專利名稱：編碼青霉素結(jié)合蛋白的基因和生產(chǎn)l－谷氨酸的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及通過發(fā)酵生產(chǎn)L-谷氨酸的方法。L-谷氨酸被廣泛用作調(diào)味品等的原料。
背景技術(shù)：
如果在含有有限量生物素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)棒狀桿菌(coryneformbacteria)，那么該細(xì)菌生產(chǎn)顯著量的L-谷氨酸。另一方面，如果在含有過量生物素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)棒狀桿菌，那么該細(xì)菌不產(chǎn)生L-谷氨酸。然而，已知即使在這種條件下，如果向所述培養(yǎng)基中加入表面活性劑或諸如青霉素的生物素活性抑制劑，所述細(xì)菌的生長受到抑制，它們也開始生產(chǎn)顯著量的L-谷氨酸。
對于通過向培養(yǎng)基中加入青霉素來誘導(dǎo)谷氨酸產(chǎn)生，已經(jīng)研究了很多年(T.D.Nunheimer,J.Birnbaum,E.D.Ihnen和A.L.Demasin,Appl.Microbiol.,20,215-217(1970))。人們認(rèn)為青霉素的作用是引起細(xì)胞表層的結(jié)構(gòu)變化，從而提高細(xì)胞質(zhì)膜對谷氨酸的通透性。
另外，也已經(jīng)研究了有限的生物素量或加入表面活性劑或青霉素通過何種機(jī)制影響棒狀桿菌的L-谷氨酸生產(chǎn)能力，已經(jīng)闡明存在被認(rèn)為參與了L-谷氨酸生產(chǎn)的基因(dtsR基因)。而且，已經(jīng)證實，其中dtsR基因被破壞的菌株即使在下述條件下也產(chǎn)生顯著量的L-谷氨酸，在所述條件中生物素的存在量使得野生菌株幾乎不生產(chǎn)L-谷氨酸(國際專利公布WO95/23224)。
而且，已經(jīng)獲得了許多同細(xì)胞質(zhì)膜通透性提高誘導(dǎo)谷氨酸生產(chǎn)的解釋相矛盾的發(fā)現(xiàn)，但仍不了解青霉素誘導(dǎo)谷氨酸產(chǎn)生的機(jī)制(E.Kimura,Y.Kawahara和W.Nakamatsu,Tanpakusshitu Kakusan Koso(Protein,Nucleic acid and Enzyme)，第42卷，2633-2640頁(1997))。
另外，眾所周知青霉素結(jié)合蛋白(PBP)在細(xì)菌細(xì)胞分裂中起重要作用。認(rèn)為所述青霉素結(jié)合蛋白是存在于細(xì)菌細(xì)胞表層的酶，并且它們特異性結(jié)合諸如青霉素的β-內(nèi)酰胺類抗生素。盡管它可以根據(jù)物種有所不同，但認(rèn)為它是通常在大腸桿菌(E.coli)中發(fā)現(xiàn)的3-8種蛋白，它們的分子量分布在大約40,000-120,000的范圍內(nèi)。青霉素通過結(jié)合所述青霉素結(jié)合蛋白活性位點的絲氨酸殘基抑制酶促反應(yīng)。
已經(jīng)闡明了7種存在于大腸桿菌中的青霉素結(jié)合蛋白，大腸桿菌尤其是研究的主要目標(biāo)(B.G.Spratt,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,72,2999(1975))。其中，已經(jīng)證實稱為PBP2和PBP3的那些蛋白在細(xì)胞分裂中起重要作用(B.G.Spratt,J.Bacteriol.,131,293(1977))。然而，還不知道在棒狀桿菌中是否存在青霉素結(jié)合蛋白。
本發(fā)明的公開本發(fā)明的發(fā)明人研究了在棒狀桿菌中是否也應(yīng)當(dāng)存在青霉素結(jié)合蛋白(下文簡寫為“PBP”)，并分析其功能。結(jié)果，本發(fā)明人獲得到了一個被認(rèn)為用于闡述青霉素在棒狀桿菌中誘導(dǎo)谷氨酸產(chǎn)生的機(jī)制的新發(fā)現(xiàn)，同時，他們發(fā)現(xiàn)該發(fā)現(xiàn)可以從仍未知的著眼點用于涉及棒狀桿菌的谷氨酸生產(chǎn)能力提高的研制。
以前述發(fā)現(xiàn)為基礎(chǔ)實現(xiàn)本發(fā)明，它涉及生產(chǎn)L-谷氨酸的方法，包括以下步驟在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)棒狀桿菌，以在該培養(yǎng)基中生產(chǎn)和累積L-谷氨酸；收集L-谷氨酸，其中PBP在所述細(xì)菌中通常不起作用，且所述細(xì)菌具有產(chǎn)生L-谷氨酸的能力。
在本發(fā)明的一個優(yōu)選的實施方案中，在前述方法中使用的棒狀桿菌是其中在第一溫度PBP通常起作用，而在第二溫度PBP通常不起作用的細(xì)菌，所述方法包括在所述細(xì)菌增殖的第一溫度培養(yǎng)所述細(xì)菌的步驟和在L-谷氨酸產(chǎn)生的第二溫度培養(yǎng)所述細(xì)菌的步驟。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，在前述方法中使用的棒狀桿菌含有包含編碼PBP的基因(PBP基因)和溫度敏感復(fù)制控制區(qū)的質(zhì)粒，其中在染色體上的PBP基因不起作用，而所述質(zhì)粒在所述第一溫度可以復(fù)制，而在所述第二溫度不能復(fù)制。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，由在所述方法中使用的棒狀桿菌產(chǎn)生的PBP具有溫度敏感型突變。
在本發(fā)明的再一個實施方案中，當(dāng)PBP結(jié)合青霉素G時，在SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳中顯示的PBP分子量約為60,000。
本發(fā)明的第二方面是編碼在下述(A)或(B)中定義的蛋白的DNA(A)具有序列表中SEQ ID NO:2的氨基酸序列的蛋白；(B)具有序列表中SEQ ID NO:2的氨基酸序列并具有結(jié)合青霉素的活性的蛋白，所述氨基酸序列包括一個或幾個氨基酸的置換、缺失、插入、添加或翻轉(zhuǎn)。
在本發(fā)明的一個優(yōu)選的實施方案中，前述DNA是在下述(a)或(b)中定義的DNA(a)至少包括序列表中SEQ ID NO:1的核苷酸數(shù)881至2623的核苷酸序列的DNA；(b)在嚴(yán)格條件下可與至少包含序列表中SEQ ID NO:1的核苷酸數(shù)881至2623的序列的核苷酸序列雜交，并編碼具有結(jié)合青霉素的活性的蛋白的DNA。
