專利名稱：一種基于新肽的精神分裂癥診斷方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明一般涉及精神紊亂診斷試驗的領(lǐng)域。更具體地說，本發(fā)明提供了精神分裂癥的一種診斷試驗。
現(xiàn)有技術(shù)以下是本發(fā)明說明書中引用的現(xiàn)有技術(shù)資料目錄。
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7．PCT專利申請公開WO95/23970在此對上述技術(shù)的參考不能理解為本發(fā)明以任何方式與其權(quán)利要求限定的專利性相關(guān)。
在下文中，以標(biāo)出它們在上述目錄中的序號來表示對上述出版物的參考。
背景技術(shù)：
精神分裂癥是一種包含多種諸如幻聽，偏執(zhí)狂，妄覺，緊張癥，怪異行為或情感減退等精神癥狀的綜合癥。精神分裂癥影響約1％總?cè)丝?，其?jīng)濟(jì)和社會負(fù)擔(dān)巨大。精神分裂癥發(fā)病早，故患者通常需要終生的醫(yī)療和精神病學(xué)的監(jiān)護(hù)。因此，在工業(yè)化的社會中，精神分裂癥是花費最高的疾病之一[1]。
與精神分裂癥相關(guān)的已知危險因素有許多如遺傳因素、冬季分娩以及妊娠和分娩并發(fā)癥等。病毒感染和繼發(fā)的自身免疫反應(yīng)也已列為一種可能的致病因素2-4。與對照組、雙極人格、抑郁癥和人格紊亂者或情感分裂型(schizoeffective)患者相比較表明，精神分裂癥患者、發(fā)狂患者體內(nèi)抗血小板自身抗體水平升高5-6。Western Blot分析表明，精神分裂癥患者來源的自身抗體所識別的血小板抗原譜與自身免疫反應(yīng)性血小板減少癥和癡呆癥患者自身抗體所識別的血小板抗原譜不同7。與精神分裂癥患者來源的自身抗體特異性結(jié)合的抗原已通過其分子量得到了鑒定。
發(fā)明概述根據(jù)本發(fā)明，證實了數(shù)種可與精神分裂癥患者體液中發(fā)現(xiàn)的水平升高的自身抗體結(jié)合的蛋白質(zhì)。這些蛋白質(zhì)結(jié)合的抗體基本上是血小板相關(guān)性自身抗體(PAA)，這些精神分裂癥患者來源的自身抗體(在下文中精神分裂癥來源的自身抗體簡寫為SDA)能夠與上述抗原結(jié)合，但非精神分裂癥者對照來源的自身抗體(在下文中非精神分裂癥者來源的自身抗體簡寫為NSDA)不與上述抗原結(jié)合。
能夠與SDA結(jié)合的蛋白質(zhì)被確定后，進(jìn)一步用化學(xué)和酶學(xué)方法來確定其特性。在已確定的有免疫反應(yīng)性的蛋白質(zhì)中有些是公知的蛋白質(zhì)，如3-磷酸甘油醛脫氫酶(G3PD)、烯醇化酶、角蛋白、肝細(xì)胞生長因子、細(xì)胞外鈣傳感受體(extracellular calcium sensingreceptor)等。通過消化兔蛋白烯醇化酶，發(fā)現(xiàn)了一種與SDA有高結(jié)合活性的免疫活性肽。
該肽，即烯醇化酶的免疫活性表位，包含序列如下的28個氨基酸SGETEDTFIADLVVGLCTGQIKTGAPCR(Seq.ID No.1)以此肽為依據(jù)，合成其它肽，并鑒定出了一些高活性肽(即，同與NSDA的結(jié)合活性低或根本不與NSDA結(jié)合的肽比較起來，此肽與SDA有高結(jié)合活性)。而且，合成的活性肽第一次能夠?qū)⒕穹至寻Y患者和非精神分裂癥個體來源的血漿區(qū)分開來。
進(jìn)一步分析合成的高反應(yīng)活性肽中的一個肽(Seq.ID No.2)表明該肽借助兩個半胱氨酸形成了一個環(huán)，并借助其余游離半胱氨酸形成二聚體，這種結(jié)構(gòu)的肽與SDA結(jié)合能力最強。
如下所述，本發(fā)明合成的高活性肽的抗原表位似乎是一種三維空間表位。
因此，本發(fā)明提供了可與精神分裂癥患者體液中發(fā)現(xiàn)的水平升高的抗體結(jié)合的肽。
本發(fā)明進(jìn)一步提供了能夠與精神分裂癥患者體液中發(fā)現(xiàn)的水平升高的抗體結(jié)合的肽，其中此肽結(jié)合的抗體能夠特異性地與具有如下氨基酸序列的肽結(jié)合LVVGLCTCQIKTGPAC(I.D No.2)。此類肽的幾個非限制性例子如下ⅲ．IADLVVGLCTGQIKTGAPCR(Seq.ID.No.3)ⅳ．ADLVVGLCTGQIKTGAPCR(Seq.I.D.No.4)ⅴ．DLVVGLCTGQIKTGAPCR(Seq.I.D.No.5)ⅵ．LVVGLCTGQIKTGAPCR(Seq.I.D.No.6)ⅶ．LVVGLCTGQIKTGPACR(Seq.I.D.No.7)ⅷ．LVVGLCTPQIKTGPACR(Seq.I.D.No.8)本發(fā)明也提供了一種能夠與精神分裂癥患者體液中發(fā)現(xiàn)的水平升高的抗體結(jié)合的肽，此類肽能夠結(jié)合的抗體不與選自如下的肽結(jié)合?。甋GETEDTFIADLVVGLCTGQ(Seq.I.D.No.9)ⅱ．VVGLCTGQIKTGAPCR(Seq.I.D.No.10)ⅲ．CTGQIKTGAPCR(Seq.ID.No.11)ⅳ．LVVGLCTGQIKTGAPC(Seq.ID.No.12)ⅴ．LVVGLCTGQIKTGAP(Seq.ID No.13)
