述了通過(guò)合成的多聚核苷酸偶聯(lián)隨機(jī)產(chǎn)生序列，將其引入宿主中隨后選擇具有預(yù)先設(shè)定特點(diǎn)的宿主細(xì)胞而獲得DNA、RNA、肽、多肽或蛋白質(zhì)的方法。
使用標(biāo)準(zhǔn)的克隆技術(shù)和蛋白質(zhì)或多肽分離技術(shù)以取得所需要的序列信息。部分已知的序列可用做探針分離其它屬或株的同源序列。編碼特定酶活性的核酸序列可用于篩選例如金孢子菌屬序列庫(kù)。本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員知道合適的雜交條件。紐約冷泉港Plainview出版的薩姆布魯克等(編者)(1998)的“分子克隆實(shí)驗(yàn)指南”一書以及紐約約翰威利父子公司出版的奧斯伯(編者)的“現(xiàn)代分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)”一書敘述了傳統(tǒng)的核酸雜交文庫(kù)的構(gòu)建和克隆技術(shù)。相關(guān)的信息也可以從后者的手冊(cè)和專利以及本領(lǐng)域的各種商用試劑盒中得到。
在另外的一個(gè)實(shí)施方案中，上述的方法包含在允許蛋白質(zhì)或多肽或其前體表達(dá)和優(yōu)選分泌的條件下培養(yǎng)菌株，隨后分離所產(chǎn)生的多肽并且任選將前體經(jīng)過(guò)另外的分離和純化步驟以得到所感興趣的多肽。這樣的方法可能包含將前體裂解為感興趣的多肽或前體的合適的步驟。當(dāng)一分泌的蛋白質(zhì)載體和感興趣的多肽由一個(gè)蛋白酶位點(diǎn)連接時(shí)，可使用Kex-2樣蛋白酶、任一基本氨基酸配對(duì)的蛋白酶或Kex-2蛋白酶裂解。本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員能夠很容易地找到Kex-2樣蛋白酶序列，因?yàn)楝F(xiàn)有一致序列的詳細(xì)資料可以利用并且已經(jīng)公開了許多其它的序列如弗林蛋白酶。
根據(jù)本發(fā)明任一實(shí)施方案生產(chǎn)多肽的方法，培養(yǎng)的合適pH值大于5，優(yōu)選5-10，更優(yōu)選6-9。在此方法中合適的培養(yǎng)溫度是25-43℃，優(yōu)選30-40℃。在此方法中所使用的本發(fā)明的金孢子菌屬真菌菌株是本發(fā)明任一實(shí)施方案所公開的非常適合的重組金孢子菌屬菌株。本發(fā)明的這種方法可進(jìn)一步以制備本發(fā)明的重組金孢子菌屬菌株為前提。合適條件的選擇取決于待表達(dá)的多肽的性質(zhì)，并且在本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員的正常工作之內(nèi)。
生產(chǎn)本發(fā)明重組金孢子菌屬菌株的方法也是本發(fā)明的一部分。此方法包含向金孢子菌屬菌株穩(wěn)定引入一段編碼異源或同源多肽的核酸片段，上述的核酸片段與一表達(dá)調(diào)控區(qū)可操作連接，上述的引入已一種已知的轉(zhuǎn)化絲狀真菌的形式發(fā)生。如上所述有其無(wú)數(shù)的參考文獻(xiàn)可以利用，本文只引用了其中一小部分。所提供的信息足夠使本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員毫不費(fèi)力地施行此方法。此方法包含引入一段或幾段在本發(fā)明重組金孢子菌屬真菌的各種不同的實(shí)施方案中所描述的任一核酸片段。
實(shí)施例中核酸片段的引入是通過(guò)原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化的方法實(shí)現(xiàn)的。在實(shí)施例中詳細(xì)敘述了此方法。正如在本領(lǐng)域其它絲狀真菌中所描述的那樣，也可以使用另外的原生質(zhì)體或球芽轉(zhuǎn)化技術(shù)。這些方法的詳細(xì)細(xì)節(jié)可在許多引用的參考文獻(xiàn)中找到，因此這些文獻(xiàn)引入本文做參考。本發(fā)明合適的方法包含使用本發(fā)明的非重組金孢子菌屬真菌作為引入所希望的編碼感興趣多肽的核酸序列的起始材料。
本發(fā)明也包括生產(chǎn)金孢子菌屬真菌酶的方法，上述的方法包含在pH值大于5，優(yōu)選5-10，更優(yōu)選6-9，6-7.5，7.5-9是合適的中性和堿性pH范圍的培養(yǎng)基中培養(yǎng)本發(fā)明的在上面任一實(shí)施方案中所描述的金孢子菌屬真菌菌株。
通常來(lái)說(shuō)，本發(fā)明進(jìn)一步包含生產(chǎn)表現(xiàn)出中性或堿性最佳活性和/或穩(wěn)定性，優(yōu)選堿性最佳活性和/或穩(wěn)定性的酶的方法。在本文的其它地方已經(jīng)提供了優(yōu)選的pH范圍和相應(yīng)的最佳活性以及測(cè)量活性的分析方法。如上所述，酶應(yīng)選自碳水化合物降解酶、蛋白酶、其它水解酶、氧化還原酶和轉(zhuǎn)移酶，上述的方法包含培養(yǎng)用編碼相應(yīng)的酶的核酸片段轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞。金孢子菌屬真菌酶是這樣的合適的酶。合適的類似的方法包含生產(chǎn)特別是如纖維素酶、木聚糖酶、果膠酶、脂酶和蛋白酶，其中纖維素酶和木聚糖酶帶有β-1，4-鍵，并且纖維素酶包含內(nèi)切葡聚糖酶、纖維二糖水解酶和β-葡糖苷酶。本發(fā)明的方法可包含培養(yǎng)本發(fā)明的含有編碼上述的這些酶的核酸片段的金孢子菌屬真菌宿主。本發(fā)明的合適的非重組金孢子菌屬菌株主要生產(chǎn)碳水化合物降解酶、水解酶和蛋白酶。在這種情況下合適的酶是除纖維素酶以外的其它酶。在表A和表B中列出了要生產(chǎn)的合適的產(chǎn)品的實(shí)施例。分離方法等同于在WO 98/15633中所敘述的方法，此方法引入本文做參考。
本發(fā)明也包括由本發(fā)明的金孢子菌屬真菌菌株所產(chǎn)生的酶。正如可從本發(fā)明的非重組金孢子菌屬菌株中分離的酶一樣，本發(fā)明也包括金孢子菌屬真菌起源的酶。它們表現(xiàn)出前述的穩(wěn)定性、活性特點(diǎn)。合適的是它們?cè)贚AS存在時(shí)也很穩(wěn)定。需要特別聲稱的是具有前述活性穩(wěn)定性特征的等電點(diǎn)為4-9.5，分子量為25-95kD的蛋白酶；等電點(diǎn)為4.0-9.5，分子量為25-65kD的木聚糖酶；等電點(diǎn)為3.5-6.5，分子量為25-55kD的內(nèi)切葡聚糖酶；等電點(diǎn)為4-4.5，分子量為45-50kD的β-葡糖苷酶和α、β-半乳糖苷酶；等電點(diǎn)為4-5，分子量為45-60kD的纖維二糖水解酶例如等電點(diǎn)為4.5，分子量為55kD；等電點(diǎn)為4.0-5.0，分子量為60-70kD如65kD的多聚半乳糖醛酸酶；等電點(diǎn)為4-5，分子量為95-105kD的酯酶。分子量是通過(guò)SDS-PAGE電泳確定的。如在WO 98/15633中所公開的那樣，非重組酶即天然的酶是除纖維素酶以外的其它酶。在WO 98/15633中所公開的酶被排除在外。上面所提到的組合等電點(diǎn)和分子量的酶也包括在內(nèi)。
本發(fā)明也考慮到由本發(fā)明的突變(重組)菌株所(過(guò)量)產(chǎn)生的非蛋白質(zhì)產(chǎn)物。這樣的非蛋白質(zhì)產(chǎn)物包括基礎(chǔ)代謝產(chǎn)物如有機(jī)酸、氨基酸和次級(jí)代謝產(chǎn)物如抗生素，例如青霉素和頭孢菌素。這些產(chǎn)物是組合幾種生化途徑的結(jié)果，涉及一些目的真菌基因。真菌的基礎(chǔ)和次級(jí)代謝產(chǎn)物和在真菌中產(chǎn)生這些代謝產(chǎn)物的過(guò)程是本領(lǐng)域眾所周知的。Mattey M在有機(jī)酸的產(chǎn)生，現(xiàn)代生物技術(shù)評(píng)論12，87-132(1992)一文中描述了基礎(chǔ)代謝產(chǎn)物產(chǎn)生的實(shí)施例。Penalva等在真菌中青霉素生物合成的優(yōu)化，生物技術(shù)趨勢(shì)16，483-489(1998)一文中描述了次級(jí)代謝產(chǎn)物產(chǎn)生的實(shí)施例。
實(shí)施例測(cè)定生物量和粘度的實(shí)施例已經(jīng)使用了三種不同的真菌鑒定了用于真菌發(fā)酵的操作參數(shù)數(shù)據(jù)范圍。所比較的三種真菌為Trichoderma longibrachiatum(以前的T.reesei)、黑曲霉和Chrysosporium lucknowense(UV18-25)。
粘度粘度是使用小的樣品適配器和31號(hào)轉(zhuǎn)軸在Brookfield LVF粘度計(jì)上測(cè)量的。
在使用粘度計(jì)前5分鐘打開循環(huán)水泵以平衡水夾套層。水浴溫度應(yīng)為30℃。