以下將詳細(xì)說明本發(fā)明。<1>棒狀桿菌的PBP在本發(fā)明中，棒狀桿菌包括那些到目前為止分類為短桿菌屬(genus Brevibacterium)但現(xiàn)在統(tǒng)一為棒狀桿菌屬(genusCorynebacrerium)的細(xì)菌(Int.J.Syst.Bacteriol.,4l,255(1981))，并包括屬于與棒狀桿菌屬密切相關(guān)的短桿菌屬的細(xì)菌。以下列出了這些棒狀桿菌的實例。
嗜乙酰乙酸棒狀桿菌(Corynebacterium acetoacidophilum)醋谷棒狀桿菌(Corynebacterium acetoglutamicum)美棒狀桿菌(Corynebacterium callunae)谷氨酸棒狀桿菌(Corynebacterium glutamicum)谷氨酸棒狀桿菌(Corynebacterium lilium(Corynebacteriumglutamicum))melassecola棒狀桿菌(Corynebacterium melassecola)谷氨酸棒狀桿菌(Brevibacterium divaricatum(Corynebacteriumglutamicum))黃色短桿菌(Brevibacterium flavum(Corynebacterium glutamicum))immariophilum短桿菌(Brevibacterium immariophilum)乳發(fā)酵短桿菌(Brevibacterium lactofermentum(Corynebacteriumglutamicum))玫瑰色短桿菌(Brevibacterium roseum)解糖短桿菌(Brevibacterium saccharolyicum)生硫短桿菌(Brevibacterium thiogenitalis)thermoaminogenes棒狀桿菌(Corynebacterium thermoaminogenes)具體地說，以下菌株可以作為實例。
嗜乙酰乙酸棒狀桿菌ATCC 13870醋谷棒狀桿菌ATCC 15806美棒狀桿菌ATCC 15991谷氨酸棒狀桿菌ATCC 13020谷氨酸棒狀桿菌(corynebacterium lilium)ATCC 15990melassecola棒狀桿菌ATCC 17965谷氨酸棒狀桿菌(Brevibacterium divaricatum)ATCC 14020黃色短桿菌ATCC 14067immariophilum短桿菌ATCC 14068乳發(fā)酵短桿菌ATCC 13869
玫瑰色短桿菌ATCC 13825解糖短桿菌ATCC 14066生硫短桿菌ATCC 19240thermoaminogenes棒狀桿菌AJ12340(FERM BP-1539)在本發(fā)明中涉及的PBP是一種存在于上述棒狀桿菌的細(xì)胞表層的膜蛋白，如果它與青霉素接觸，那么它以共價鍵與青霉素結(jié)合?？梢酝ㄟ^例如向棒狀桿菌的膜部分加入標(biāo)記的青霉素以開始反應(yīng)，使可溶性的表面活性劑組分在聚丙烯酰胺凝膠上電泳，并目測標(biāo)記，從而檢測PBP(青霉素結(jié)合實驗)。如在下文提及的實施例中所示，在乳發(fā)酵短桿菌的PBP結(jié)合青霉素G的狀態(tài)下，在SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)上檢測到它們于分子量約110kDa、100kDa和60kDa處有三條帶，將它們命名為PBP1、PBP2和PBP3。
在研究這些PBP和衍生自青霉素G的氮脒青霉素之間的親和力時，發(fā)現(xiàn)氮脒青霉素選擇性地結(jié)合PBP3。而且，發(fā)現(xiàn)當(dāng)在存在顯著量生物素的條件下培養(yǎng)乳發(fā)酵短桿菌時，在一定濃度的氮脒青霉素存在下產(chǎn)生L-谷氨酸。這些事實提示，在存在顯著量的生物素時通過抑制PBP的作用，至少是抑制PBP3的作用，可以誘導(dǎo)L-谷氨酸產(chǎn)生。因此，即使存在顯著量的生物素，其中PBP通常不起作用的棒狀桿菌也應(yīng)該能夠在不加入生物素活性抑制劑的情況下誘導(dǎo)L-谷氨酸產(chǎn)生。而且，這種其中PBP通常不起作用的棒狀桿菌應(yīng)當(dāng)具有提高L-谷氨酸生產(chǎn)能力的可能性。此外，通過操作PBP基因，應(yīng)該獲得有關(guān)棒狀桿菌產(chǎn)生L-谷氨酸的新發(fā)現(xiàn)，可以利用它來從至今還未知的方面進(jìn)行開發(fā)。
在本發(fā)明中，表述“PBP通常不起作用”意指在顯著量的生物素存在下誘導(dǎo)L-谷氨酸產(chǎn)生的狀態(tài)。它可以是一種因為抑制PBP基因的轉(zhuǎn)錄或翻譯而不產(chǎn)生PBP的狀態(tài)，或者是一種因為在產(chǎn)生的PBP時發(fā)生了突變而降低或消除了PBP作用的狀態(tài)。<2>其中PBP通常不起作用的棒狀桿菌用于按照本發(fā)明生產(chǎn)L-谷氨酸的方法的棒狀桿菌是其中PBP通常不起作用的棒狀桿菌。在一個優(yōu)選的實施方案中，在前述方法中使用的棒狀桿菌是其中在第一培養(yǎng)條件下PBP通常起作用，而在第二培養(yǎng)條件下PBP通常不起作用的細(xì)菌。這種棒狀桿菌可以在所述第一培養(yǎng)條件下增殖，而在所述第二培養(yǎng)條件下在顯著量的生物素存在時可以產(chǎn)生L-谷氨酸。至于PBP，優(yōu)選PBP3。
關(guān)于上述的培養(yǎng)條件，可提及培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)基的滲透壓、pH、培養(yǎng)基的組分等等。培養(yǎng)基組分的實例包括諸如IPTG(異丙基-β-D-硫代半乳糖苷)和乙酸的誘導(dǎo)劑，以及諸如葡萄糖的抑制劑。所述培養(yǎng)溫度將在下文描述中作為培養(yǎng)條件的實例進(jìn)行說明。然而，關(guān)于其它培養(yǎng)條件，在以下描述中的術(shù)語“溫度”可以由表示另一條件的術(shù)語代替。
作為其中PBP通常不起作用的棒狀桿菌的實例，可以提及一種突變株，在該菌株中將突變引入到編碼PBP的基因(PBP基因)中，以使通常起作用的PBP不被表達(dá)。上述突變可以是抑制PBP基因轉(zhuǎn)錄或翻譯的突變，或者是產(chǎn)生通常不起作用的PBP的突變。
因為引起PBP完全缺乏的突變對所述細(xì)菌應(yīng)當(dāng)是致死性的，所以上述突變株可以作為諸如溫度敏感突變株的條件突變株獲得。通過例如利用紫外線照射或用化學(xué)試劑處理棒狀桿菌，獲得可以在第一溫度(例如低溫)增殖，但在第二溫度(例如高溫)不能增殖的突變株，并從獲得的突變株中選擇可以在第一溫度增殖，并當(dāng)在第二溫度培養(yǎng)它時，在顯著量的生物素存在下可以產(chǎn)生L-谷氨酸的突變株，從而可以得到所述突變株。作為具有這種特性的突變株，可以選擇DTSR蛋白缺陷菌株(國際專利公布WO95/23224)或α-KGDH缺陷菌株(國際專利公開WO95/34672)。然而，如果侯選菌株是具有涉及PBP的突變的突變株，那么可以通過對在所述第二溫度培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行上述的青霉素結(jié)合實驗進(jìn)行證實。