ⅵ．LVVGLCTGQIKTGPAC(Seq.ID No.14)本發(fā)明也提供了一種能夠與精神分裂癥患者體液中發(fā)現(xiàn)的水平升高的抗體結(jié)合的肽，這種肽包含選自如下的氨基酸序列?。甋GETEDTFIADLVVGLCTGQIKTGAPCR(Seq.I.D.No.1)ⅱ．LVVGLCTCQIKTGPAC(Seq.I.D.No.2)ⅲ．IADLVVGLCTGQIKTGAPCR(Seq.ID.No.3)ⅳ．ADLVVGLCTGQIKTGAPCR(Seq.I.D.No.4)ⅴ．DLVVGLCTGQIKTGAPCR(Seq.I.D.No.5)ⅵ．LVVGLCTGQIKTGAPCR(Seq.I.D.No.6)ⅶ．LVVGLCTGQIKTGPACR(Seq.I.D.No.7)ⅷ．LVVGLCTPQIKTGPACR(Seq.I.D.No.8)根據(jù)優(yōu)選實施方案，本發(fā)明提供了一種能夠與精神分裂癥患者體液中發(fā)現(xiàn)的水平升高的抗體結(jié)合的肽，其選自如下的肽?。甋GETEDTFIADLVVGLCTGQIKTGAPCR(Seq.I.D.No.1)ⅱ．LVVGLCTCQIKTGPAC(Seq.I.D.No.2)ⅲ．IADLVVGLCTGQIKTGAPCR(Seq.I.D.No.3)ⅳ．ADLVVGLCTGQIKTGAPCR(Seq.I.D.No.4)ⅴ．DLVVGLCTGQIKTGAPCR(Seq.I.D.No.5)ⅵ．LVVGLCTGQIKTGAPCR(Seq.I.D.No.6)ⅶ．LVVGLCTGQIKTGPACR(Seq.I.D.No.7)ⅷ．LVVGLCTPQIKTGPACR(Seq.I.D.No.8)上面(和此后)用來表示特定氨基酸的字母與IUPAC-IUB生化命名委員會推薦的單字母氨基酸符號一致。
不囿于理論，以本發(fā)明獲得的結(jié)果為依據(jù)，可清楚看出，同與NSDA的結(jié)合比較起來，與SDA以相當(dāng)高水平結(jié)合的肽的抗原表位結(jié)構(gòu)是一三維表位。通過以最小能量計算法為基礎(chǔ)的計算機程序預(yù)測本發(fā)明肽的抗原表位為一環(huán)狀結(jié)構(gòu)，其中包含一疏水核心和一帶約兩個正電荷的延伸區(qū)。帶正電荷的延伸區(qū)可以以其可能的多種空間方位之一存在。
本發(fā)明肽與多種抗體的結(jié)合活性可以以任一公知的方法如酶聯(lián)免疫吸附試驗或Western Blotting等方法來確定。例如，可通過下列方法檢測肽與抗體的結(jié)合活性將肽進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)移到PVDS膜上，與SDA反應(yīng)并比較它們與NSDA的反應(yīng)性。
本發(fā)明肽與PAA的結(jié)合程度能夠以任何本領(lǐng)域公知的檢測系統(tǒng)如可檢測標(biāo)記物標(biāo)記的抗人免疫球蛋白或其片段的抗體來確定。標(biāo)記物可能是一種放射性基團(tuán)、熒光基團(tuán)，能夠催化生成一種可檢測產(chǎn)物的酶或能夠被親合素檢測的生物素基團(tuán)等。
這方面的優(yōu)選實施方案中，將本發(fā)明的肽結(jié)合到一種固相支持物如PVDF膜上，與被檢測樣品反應(yīng)，利用可檢測標(biāo)記物標(biāo)記的抗人Fc抗體確定樣品中PAA的結(jié)合水平。
根據(jù)具體的實施例，以辣根過氧化酶標(biāo)記的抗人Fc抗體(SIGMA)并以Fast-DABTM(SIGMA)或4-氯萘酚(SIGMA)為顯色試劑確定與檢測肽結(jié)合的自身抗體水平。
本發(fā)明檢測肽與SDA的結(jié)合“實質(zhì)性高于”其與NSDA的結(jié)合，意味著以任何本領(lǐng)域公知的統(tǒng)計學(xué)方法(如Student’s t檢驗)分析上述實驗結(jié)果的相關(guān)性，該肽與SDA的結(jié)合水平都應(yīng)該在統(tǒng)計學(xué)上顯著地高于其與NSDA的結(jié)合。
上述肽的類似物也構(gòu)成了本發(fā)明的一個方面。本領(lǐng)域的熟練技術(shù)人員能夠理解本發(fā)明肽的氨基酸序列可以改變，例如插入，替代，或缺失一個或更多的氨基酸而基本上不改變肽與SDA的結(jié)合能力。例如，可以用屬于同一家族的甘氨酸或纈氨酸替代本發(fā)明肽氨基酸序列中第一位亮氨酸而并不改變其結(jié)合活性。根據(jù)可查找的公知的氨基酸家族分類，例如在AlbertsB等編著的《細(xì)胞的分子生物學(xué)》書(Garland出版，紐約和倫敦，第二版，1989,54-55頁)中可查找，本領(lǐng)域的熟練技術(shù)人員不難確定肽中的每一個氨基酸能夠被哪一個氨基酸所代替。
本發(fā)明范圍內(nèi)肽的類似物是一類和SDA的結(jié)合活性與所述肽基本相同的肽，即以本領(lǐng)域公知的任一方法如實施例1所描述的方法確定出此類肽與SDA的結(jié)合水平比與NSDA的結(jié)合水平更高。
本發(fā)明肽能夠以酶(例如梭菌蛋白酶)消化或化學(xué)方法(例如溴化氰)消化一種更長的蛋白質(zhì)獲得。在此條件下，以本領(lǐng)域公知的方法如RP-HPLC分離生成的肽，測定分離肽的序列(如Eurosequenceb.v.(Nijenborgh 4；9749 Gronigen；The Netherlands))，并以上述方法分析它們與SDA的結(jié)合能力。