收獲10毫升新鮮的發(fā)酵培養(yǎng)液并將此發(fā)酵培養(yǎng)液置于小的樣品轉(zhuǎn)軸上。選擇轉(zhuǎn)軸速度使其讀數(shù)范圍在10-80內(nèi)。等待4分鐘后讀取粘度測(cè)量值。讀數(shù)乘以下面所給出的系數(shù)就得到了以厘泊(cP)為單位的粘度值。
轉(zhuǎn)軸速度 系數(shù)6 5012253010605使用上面的方法對(duì)特定的真菌所測(cè)量的發(fā)酵的粘度值范圍如下粘度值(cP)T.longibrachiatum 200-600黑曲霉1500-2000C.lucknowense(UV18—25)低至10生物量生物量是通過(guò)下列方法測(cè)定的在鋁稱量盤上對(duì)直徑為5.5厘米的濾紙(沃特曼54)預(yù)先稱重。
在布氏漏斗上過(guò)濾5.0毫升全培養(yǎng)液，用10毫升去離子水沖洗濾餅，將洗過(guò)的餅和濾器置于平底稱量盤上60℃過(guò)夜干燥。最后100℃干燥1小時(shí)，然后置于干燥器中冷卻。
稱量干物質(zhì)的重量?？偵锪?克/升)等于兩次稱量值之差再乘以200得到的數(shù)值。
使用上面的方法對(duì)特定的真菌所測(cè)量的發(fā)酵的生物量范圍如下生物量(克/升)T.longibrachiatum 2.5-5黑曲霉 5-10C.lucknowense(UV18—25) 0.5-1蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)水平是利用Sigma公司的伯樂分析方法測(cè)定的。金孢子菌屬真菌的蛋白質(zhì)水平最高。
上面的數(shù)值代表發(fā)酵過(guò)程開始48小時(shí)以后直至發(fā)酵結(jié)束的測(cè)量值；曲霉和木霉的所有數(shù)值都是來(lái)自商業(yè)相關(guān)的真菌并且反映了真實(shí)的商業(yè)數(shù)據(jù)。
真菌菌株C.lucknowense(UV18-25)具有低粘度的特點(diǎn)，從而允許在發(fā)酵中使用低功率輸入和/或剪切以迎合在一些由于物理?yè)p傷產(chǎn)物分子因而剪切壓力對(duì)產(chǎn)量具有致命性損害的情況下的氧需求。在高蛋白質(zhì)產(chǎn)量時(shí)的低生物量顯示了一種更有效的將發(fā)酵培養(yǎng)液轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物的有機(jī)體。因此，金孢子菌屬真菌在提供至少同樣多蛋白質(zhì)的同時(shí)提供了更好的生物量和粘度數(shù)據(jù)，實(shí)際上比所用的優(yōu)于通常所保藏的曲霉和T.reesei的兩個(gè)商業(yè)真菌表達(dá)系統(tǒng)產(chǎn)生的蛋白質(zhì)多得多。
由C.lucknowense(UV18-25)所產(chǎn)生的高蛋白質(zhì)產(chǎn)量低生物量濃度可能允許在發(fā)酵條件達(dá)到極限之前發(fā)展具有更高生物量的發(fā)酵條件以生產(chǎn)目的產(chǎn)物，如果增加生物量導(dǎo)致產(chǎn)量提高的話。
由于現(xiàn)有的生物量和粘度水平已經(jīng)接近實(shí)際的極限發(fā)酵條件，由T.longibrachiatum和黑曲霉所產(chǎn)生的現(xiàn)有的高水平的生物量和粘度水平限制了生物量的提高。
金孢子菌屬真菌、木霉和Tolypocladium轉(zhuǎn)化比較的實(shí)施例在兩種培養(yǎng)基(pH6.8的GS培養(yǎng)基和pH6.8的Pridham瓊脂(PA)培養(yǎng)基)上測(cè)試了兩株未轉(zhuǎn)化的金孢子菌屬C1菌株和一株T.reesei參考菌株。在培養(yǎng)了7天的PDA培養(yǎng)皿上收獲孢子以檢測(cè)其抗生素抗性水平。所選擇的培養(yǎng)皿置于32℃孵育并于第2、4和5天后測(cè)量其數(shù)值。發(fā)現(xiàn)C1菌株NG7C-19和UV18-25很明顯對(duì)腐草霉素和潮霉素的基礎(chǔ)抗性水平很低。這個(gè)抗性水平等同于常用的T.reesei實(shí)驗(yàn)室參考菌株的抗性水平。因此，很明顯這兩種標(biāo)準(zhǔn)的真菌選擇標(biāo)記可以很好地應(yīng)用于金孢子菌屬真菌菌株。其它標(biāo)準(zhǔn)的真菌選擇標(biāo)記所帶來(lái)的問(wèn)題應(yīng)該不會(huì)出現(xiàn)。
在50毫克/毫升時(shí)成功地選擇出了Sh ble(腐草霉素抗性)轉(zhuǎn)化的金孢子菌屬真菌菌株。這也是用于T.reesei的選擇水平，因此表明在金孢子菌屬真菌中可以很容易地達(dá)到差示選擇。150毫克/毫升時(shí)，上面的討論同樣適用于帶有潮霉素抗性的轉(zhuǎn)化菌株。
表C
在普遍使用的真菌轉(zhuǎn)化技術(shù)的基礎(chǔ)上原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化技術(shù)被用于金孢子菌屬真菌。在一個(gè)直徑為55毫米的PDA培養(yǎng)皿上所有的孢子被收獲到8毫升的IC1培養(yǎng)液中并轉(zhuǎn)移入帶有50毫升IC1培養(yǎng)液的搖瓶中，35℃200轉(zhuǎn)/分鐘孵育15小時(shí)。然后對(duì)培養(yǎng)物離心，沉淀用MnP溶液洗滌，然后重懸于10毫升MnP和10毫克/毫升的C3Caylase的溶液中并于35℃振蕩(150轉(zhuǎn)/分鐘)孵育30分鐘。
過(guò)濾溶液，濾液3500轉(zhuǎn)/分鐘離心10分鐘。用10毫升的MnPCa2+溶液洗滌沉淀。然后于25℃再離心10分鐘后加入50微升預(yù)冷的PMC溶液?；旌衔镏糜诒?0分鐘后加入2.5毫升PMC溶液。室溫15分鐘后處理的原生質(zhì)體與3毫升軟MnR混合并立即涂布于含有選擇因子腐草霉素或潮霉素的MnR培養(yǎng)皿上。30℃孵育5天后分析轉(zhuǎn)化體(48小時(shí)以后肉眼可見克隆)，使用10微克pAN8-1參考質(zhì)粒來(lái)測(cè)定轉(zhuǎn)化效率。結(jié)果見下表D。
表D轉(zhuǎn)化效率(使用10微克pAN8-1參考質(zhì)粒)
結(jié)果表明金孢子菌屬真菌的轉(zhuǎn)化體成活力優(yōu)于木霉的轉(zhuǎn)化體成活力。菌株的轉(zhuǎn)化能力是等同的，因此在一個(gè)實(shí)驗(yàn)中金孢子菌屬真菌所得到的轉(zhuǎn)化體數(shù)目是T.reesei的4倍。所以金孢子菌屬真菌轉(zhuǎn)化系統(tǒng)不但等同于常用的T.reesei系統(tǒng)，而且甚至要優(yōu)于T.reesei系統(tǒng)。這種提高對(duì)轉(zhuǎn)化效率比pAN8-1低的載體是非常有用的。這些低效轉(zhuǎn)化載體的實(shí)施例如通常產(chǎn)生少于此10倍轉(zhuǎn)化體的用于生產(chǎn)非真菌蛋白質(zhì)的載體蛋白質(zhì)載體。
用同源的金孢子菌屬真菌蛋白質(zhì)編碼序列，也用異源蛋白質(zhì)編碼序列構(gòu)建了許多其它的轉(zhuǎn)化和表達(dá)載體，以用于金孢子菌屬真菌轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)。在圖6-11中提供了載體圖譜。
待表達(dá)的同源蛋白質(zhì)選自由金孢子菌屬真菌產(chǎn)生的由屬于家族6(分子量43kDa)的內(nèi)切葡聚糖酶6組成的纖維素酶，異源蛋白是由青霉產(chǎn)生的屬于家族12(分子量25kDa)的內(nèi)切葡聚糖酶3。
PF6g包含與內(nèi)切葡聚糖酶6信號(hào)序列連接的金孢子菌屬真菌內(nèi)切葡聚糖酶6啟動(dòng)子片段，框內(nèi)與內(nèi)切葡聚糖酶6開放讀碼框連接，其后是內(nèi)切葡聚糖酶6的終止子序列。通過(guò)與選擇載體共轉(zhuǎn)化來(lái)挑選轉(zhuǎn)化體。
PUT1150包含與內(nèi)切葡聚糖酶6信號(hào)序列連接的T.reesei纖維二糖水解酶啟動(dòng)子，框內(nèi)與內(nèi)切葡聚糖酶開放讀碼框連接，其后是T.reesei纖維二糖水解酶的終止子序列。此外，此載體攜帶帶有選擇標(biāo)記即腐草霉素抗性基因(Sh ble基因)的第二表達(dá)盒。
PUT1152包含與內(nèi)切葡聚糖酶6信號(hào)序列連接的構(gòu)巢曲霉甘油醛-3-磷酸脫氫酶啟動(dòng)子，框內(nèi)與內(nèi)切葡聚糖酶6開放讀碼框連接，其后是構(gòu)巢曲霉色氨酸合酶(trpC)的終止子序列。此外，此載體攜帶帶有選擇標(biāo)記即腐草霉素抗性基因(Sh ble基因)的第二表達(dá)盒。
PUT1155包含與T.reesei纖維二糖水解酶信號(hào)序列連接的構(gòu)巢曲霉甘油醛-3-磷酸脫氫酶A啟動(dòng)子，框內(nèi)與連接至內(nèi)切葡聚糖酶6開放讀碼框的Sh ble載體蛋白連接，其后是構(gòu)巢曲霉色氨酸合酶(trpC)的終止子序列。這個(gè)載體使用了將載體蛋白融合至目的蛋白的技術(shù)，這大大增加了我們所感興趣的蛋白的分泌。