如果一旦獲得這種突變株，可以將該突變株用作宿主克隆棒狀桿菌的PBP基因。即可以通過用包含得自棒狀桿菌的染色體DNA的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化其中PBP通常不起作用的突變株，選擇其中PBP通常起作用的轉(zhuǎn)化株并收集所述質(zhì)粒，從而獲得包含PBP基因的DNA片段。
在本領(lǐng)域那些技術(shù)人員熟知的參考文獻(xiàn)(例如J.Sambrook,E.F.Fritsch和T.Maniatis,Molecular Cloning,Cold Spring Harbor LaboratoryPress(1989)等)中描述了用于通常的基因重組的技術(shù)，諸如那些用于DNA的消化和連接、轉(zhuǎn)化、由轉(zhuǎn)化體中提取重組DNA、集落雜交等技術(shù)。
例如可以如下生產(chǎn)染色體DNA文庫。首先，用Miura等人的方法(H.Saito和K.Miura,Biochem.Biophys.Acta,72,619(1963))或類似的方法制備染色體DNA。然后，用合適的限制酶部分消化所述染色體DNA，以獲得各種片段的混合物。如果所述消化的程度通過調(diào)節(jié)消化反應(yīng)時間等控制，那么可以使用的限制酶范圍很廣。例如，于30℃或更高的溫度(優(yōu)選37℃或更高的溫度)，通過讓Sau3AⅠ以1-10單位/ml的酶濃度作用于染色體DNA不同的時間長度(1分鐘至2小時)，來消化所述染色體DNA。
接著，將消化的染色體DNA片段連接到在大腸桿菌細(xì)胞可自主復(fù)制的載體DNA，以產(chǎn)生重組DNA。更具體地說，讓與用于消化染色體DNA的限制酶Sau3AⅠ產(chǎn)生相同末端核苷酸序列的限制酶(例如BamHⅠ)，于30℃或更高的溫度，以1-100單位/ml的酶濃度，作用于所述載體DNA1小時或更長時間(最好1-3小時)，以完全消化所述載體并切斷它。然后，將染色體DNA片段的混合物和如上所述獲得的切斷的載體DNA混合，并讓DNA連接酶(優(yōu)選T4 DNA連接酶)于4-16℃的溫度，以1-100單位/ml的酶濃度，作用于所述混合物1小時或更長時間(最好6-24小時)，以獲得重組DNA。
可在大腸桿菌細(xì)胞中自主復(fù)制的載體最好是在宿主細(xì)胞中自主復(fù)制的質(zhì)粒載體，其實例包括pUC19、pUC18、pBR322、pHSG299、pHSG399、pHSG398、RSF1010等。
而且，如果將具有使質(zhì)粒在棒狀桿菌(它可以由例如pAM330(參見日本專利公開(Kokai)第58-67699號)、pHM1519(參見日本專利公開第58-77895號)、pCG1(參見日本專利公開第57-134500號)、pCG2(參見日本專利公開第58-35197號)、pCG4(參見日本專利公開第57-183799號)、pCG11(參見日本專利公開第57-183799號)等制備)中自主復(fù)制的能力的DNA片段插入到上述載體中，那么它們可以用作在大腸桿菌和棒狀桿菌中都自主復(fù)制的所謂的穿梭載體。
這種穿梭載體的實例包括下文提及的那些載體。下文也列出了帶有各種載體的微生物，其在國際保藏單位的保藏號分別列于圓括號中。
pAJ655大腸桿菌AJ11882(FERM BP-136)谷氨酸棒狀桿菌SR8201(ATCC 39135)pAJ1844大腸桿菌AJ11883(FERM BP-137)谷氨酸棒狀桿菌SR8202(ATCC 39136)pAJ611大腸桿菌AJ11884(FERM BP-138)pAJ3148谷氨酸棒狀桿菌SR8203(ATCC 39137)pAJ440枯草桿菌AJ11901(FERM BP-140)例如通過使用獲得的重組DNA轉(zhuǎn)化大腸桿菌K-12菌株，以制備染色體DNA文庫。該轉(zhuǎn)化可以利用D.M.Morrison的方法(Methodsin Enzymology,68,326,1979)進(jìn)行，該方法包括用氯化鈣處理受體細(xì)胞，以增加其對DNA(M.Mandel和A Higa,J.Mol.,Biol.,53,159(1970))等的通透性。
然后，用獲得的染色體DNA文庫轉(zhuǎn)化其中PBP通常不起作用的棒狀桿菌的突變株。作為轉(zhuǎn)化棒狀桿菌的方法，有上文提及的使用氯化鈣處理細(xì)胞的方法，或包括讓處于它們能夠吸收DNA的特殊生長階段的細(xì)胞吸收DNA的方法(由C.H.Duncan等人報導(dǎo)用于枯草桿菌(Bacillus subtilis))。除了這些，還可以使用的方法是使DNA受體細(xì)胞成為可以輕易吸收重組DNA的裸細(xì)胞或原生質(zhì)球，接著將所述重組DNA引入到所述細(xì)胞中，已知該方法可用于枯草桿菌、放線菌和酵母(S.Chang等，Molec.Gen.Genet.,168,111(1979)；Bibb等，Nature,274,398(1978)；A.Hinnen等，Proc.Natl.Sci.USA,75,1929(1978))。除了這些以外，在日本專利公開第2-207791號中也公開了用于轉(zhuǎn)化棒狀桿菌的方法。
通過在未轉(zhuǎn)化的突變株(宿主)不能生長的條件下平板接種轉(zhuǎn)化的突變株，并選擇已形成菌落的菌株，可以獲得引入PBP基因的轉(zhuǎn)化菌株。例如使用P.Guerry等的方法(J.Bacteriol.,116,1064(1973))、D.B.Clewell的方法(J.Bacteriol.,110,667(1972))或類似的方法由獲得的轉(zhuǎn)化體中分離重組DNA，可以得到含有PBP基因的DNA片段。使用編碼已知的微生物的PBP(例如大腸桿菌的PBP)的基因，或者使用基于其核苷酸序列產(chǎn)生的寡核苷酸，通過雜交可能也可以獲得用包含PBP基因的重組DNA轉(zhuǎn)化的棒狀桿菌。
除了誘變處理外，使用如上所述獲得的PBP基因可以產(chǎn)生其中PBP通常不起作用的棒狀桿菌。通過用包含PBP基因的DNA轉(zhuǎn)化棒狀桿菌，所述PBP基因用內(nèi)部缺失修飾以便不產(chǎn)生通常起作用的PBP(缺失型PBP基因)，并在缺失型PBP基因和染色體上的PBP基因之間進(jìn)行重組，可以破壞在染色體上的PBP基因。已經(jīng)確立了這種利用同源重組的基因破壞，并有使用線性DNA、含有溫度敏感復(fù)制控制區(qū)的質(zhì)粒等的方法。在本發(fā)明中，優(yōu)選使用含有溫度敏感復(fù)制控制區(qū)的質(zhì)粒的方法。
可以用缺失型PBP基因如下置換在宿主染色體上的PBP基因。即首先通過插入溫度敏感復(fù)制控制區(qū)、突變PBP基因和抗諸如氯霉素的藥物的標(biāo)記基因，制備重組DNA，用所述重組DNA轉(zhuǎn)化棒狀桿菌。此外，在溫度敏感復(fù)制控制區(qū)不起作用的溫度培養(yǎng)產(chǎn)生的轉(zhuǎn)化菌株，接著可以在含有所述藥物的培養(yǎng)基中培養(yǎng)該轉(zhuǎn)化菌株，以獲得其中重組DNA摻入到染色體DNA中的轉(zhuǎn)化體菌株。