本發(fā)明肽也可以通過本領(lǐng)域公知的方法如由Eurosequence b.v.在Abimed 522按10微摩爾的量合成(詳細(xì)說明見下面的例子)，以上述任何一種方法確定新合成肽的結(jié)合活性。
本發(fā)明的肽能夠?qū)⒕穹至寻Y患者和非精神分裂癥者來源的樣品區(qū)分開來，因此，在個體精神分裂癥的診斷方面有用。另外一方面，本發(fā)明提供了一種可應(yīng)用于個體精神分裂癥診斷的肽，此肽能夠與精神分裂癥患者體液中發(fā)現(xiàn)的水平升高的抗體結(jié)合。
被檢測者的樣品通常上是含血小板血液樣品的含PAA組分。但根據(jù)本發(fā)明，直接檢測被檢者血漿而無需先從樣品中分離PAA以確定患精神分裂癥的可能性第一次成為可能。因此根據(jù)本發(fā)明，待檢測者的樣品可以是血漿或以本領(lǐng)域任何公知的方法從其中分離的含PAA的成份(例如獲得富含血小板的血漿(PRA)并從中分離PAA)。
與得自非精神分裂癥者對照的樣品比較，本發(fā)明的肽能夠不同程度的與精神分裂癥患者來源的樣品中血小板衍生自身抗體結(jié)合，因此，該肽可應(yīng)用于個體精神分裂癥的診斷。因此，本發(fā)明的另外一方面是提供一種個體精神分裂癥的診斷試驗，包含以下步驟(a)采集待檢測者的樣品，樣品為全血、包含血小板的成份，或含從血小板上脫落的血小板相關(guān)抗體(PAA)的成份；(b)將所述樣品與能夠與精神分裂癥患者體液中發(fā)現(xiàn)的水平升高的抗體結(jié)合的肽接觸；(c)確定所述肽與樣品的結(jié)合水平，如果結(jié)合水平高于該肽與非精神分裂癥者樣品的結(jié)合水平則表明該檢測者患精神分裂癥的可能性高。
在更進(jìn)一步的實施方案中，上述步驟(b)中肽是可以和能夠與具Seq.I.D.No.2氨基酸序列的肽特異性地結(jié)合的抗體結(jié)合的肽，另一實施方案中，上述步驟(b)中的肽包含選自如下的氨基酸序列?。甋GETEDTFIADLVVGLCTGQIKTGAPCR(Seq.I.D.No.1)ⅰ．LVVGLCTCQIKTGPAC(Seq.I.D.No.2)ⅲ．IADLVVGLCTGQIKTGAPCR(Seq.I.D.No.3)ⅳ．ADLVVGLCTGQIKTGAPCR(Seq.I.D.No.4)ⅴ．DLVVGLCTGQIKTGAPCR(Seq.I.D.No.5)ⅵ．LVVGLCTGQIKTGAPCR(Seq.I.D.No.6)ⅶ．LVVGLCTGQIKTGPACR(Seq.I.D.No.7)ⅷ．LVVGLCTPQIKTGPACR(Seq.I.D.No.8)在一優(yōu)選的實施方案中，步驟(b)中的肽選自如下的肽?。甋GETEDTFIADLVVGLCTGQIKTGAPCR(Seq.I.D.No.1)ⅱ．LVVGLCTCQIKTGPAC(Seq.I.D.No.2)ⅲ．IADLVVGLCTGQIKTGAPCR(Seq.I.D.No.3)ⅳ．ADLVVGLCTGQIKTGAPCR(Seq.I.D.No.4)ⅴ．DLVVGLCTGQIKTGAPCR(Seq.I.D.No.5)ⅵ．LVVGLCTGQIKTGAPCR(Seq.I.D.No.6)ⅶ．LVVGLCTGQIKTGPACR(Seq.I.D.No.7)本發(fā)明也提供了上述試驗中有用的試劑盒。該試劑盒包含其上固定了一種或更多種本發(fā)明肽的支持物，抗人免疫球蛋白抗體或其片段?？谷嗣庖咔虻鞍卓贵w可以偶聯(lián)了可檢測標(biāo)記物，或者，該試劑盒可同時也包含一種抗所述一抗的二抗，其中二抗偶聯(lián)了可檢測的標(biāo)記物。該試劑盒也包含試驗實施所需的各種試劑和使用說明書。
參考以下非限制性的具體實施方案和


本發(fā)明。
附圖簡述圖1是具Seq.I.D.No.2序列的肽14與從精神分裂癥患者樣品中制備的PAA的結(jié)合活性(圖1A)和該肽與從非精神分裂癥者樣品中制備的PAA的結(jié)合活性(圖1B)圖解說明。以序列為Seq.I.D.No.9的肽作為陰性對照。
圖2是肽14(Seq.I.D.No.2)與精神分裂癥患者的血漿樣品的結(jié)合活性(圖2A)和該肽與非精神分裂癥者的血漿樣品結(jié)合活性(圖2B)圖解說明。以序列為Seq.I.D.No.9的肽作為陰性對照。
圖3是基于最小能量計算法的計算機程序預(yù)測的本發(fā)明肽抗原表位三維空間結(jié)構(gòu)示意圖。
圖4為從公開肽數(shù)據(jù)庫中得到的烯醇化酶三維結(jié)構(gòu)X-射線并與本發(fā)明肽水模型比較。
以下列字母表示該表位中的氨基酸L=亮氨酸A=丙氨酸P=脯氨酸R=精氨酸K=賴氨酸實施例材料和方法1．血小板和抗血小板自身抗體以肝素為抗凝劑，采集患者和對照的靜脈血(20ml)。室溫下離心(100g,20分鐘)獲得富含血小板的血漿(PRA)。以添加10mMEDTA為抗凝劑的磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌三次(4000g；15分鐘；4℃)制備無血漿的血小板。為分離抗血小板抗體，在室溫下將血小板和0.1M甘氨酸/10mM EDTA,pH2.8共同孵育10分鐘后離心(4000g；15分鐘；4℃)，以飽和Na2PO4溶液中和含抗血小板抗體的上清液，-20℃下保存待用。2．制備型等電聚焦