PUT1160包含與T.reesei纖維二糖水解酶信號(hào)序列連接的構(gòu)巢曲霉甘油醛-3-磷酸脫氫酶A啟動(dòng)子，框內(nèi)與連接至青霉的內(nèi)切葡聚糖酶3開放讀碼框的Sh ble載體蛋白連接，其后是構(gòu)巢曲霉色氨酸合酶(trpC)的終止子序列。
PUT1162包含與內(nèi)切葡聚糖酶3信號(hào)序列連接的T.reesei纖維二糖水解酶啟動(dòng)子，框內(nèi)與青霉的內(nèi)切葡聚糖酶3開放讀碼框連接，其后是T.reesei纖維二糖水解酶的終止子序列。此外，此載體攜帶帶有選擇標(biāo)記即腐草霉素抗性基因(Sh ble基因)的第二表達(dá)盒。
表E比較轉(zhuǎn)化
表E顯示了轉(zhuǎn)化金孢子菌屬真菌UV18-25和Tolypocladiumgeodes菌株的結(jié)果。所用的轉(zhuǎn)化方法見異源轉(zhuǎn)化那一節(jié)。
金孢子菌屬真菌菌株異源和同源表達(dá)的實(shí)施例已經(jīng)測(cè)定了C1菌株(NG7C-19和/或UV18-25)分泌各種異源蛋白的能力細(xì)菌蛋白(Streptoalloteichus hindustanus腐草霉素抗性蛋白，Sh ble)、真菌蛋白(T.reesei木聚糖酶II，XYN2)和人體蛋白(人溶菌酶，HLZ)。
此方法的詳細(xì)細(xì)節(jié)如下[1]C1菌株分泌Streptoalloteichus hindustanus腐草霉素抗性蛋白(Sh ble)已經(jīng)用pUT720質(zhì)粒1轉(zhuǎn)化C1菌株NG7C-19和UV18-25。此質(zhì)粒帶有以下真菌表達(dá)盒
—構(gòu)巢曲霉甘油醛-3-磷酸脫氫酶A(gpdA)啟動(dòng)子2—合成的T. reesei纖維二糖水解酶I(cbhl)信號(hào)序列1.3—Streptoalloteichus hindustanus腐草霉素抗性基因Sh ble4—構(gòu)巢曲霉色氨酸合酶(trpC)終止子5此載體也包含β-內(nèi)酰胺酶基因(bla)和來(lái)自pUC18質(zhì)粒6的大腸桿菌復(fù)制起點(diǎn)。圖2中提供了詳細(xì)的質(zhì)粒圖譜。
根據(jù)Durand等7的方法轉(zhuǎn)化C1原生質(zhì)體。適應(yīng)C1菌株(培養(yǎng)基和溶液到處有售)收獲一個(gè)直徑為90毫米的PDA培養(yǎng)皿上未轉(zhuǎn)化C1菌株的所有孢子至8毫升的IC1培養(yǎng)液中，并轉(zhuǎn)移入帶有50毫升IC1培養(yǎng)液的搖瓶中，35℃150轉(zhuǎn)/分鐘孵育15小時(shí)。然后對(duì)培養(yǎng)物離心，用MnP溶液洗滌沉淀，重懸于10毫升MnP和10毫克/毫升的C3 Caylase的溶液中并于35℃振蕩(150轉(zhuǎn)/分鐘)孵育30分鐘。過(guò)濾溶液，濾液3500轉(zhuǎn)/分鐘離心10分鐘。用10毫升的MnPCa2+溶液洗滌沉淀。然后3500轉(zhuǎn)/分鐘再離心10分鐘，沉淀溶于1毫升的MnPCa2+溶液中。向200微升原生質(zhì)體溶液中加入10微克pUT720DNA室溫(約20(℃)孵育10分鐘。然后加入50微升預(yù)冷的PMC溶液?；旌衔镏糜诒?0分鐘后加入2.5毫升PMC溶液。室溫15分鐘后500微升處理的原生質(zhì)體與3毫升軟MnR混合并立即涂布于含有選擇因子腐草霉素(pH6.5時(shí)50微克/毫升)的MnR培養(yǎng)皿上。30℃孵育5天后分析轉(zhuǎn)化體(48小時(shí)以后形成肉眼可見克隆)。
用下列方法分析C1轉(zhuǎn)化體(腐草霉素抗性克隆)所產(chǎn)生的Shble牙簽挑取基本轉(zhuǎn)化體接種至含有腐草霉素(5微克/毫升)的GS平板上，32℃培養(yǎng)5天以確定其抗性。每一經(jīng)過(guò)確認(rèn)的抗性克隆被亞克隆到GS平板上。為了獲得用于液體培養(yǎng)的孢子，將每個(gè)轉(zhuǎn)化體的兩個(gè)亞克隆接種至PDA平板上。在IC1液體培養(yǎng)液中27℃生長(zhǎng)5天(200轉(zhuǎn)/分鐘搖動(dòng))。然后，對(duì)培養(yǎng)物離心(5000g，10分鐘)，收集500微升上清夜。用TCA使這些樣品中的蛋白質(zhì)沉淀下來(lái)并且重懸于樣品緩沖液中至總蛋白濃度為4毫克/毫升(LowIy方法8)。10微升樣品(約40微克總蛋白)上樣至12％丙烯酰胺/SDS凝膠上然后電泳(伯樂微型電轉(zhuǎn)印跡系統(tǒng))。蛋白印跡是根據(jù)伯樂的說(shuō)明(Schleicher和Schull 0.2微米膜)使用兔抗Sh ble抗血清作為一抗進(jìn)行的。


圖1和表F顯示了實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
表FC1菌株中估測(cè)的Shble表達(dá)水平
這些數(shù)據(jù)表明1)來(lái)自pUT720的異源轉(zhuǎn)錄/翻譯信號(hào)在金孢子菌屬真菌中也是起作用的。
2)pUT720的異源信號(hào)序列在金孢子菌屬真菌中也是起作用的。
3)金孢子菌屬真菌可以用做分泌異源細(xì)菌蛋白的宿主。C1菌株分泌人溶菌酶(HLZ)已經(jīng)用pUT970G9質(zhì)粒轉(zhuǎn)化了C1菌株NG7C-19和UV18-25。此載體帶有以下真菌表達(dá)盒
—構(gòu)巢曲霉甘油醛-3-磷酸脫氫酶A(gpdA)啟動(dòng)子2—合成的T reesei纖維二糖水解酶I(cbh1)信號(hào)序列1.3—用做載體蛋白10的Streptoalloteichus hindustanus腐草霉素抗性基因Shble4—克隆自pAN56-2質(zhì)粒的黑曲霉葡糖淀粉酶(glaA2)鉸鏈區(qū)11.12—具有KEX2樣蛋白酶裂解位點(diǎn)的連接肽(LGERK)1—合成的人溶菌酶基因(hlz)10—構(gòu)巢曲霉色氨酸合酶(trpC)終止子5此載體也包含β-內(nèi)酰胺酶基因(bla)和來(lái)自pUC18質(zhì)粒6的大腸桿菌復(fù)制起點(diǎn)。圖3中提供了詳細(xì)的質(zhì)粒圖譜。
遵循已經(jīng)在實(shí)施例1中描述的相同方法用pUT970G質(zhì)粒轉(zhuǎn)化C1原生質(zhì)體。融合蛋白(Sh ble∷GAM鉸鏈HLZ)是具有腐草霉素抗性的，因此可以很容易地選擇C1轉(zhuǎn)化體。而且，腐草霉素抗性水平與hlz表達(dá)水平密切相關(guān)。
用如下的溶菌酶活性分析方法來(lái)分析由C1轉(zhuǎn)化體(腐草霉素抗性克隆)所產(chǎn)生的HLZ牙簽挑取基本轉(zhuǎn)化體接種至含有腐草霉素(5微克/毫升)的GS平板(抗性確認(rèn))和LYSO平板(通過(guò)條帶顯色清除來(lái)檢測(cè)HLZ活性1.10)上。將平板置于32℃培養(yǎng)5天。每一經(jīng)過(guò)確認(rèn)的抗性克隆被亞克隆到LYSO平板上。為了獲得用于液體培養(yǎng)用的孢子，將每個(gè)轉(zhuǎn)化體的兩個(gè)亞克隆接種至PDA平板上。在IC1液體培養(yǎng)液中27℃生長(zhǎng)5天(180轉(zhuǎn)/分鐘搖動(dòng))。然后，對(duì)培養(yǎng)物離心(5000g，10分鐘)。根據(jù)Morsky等13的方法測(cè)量了這些樣品的溶菌酶活性。
表GC1菌株產(chǎn)生的活性HLZ水平
這些數(shù)據(jù)表明1)證實(shí)了實(shí)施例1中的第一點(diǎn)和第二點(diǎn)2)Sh ble可以用做金孢子菌屬真菌的抗性標(biāo)志3)Sh ble可以用做金孢子菌屬真菌的載體蛋白4)在金孢子菌屬真菌中存在活性的KEX2樣蛋白酶裂解位點(diǎn)(否則HLZ無(wú)活性)5)金孢子菌屬真菌可以用做分泌異源哺乳動(dòng)物蛋白的宿主[3]C1菌株分泌T.reesei木聚糖酶II(XYN2)已經(jīng)用pUT1064和pUT1065質(zhì)粒轉(zhuǎn)化了C1菌株UV18-25。
pUT1064質(zhì)粒具有以下真菌表達(dá)盒第一個(gè)表達(dá)盒用于選擇腐草霉素抗性轉(zhuǎn)化體—粗糙脈孢霉交叉旁路控制基因(cpc-1)啟動(dòng)子14—Streptoalloteichus hindustanus腐草霉素抗性基因Sh ble4—構(gòu)巢曲霉色氨酸合酶(trpC)終止子5第二個(gè)表達(dá)盒是木聚糖酶產(chǎn)生表達(dá)盒—T.reeseiTR2株cbh1啟動(dòng)子15—T.reeseiTR2株xyn2基因(包括其信號(hào)序列)16
—T.reeseiTR2株cbh1終止子15此載體也攜帶來(lái)自pUC19質(zhì)粒6的大腸桿菌復(fù)制起點(diǎn)。圖4中提供了詳細(xì)的質(zhì)粒圖譜。