在這種其中重組DNA摻入到染色體DNA中的菌株中，突變PBP基因與最初存在于染色體上的PBP基因重組，將染色體PBP基因和缺失型PBP基因的兩個融合基因插入到所述染色體中，以便使重組DNA的其它部分(載體區(qū)段、溫度敏感復(fù)制控制區(qū)和藥物抗性標(biāo)記)存在于所述兩個融合基因之間。因此，所述轉(zhuǎn)化體表達(dá)PBP，因為正常的PBP基因在此狀態(tài)下是占優(yōu)勢的，所述它可以生長。
然后，為了僅去掉在染色體DNA上的缺失型PBP基因，通過重組兩個PBP基因從染色體DNA中消除一個PBP基因的拷貝和所述載體區(qū)段(包括所述溫度敏感復(fù)制控制區(qū)和所述藥物抗性標(biāo)記)。在此情況下，在染色體DNA上留下正常的PBP基因，而缺失型PBP基因從染色體DNA上切除，或與此相反，在染色體DNA上留下缺失型PBP基因，而正常的PBP基因從DNA上切除。在這兩種情況下，當(dāng)細(xì)胞在溫度敏感復(fù)制控制區(qū)可以起作用的溫度培養(yǎng)時，切除的DNA可以在細(xì)胞中作為質(zhì)粒保留。接著，在溫度敏感復(fù)制控制區(qū)不能起作用的溫度培養(yǎng)所述細(xì)胞。在該培養(yǎng)中，當(dāng)在染色體DNA上留下缺失型PBP基因時細(xì)胞不能增殖，因為包含正常PBP基因的質(zhì)粒從細(xì)胞中丟失(drop)。另一方面，當(dāng)在染色體DNA上留下正常PBP基因時，細(xì)胞可以增殖。因此，通過選擇在溫度敏感復(fù)制控制區(qū)起作用的溫度可以增殖，但在溫度敏感復(fù)制控制區(qū)不起作用的溫度不能增殖的菌株，可以獲得其中染色體DNA上的PBP基因被破壞，而質(zhì)粒上帶有正常PBP基因的菌株。
當(dāng)在溫度敏感復(fù)制控制區(qū)起作用的溫度(例如低溫)培養(yǎng)如上所述獲得的具有破壞的PBP基因的菌株時，該菌株在細(xì)胞中保留了PBP基因，而當(dāng)在溫度敏感復(fù)制控制區(qū)不起作用的溫度(例如高溫)培養(yǎng)該菌株時，它丟失了PBP基因。在以下的描述中，溫度敏感質(zhì)粒不能復(fù)制的溫度是指高溫。然而，不想排除所述溫度是低溫的可能性，如果獲得的溫度敏感復(fù)制控制區(qū)在低溫時不能復(fù)制但在高溫時可以復(fù)制，那么也可以使用它。
在染色體DNA上的PBP基因被破壞，正常的PBP基因摻入到質(zhì)粒中之后被制成recA-的菌株最好用作在本發(fā)明中使用的微生物，因為在這種菌株中，防止了在培養(yǎng)過程中質(zhì)粒上的PBP基因在低溫下?lián)饺氲饺旧w中，并因此保證所述基因的丟失。
通過在棒狀桿菌細(xì)胞中進(jìn)行質(zhì)粒的自主復(fù)制并得到對誘變處理的藥物抗性，用所述質(zhì)粒轉(zhuǎn)化棒狀桿菌，并由在包含所述藥物的培養(yǎng)基中于低溫下可以生長但在高溫下不能生長的轉(zhuǎn)化體中提取質(zhì)粒，可以獲得所述溫度敏感復(fù)制控制區(qū)。
至于誘變質(zhì)粒的方法，可以提及利用羥胺于體外處理質(zhì)粒的方法(G.O.Humpherys等，Molec.Gen.Genet.,145,101-108(1976)等)。
本文使用的術(shù)語“低溫”和“高溫”為相關(guān)的概念，低溫和高溫之間的界限沒有特別限定。所述“低溫”是指一個溫度范圍，當(dāng)在此范圍內(nèi)培養(yǎng)棒狀桿菌時它們至少可以增殖。所述“高溫”是指一個溫度，在此溫度下棒狀桿菌本身不會死亡。在含有藥物的培養(yǎng)基中于不同的溫度培養(yǎng)帶有溫度敏感質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化體，以確定下限溫度，在此溫度以上所述轉(zhuǎn)化體不能生長，可以以此確定所述低溫和所述高溫之間的界限。
在棒狀桿菌細(xì)胞中具有起作用的溫度敏感復(fù)制控制區(qū)的質(zhì)粒的實例包括pHS4、pHS22和pHS23。質(zhì)粒pHSC4也可以作為溫度敏感質(zhì)粒用于本發(fā)明，該質(zhì)粒通過將由pHS4切除的并含有來自棒狀桿菌的復(fù)制控制區(qū)的DNA片段連接到大腸桿菌載體pHSG398獲得。pHSC4在棒狀桿菌和大腸桿菌中自主增殖，并賦予宿主氯霉素抗性。帶有pHSC4的大腸桿菌AJ12571于1990年10月11日保藏在國立生命科學(xué)和人體技術(shù)研究所，工業(yè)科學(xué)和技術(shù)代理處，國際貿(mào)易和工業(yè)部，獲得的保藏號為FERM P-11763。然后，根據(jù)布達(dá)佩斯條約的規(guī)定于1991年8月26日轉(zhuǎn)移到國際保藏單位，獲得的保藏號為FERM BP-3524。
這些溫度敏感質(zhì)粒在棒狀桿菌細(xì)胞中在大約10-32℃可以自主增殖，但它們在大約34℃或更高的溫度下不能自主增殖。
通過例如用BamHⅠ和KpnⅠ消化上述pHSC4，可以獲得具有溫度敏感復(fù)制控制區(qū)的DNA片段。
在日本專利公布(kokoku)第7-108228號中公開了上述質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)和包含其溫度敏感復(fù)制控制區(qū)的區(qū)的核苷酸序列。
也已知在大腸桿菌中一些青霉素結(jié)合蛋白基因形成基因簇，并且murE基因和PBP3基因(ftsⅠ)互相緊密定位(F.Ishino,NipponNogeikagaku,Kaishi，第63卷，第11期，1755-1764(1989))。因此，通過用包含得自棒狀桿菌的染色體DNA的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化作為宿主的已經(jīng)由棒狀桿菌獲得的murE溫度敏感突變體，以獲得在所述宿主不能生長的溫度能夠生長的轉(zhuǎn)化體菌株，從而可以得到與murE基因一起的PBP基因。本發(fā)明的發(fā)明人如在下文提及的實施例中所述成功獲得了基于此原理的PBP基因。
此外，因為本發(fā)明闡明了PBP基因和側(cè)翼區(qū)的核苷酸序列，所以通過制備基于所述序列的引物和利用棒狀桿菌染色體DNA作為模板進(jìn)行PCR(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)；參見T.J.White等，Trends Genet.,5,185(1989))，可以容易地獲得PBP基因。
含有在以后提及的實施例中獲得的PBP基因的核苷酸序列如序列表中的SEQ ID NO:1所示。在此核苷酸序列中存在三個開放讀框(ORF)(核苷酸數(shù)881-2623,2790-4454和4467-5345)。由所述ORF編碼的氨基酸序列示于SEQ ID NO:2-4。