O型血的血小板濃縮物購自當(dāng)?shù)匮?，以PBS/10mM EDTA(4000g；15分鐘；4℃)洗滌3-5次直到上清液中無血漿為止。以20ml0.5％Triton X-100/0.5％NP40水溶液室溫下輕輕搖動溶解血小板(大約20份濃縮物)15分鐘。離心懸浮液(10000g；15分鐘；4℃)，移取上清并以0.1％Triton X-100水溶液再抽提沉淀2次，合并三次的上清液并加入AmpholyteTM3/10(Bio-Rad)使終濃度為1％。將該溶液裝入ROTOFORTM槽中(容量60ml)，按廠家(Bio-Rad)儀器操作說明書進(jìn)行制備型等電聚焦。通常4.5小時完成聚焦(10℃；10瓦恒定功率)。收集20個組分并確定各組分的pH值(pH梯度1.5-12)，-20℃下保存待用。3．免疫反應(yīng)性組分的鑒定按以下的方法確定組分的免疫反應(yīng)性以聚丙烯酰胺(10％)凝膠電泳分析各個組分，轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，以1ml自身抗體在50ml孵育緩沖液中與膜雜交，以SIGMA的辣根過氧化酶偶聯(lián)的抗人Fc抗體(山羊)(1∶500稀釋)并以Fast-DABTM(SIGMA)或4-氯萘酚(SIGMA)為顯色試劑，檢測結(jié)合的人抗血小板抗體。在pH6.0-10.0間的組分中檢測到免疫反應(yīng)性。4．制備型聚丙烯酰胺(8％)凝膠電泳合并免疫反應(yīng)性組分(pH6-10)，按制造商儀器說明書方法用Bio-Rad的PrepCell在還原條件下進(jìn)行制備型SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳(8％,8cm高)，按照分子量大小分離組分。收集1.5ml級分(n=400):每10個級分取一樣品經(jīng)SDS凝膠電泳并銀染確定分子大小在400個級分中的分布情況。5．免疫反應(yīng)性級分的鑒定每5個級分(0.1ml)取一樣品，用Bio-Rad的DotBlot裝置(96孔)將其點印跡到PVDF膜上。按上述方法確定免疫反應(yīng)性組分(1.3)。6．免疫反應(yīng)性蛋白質(zhì)的鑒定如前所述，鑒定了多個免疫反應(yīng)性的蛋白質(zhì)。優(yōu)先測定免疫反應(yīng)性與蛋白質(zhì)量比值高的蛋白質(zhì)序列。基本上按如下方法制備樣品陽性級分附近的級分(+/-10)以1.5所述的方法再次分析其免疫反應(yīng)性。合并陽性級分、凍干后在分析級(0.75mm)SDS聚丙烯酰胺(10％)凝膠電泳上再分離，以考馬斯亮藍(lán)染色，切下條帶，送到Eurosequenceb.v測序(酶消化，RP-HPLC分離肽后測定氨基酸序列)。7．免疫反應(yīng)性表位的鑒定在被鑒定的蛋白質(zhì)中，發(fā)現(xiàn)有兩個蛋白質(zhì)已有商品出售a)甘油醛-6-磷酸脫氫酶(G6PD)b)烯醇化酶以酶法(梭菌蛋白酶)或化學(xué)法(溴化氰)消化大約10mg蛋白質(zhì)，以RP-HPLC法分離生成的肽。取部分(20％)級分由Eurosequence b.v送往Main Inventor按1.5所述方法分析其免疫反應(yīng)性。僅以酶法消化的烯醇化酶產(chǎn)物中得到了一有活性的片段，繼后由Eurosequenceb.v測定其序列。8．肽的合成由Eurosequence b.v在Abimed 522按10微摩爾的量合成多種肽，將肽常規(guī)溶解于1ml水/DMF/DMSO(1∶1∶1；v/v/v)中。將肽線印跡到PVDF膜上按上述方法檢測其免疫反應(yīng)性。9．表位掃描在MacIntosh計算機系統(tǒng)上計算本發(fā)明肽的水模型，從公開肽數(shù)據(jù)庫中得到烯醇化酶的X-射線三維結(jié)構(gòu)，并掃描其表面以尋找與水模型計算的肽表位相匹配的表位。實施例1免疫反應(yīng)性蛋白質(zhì)的鑒定以1.3所述方法已確定出以下蛋白質(zhì)能夠與精神分裂癥患者體液中發(fā)現(xiàn)的水平較高的自身抗體以高水平結(jié)合蛋白質(zhì)甘油醛-6-磷酸脫氫酶烯醇化酶角蛋白肝細(xì)胞生長因子胞外鈣傳感受體。
檢測上述蛋白質(zhì)與精神分裂癥患者和非精神分裂癥患者對照的血漿的結(jié)合能力。結(jié)果表明用上述蛋白質(zhì)無法將精神分裂癥患者和非精神分裂癥者的血漿區(qū)分開，也就是說，結(jié)合結(jié)果不是結(jié)論性的。
通過與SDA(從精神分裂癥患者樣品中制備的)和NSDA(從非精神分裂癥者樣品中制備的)的反應(yīng)，確定上述兩種酶的結(jié)合活性。如下表1所示，蛋白質(zhì)與SDA的結(jié)合顯著高于與NSDA的結(jié)合，由能夠與每種酶呈陽性反應(yīng)的樣品的數(shù)目來表示。
表1蛋白質(zhì)與SDA與NSDA的反應(yīng)性
以上結(jié)果表明本發(fā)明獲得的蛋白質(zhì)可能在個體精神分裂癥的診斷方面有用，但要求得自該個體的檢測樣品包含制備的血小板來源的自身抗體。這兩種酶不適合直接檢測血漿以診斷精神分裂癥。實施例2鑒定被消化蛋白質(zhì)中能夠特異性地與SDAs結(jié)合的表位利用化學(xué)(溴化氰)和酶法(梭菌蛋白酶)消化人G-3-P脫氫酶和兔烯醇化酶的產(chǎn)物鑒定其表位，只在酶消化的烯醇化酶中發(fā)現(xiàn)一個具免疫活性的肽(氨基酸372-399，該肽具有如下表2中的Seq.I.D.No.1序列)，即該肽與SDA的結(jié)合程度和能力高于與NSDA的結(jié)合。