pUT1065質(zhì)粒具有以下真菌表達(dá)盒—構(gòu)巢曲霉甘油醛-3-磷酸脫氫酶(gpdA)啟動(dòng)子2—合成的T.reesei纖維二糖水解酶I(cbh1)信號(hào)序列1.3—用做載體蛋白10的Streptoalloteichus hindustanus腐草霉素抗性基因Sh ble4—具有KEX2樣蛋白酶裂解位點(diǎn)的連接肽(LGERK)1—T.reeseiTR2株xyn2基因(無(wú)信號(hào)序列)16—構(gòu)巢曲霉色氨酸合酶(trpC)終止子5此載體也包含β-內(nèi)酰胺酶基因(bla)和來(lái)自pUC18質(zhì)粒6的大腸桿菌復(fù)制起點(diǎn)。圖2中提供了詳細(xì)的質(zhì)粒圖譜。
遵循已經(jīng)在實(shí)施例1中描述的相同方法用pUT1064和pUT1065質(zhì)粒轉(zhuǎn)化C1原生質(zhì)體。pUT1065質(zhì)粒中的融合蛋白(Shble∷XYN2)是具有腐草霉素抗性的，因此可以很容易地選擇C1轉(zhuǎn)化體。而且，腐草霉素抗性水平與xyn2表達(dá)水平密切相關(guān)。帶有自己信號(hào)序列的xyn2被克隆到pUT1064質(zhì)粒中。
用如下的木聚糖酶活性分析方法來(lái)分析由C1轉(zhuǎn)化體(腐草霉素抗性克隆)所產(chǎn)生的木聚糖酶牙簽挑取基本轉(zhuǎn)化體接種至含有腐草霉素(5微克/毫升)的GS平板(抗性確認(rèn))和XYLAN平板(通過(guò)觀察透明區(qū)帶來(lái)檢測(cè)木聚糖酶活性17)上。將平板置于32℃培養(yǎng)5天。每一經(jīng)過(guò)確認(rèn)的抗性克隆被亞克隆到XYLAN平板上。為了獲得用于液體培養(yǎng)用的孢子，將每個(gè)轉(zhuǎn)化體的兩個(gè)亞克隆接種至PDA平板上。在含有5克/升Kphtalate的IC1液體培養(yǎng)液中27℃培養(yǎng)5天(180轉(zhuǎn)/分鐘搖動(dòng))。然后，對(duì)培養(yǎng)物離心(5000g，10分鐘)。根據(jù)Miller等18的方法，我們使用DNS技術(shù)測(cè)量了這些樣品的木聚糖酶活性。
表HC1菌株(最佳產(chǎn)量菌株)的活性XYN2生產(chǎn)水平
這些數(shù)據(jù)表明1)證實(shí)了實(shí)施例2中的第一至第四點(diǎn)。
2)C1菌株可以用做分泌異源真菌蛋白的宿主。我們也列出了轉(zhuǎn)化的UV18-25菌株的表達(dá)數(shù)據(jù)，其中表I顯示了用于轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒和結(jié)果。這個(gè)表說(shuō)明不但用異源表達(dá)調(diào)控序列和信號(hào)序列可以得到內(nèi)切葡聚糖酶和纖維二糖水解酶很高水平的表達(dá)，而且用同源表達(dá)調(diào)控序列和信號(hào)序列也可以。各種質(zhì)粒的詳細(xì)資料可在本文其它各處的敘述及圖中找到。生產(chǎn)條件是35℃和堿性pH下。
表I轉(zhuǎn)化的UV18-25菌株的表達(dá)數(shù)據(jù)
培養(yǎng)條件(搖瓶)88小時(shí)，35℃，230轉(zhuǎn)/分鐘。*所有以上數(shù)據(jù)都是相對(duì)于親本UV18-25菌株的百分?jǐn)?shù)。
實(shí)施例附錄培養(yǎng)基轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基Mandels堿MnP培養(yǎng)基KH2PO42.0克/升Mandels堿加(NH4)2SO41.4克/升肽胨1克/升MgSO4.7H2O 0.3克/升MES 2克/升CaCl20.3克/升蔗糖100克/升微量元素 1.0毫升/升 調(diào)pH值至5MnR MnP Ca2+MnP＋蔗糖 130克/升MnP培養(yǎng)基＋酵母提取物 2.5克/升CaCl2.2H2O50mM葡萄糖 2.5克/升調(diào)pH值至6.5瓊脂 15克/升軟MnR只加7.5克/升瓊脂MPCCaCl250mM pH5.8MOPS 10mMPEG40％用于選擇和培養(yǎng)GS葡萄糖 10克/升Biosoyase 5克/升 [Merieux]瓊脂 15克/升 調(diào)pH值至6.8PDA馬鈴薯葡萄糖瓊脂39克/升[Difco]調(diào)pH值至5.5MPGMandels堿加K.Phtalate5克/升葡萄糖30克/升酵母提取物5克/升加入50微克/毫升腐草霉素或100-150微克/毫升潮霉素的再生培養(yǎng)基(MnR)被用于選擇轉(zhuǎn)化體。加入5微克/毫升腐草霉素的GS培養(yǎng)基被用于證實(shí)抗生素抗性。
PDA是用于快速生長(zhǎng)和產(chǎn)生孢子的完全培養(yǎng)基。用1/20的孢子懸液(在一個(gè)90毫米PDA平板上所有孢子收獲到5毫升0.1％吐溫中)接種液體培養(yǎng)基。在搖瓶中(200轉(zhuǎn))27℃培養(yǎng)。
C1蛋白的分離和鑒定獲得各種不同的蛋白質(zhì)的方法被認(rèn)為是蛋白質(zhì)的許多特征。表A、B和J中提供了純化方案和純化過(guò)程的詳細(xì)資料。使用與WO98/15633描述的方法，此方法引入本文做參考，類似的方法用DEAE-Toyotearl離子交換層析從金孢子菌屬真菌培養(yǎng)物中分離蛋白質(zhì)。從此層析中得到的非附著蛋白部分(F60-31 CF)在平衡至pH7.6后用大量制備物離子交換層析純化。收集非附著蛋白部分(NBNB)，附著蛋白被洗脫至0.1M NaCl梯度中。NBNB部分提供了19、30、35和46kD的主要蛋白質(zhì)和51kD的次要蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)峰從各個(gè)不同的部分被洗脫到0.1M NaCl梯度中。39-41部分包括28、36和60kD蛋白；44-48包括28、45和66kD主要蛋白帶和33、36、55、60和67kD蛋白；49-51部分包括30、36、56和68kD蛋白；52-59部分包括33和55kD主要蛋白和28、36kD次要蛋白。收集的NBNB部分經(jīng)Phenyl superose疏水層析進(jìn)一步純化。用pH7.0含有1.2M (NH4)2SO4的0.03M磷酸鈉緩沖液平衡NBNB部分，然后上柱。吸附蛋白被洗脫至1.2M-0.6M(NH4)2SO4梯度溶液中。因此如同等電點(diǎn)為8.9的30kD的蛋白酶一樣，就得到了分子量分別為30kD和51kD、等電點(diǎn)分別為9.1和8.7的同源木聚糖酶。
此木聚糖酶無(wú)MUF纖維二糖酶活性，因此是真正的木聚糖酶。30kD的堿性(等電點(diǎn)為9.1)木聚糖酶在一個(gè)非常寬的pH范圍即pH5-8內(nèi)具有高活性，在pH9-10時(shí)仍然維持65％的最大活性；它是木聚糖酶F家族中的一員在SEQ ID NO.5中列出了其部分核苷酸和氨基酸序列。所描述的部分氨基酸序列對(duì)應(yīng)于成熟蛋白N末端大約50-170位氨基酸位置。本發(fā)明的木聚糖酶與SEQ ID NO.5部分氨基酸序列具有至少60％，優(yōu)選至少70％，最優(yōu)選至少80％的序列相同性。可用SEQ ID NO.5的部分核苷酸序列鑒定相應(yīng)的作為本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施方案的木聚糖酶啟動(dòng)子。51kD的木聚糖酶(等電點(diǎn)為8.7)在pH6時(shí)具有最大活性，在pH7.5時(shí)保持70％的活性，在pH8.0時(shí)保持至少50％的活性。它非常不穩(wěn)定在pH5.5時(shí)只具有15％的活性，在pH7.5時(shí)只具有4％的活性。30kD木聚糖酶對(duì)樺木聚糖的Michaelis常數(shù)為4.2克/升，51kD木聚糖酶對(duì)樺木聚糖的Michaelis常數(shù)為3.4克/升。最適溫度較高，兩種木聚糖酶都達(dá)到了70℃。
30kD蛋白酶在50℃ pH7時(shí)對(duì)NBNB部分蛋白的活性似乎等于0.4×10-3單位/毫升。此部分對(duì)染色的酪蛋白的活性為0.4單位/毫克(pH7)。加入尿素作為離液劑導(dǎo)致蛋白酶活性增加2-3倍。蛋白酶對(duì)木聚糖酶的效應(yīng)是顯著的。在pH10.3 50℃孵育30分鐘后只保持了30％的木聚糖酶活性。在pH8時(shí)保持了95％的木聚糖酶活性。加入LAS導(dǎo)致木聚糖酶活性急劇降低，在pH8和pH10.3時(shí)孵育10分鐘，無(wú)論有無(wú)蛋白酶抑制劑PMSF，只有50％的木聚糖酶活性保留下來(lái)。30kD的蛋白酶是堿性蛋白，其最適pH為pH10-11。其活性受到苯甲基磺酰氟(PMSF)而不是碘乙酸、胃蛋白酶抑制劑和EDTA所抑制說(shuō)明它是絲氨酸類型的蛋白酶。在無(wú)離液劑、50℃中性pH條件下，蛋白酶對(duì)C1蛋白無(wú)活性。增加pH值和加入離液劑如LAS、SDS和尿素顯著增加了蛋白酶解作用。