當(dāng)在現(xiàn)有蛋白數(shù)據(jù)庫中檢索顯示與這些氨基酸序列同源的序列時，發(fā)現(xiàn)由第一個ORF編碼的氨基酸序列顯示與大腸桿菌的PBP3基因(ftsⅠ)編碼的氨基酸序列在氨基酸水平上大約31％同源。由第二個ORF和第三個ORF編碼的氨基酸序列顯示分別與大腸桿菌的murE基因和murF基因編碼的氨基酸序列同源。這些結(jié)果表明第一個ORF是對應(yīng)于大腸桿菌的ftsⅠ的PBP基因。
本發(fā)明的PBP基因可以編碼一個或幾個置換、缺失、插入、添加或翻轉(zhuǎn)的氨基酸，只要用于結(jié)合青霉素的編碼蛋白的活性不被降解。由本文使用的術(shù)語“幾個”代表的數(shù)字可以根據(jù)在蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)中的定位和氨基酸殘基的種類有所變化。這是緣于以下事實，即在氨基酸中諸如異亮氨酸和纈氨酸的類似的氨基酸和在這些氨基酸中的差異基本上不影響蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)。因此，所述編碼蛋白可以是具有相對于構(gòu)成所述蛋白的完整氨基酸序列30-40％同源或更高，優(yōu)選55-65％同源或更高，并具有結(jié)合青霉素的活性的蛋白。
通過用例如定點誘變修飾所述核苷酸序列，以使特定位點的氨基酸殘基應(yīng)包括置換、缺失、插入、添加或翻轉(zhuǎn)，由此可以獲得這種編碼與如上所述的青霉素結(jié)合蛋白基本相同的蛋白的DNA。以上提及的這種修飾的DNA也可以通過已知的誘變處理獲得。所述誘變處理的實例包括用羥胺等體外處理編碼青霉素結(jié)合蛋白的DNA、利用紫外線照射或利用用于通常誘變處理的誘變劑(諸如N-甲基-N′-硝基-N-亞硝基胍(NTG)或亞硝酸)處理具有編碼青霉素結(jié)合蛋白的DNA的微生物(例如大腸桿菌)。
上述的核苷酸的置換、缺失、插入、添加或翻轉(zhuǎn)也包括由于個體差異、具有青霉素結(jié)合蛋白的微生物的物種或?qū)俚牟町惗烊划a(chǎn)生的突變(突變體或變種)。
通過在合適的細(xì)胞中表達(dá)具有如上所述的這種突變的DNA，并檢測表達(dá)產(chǎn)物的青霉素結(jié)合活性，可以獲得編碼同青霉素結(jié)合蛋白基本相同的蛋白的DNA。通過由編碼具有突變的青霉素結(jié)合蛋白的DNA中或由具有該DNA的細(xì)胞中分離在嚴(yán)格條件下可與具有例如序列表中SEQ ID NO:1的核苷酸數(shù)881至2623的核苷酸序列、并編碼具有青霉素結(jié)合活性的蛋白的DNA雜交的DNA，也可以獲得編碼與青霉素結(jié)合蛋白基本相同的蛋白的DNA。本文提到的“嚴(yán)格條件”是一種條件，在此條件下形成所謂的特異性雜交，而不形成非特異性雜交。難以用數(shù)值清楚表達(dá)此條件。但是，所述嚴(yán)格條件例如包括以下條件，在此條件下兩個具有高同源性的DNA(例如同源性不小于50％的兩個DNA)互相雜交，而兩個具有低于上述的同源性的DNA互相不雜交。另一方面，用以下條件，即60℃、1×SSC、0.1％SDS，優(yōu)選0.1×SSC、0.1％SDS，舉例說明所述嚴(yán)格條件，在該條件下在相當(dāng)于DNA雜交中一般洗滌條件的鹽濃度下，兩個DNA互相雜交。
在如上所述的條件下可雜交的基因包括那些具有在所述基因中產(chǎn)生的終止密碼子的基因和那些由于活性中心的突變而不具有活性的基因。然而，通過將所述基因與市售的活性表達(dá)載體連接，并檢測青霉素結(jié)合活性，可以很容易除去這類突變基因。<3>生產(chǎn)L-谷氨酸通過培養(yǎng)如上所述的這樣一種其中PBP通常不起作用且在液體培養(yǎng)基中具有L-谷氨酸生產(chǎn)能力的棒狀桿菌，以在所述培養(yǎng)基中產(chǎn)生和積累L-谷氨酸；收集L-谷氨酸，可以生產(chǎn)L-谷氨酸。按照本發(fā)明的方法，在含有顯著量的生物素(如糖蜜)而不加入生物素活性抑制劑的培養(yǎng)基中可以生產(chǎn)L-谷氨酸。
當(dāng)使用的棒狀桿菌是其中PBP在第一溫度通常起作用，而在第二溫度通常不起作用的細(xì)菌時，在第一溫度培養(yǎng)所述細(xì)菌，以讓其增殖，然后將溫度轉(zhuǎn)換到第二溫度培養(yǎng)，以生產(chǎn)L-谷氨酸。
具體而言，所述溫度轉(zhuǎn)換例如可以通過在低溫下進(jìn)行種子培養(yǎng)，并在高溫下在主培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)(主培養(yǎng))實現(xiàn)。在預(yù)培養(yǎng)或主培養(yǎng)過程中也可以轉(zhuǎn)換溫度。不能明顯區(qū)分細(xì)胞增殖的步驟和質(zhì)粒丟失的步驟，質(zhì)粒丟失的步驟伴隨有細(xì)胞增殖。
關(guān)于溫度轉(zhuǎn)換的時間，通過進(jìn)行溫度轉(zhuǎn)換的不同培養(yǎng)時間段的初步實驗，可以容易地確定在低溫下的培養(yǎng)時間段。通常，該培養(yǎng)可以持續(xù)至在對數(shù)生長階段達(dá)到所需的細(xì)胞濃度，然后可以將溫度轉(zhuǎn)換到在該溫度下所述質(zhì)粒不能復(fù)制的水平。
用于所述培養(yǎng)的培養(yǎng)基沒有特別限制，可以使用通常的含有碳源、氮源和無機(jī)離子以及根據(jù)需要的有機(jī)痕量營養(yǎng)物的培養(yǎng)基。具體來說，在本發(fā)明中可以使用含有顯著量生物素的培養(yǎng)基。
至于所述碳源，可以使用諸如葡萄糖、乳糖、半乳糖、果糖和淀粉的水解產(chǎn)物的糖類；諸如乙醇和肌醇的醇類；諸如乙酸、延胡索酸、檸檬酸和琥珀酸的有機(jī)酸等。
至于所述氮源，可以使用諸如硫酸銨、氯化銨和磷酸銨的無機(jī)銨鹽，諸如大豆水解產(chǎn)物、氨氣、氨水的有機(jī)氮等。
至于所述無機(jī)離子或其來源，可以加入少量的磷酸鉀、硫酸鎂、鐵離子、錳離子等。至于痕量有機(jī)營養(yǎng)物，理想的是根據(jù)需要加入適量的諸如維生素B1和酵母提取物等的所需物質(zhì)。
所述培養(yǎng)最好在有氧條件下進(jìn)行16至72小時，在培養(yǎng)過程中培養(yǎng)溫度控制在20-45℃,pH控制在5-8.5。至于調(diào)節(jié)pH，可以使用無機(jī)或有機(jī)酸性或堿性物質(zhì)、氨氣等。
通常可以通過使用已知技術(shù)的組合，諸如使用離子交換樹脂、沉淀方法等的技術(shù)，從所述培養(yǎng)物收集L-谷氨酸。
附圖簡述

圖1是一幅曲線圖，顯示了氮脒青霉素對PBP3和青霉素G結(jié)合的抑制。箭頭指示最小抑制濃度。
實施本發(fā)明的最佳方式以下將說明本發(fā)明的實施例。