以從消化的蛋白質(zhì)中發(fā)現(xiàn)的表位序列為依據(jù)，按1.8所述的方法合成多種肽，按上述方法評估合成肽與SDA和NSDA的結(jié)合活性。
如下表2所示，合成肽中有幾種肽與SDA的結(jié)合活性實質(zhì)性高于與NSDA的結(jié)合活性。(表中以‘是’表示，)而其他的肽與精神分裂癥患者及非精神分裂癥者來源的樣品的結(jié)合活性無差別(表中以‘否’表示)。 表2
在合成肽中，肽Seq.I.D.NO.2與精神分裂癥患者體液中發(fā)現(xiàn)的水平較高的抗體的結(jié)合活性最強。實施例3肽Seq.I.D.NO.2的鑒定肽Seq.I.D.NO.2(含3個半胱氨酸)合成后以激光解吸質(zhì)譜分析表明，它以單體存在，并沒有借助半胱氨酸形成一個環(huán)狀結(jié)構(gòu)。但將肽(約4mg)溶解于1ml水/DMF/DMSO(1∶1∶1；v∶v∶v)中室溫下放置過夜后，肽借助兩個半胱氨酸形成一個環(huán)，并借助其余的游離半胱氨酸形成二聚體，沒有檢測到更大的多聚體。當(dāng)檢測兩種形式的肽與SDA的結(jié)合活性時，清楚地表明二聚體形式下的肽與SDA結(jié)合活性遠(yuǎn)高于非二聚體形式。
以化學(xué)還原法分析肽，舉例來說巰基乙醇、硼氫化鈉，可完全破壞其免疫活性，而氧化如空氣或氧氣則可恢復(fù)其免疫活性。實施例4肽Seq.I.D.N0.2與精神分裂癥患者和非精神分裂癥者的樣品的結(jié)合活性以上述方法檢測肽14(Seq.I.D.NO.2)與分離的PAA的結(jié)合活性。如圖1A所示，上述肽與8例精神分裂癥患者中7例來源的PAA結(jié)合為陽性。圖1B表明該肽不與8例非精神分裂癥者來源的PAA結(jié)合，肽Seq.I.D.N0.9為陰性對照。
檢測肽14(Seq.I.D.NO.2)與精神分裂癥患者來源的血漿樣品中SDA結(jié)合活性。如圖2A所示，它能夠與8例精神分裂癥患者中4例的SDA結(jié)合。圖2B表示上述肽不與15例非精神分裂癥者中14例的NSDA結(jié)合。肽14(Seq.I.D.NO.9)為陰性對照。實施例5三維結(jié)構(gòu)以基于最小能量計算法的計算機程序預(yù)測本發(fā)明肽抗原表位的三維結(jié)構(gòu)。
如圖3所示，預(yù)測的抗原表位是一包含一疏水核心和一帶約兩個正電荷的延伸區(qū)的環(huán)狀結(jié)構(gòu)。帶正電荷的延伸區(qū)可以其多種可能的空間方位之一存在。實施例6掃描烯醇化酶分子表面尋找與肽計算表位相匹配的表位計算本發(fā)明肽的水模型三維結(jié)構(gòu)。掃描從公開肽數(shù)據(jù)庫中得到的烯醇化酶X-射線三維結(jié)構(gòu)，將本發(fā)明肽的氨基酸位置與烯醇化酶分子表面的氨基酸位置相比較，確定是否能夠在烯醇化酶分子表面尋找到一種與本分明肽的計算表位中的一個或多個相匹配的表位。
如圖4即計算機模擬的烯醇化酶分子表面的掃描圖所示，在烯醇化酶表面發(fā)現(xiàn)一表位，此表位包含由帶正電荷的氨基酸(精氨酸、賴氨酸)包圍的疏水氨基酸簇(亮氨酸、丙氨酸和脯氨酸)，它與本發(fā)明肽的模擬表位相匹配。因此，在烯醇化酶的分子表面的確能夠找到本發(fā)明肽的抗原表位的預(yù)測結(jié)構(gòu)。
序列表(1)一般信息(ⅰ)申請人(A)名稱YEDA RESEARCH AND DEVELOPMENT COMPANY LTD.
(B)街道THE WEIZMANN INSTITUTE OF SCIENCE(C)城市REHOVOT(E)國家以色列(F)郵編(ZIP)P.O.BOX 95(G)電話+08 9470617(H)傳真+08 9470739(ⅱ)發(fā)明題目一種基于新肽的精神分裂癥診斷方法(ⅲ)序列數(shù)目14(ⅳ)計算機可讀形式(A)介質(zhì)類型軟盤(B)計算機IBM PC兼容機(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件Patentin Release#1.0,Version # 1.30(EPO)(2)SEQ ID NO:1的資料(ⅰ)序列特征(A)長度28個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型未知(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)未知(ⅱ)分子類型肽(ⅲ)假設(shè)無(ⅳ)反義無(ⅴ)片段類型內(nèi)部的(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:1Ser Gly Glu Thr Glu Asp Thr Phe Ile Ala Asp Leu Val Val Gly Leu1 5 10 15Cys Thr Gly Gln Ile Lys Thr Gly Ala Pro Cys Arg20 25(2)SEQ ID