39-41部分是用Phenyl superose疏水層析純化的。用pH7.2含有1.5M(NH4)2SO4的0.03M磷酸鈉緩沖液平衡此部分，然后上柱。吸附蛋白被洗脫至1.5M-0 M(NH4)2SO4梯度溶液中。因此得到了等電點(diǎn)為4.7的60kD同源木聚糖酶。此木聚糖酶對(duì)木聚糖、MUF-纖維二糖、MUF-木糖苷和MUF-乳糖苷具有活性。此木聚糖酶可能屬于家族10(家族F)。此酶在pH5到8的范圍內(nèi)很穩(wěn)定，50℃孵育24小時(shí)后其活性仍然大于80％。在pH5到7的范圍內(nèi)60℃孵育其保持70％的活性。在pH9時(shí)50℃孵育5小時(shí)仍然保持80％活性，24小時(shí)后保持35％活性。在pH10時(shí)50℃孵育0.5小時(shí)后保持60％活性。在pH8時(shí)60℃孵育5小時(shí)后發(fā)現(xiàn)其活性為45％，24小時(shí)后降為0。其最適pH范圍為pH6-7，在pH9時(shí)保留70％活性，在pH9.5時(shí)保留50％活性。對(duì)樺木聚糖酶的Michaelis常數(shù)為0.5克/升。最適溫度很高，達(dá)到了80℃。
44-48部分是用Mono P.A層析聚焦純化的，7.63-5.96的pH梯度被用于洗脫蛋白。結(jié)果是得到了等電點(diǎn)為6的45kD內(nèi)切葡聚糖酶。此45kD的內(nèi)切酶在pH5時(shí)對(duì)羧甲基纖維素具有最大活性，在pH5-7時(shí)對(duì)RBB羧甲基纖維素具有最大活性。在pH6.5時(shí)此內(nèi)切酶對(duì)羧甲基纖維素保持70％的最大活性，pH7.0時(shí)對(duì)RBB羧甲基纖維素保持70％的最大活性；在pH7時(shí)對(duì)羧甲基纖維素具有50％的最大活性，pH8時(shí)對(duì)RBB羧甲基纖維素具有50％的最大活性。對(duì)羧甲基纖維素的Michaelis常數(shù)為4.8克/升。最適溫度很高，達(dá)到了80℃。其它28、33、36、55、60和65kD的蛋白也被混在一起洗脫下來(lái)。
52-58部分也是用Mono P.A層析聚焦純化的，7.6-4.5的pH梯度被用于洗脫蛋白。得到了等電點(diǎn)為4.9的55kD內(nèi)切葡聚糖酶。此55kD的內(nèi)切酶是中性的。其最適pH值是4.5-6，在pH7.0時(shí)對(duì)羧甲基纖維素和RBB羧甲基纖維素均保持70％活性，在pH8時(shí)對(duì)羧甲基纖維素和RBB羧甲基纖維素均保持50％活性。對(duì)羧甲基纖維素的Michaelis常數(shù)為1克/升。最適溫度很高，達(dá)到了80℃。許多部分也含有分子量為28、33和36kD的蛋白質(zhì)。
使用Macro Prep Q層析從50-53部分得到了金孢子菌屬真菌培養(yǎng)物的F 60-8 UF部分，然后從吸附在DEAEToyopearl上的F60-8UF中分離得到了45、48和100kD蛋白。
用0.03M pH5.57的吲哚鹽酸緩沖液平衡50-53部分，然后上柱。吸附蛋白被洗脫至0.1-0.25M NaCl梯度溶液中，置于梯度溶液中4小時(shí)。其結(jié)果是分離出了均質(zhì)的45kD(等電點(diǎn)4.2)、48kD(等電點(diǎn)4.4)和100kD(等電點(diǎn)4.5)蛋白。
根據(jù)45kD蛋白對(duì)對(duì)硝基苯基-α-半乳糖苷和硝基苯基-β-半乳糖苷的活性推測(cè)它是一種α、β半乳糖苷酶。最適pH是4.5，在pH5.7時(shí)具有70％活性，在pH6.8時(shí)保留50％活性，最適溫度為60℃。
48kD蛋白是對(duì)對(duì)硝基苯基-β-半乳糖苷有高活性和對(duì)MUF纖維二糖苷、MUF乳糖苷和對(duì)硝基苯基丁酸酯有活性的纖維二糖水解酶。48kD蛋白對(duì)CMC的最適pH為5，對(duì)RBB-CMC的最適pH為5-6。
等電點(diǎn)為4.5的100kD蛋白酶只對(duì)對(duì)硝基苯基丁酸酯具有活性。它可能是一種酯酶但不是阿魏酸酯酶，因?yàn)樗鼘?duì)阿魏酸的甲基酯無(wú)活性。其最適pH為中性/堿性(pH8-9)，最適溫度為55-60℃。
等電點(diǎn)為4.2的90kD蛋白酶分離自結(jié)合蛋白部分，50℃ pH7時(shí)所測(cè)量的其對(duì)NBNB部分蛋白的活性似乎等于12×10-3單位/毫升。此部分對(duì)染色的酪蛋白的活性為0.01單位/毫克(pH7)。在pH7和pH9(50℃)時(shí)加入尿素作為離液劑導(dǎo)致蛋白酶活性增加2-3倍。加入LAS也導(dǎo)致如此效果。90kD蛋白酶是中性的，其最適pH為8。其活性受苯甲基磺酰氟(PMSF)，而不是碘乙酸、胃蛋白酶抑制劑和EDTA所抑制說(shuō)明它是絲氨酸類型的蛋白酶。
等電點(diǎn)為4.2的43kD內(nèi)切葡聚糖酶(33-37部分)、等電點(diǎn)為4.1的25kD內(nèi)切葡聚糖酶(39-43部分)、等電點(diǎn)為4.9的55kD纖維二糖水解酶(39-43部分)和等電點(diǎn)為4.4的65kD多聚半乳糖醛酸酶(39-43部分)也從結(jié)合的蛋白部分分離出來(lái)。內(nèi)切葡聚糖酶對(duì)微晶纖維素或MUF-纖維二糖苷并無(wú)活性，但對(duì)甲基纖維素、RBB羧甲基纖維素、羧甲基纖維素41、β-葡聚糖酶和內(nèi)切葡聚糖酶具有較高活性。25kD內(nèi)切葡聚糖酶不從羧甲基纖維素中產(chǎn)生葡萄糖，而43kD內(nèi)切葡聚糖酶則從中產(chǎn)生。從微晶纖維素中不形成葡萄糖。43kD內(nèi)切葡聚糖酶的最適pH是4.5，在pH7.2時(shí)具有70％最大活性，在pH8時(shí)只保留50％最大活性。在pH5和6時(shí)孵育25小時(shí)后43kD內(nèi)切葡聚糖酶保留70％活性。在pH7孵育同樣時(shí)間它只保留10％活性。25kD內(nèi)切葡聚糖酶對(duì)羧甲基纖維素的活性最適pH為5，對(duì)RBB羧甲基纖維素活性最適pH較寬，在pH9時(shí)具有90％最大活性，在pH10時(shí)保留50％最大活性。在pH5和6時(shí)孵育120小時(shí)后保持100％活性，在pH7、8、8.6和9.6孵育同樣時(shí)間它仍保留80％活性。25kD內(nèi)切葡聚糖酶的活性最適溫度為70℃。43kD內(nèi)切葡聚糖酶的活性最適溫度為60℃。對(duì)羧甲基纖維素的Michaelis常數(shù)分別是25kD內(nèi)切葡聚糖酶62克/升，43kD內(nèi)切葡聚糖酶12.7克/升。多聚半乳糖醛酸酶是一種果膠酶。對(duì)PDA的Michaelis常數(shù)為3.8克/升。PGU活性的最適pH范圍為pH5-7，最適溫度為50-65℃。
編碼金孢子菌屬真菌蛋白的基因可以用PCR技術(shù)得到并通過(guò)序列分析鑒定。相應(yīng)的全基因是通過(guò)用分離出的PCR片段篩選(部分)基因庫(kù)而獲得的。已經(jīng)克隆、測(cè)序和分析了C1菌株的43kD內(nèi)切葡聚糖酶(EG6，家族6)的全基因(包括2.5kb啟動(dòng)子區(qū)和0.5kb終止子區(qū))。在SEQ ID NO.1中列出了其核苷酸和氨基酸序列。預(yù)測(cè)成熟蛋白的分子量為39427道爾頓，等電點(diǎn)為4.53，與實(shí)際測(cè)量值很接近。與6.2家族的其它糖基水解酶的蛋白質(zhì)序列比較分析表明C1-EG6并不包括纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域(CBD)。使用SwissPort SAMBA軟件(史密斯和沃特曼公式，Gap penalty 12/2，alignment 10，blosum62matrix)進(jìn)行的同源分析表明C1-EG6與Oxysporum鐮孢霉(多于376個(gè)氨基酸)具有51.6％的相同性，與Agaricus bispoma CBH3(多于353個(gè)氨基酸)具有51.0％的相同性，與T.reeseiCBH2(多于367個(gè)氨基酸)具有50.7％的相同性。推測(cè)從第1位蛋氨酸到第28位精氨酸為信號(hào)序列。啟動(dòng)子具有幾個(gè)潛在的CreA結(jié)合位點(diǎn)，所以啟動(dòng)子很可能在一個(gè)CreA調(diào)控的真菌菌株中受到葡萄糖抑制。
同樣的，已經(jīng)克隆、測(cè)序和分析了C1菌株的25kD內(nèi)切葡聚糖酶(EG5，家族5)的全基因(包括3.3kb啟動(dòng)子區(qū)和0.7kb終止子區(qū))。在SEQ ID NO.2中列出了其核苷酸和氨基酸序列。預(yù)測(cè)成熟蛋白的分子量為21858道爾頓，等電點(diǎn)為4.66，與實(shí)際測(cè)量值很接近。這是目前已知的最小的真菌內(nèi)切葡聚糖酶。與家族45的其它糖基水解酶的蛋白質(zhì)序列比較分析表明C1-EG5既不包括纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域(CBD)，也不包括Cohesin/dockerin結(jié)構(gòu)域。使用NCBI-BLASTP2軟件(Gap penalty 11/1，alignment 10，blosum62 matrix)進(jìn)行的同源分析表明與C1-EG5最接近的蛋白是Oxysporum鐮孢霉，具有63％的相同性。推測(cè)從第1位蛋氨酸到第18位丙氨酸為信號(hào)序列。啟動(dòng)子具有許多潛在的CreA結(jié)合位點(diǎn)，所以啟動(dòng)子很可能在一個(gè)CreA調(diào)控的真菌菌株中受到葡萄糖抑制。