實施例1檢測棒狀桿菌的PBP根據(jù)前述的Spratt等的方法進(jìn)行棒狀桿菌的PBP的檢測，具體如下。<1>制備膜部分PBP被認(rèn)為是一種膜蛋白。如下制備棒狀桿菌的膜部分。將棒狀桿菌的野生菌株乳發(fā)酵短桿菌ATCC 13869菌株接種到20ml的A培養(yǎng)基(在1升水中含有10克聚蛋白胨、5克酵母提取物、5克NaCl和5克葡萄糖)中，于30℃振蕩培養(yǎng)，并在660nm的吸收達(dá)到約1.0時收獲。在50mM的磷酸鈉緩沖液pH7.0中清洗細(xì)胞。然后，將玻璃珠加入到該緩沖液中并超聲處理破碎細(xì)胞。通過離心除去破碎碎片后，將所述緩沖液于100,000×g超速離心30分鐘，收集膜部分。用相同的緩沖液清洗獲得的部分，將最后懸浮于500μl相同緩沖液中的部分用作所述膜部分。通過使用蛋白定量試劑盒(由PIERCE生產(chǎn)，Micro BCA蛋白檢測試劑盒)測定此膜部分的蛋白濃度，實測值為4mg/ml。<2>青霉素結(jié)合反應(yīng)將3μl的14C-青霉素G(由Amersham生產(chǎn))加入到體積為30μl的所制備的膜部分中，并使其于30℃反應(yīng)10分鐘。然后，加入2μl 15％的十二烷基肌氨酸鈉(N-月桂酰肌氨酸鈉)和45mg/ml青霉素G，置于室溫20分鐘。然后，于20℃以13,000rpm離心所述部分30分鐘，得到可溶性部分。對此部分的樣品進(jìn)行SDS-PAGE(使用含有10％聚丙烯酰胺的凝膠)，混合凝膠，干燥并用Fuji Photo Film Co.,Ltd生產(chǎn)的圖象分析儀BAS2000分析。結(jié)果在110kDa、100kDa和60kDa檢測到三條帶，分別命名為PBP1、PBP2和PBP3。<3>使用PBP結(jié)合抑制劑進(jìn)行分析研究衍生自青霉素G的氮脒青霉素和PBP之間的親和性。通過在前述青霉素結(jié)合反應(yīng)之前加入不同濃度的氮脒青霉素，并檢測對與同位素(14C)標(biāo)記的青霉素G結(jié)合的抑制程度，由此研究所述衍生物和PBP之間的親和性。結(jié)果，加入氮脒青霉素只抑制了PBP3與標(biāo)記的青霉素G的結(jié)合。即闡明氮脒青霉素選擇性地結(jié)合PBP3(圖1)。
實施例2加入氮脒青霉素誘導(dǎo)棒狀桿菌生產(chǎn)谷氨酸將乳發(fā)酵短桿菌ATCC 13869菌株接種到前述的A培養(yǎng)基中，于30℃振蕩培養(yǎng)2小時，然后加入0.01μM至100μM的氮脒青霉素，再振蕩培養(yǎng)8小時。然后，使用Biotech Analyzer AS210(由AsahiChemical Industry Co.,Ltd.生產(chǎn))檢測所述培養(yǎng)基中的谷氨酸濃度(表1)。
表1

因為在加入氮脒青霉素誘導(dǎo)L-谷氨酸生產(chǎn)的條件下只有PBP3結(jié)合氮脒青霉素，所以證明至少是由抑制PBP3的作用促成了由加入青霉素或氮脒青霉素誘導(dǎo)的谷氨酸生產(chǎn)。
實施例3克隆乳發(fā)酵短桿菌ATCC 13869的PBP基因(1)制備乳發(fā)酵短桿菌ATCC 13869的染色體DNA在10ml L培養(yǎng)基(1％聚蛋白胨、0.5％酵母提取物、0.5gNaCl、0.1％葡萄糖，pH7.2)中過夜培養(yǎng)乳發(fā)酵短桿菌ATCC 13869菌株，并收獲。用50mM Tris-HCl、50mM EDTA緩沖液(pH8.0)清洗細(xì)胞，并在800μl相同緩沖液中懸浮。
向上述細(xì)胞懸浮液中加入40μl的50ml/ml溶菌酶溶液和20μl的10mg/ml RNA酶溶液，于37℃溫育該混合物1小時。向混合物中加入20μl的20％SDS溶液，并于70℃溫育1小時。然后，向混合物中加入24μl的20mg/ml蛋白酶K溶液，于50℃溫育1小時，再加入24μl的蛋白酶K溶液，并溫育1小時。
向如上所述獲得的細(xì)胞裂解液中加入等量的苯酚并攪拌。將所述裂解液置于4℃過夜，然后離心收集水層。用苯酚/氯仿提取水層2小時，并用氯仿/異戊醇提取30分鐘。通過在攪拌預(yù)定的一段時間后，對其離心以收集水層，留下裂解物，從而進(jìn)行提取。通過乙醇沉淀由獲得的提取物中收集DNA。在300μl的TE緩沖液(10mM Tris-HCl、1mM EDTA,pH8.0)中溶解DNA沉淀。(2)制備乳發(fā)酵短桿菌ATCC 13869的染色體DNA文庫用限制酶HindⅢ(Takara Shuzo)消化如上所述獲得的乳發(fā)酵短桿菌ATCC 13869的染色體DNA和高拷貝數(shù)的大腸桿菌載體pHSG398(Takara Shuzo)。以合適的量混合這兩種DNA，并使用TakaraDNA連接試劑盒2型(Takara Shuzo)連接，以構(gòu)建乳發(fā)酵短桿菌ATCC13869的染色體DNA文庫。(3)選擇PBP基因克隆用如上所述獲得的乳發(fā)酵短桿菌ATCC 13869的染色體DNA文庫轉(zhuǎn)化大腸桿菌的murE突變株TLKll(murE溫度敏感型突變，J.Bacteriol.,1972,110:41-46)，并于42℃在含有20μg/ml氯霉素的L瓊脂培養(yǎng)基(含有1.5％瓊脂的L培養(yǎng)基)上培養(yǎng)過夜。
將形成的菌落接種到L液體培養(yǎng)基培養(yǎng)，從獲得的細(xì)胞收集質(zhì)粒。結(jié)果在該質(zhì)粒中克隆了約5.3kb的HindⅢ片段。該質(zhì)粒命名為pHSGH-H。(4)測定克隆的DNA片段的核苷酸序列使用具有7-脫氮-2-脫氧鳥苷三磷酸的Thermo測序酶熒光標(biāo)記引物循環(huán)測序試劑盒(Amersham Pharmacia Biotech)對前述的克隆片段進(jìn)行雙脫氧反應(yīng)，并使用DNA測序儀DSQ-1000L(Shimadzu)測定所述核苷酸序列。測定的核苷酸序列示于SEQ ID NO:1。
實施例4構(gòu)建PBP基因被破壞的乳發(fā)酵短桿菌菌株使用在日本專利公開第5-7491號中公開的溫度敏感質(zhì)粒經(jīng)過同源重組，產(chǎn)生在染色體上具有破壞的PBP基因的乳發(fā)酵短桿菌。
使用pHSGH-H作為模板，使用具有SEQ ID NO:5和6所示的核苷酸序列的寡核苷酸作為引物，進(jìn)行PCR，以擴(kuò)增PBP基因片段。SEQ ID NO:5所示的引物含有對應(yīng)于SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的核苷酸數(shù)31-50的序列，SEQ ID NO:6所示的引物含有對應(yīng)于SEQID NO:1所示核苷酸序列的核苷酸數(shù)2991-3014的序列，而它們每個在5′末端序列中都具有EcoRⅠ識別序列。使用市售PCR儀器(由TakaraShuzo等生產(chǎn)的DNA熱循環(huán)儀，型號PJ2000)和TaqDNA聚合酶(Takara Shuzo)，按照廠商的方法進(jìn)行所述PCR反應(yīng)。