NO:2資料(ⅰ)序列特征(A)長度16個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型未知(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)未知(ⅱ)分子類型肽(ⅲ)假設(shè)無(ⅳ)反義無(ⅴ)片段類型內(nèi)部的(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:2Leu Val Val Gly Leu Cys Thr Cys Gln Ile Lys Thr Gly Pro Ala Cys1 5 10 15(2)SEQ ID NO:3資料(ⅰ)序列特征(A)長度20個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型未知(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)未知(ⅱ)分子類型肽(ⅲ)假設(shè)無(ⅳ)反義無(ⅴ)片段類型內(nèi)部的(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:3Ile Ala Asp Leu Val Val Gly Leu Cys Thr Gly Gln Ile Lys Thr Gly1 5 10 15Ala Pro Cys Arg20(2)SEQ ID NO:4資料(ⅰ)序列特征(A)長度19個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型未知(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)未知(ⅱ)分子類型肽(ⅲ)假設(shè)無(ⅳ)反義無(ⅴ)片段類型內(nèi)部的(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:4Ala Asp Leu Val Val Gly Leu Cys Thr Gly Gln Ile Lys Thr Gly Ala1 5 10 15Pro Cys Arg(2)SEQ ID NO:5資料(ⅰ)序列特征(A)長度18個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型未知(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)未知(ⅱ)分子類型肽(ⅲ)假設(shè)無(ⅳ)反義無(ⅴ)片段類型內(nèi)部的(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:5Asp Leu Val Val Gly Leu Cys Thr Gly Gln Ile Lys Thr Gly Ala Pro1 5 10 15Cys Arg(2)SEQ ID NO:6資料(ⅰ)序列特征(A)長度17個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型未知(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)未知(ⅱ)分子類型肽(ⅲ)假設(shè)無(ⅳ)反義無(ⅴ)片段類型內(nèi)部的(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:6Leu Val Val Gly Leu Cys Thr Gly Gln Ile Lys Thr Gly Ala Pro Cys Arg1 510 15(2)SEQ ID NO:7資料(ⅰ)序列特征(A)長度17個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型未知(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)未知(ⅱ)分子類型肽(ⅲ)假設(shè)無(ⅳ)反義無(ⅴ)片段類型內(nèi)部的(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:7Leu Val Val Gly Leu Cys Thr Gly Gln Ile Lys Thr Gly Pro Ala Cys1 510 15Arg(2)SEQ ID NO:8資料(ⅰ)序列特征
(A)長度17個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型未知(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)未知(ⅱ)分子類型肽(ⅲ)假設(shè)無(ⅳ)反義無(ⅴ)片段類型內(nèi)部的(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:8Leu Val Val Gly Leu Cys Thr Pro Gln Ila Lys Thr Gly Pro Ala Cys1 5 10 15Ars(2)SEQ ID NO:9資料(ⅰ)序列特征(A)長度20個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型未知(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)未知(ⅱ)分子類型肽(ⅲ)假設(shè)無(ⅳ)反義無(ⅴ)片段類型內(nèi)部的(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:9Ser Gly Glu Thr Glu Asp Thr Phe Ile Ala Asp Leu Val Val Gly Leu1 5 10 15Cys Thr Gly Gln20(2)SEQ ID NO:10資料(ⅰ)序列特征(A)長度16個氨基酸(B)類型氨基酸
