專利名稱：雜交種子生產(chǎn)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及制備雜交種子的方法。
具體地講，本發(fā)明涉及作物不育性的分子控制。植物的所述雄性和雌性不育性可用于由天然自花授粉的作物制備雜交種子。
本發(fā)明還提供了恢復(fù)親本植株育性的方法，以便能夠自花授粉，從而能夠保持親本系。
本發(fā)明還涉及用于整合到植物親本中的表達(dá)框，并涉及將所述表達(dá)框用于雄性/雌性不育性恢復(fù)系統(tǒng)。
由雜交種子長成的雜交植物具有讓兩種不同的遺傳背景雜交的雜交優(yōu)勢。雜交種子的生產(chǎn)取決于控制自花授粉并確保父本植株和母本植株異花授粉的能力。
有多種方法可用于控制花粉育性。例如，就玉米而言，它具有分離的雄花和雌花，控制花粉育性是在花粉釋放之前機(jī)械去除雄花或穗狀雄花而實(shí)現(xiàn)的，由此阻止自花授粉。
不過，大部分主要作物在同一朵花內(nèi)具有功能性雄性和雌性生殖器官，在這種情況下，去除生產(chǎn)花粉的器官需要花費(fèi)大量的勞動(dòng)力和資金。特別是在小麥、玉米和稻上，可用化合物(殺配子劑)殺死或抑制花粉產(chǎn)生，能產(chǎn)生暫時(shí)性的雄性不育性，但使用這種化合物是昂貴的?；衔锏目煽啃约捌渥饔脮r(shí)間也成問題。
人們對開發(fā)基于產(chǎn)生雄性不育性的遺傳機(jī)制的花粉控制系統(tǒng)有極大的興趣。存在兩種大的類型a)由于一個(gè)或幾個(gè)核基因引起的花粉生產(chǎn)缺陷所導(dǎo)致的核雄性不育性，和b)細(xì)胞質(zhì)雄性不育性(CMS)，其中，花粉的生產(chǎn)由于存在于線粒體上的基因的缺陷而受到抑制。
現(xiàn)有的核系統(tǒng)是基于將雄性不育性狀導(dǎo)入一種親本植物，然后通過與另一種植物異花授粉導(dǎo)入育性恢復(fù)基因，以便產(chǎn)生可育的雜交植物。披露于WO96/01799中的Paladin系統(tǒng)是不同的，它基于基因在雜交種子生產(chǎn)中的分離，當(dāng)這些基因在一個(gè)植株中同時(shí)表達(dá)時(shí)，具有細(xì)胞毒性作用，導(dǎo)致雄性不育性。
稻和小麥?zhǔn)亲曰ㄊ诜壑参?，并具有小的兩性花，因此，不能采用用于在玉米上生產(chǎn)雜交種子的去雄方法。首先，去除花藥是困難的并且要花費(fèi)大量時(shí)間。另外，小麥花粉比較重，并且僅能存活很短時(shí)間，很少能保存活力超過30分鐘。因此，用于雜交玉米生產(chǎn)的種植技術(shù)，即將父本種植在與母本(雄性不育)機(jī)械隔離的小區(qū)中，并利用風(fēng)力傳粉，不能很好適用于小麥或稻。這些作物的父本和母本必須相間種植，以確保異花授粉。由于雜交種子需要包括95％以上的雜種，必須清除由父本自花授粉所產(chǎn)生的種子或者使得父本不能夠自花授粉，從而不能產(chǎn)生非雜交種子。很顯然，親本植株的相間種植意味著上述第一種選擇是困難的，除非父本植物容易受某種化學(xué)處理的影響，而母本對這種化學(xué)處理有承受能力，例如，除草劑處理。