用EcoRⅠ處理獲得的擴(kuò)增片段，并將其插入到pHSG299(由TakaraShuzo生產(chǎn))的EcoRⅠ位點，產(chǎn)生pHSGE。另外用BamHⅠ和KpnⅠ消化棒狀桿菌的溫度敏感質(zhì)粒pHSC4，獲得含有復(fù)制控制區(qū)的基因片段，使用由Takara Shuzo生產(chǎn)的平端試劑盒平端化獲得的片段，并使用XbaⅠ接頭(由Takara Shuzo生產(chǎn))將其插入到pHSGE的XbaⅠ位點，產(chǎn)生pHSGX。然后，用BamHⅠ和KpnⅠ消化pHSGX，用由TakaraShuzo生產(chǎn)的平端試劑盒平端化，并使用Takara DNA連接試劑盒2型(Takara Shuzo)使其產(chǎn)生自連接。獲得的質(zhì)粒pHSGXΔBK具有內(nèi)部缺失的PBP基因。
使用如上所述獲得的用于PBP基因置換的質(zhì)粒pHSGXΔBK，利用雙重組技術(shù)進(jìn)行缺失型PBP基因和在乳發(fā)酵短桿菌染色體DNA上的PBP基因之間的基因置換。具體而言，如下完成所述置換。通過電脈沖法(參見日本專利公布第2-207791號)，用pHSGXΔBK轉(zhuǎn)化乳發(fā)酵短桿菌ATCC 13869。于25℃在M-CM2G液體培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)轉(zhuǎn)化體6小時，并將其接種到含有25μg/ml卡那霉素的M-CM2G培養(yǎng)基上。獲得于34℃形成菌落的菌株。
在獲得的菌株中，將缺失型PBP基因與原來存在于染色體上的PBP基因重組，將染色體PBP基因和缺失型PBP基因的兩個融合基因插入到染色體中，這樣在兩個融合基因之間應(yīng)當(dāng)存在所述重組DNA的其它部分(載體區(qū)段、溫度敏感復(fù)制控制區(qū)和藥物抗性標(biāo)記)。因此，所述轉(zhuǎn)化體菌株在高溫下可以生長，因為正常的PBP基因在此狀態(tài)下是占優(yōu)勢的。
然后，于25℃培養(yǎng)所述轉(zhuǎn)化體菌株，由在25℃可以生長但在34℃不能生長的菌株中選擇其中染色體上的PBP基因用缺失型基因置換的菌株，并命名為ΔP3/p3菌株。在所述ΔP3/p3菌株中，在染色體DNA上留下缺失型PBP基因，而含有正常PBP基因的質(zhì)粒存在于細(xì)胞中。通過測定缺失區(qū)之后留下的連接區(qū)的核苷酸序列，證實染色體上的PBP基因是否由缺失型置換。
工業(yè)適用性按照本發(fā)明，提供棒狀桿菌的編碼青霉素結(jié)合蛋白的基因(PBP基因)。使用具有所述基因的棒狀桿菌(其中染色體上的PBP基因被破壞)，在存在顯著量的生物素而不加入生物素活性抑制劑的情況下可以生產(chǎn)L-谷氨酸。
序列表<110>Ajinomoto Co.,Inc.<120>編碼青霉素結(jié)合蛋白的基因和生產(chǎn)L-谷氨酸的方法<130>0P843-PCT<141>1999年3月5日<150>JP10-55608<151>1998年3月6日<160>6<170>ParentIn，版本2.0<210>1<211>5347<212>DNA<213>乳發(fā)酵短桿菌<220><221>CDS<222>(881)..(2623)<220><223>CDS<224>(2790)..(4454)<220><225>CDS<226>(4467)..(5345)<400>1aagcttcggg gaggggcgcg tcgataagca cgcaacctcg tcgtgacatg gcgccggaaa 60ggaaacaacc cgggccctgg tgaaccctgg cgtgcagcaa cgcgtaattg atgcagcaca 120agctgggctc tcagcaggtt atgtcggtgc gtggtcgccg cgttgaggca aaacgtgctg 180atcctaaggt gatccagctg tctgtgctgg tggttatcct gctgtgcgtt ggtgttggcg 240cgaccatggg tctgtccgga acgtctacac agcagacttt ccagttgcag gaacttcagg 300caactgaaac ggatttgagc aatcgcattg agtctctcaa ccgagatgtg gaagatgctc 360gctcagcagc aaccttggca gcgaatgcta cggagatggg cttggtatcc ccagtggaac 420ctggcgtgct cgcagtgcag gaaaacggtg atgttgtgga ggagcgcgaa caaatccaga 480gacacgccct atagttgaca tcaatggaca acagacccga ccaaatcggg catcaagcaa 540ccctgacgag actaacgcat actgaaaacc tccaggcgat tccacaagaa gcagcagctc 600cgccgtatca gaccaacact 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420 425 430Arg Arg Asp Ser Thr Lys Arg Gly Pro Met Gly Ser Cys Pro His Arg435 440 445Ser Gly Ser Ser Tyr Cys Thr Asp Ala Asn Leu Val Arg Val Ala Gly450 455 460Thr Ile Arg Ala Ala Val Thr Ala Gly Ala Gln Gln Gly Ala Ser Glu465 470 475 480Ser Glu Arg Pro Val Glu Val Leu Glu Ile Gly Asp Arg Ala Glu Ala485 490 495Ile Arg Val Leu Val Glu Trp Ala Gln Pro Gly Asp Gly Ile Val Val500 505 510Ala Gly Lys Gly His Glu Val Gly Gln Leu Val Ala Gly Val Thr His515 520 525His Phe Asp Asp Arg Glu Glu Gly Arg Ala Ala Leu Thr Glu Lys Leu530 535 540Asn Asn Lys Leu Pro Leu Thr Thr Glu Glu Gly545 550 555<210>4<211>293<212>PRT<213>乳發(fā)酵短桿菌<400>4Met Ile Thr Met Thr Leu Gly Glu Ile Ala Asp Ile Val Gly Gly Arg1 5 10 15Leu Thr Gly Gly Ala Gln Glu Asp Thr Leu Val Ser Ser Ser