(C)鏈型未知(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)未知(ⅱ)分子類型肽(ⅲ)假設(shè)無(ⅳ)反義無(ⅴ)片段類型內(nèi)部的(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:10Val Val Gly Leu Cys Thr Gly Gln Ile Lys Thr Gly Ala Pro Cys Arg1 5 10 15(2)SEQ ID NO:11資料(ⅰ)序列特征(A)長度12個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型未知(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)未知(ⅱ)分子類型肽(ⅲ)假設(shè)無(ⅳ)反義無(ⅴ)片段類型內(nèi)部的(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:11Cys Thr Gly Gln Ile Lys Thr Gly Ala Pro Cys Arg1 5 10(2)SEQ ID NO:12資料(ⅰ)序列特征(A)長度16個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型未知(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)未知(ⅱ)分子類型肽
(ⅲ)假設(shè)無(ⅳ)反義無(ⅴ)片段類型內(nèi)部的(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:12Leu Val Val Gly Leu Cys Thr Gly Gln Ile Lys Thr Gly Ala Pro Cys1 5 10 15(2)SEQ ID NO:13資料(ⅰ)序列特征(A)長度15個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型未知(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)未知(ⅱ)分子類型肽(ⅲ)假設(shè)無(ⅳ)反義無(ⅴ)片段類型內(nèi)部的(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:13Leu Val Val Gly Leu Cys Thr Gly Gln Ile Lys Thr Gly Ala Pro1 5 10 15(2)SEQ ID NO:14資料(ⅰ)序列特征(A)長度16個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型未知(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)未知(ⅱ)分子類型肽(ⅲ)假設(shè)無(ⅳ)反義無(ⅴ)片段類型內(nèi)部的
(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:14Leu Val Val Gly Leu Cys Thr Gly Gln Ile Lys Thr Gly Pro Ala Cys1 5 10 1權(quán)利要求
1．一種肽，該肽能夠與精神分裂癥患者體液中發(fā)現(xiàn)的水平升高的抗體結(jié)合。
2．根據(jù)權(quán)利要求1的肽，該肽可和能夠特異性地與一種具有Seq.I.D.No.2氨基酸序列的肽結(jié)合的抗體結(jié)合。
3．根據(jù)權(quán)利要求1或2的肽，該肽可和能夠與一種選自如下的肽結(jié)合的抗體結(jié)合?。甋GETEDTFIADLVVGLCTGQIKTGAPCR (Seq.I.D.No.1)ⅱ．LVVGLCTCQIKTGPAC (Seq.I.D.No.2)ⅲ．IADLVVGLCTGQIKTGAPCR(Seq.I.D.No.3)ⅳ．ADLVVGLCTGQIKTGAPCR(Seq.I.D.No.4)ⅴ．DLVVGLCTGQIKTGAPCR(Seq.I.D.No.5)ⅵ．LVVGLCTGQIKTGAPCR(Seq.I.D.No.6)ⅶ．LVVGLCTGQIKTGPACR(Seq.I.D.No.7)ⅷ．LVVGLCTPQIKTGPACR(Seq.I.D.No.8)
4．根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一項所述的肽，該肽能夠和不與一種選自如下的肽結(jié)合的抗體結(jié)合?。甋GETEDTFIADLVVGLCTGQ(Seq.I.D.No.9)ⅱ．VVGLCTGQIKTGAPCR(Seq.I.D.No.10)ⅲ．CTGQIKTGAPCR(Seq.I.D.No.11)ⅳ．LVVGLCTGQIKTGAPC(Seq.ID.No.12)ⅴ．LVVGLCTGQIKTGAP(Seq.ID No.13)ⅵ．LVVGLCTGQIKTGPAC(Seq.ID No.14)