而且，在纖維素酶家族12同源分析的基礎(chǔ)上通過(guò)PCR技術(shù)發(fā)現(xiàn)了另外一個(gè)內(nèi)切葡聚糖酶。在SEQ ID NO.3中列出此內(nèi)切葡聚糖酶(EG3，家族12)的部分核苷酸和氨基酸序列。
55kD蛋白是對(duì)MUF-纖維二糖苷、MUF-乳糖苷、FP和微晶纖維素具有活性，也對(duì)對(duì)硝基苯-β-葡糖苷、纖維二糖和對(duì)硝基苯乳糖苷有活性的纖維二糖水解酶(本文參做CBH1)。其對(duì)MUF-纖維二糖苷的活性受到纖維二糖抑制。抑制常數(shù)為0.4mM。對(duì)MUF-纖維二糖苷的Michaelis常數(shù)為0.14 mM，對(duì)MUF-乳糖苷的Michaelis常數(shù)為4mM，對(duì)羧甲基纖維素為3.6克/升。最適pH相當(dāng)寬，從pH4.5到7皆可。在pH8時(shí)對(duì)羧甲基纖維素具有50％最大活性，對(duì)RBB羧甲基纖維素具有80％活性。在pH5-8時(shí)孵育25小時(shí)后保持70-80％活性。最適溫度為60-70℃。CBH1可能是纖維二糖水解酶家族7的一員；在SEQ ID NO.4中列出了其部分核苷酸和氨基酸序列。所類出的部分氨基酸序列對(duì)應(yīng)于成熟蛋白N末端300-450位氨基酸位置。本發(fā)明的纖維二糖水解酶具有SEQ ID NO.4部分氨基酸序列至少60％，優(yōu)選至少70％，最優(yōu)選至少80％的序列相同性?？捎肧EQ IDNO.4中的部分核苷酸序列鑒定相應(yīng)的作為本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施方案的CBH啟動(dòng)子。在微晶纖維素水解過(guò)程中觀察到了25kD內(nèi)切葡聚糖酶和55kD CBH之間的協(xié)同效應(yīng)。在25kD內(nèi)切葡聚糖酶與55kD CBH的比例為80∶20時(shí)協(xié)同效應(yīng)最大。Ksyn最大值為1.3。
表J純化方案
通過(guò)RNA印跡分析研究了金孢子菌屬真菌的5個(gè)主要基因的表達(dá)水平。在33℃時(shí)各種不同的C.lucknowense菌株生長(zhǎng)于含有pharmedia纖維二糖和乳糖的豐富培養(yǎng)基(培養(yǎng)基1)和含有pharmedia和葡萄糖的豐富培養(yǎng)基(培養(yǎng)基2)中。48小時(shí)后，收獲菌絲體分離RNA。用5種不同的探針EG5、EG6、EG3、XylF和CBH與RNA雜交。爆光后剝離RNA印跡，與作為印跡中mRNA數(shù)量對(duì)照的核酶L3探針再次雜交。在培養(yǎng)基1中生長(zhǎng)的許多菌株表現(xiàn)出對(duì)CBH很高的反應(yīng)和對(duì)XylF的高反應(yīng)。在培養(yǎng)基2中生長(zhǎng)的半數(shù)菌株對(duì)所有基因都表現(xiàn)出高反應(yīng)性，剩下的一半反應(yīng)較低。從這些數(shù)據(jù)推斷表達(dá)強(qiáng)度的順序?yàn)镃BH＞XylF＞EG5＞EG3＞EG6。
表A、B和J中顯示了以上的詳細(xì)數(shù)據(jù)。
圖的說(shuō)明圖1是實(shí)施例中所描述的蛋白印跡。
圖2是pUT720圖譜。
圖3是pUT970G圖譜。
圖4是pUT1064圖譜。
圖5是pUT1065圖譜。
圖6是pF6g圖譜。
圖7是pUT1150圖譜。
圖8是pUT1152圖譜。
圖9是pUT1155圖譜。
圖10是pUT1160圖譜。
圖11是pUT1162圖譜。
圖12DEAE-Toyopearl純化F 60-31 CF樣品后對(duì)NB部分進(jìn)行Macro Prep Q離子交換層析。
圖1330kD(等電點(diǎn)8.9)和90kD(等電點(diǎn)4.2)蛋白酶對(duì)C1蛋白的活性pH過(guò)程(50℃，孵育30分鐘)。
圖1450℃時(shí)30kD(等電點(diǎn)8.9)“堿性”蛋白酶對(duì)F 60-31 CF的NBNB部分(Macro Prep Q)木聚糖酶活性的影響。
圖1550℃時(shí)90kD(等電點(diǎn)4.2)中性蛋白酶對(duì)F60-8UF-conc樣品的附著部分44-45(DEAE-Toyopearl)蛋白羧甲基纖維素活性的影響。
圖1665kD多聚半乳糖醛酸酶(等電點(diǎn)4.4)完全水解多聚半乳糖醛酸50℃，pH4.5，PGA濃度為5克/升，蛋白濃度為0.1克/升。
圖17F 60-43 UF-conc多聚半乳糖醛酸酶活性的pH和溫度依賴。
圖18纖維二糖抑制55kD CBH(等電點(diǎn)4.4)對(duì)MUF-纖維二糖苷的活性pH4.5，40℃。
圖1925kD內(nèi)切葡聚糖酶(等電點(diǎn)4.1)和55kD CBH(等電點(diǎn)4.4)對(duì)微晶纖維素的協(xié)同效應(yīng)(40℃，pH5，25分鐘)。
圖20從F 60-8 UF-conc樣品的附著部分分離出的酶對(duì)羧甲基纖維素(a)和微晶纖維素(b)的完全水解(50℃，pH5)羧甲基纖維素和微晶纖維素濃度為5克/升，25kD內(nèi)切葡聚糖酶濃度為0.01克/升，43kD內(nèi)切葡聚糖酶濃度為0.02克/升；1代表25kD內(nèi)切葡聚糖酶(等電點(diǎn)4.1)，2代表43kD內(nèi)切葡聚糖酶(等電點(diǎn)4.2)。
圖21無(wú)(a)或有(b)δ葡糖酸內(nèi)酯時(shí)55kD CBH(等電點(diǎn)4.4)對(duì)羧甲基纖維素(1)和微晶纖維素(2)的完全水解(50℃，pH4.5)羧甲基纖維素和微晶纖維素濃度為5克/升，蛋白濃度為0.1克/升，δ葡糖酸內(nèi)酯濃度為5克/升。
圖22從F 60-8 UF-conc樣品中分離出的酶對(duì)羧甲基纖維素和RBB羧甲基纖維素酶活性的pH依賴1代表25kD內(nèi)切葡聚糖酶(等電點(diǎn)4.1)，2代表43kD內(nèi)切葡聚糖酶(等電點(diǎn)4.2)。
圖2355kD CBH(等電點(diǎn)4.4)的羧甲基纖維素酶和RBB羧甲基纖維素酶活性的pH依賴。
圖24從F 60-8 UF-conc樣品的附著部分分離出的酶羧甲基纖維素酶活性(pH4.5)的溫度依賴1代表55kD CBH(等電點(diǎn)4.4)，2代表25kD內(nèi)切葡聚糖酶(等電點(diǎn)4.1)，3代表43kD內(nèi)切葡聚糖酶(等電點(diǎn)4.2)。
圖25從F 60-8 UF-conc樣品的附著部分分離出的酶的pH穩(wěn)定性1代表55kD CBH(等電點(diǎn)4.4)，2代表25kD內(nèi)切葡聚糖酶(等電點(diǎn)4.1)，3代表43kD內(nèi)切葡聚糖酶(等電點(diǎn)4.2)。
圖26從F 60-8 UF-conc樣品的附著部分分離出的酶的吸附。
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t409AGAACCAGTAGTGGCTGCAGCTTACAAACGCGAGCATGGTGAACATCTCCGAGAAAAGGG +1860 t469AGGGATCC +1868 t477BamH ISEQ ID No.2C1-EG5″25kD″(家族45)基因，其是基于“25kD Endo”蛋白測(cè)序和家族45同源性分析而經(jīng)PCR獲得。-3309 GCTTAGGAG -3301AATCACGAGAAGCTAATTGGGCTCTATAGTATCCGACAAGATGACCCAGAGCGAGATTGA -3241GGATCTCGAGGGAACCCTGAAGCAGAGCAGCAACAACGACACCAGCCTCCTCCGCGACCT -3181GCTCGACAAGATTCCCGATGGCCTCCTCGGCGGCAACAACAAATCCAAGCTGGACGATAT -3121CCAGAGCAACGCGCAGGCCGCGCAGATGGAGAACCTGAGCGTCTCGCCGCGGGAACCCGA -3061GGAGCTGACCAGATACGTCCAGGAAGTGTTCCGTCAGATCATGCCCGCCATCAAGTTCCA -3001TGACCAGCTTCTCCAGGACATCTCGGAGGCCATCGACAAGATCCCGGTGCTGCCCAAGAT -2941TGTGGAGCAGCTGGAGGAGCAGATGTCCATCTTTGTATTCCAGATCATGGCCCCGTTCGT -2881creAGGTTCCGCTTATCGAGCAGATCAAGAACGAGCTCGCGACTGGCTCCAGCGAGATCATCCA -2821GAGCAGCAGGGCTGAGCAGCACAACGTCTTTGAGGACGACAACGCCACCGACCCGACTCA -2761CTCGATGTTGGCCAAGGACCACTTTAGTAACGTAAAGCCGACCCTAATCAGAAGCTCGCA -2701TGTAGAATTGAGTTAGACTGACGCGACTTGTTTCCCGTCTCTGTAGATCCTCAACGAGAT -2641CGGCGGTCGCGCCGCCTCCAAGGTCGTCTCCTGGGTCGTCCCGCAGCTCATGGAGGCCTG 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-61ATCCGTCCGCCTTTGATAACCCGCTCCCCGACTCAGTCAAGACGACGCATACTTGGCACC -1ATGCATCTCTCCGCCACCACCGGGTTCCTCGCCCTCCCGGCCCTGGCCCTGGCCCAGCTC +60推測(cè)的信號(hào)序列M H L S A T T G F L A L P A L A L A O L20TCGGGCAGCGGCCAGACGACCCGGTACTGGGACrGCTGCAAGCCGAGCTGCGCCrGGCCC +120S G S G Q T T R Y W D C C K P S C A W P40GGCAAGGGCCCCTCGTCTCCGGTGCAGGCCTGCGACAAGAACGACAACCCGCTCAACGAC+180G K G P S S P V Q A C D K N D N P L N D 60GGCGGCTCCACCCGGTCCGGCTGCGACGCGGGCGGCAGCGCCTACATGTGCTCCTCCCAG+240G G S T R S G C D A G G S A Y M C S S Q 80AGCCCCTGGGCCGTCAGCGACGAGCTGTCGTACGGCTGGGCGGCCGTCAAGCTCGCCGGC+300S P W A V S D E L S Y G W A A V K L A G 100AGCTCCGAGTCGCAGTGGTGCTGCGCCTGCTACGAGCTGACCTTCACCAGCGGGCCGGTC+360S S E S Q W C C A C Y E L T F T S G P V 120GCGGGCAAGAAGATGATTGTGCAGGCGACCAACACCGGTGGCGACCTGGGCGACAACCAC+420A G K K M I V Q A T N T G G D L G D N H 140TTTGACCTGGCCgtgagttgcctccccttctccccggaccgctcagattagatgagatta+480內(nèi)含子1F D L A 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t205CTTCTCCCAACCTAGTCAAGAATGAATCGTGAGAGAGGCTGAGAGAGATAAGATCGACTT +1260 t265CAGAAATCCAGGGrTGAAAGAATAAAAAAAATTCCTGTGGGGATGAATATCTCGTGATGC +1320 polyA位點(diǎn)AACGACCCTCCTAGGAAACCTTGACGAAATTTGCTGACGGCAAATTCIACAAAGACTCTT +1380 t385TAACCGGTCGCCCGTAGTGGTCCTGTTGCCCCAATCCGTTTGTGTTGAAATGACATTGCG +1440 t445CGTAACGCCGGACTCATATCAACTGCGTACCGAAAGCCAATCCCTCCCCAAACACGCCCT +1500 t505CTCTAATAAG CTCTCCCAAACAAGACCTCTTGAGACAGAAAATACGCCCAGATGCTGGG +1560 t565ACTTGACAAGCCGGGGGGGGGGGGGGGCTTGTCAAGYHVSSSSSCTTGCCCATTTCATGC +1620 t625TGGTATCAAAAAAACAAAAAAAAAAAAAAACATTTCAAGTCGCGGATGCCCCATTTACAT +1680 t685TGCTTGCGTGCGCCAATAGAAACTTGCAACACGTCAGTGTCATCTTGCACGCCTTGG +1737 t742SEQ ID No.3C1-EG3(家族12)基因片段，其基于家族12纖維素酶同源性分析而經(jīng)PCR獲得。GAATTCGGGGATTACGAGCTAATGATCTGgtcagttttttttttcttttttcttttcttcncttttcttttcttttcctttctcctgttttattttctta 100g d y e l m i wtccattgcttcgccctctttccttaaccctgctgactctctcttcttgtcaatgatactgtaatagGCTGGCGAGATTCGGCGACGTCTACCCCATCGGC 200L A R F G D V Y P I GTCGTCCCAGGGCCACGTCAACGTGGCCGGCCAGGACTGGGAGCTGTGGACGGGCTTCAANGGNAACATGCGGGTCTACAGCTTCGTAGCGCCCANCCCC 299S S Q G H V N V A G Q D W E L W T G F X G N M R V Y S F V A P X PCGCAACAGNTTCAGCGCCAACGTCAAGGACTTCTTCAACTATCTCCAGTCCAACCAGGGCTTCCCGGCCAGCAGCCAATACCTTCTCAAgtaaggagacga 400r n x f s a n v k d f f n y 1 q s n q g f p a s s q y 1 1 n？gatctcgaacagcataccatatatgcgtgcggtacaagtgcactaaccccctttttttcccgttcgcagtCTTCCAGTTCGGCACTG 487？ ？ ？SERQ ID No.4金孢子菌纖維二糖水解酶CBHITTTNGGGCGCCGTCTTACTCCTACCTTGCACCGTGATCGGCCAGTCGCGCTGCGAGGGCG1 ？ G A V L L L P C T V I G Q S R C E GACTCGTGCGGCGGTACCTACAGCACCGACCGCTATGCCGGCATCTGCGACCCCGACGGAT61 D S C G G T Y S T D R Y A G I C D P D GGCGACTTCAACTCGTACCGCCAGGGCAACAAGACCTTCTACGGCAAGGGCATGACGGTCG121 C D F N S Y R Q G N K T F Y G K G M T VACACGACCAAGAAGATCACGGTCGTCACCCAGTTCCTCAAGAACTCGGCCGGCGAGCTCT181 D T T K K I T V V T Q F L K N S A G E LCCGAGATCAAGCGGTTCTACGTCCAGAACGGCAAGGTCATCCCCAACTCCGAGTCCACCA241 S E I K R F Y V Q N G K V I P N S E S TTCCCGGGCGTCGAGGGCAACTCCATCACCCAGGACTGGTGCGACCGCCAGAAGGCCGCCT301 I P G V E G N S I T Q D W C D R Q K A ATCGGCGACGTGACCGACTTCCAGGACAAGGGCGGCATGGTCCAGATGGGCAAGGCCCTCG361 F G D V T D F Q D K G G M V Q M G K A LCGGGGCCCATGGTCCTCGTCATGTCCATATGGGACGACCACGCCAGTNAACA421 A G P M V L V M S I W D D H A S ？SEQ ID No.5金孢子菌木聚糖酶FTGACCTTCTCCTCCTTCTCCCGAACAATAATAGATAATTACGAGCCGGTTCGAGGCTGAC1ATTGCGCGATTCTAGCGAGCCGCAATCAATTCAACTTTGCCAACGCCGACGCGGTTGTC61S R N Q F N F A N A D A V VAACTTTGCCCAGGCCAACGGCAAGCTCATCCGCGGCCACACCCTCCTCTGGCACTCTCAG120N F A Q A N G K L I R G H T L L W H S QCTGCCGCAGTGGGTGCAGAACATCAACGACCGCAACACCTTGACCCAGGTCATCGAGAAC180L P Q W V Q N I N D R N T L T Q V I E NCACGTCACCACCCTTGTCACTCGCTACAAGGGCAAGATCCTCCACTGGGACGTCGTTAAC240H V T T L V T R Y K G K I L H W D V V NGAGATCTTTGCCGAGGACGGCTCGCTCCGCGACAGCGTCTTCAGCCGCGTCCTCGGCGAG300E I F A E D G S L R D S V F S R V L G EGACTTTGTCGGCATCGCCTTCCGCGCCGCCCGCGCCGCCGATCCCAACGCCAAGCTCTAC360D F V G I A F R A A R A A D P N A K L YATCAACGACTACAGGTCGACA420I N D Y R S T