Val Glu20 25 30Phe Asp Ser Arg Ser Leu Thr Pro Gly Gly Leu Phe Leu Ala Leu Pro35 40 45Gly Ala Arg Val Asp Gly His Asp Phe Ala Ala Thr Ala Ile Glu Lys50 55 60Gly Ala Val Ala Val Leu Ala Ala Arg Glu Val Asp Val Pro Ala Ile65 70 75 80Val Val Pro Pro Val Lys Ile Gln Glu Ser Asn Ala Asp Ile Tyr Ala85 90 95His Glu Pro Asp Gly His Gly Ala Ala Val Val Glu Ala Leu Ser Arg100 105 110Leu Ala Arg His Val Val Asp Ile Cys Val Ala Gly His Gln Leu Asn115 120 125Val Val Ala Ile Thr Gly Ser Ala Gly Lys Thr Ser Thr Lys Asp Phe
130 135 140Ile Ala Thr Val Leu Gly Gln Asp Gly Pro Thr Val Ala Pro Pro Gly145150 155 160Ser Phe Asn Asn Glu Leu Gly Leu Pro His Thr Val Arg Cys Thr Thr165 170 175Asp Thr LyS Tyr Leu Val Ala Glu Met Ser Ala Arg Gly Ile Gly His180 185 190Ile Lys His Leu Thr Glu Ile Arg Pro Pro Arg Ile Ala Ala Val Leu195 200 205Asn Val Gly His Ala His Leu Gly Glu Phe Gly Ser Arg Glu Asn Ile210 215 220Ala Gln Ala Lys Gly Glu Ile Ile Glu Ala Leu Pro Ser Lys Lys Thr225 230 235 240Gly Gly Val Ala Val Leu Asn Ala Asp Asp Pro Phe Val Ala Arg Met245 250 255Ala Pro Arg Thr Lys Ala Arg Val Val Trp Phe Thr Thr Asp Ala Gly260 265 270Gln Ala Lys Lys Ser Asp Tyr Trp Ala Thr Ser Ile Ser Leu Asp Ala275 280 285Val Ala Arg Ala Ser290<210>5<211>30<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物<400>5gcgcgaattc cgcaacctcg tcgtgacatg 30<210>6<211>340<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物<400>6gcgcgaattc aagaccaata gccgcgattg cttg 3權(quán)利要求
1．生產(chǎn)L-谷氨酸的方法，該方法包括以下步驟在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)棒狀桿菌，以在該培養(yǎng)基中生產(chǎn)和積累L-谷氨酸；收集L-谷氨酸，其中在所述棒狀桿菌中青霉素結(jié)合蛋白(PBP)通常不起作用，且所述棒狀桿菌具有生產(chǎn)L-谷氨酸的能力。
2．按照權(quán)利要求1的方法，其中所述棒狀桿菌是其中青霉素結(jié)合蛋白通常在第一溫度起作用、而在第二溫度通常不起作用的細(xì)菌；該方法包括以下步驟在第一溫度培養(yǎng)所述細(xì)菌，以增殖該細(xì)菌，在第二溫度培養(yǎng)該細(xì)菌，以生產(chǎn)L-谷氨酸。
3．按照權(quán)利要求2的方法，其中所述棒狀桿菌是帶有包含編碼青霉素結(jié)合蛋白的基因(PBP基因)和溫度敏感復(fù)制控制區(qū)的質(zhì)粒的細(xì)菌，其中在染色體上的所述PBP基因不起作用，且所述質(zhì)粒在第一溫度可以復(fù)制，而在第二溫度不能復(fù)制。
4．按照權(quán)利要求2的方法，其中由所述棒狀桿菌產(chǎn)生的青霉素結(jié)合蛋白具有溫度敏感型突變。
5．按照權(quán)利要求1-4中任一項的方法，其中當(dāng)所述青霉素結(jié)合蛋白結(jié)合青霉素G時，所述青霉素結(jié)合蛋白在SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳中顯示的分子量約60,000。
6．按照權(quán)利要求1-4中任一項的方法，其中所述青霉素結(jié)合蛋白具有在序列中的SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。
7．按照權(quán)利要求3的方法，其中所述PBP基因具有至少包含在序列表中的SEQ ID NO:1的核苷酸數(shù)881-2623的序列的核苷酸序列。
8．編碼在下述(A)或(B)中定義的蛋白的DNA(A)具有在序列表中的SEQ ID NO:2的氨基酸序列的蛋白；(B)具有在序列表中的SEQ ID NO:2的氨基酸序列并具有結(jié)合青霉素的活性的蛋白，所述氨基酸序列包括一個或幾個氨基酸的置換、缺失、插入、添加或翻轉(zhuǎn)。
9．按照權(quán)利要求7的DNA，該DNA是在以下(a)或(b)中定義DNA(a)至少包含在序列表中的SEQ ID NO:1的核苷酸數(shù)881-2623的核苷酸序列的DNA；(b)在嚴(yán)格條件下可與至少包含在序列表中的SEQ ID NO:1的核苷酸數(shù)881-2623的序列的核苷酸序列雜交，并編碼具有結(jié)合青霉素的活性的蛋白的DNA。
全文摘要
生產(chǎn)L－谷氨酸的方法,該方法包括在不讓溫度敏感復(fù)制調(diào)節(jié)區(qū)發(fā)揮其作用的溫度培養(yǎng)棒狀桿菌的步驟,在所述棒狀桿菌中染色體上的編碼青霉素結(jié)合蛋白的青霉素結(jié)合蛋白基因(PBP基因)已經(jīng)被破壞,且在具有所述溫度敏感復(fù)制調(diào)節(jié)區(qū)的質(zhì)粒上帶有正常的PBP基因;包括在讓所述溫度敏感復(fù)制調(diào)節(jié)區(qū)發(fā)揮其作用的溫度培養(yǎng)所述細(xì)菌的步驟,藉此生產(chǎn)L－谷氨酸。
文檔編號C12P13/00GK1299418SQ9980565
公開日2001年6月13日 申請日期1999年3月5日 優(yōu)先權(quán)日1998年3月6日
發(fā)明者和地正明, 永井和夫 申請人:味之素株式會社