5．根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一項所述的肽，其中包含一種選自如下的氨基酸序列ⅰ．SGETEDTFIADLVVGLCTGQIKTGAPCR(Seq.I.D.No.1)ⅱ．LVVGLCTCQIKTGPAC(Seq.I.D.No.2)ⅲ．IADLVVGLCTGQIKTGAPCR(Seq.I.D.No.3)ⅳ．ADLVVGLCTGQIKTGAPCR(Seq.I.D.No.4)ⅴ．DLVVGLCTGQIKTGAPCR(Seq.I.D.No.5)ⅵ．LVVGLCTGQIKTGAPCR(Seq.I.D.No.6)ⅶ．LVVGLCTGQIKTGPACR(Seq.I.D.No.7)ⅷ．LVVGLCTPQIKTGPACR(Seq.I.D.No.8)。
6．根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一項所述的肽，其選自如下的肽?。甋GETEDTFIADLVVGLCTGQIKTGAPCR(Seq.I.D.No.1)ⅱ．LVVGLCTCQIKTGPAC(Seq.I.D.No.2)ⅲ．IADLVVGLCTGQIKTGAPCR(Seq.I.D.No.3)ⅳ．ADLVVGLCTGQIKTGAPCR(Seq.I.D.No.4)ⅴ．DLVVGLCTGQIKTGAPCR(Seq.I.D.No.5)ⅵ．LVVGLCTGQIKTGAPCR(Seq.I.D.No.6)ⅶ．LVVGLCTGQIKTGPACR(Seq.I.D.No.7)ⅷ．LVVGLCTPQIKTGPACR(Seq.I.D.No.8)
7．一種能夠與精神分裂癥患者體液中發(fā)現(xiàn)的水平升高的抗體結(jié)合的肽，該肽包含至少一個抗原表位，該表位具有由一個疏水核心和一個帶正電荷的延伸區(qū)組成的環(huán)狀三維結(jié)構(gòu)。
8．一種個體中精神分裂癥的診斷方法，包含以下步驟(a)采集被檢測者的樣品，該樣品是血樣、其含血小板的成分，或含從血小板上脫落的血小板相關(guān)抗體(PAA)的成分；(b)將所述樣品和能夠與精神分裂癥患者體液中發(fā)現(xiàn)的水平升高的抗體結(jié)合的肽接觸；(c)確定該肽與樣品的結(jié)合水平，結(jié)合水平高于該肽與非精神分裂癥者血樣的結(jié)合水平則提示被檢測者患精神分裂癥的可能性高。
9．根據(jù)權(quán)利要求8的方法，其中步(b)中的肽具有Seq.I.D.No.2的氨基酸序列。
10．根據(jù)權(quán)利要求8的方法，其中步驟(b)中的肽包含一種選自如下的氨基酸序列ⅰ．SGETEDTFIADLVVGLCTGQIKTGAPCR(Seq.I.D.No.1)ⅱ．LVVGLCTCQIKTGPAC(Seq.I.D.No.2)ⅲ．IADLVVGLCTGQIKTGAPCR(Seq.I.D.No.3)ⅳ．ADLVVGLCTGQIKTGAPCR(Seq.I.D.No.4)ⅴ．DLVVGLCTGQIKTGAPCR(Seq.I.D.No.5)ⅵ．LVVGLCTGQIKTGAPCR(Seq.I.D.No.6)ⅶ．LVVGLCTGQIKTGPACR(Seq.I.D.No.7)ⅷ．LVVGLCTPQIKTGPACR(Seq.I.D.No.8).
11．根據(jù)權(quán)利要求8的方法，其中步驟(b)中的肽是選自如下的一種肽?。甋GETEDTFIADLVVGLCTGQIKTGAPCR(Seq.I.D.No.1)ⅱ．LVVGLCTCQIKTGPAC(Seq.I.D.No.2)ⅲ．IADLVVGLCTGQIKTGAPCR(Seq.I.D.No.3)ⅳ．ADLVVGLCTGQIKTGAPCR(Seq.I.D.No.4)ⅴ．DLVVGLCTGQIKTGAPCR(Seq.I.D.No.5)ⅵ．LVVGLCTGQIKTGAPCR(Seq.I.D.No.6)ⅶ．LVVGLCTGQIKTGPACR(Seq.I.D.No.7)ⅷ．LVVGLCTPQIKTGPACR(Seq.I.D.No.8)
12．根據(jù)權(quán)利要求8的方法，其中步驟(b)中的肽是根據(jù)權(quán)利要求7的肽。
13．根據(jù)權(quán)利要求8-12中任一項的方法，其中采自被檢測者的樣品是全血。
14．一種用于精神分裂癥診斷的試劑盒，其中包含?。渖瞎潭艘环N或多種根據(jù)權(quán)利要求1-7中任一項所述肽的支持物；ⅱ．與可檢測的標(biāo)記物偶聯(lián)的抗人免疫球蛋白抗體或其片段；ⅲ．實施診斷試驗所需的試劑；和ⅳ．使用說明書。
全文摘要
本發(fā)明涉及可與精神分裂癥患者體液中水平升高而在非精神分裂癥者體液中水平更低或根本不存在的抗體結(jié)合的肽。利用計算機程序預(yù)測出本發(fā)明肽的抗原表位含由帶正電荷的氨基酸包圍的疏水性氨基酸核心。本發(fā)明肽在個體中精神分裂癥的診斷方面有應(yīng)用價值。
文檔編號C07K7/08GK1300320SQ99805995
公開日2001年6月20日 申請日期1999年3月30日 優(yōu)先權(quán)日1998年4月2日
發(fā)明者M·實尼茲克, M·德克馬尼 申請人:耶達(dá)研究與開發(fā)有限公司