權(quán)利要求
1.一種含有編碼感興趣多肽的核酸序列的金孢子菌屬突變株，所述的核酸序列與一表達(dá)調(diào)控區(qū)和任選地一分泌信號(hào)序列可操作連接，所述的突變株在同等條件下表達(dá)所述的感興趣多肽的水平高于非突變株的表達(dá)水平。
2.如權(quán)利要求1的金孢子菌屬突變株，所述的突變株通過(guò)重組方法而獲得，所述重組方法包括穩(wěn)定引入選自編碼異源多肽的核酸序列、異源信號(hào)序列和異源表達(dá)調(diào)控序列的至少一種異源核酸序列。
3.如權(quán)利要求2的金孢子菌屬突變株，其中所述的感興趣多肽是植物、動(dòng)物(包括人)、藻類、細(xì)菌、古細(xì)菌或真菌起源的異源多肽。
4.如權(quán)利要求1或2的金孢子菌屬突變株，其中所述的感興趣多肽是在同等條件下表達(dá)水平比相應(yīng)的非突變株高的同源多肽。
5.如權(quán)利要求1至4任一項(xiàng)的金孢子菌屬突變株，其中所述的感興趣多肽選自碳水化合物降解酶、蛋白酶、脂酶、酯酶、其它水解酶、氧化還原酶和轉(zhuǎn)移酶。
6.如權(quán)利要求1至4任一項(xiàng)的金孢子菌屬突變株，其中所述的感興趣多肽選自允許初級(jí)代謝物包括有機(jī)酸和次級(jí)代謝物包括抗生素(過(guò)量)產(chǎn)生的真菌酶。
7.如權(quán)利要求1至6任一項(xiàng)的金孢子菌屬突變株，其中所述的感興趣多肽在pH低于5，特別是在pH低于6時(shí)是失活的。
8.如權(quán)利要求1至7任一項(xiàng)的金孢子菌屬突變株，其中所述的感興趣多肽在pH高于6時(shí)顯示其最佳活性和/或穩(wěn)定性，和/或在pH高于6時(shí)具有至少70％的活性和/或穩(wěn)定性。
9.如權(quán)利要求1至8任一項(xiàng)的金孢子菌屬突變株，含有一異源信號(hào)序列，優(yōu)選為真菌如子囊菌的信號(hào)序列。
10.如權(quán)利要求9的金孢子菌屬突變株，其中真菌信號(hào)序列是纖維素酶、β-半乳糖苷酶、木聚糖酶、果膠酶、酯酶、蛋白酶、淀粉酶、多聚半乳糖醛酸酶、或疏水蛋白的信號(hào)序列。
11.如前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的金孢子菌屬突變株，進(jìn)一步含有一個(gè)選擇標(biāo)記，例如賦予抗藥性或解除營(yíng)養(yǎng)缺陷的標(biāo)記。
12.如前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的金孢子菌屬突變株，包含一異源表達(dá)調(diào)控區(qū)，優(yōu)選真菌的異源表達(dá)調(diào)控序列。
13.如權(quán)利要求12的金孢子菌屬突變株，其中表達(dá)調(diào)控區(qū)包含一個(gè)誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。
14.如權(quán)利要求12或13的金孢子菌屬突變株，其中表達(dá)調(diào)控區(qū)包含一個(gè)高表達(dá)的啟動(dòng)子。
15.如權(quán)利要求1的金孢子菌屬突變株，所述的突變株是通過(guò)包括紫外線照射和化學(xué)誘變中的至少一種的誘變步驟獲得的，優(yōu)選包含一個(gè)首次紫外線照射步驟，一個(gè)N-甲基-N’-硝基-N-亞硝基胍處理步驟和一個(gè)二次紫外線照射步驟。
16.如前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的金孢子菌屬突變株，所述的突變株來(lái)自Chrysosporium lucknowense，特別是來(lái)自Clucknowense C1菌株(VKM F-3500 D)。
17.如權(quán)利要求16的金孢子菌屬突變株，所述的突變株對(duì)應(yīng)于或來(lái)自Chrysosporium lucknowense突變株UV13-6(VKM F-3632 D)、NG7C-19(VKM F-3633 D)和UV18-25(VKM F-3631 D)之一。
18.如前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的金孢子菌屬突變株，所述的菌株生物量少于T.reesei生物量的一半，所述的木霉在同等的最佳條件下培養(yǎng)時(shí)其粘度值為200-600厘泊。
19.如前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的金孢子菌屬突變株，所述的菌株所產(chǎn)生的纖維素酶的量至少等同于由Chrysosporium lucknowense突變株C1(VKMF-3500D)、UV13-6(VKMF-3632D)、NG7C-19(VKMF-3633 D)和UV18-25(VKM F-3631 D)的任何之一所產(chǎn)生的纖維素酶的量。
20.如前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的金孢子菌屬突變株，所述的菌株所產(chǎn)生的蛋白酶少于由Chrysosporium lucknowense菌株C1(VKMF-3500 D)所產(chǎn)生的蛋白酶，優(yōu)選少于所述C1菌株所產(chǎn)生的蛋白酶數(shù)量的一半。
21.一種核酸構(gòu)建體，包含與一編碼多肽的核酸序列可操作連接的來(lái)自金孢子菌屬真菌，優(yōu)選來(lái)自Chrysosporium lucknowense，更優(yōu)選來(lái)自Chrysosporium lucknowense C1(VKM F-3500 D)或UV18-25(VKM F-3631 D)的核酸表達(dá)調(diào)控區(qū)。
22.如權(quán)利要求21的核酸構(gòu)建體，所述的表達(dá)調(diào)控區(qū)包括一個(gè)與纖維素酶表達(dá)或木聚糖酶表達(dá)有關(guān)的啟動(dòng)子序列，優(yōu)選一個(gè)纖維二糖水解酶(CBH1)啟動(dòng)子序列。
23.重組微生物菌株，優(yōu)選真菌菌株，其含有權(quán)利要求21或22的核酸構(gòu)建體并且能夠表達(dá)由該編碼核酸序列編碼的多肽。
24.一種生產(chǎn)感興趣多肽的方法，所述的方法包括在允許蛋白或多肽表達(dá)和優(yōu)選地分泌的條件下培養(yǎng)權(quán)利要求1-20和23-24任一項(xiàng)的菌株，并回收隨后產(chǎn)生的感興趣多肽。
25.如權(quán)利要求24的方法，進(jìn)一步包括將所述的多肽前體裂解為多肽或感興趣前體的裂解步驟，優(yōu)選用Kex-2樣蛋白酶，任何堿性氨基酸成對(duì)的蛋白酶或Kex-2裂解。
26.如權(quán)利要求24或25的方法，其中在pH6-9和/或溫度25-43℃的范圍內(nèi)培養(yǎng)。
27.一種用于產(chǎn)生權(quán)利要求1-20任一項(xiàng)的金孢子菌屬突變株的方法，包括向金孢子菌屬真菌穩(wěn)定引入編碼異源或同源多肽的核酸序列，所述的核酸序列與一表達(dá)調(diào)控區(qū)可操作連接，所述的引入以轉(zhuǎn)化絲狀真菌的公知方式引入。
28.如權(quán)利要求27的方法，其中轉(zhuǎn)化方法是原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化方法。
29.木聚糖酶F家族的金孢子菌屬木聚糖酶，其等電點(diǎn)為9.1，SDS PAGE分子量為30kD，并且與SEQ ID NO.5中所列出的氨基酸序列在一段120個(gè)氨基酸的序列上具有至少75％的氨基酸相同性。
全文摘要
本發(fā)明描述了用于表達(dá)和分泌異源蛋白或多肽的絲狀真菌宿主領(lǐng)域的一種新的轉(zhuǎn)化系統(tǒng)。本發(fā)明也包括以一種非常經(jīng)濟(jì)的方式大量制備多肽或蛋白的方法。本發(fā)明的系統(tǒng)包括金孢子菌屬,特別是Chrysosporium lucknowense的轉(zhuǎn)化的或轉(zhuǎn)染的真菌菌株和其突變體或衍生物。本發(fā)明也包括含有金孢子菌屬真菌編碼序列以及金孢子菌屬真菌基因表達(dá)調(diào)節(jié)序列的轉(zhuǎn)化體。
文檔編號(hào)C12N9/16GK1330717SQ99814133
公開日2002年1月9日 申請(qǐng)日期1999年10月6日 優(yōu)先權(quán)日1998年10月6日
發(fā)明者馬克·阿龍·埃馬爾法爾布, 理查德·保羅·柏林蓋姆, 菲利普·特里·奧爾森, 阿爾卡季·潘捷列伊莫諾維奇·西尼岑, 馬丁·帕里奇, 讓·克里斯托夫·布松, 克里斯蒂娜·馬里·平內(nèi)寧, 彼得·揚(yáng)·蓬特, 科妮莉亞·瑪麗亞·約翰娜·范塞爾 申請(qǐng)人:馬克·阿龍·埃馬爾法爾布