我們的國際專利申請?zhí)朠CT/GB90/00110披露了一系列基因序列，該基因序列能表達(dá)一種能在母本植株中破壞有活力的花粉生物合成的蛋白。不過，在這種情況下，僅有一種親本植物，即母本是不育的，以便減少母本植物的自花授粉，并且該母本植物與可育的父本植物雜交，以便產(chǎn)生可育的雜交種子。不過，在該文獻(xiàn)中沒有披露生產(chǎn)雜交種子的方法，其中，兩種親本植物都不能自花授粉。
本發(fā)明涉及兩種方法，通過該方法可以生產(chǎn)雜交種子，該方法試圖克服目前與雜交種子生產(chǎn)，特別是與雜交小麥和稻種子生產(chǎn)相關(guān)的問題。
根據(jù)本發(fā)明的第一方面，提供了一種制備雜交種子的方法，包括相間種植雄性可育并且純合隱性的雌性不育父本植物和純合隱性雄性不育而雌性可育的母本植物，進(jìn)行異花授粉，并獲得由此所產(chǎn)生的種子。
根據(jù)本發(fā)明的第二方面，提供了將上述方法用于生產(chǎn)雜交種子的用途。
根據(jù)本發(fā)明的第三方面，提供了通過上述方法生產(chǎn)的可育的植物。
根據(jù)本發(fā)明的第四方面，提供了上述植物的后代，所述植物和所述后代的種子。
根據(jù)本發(fā)明的第五方面，提供了一種表達(dá)框，包括
(a)第一基因啟動(dòng)子序列，它是雄花特異性啟動(dòng)子序列；(b)編碼一種能夠破壞雄性育性的產(chǎn)物的破壞基因，該基因有效連接于所述第一基因啟動(dòng)子序列上；(c)第二基因啟動(dòng)子序列，它是可任選有效連接于一個(gè)或幾個(gè)翻譯增強(qiáng)子或內(nèi)含子序列上的雌花特異性啟動(dòng)子序列；(d)編碼一種能夠恢復(fù)雌性育性的產(chǎn)物的恢復(fù)基因，它有效連接于所述第二基因啟動(dòng)子序列上；(e)對一種外源化學(xué)誘導(dǎo)物的存在或缺乏有反應(yīng)的第三基因啟動(dòng)子序列，它選擇性、有效連接于一個(gè)或幾個(gè)翻譯增強(qiáng)子或內(nèi)含子序列上；和(f)編碼一種能夠恢復(fù)雄性育性的產(chǎn)物的恢復(fù)基因，它有效連接于所述第三基因啟動(dòng)子序列上；因此，所述外源化學(xué)誘導(dǎo)物的存在能夠控制雄性可育性。
根據(jù)本發(fā)明的第六方面，提供了一種表達(dá)框，包括(a)第一基因啟動(dòng)子序列，它是雌花特異性啟動(dòng)子序列；(b)編碼一種能夠破壞雌性育性的產(chǎn)物的破壞基因；(c)第二基因啟動(dòng)子序列，它是可任選有效連接于一個(gè)或幾個(gè)翻譯增強(qiáng)子或內(nèi)含子序列上的雄花特異性啟動(dòng)子序列；(d)編碼一種能夠恢復(fù)雄性育性的產(chǎn)物的恢復(fù)基因，它有效連接于所述第二基因啟動(dòng)子序列上；(e)對一種外源化學(xué)誘導(dǎo)物的存在或缺乏有反應(yīng)的第三基因啟動(dòng)子序列，它可任選有效連接于一個(gè)或幾個(gè)翻譯增強(qiáng)子或內(nèi)含子序列上；和(f)編碼一種能夠恢復(fù)雌性育性的產(chǎn)物的恢復(fù)基因，它有效連接于所述第三基因啟動(dòng)子序列上；因此，所述外源化學(xué)誘導(dǎo)物的存在能夠控制雌性可育性。
根據(jù)本發(fā)明的第七方面，提供了另一種生產(chǎn)雜交種子的方法，包括將本發(fā)明上述第五方面的第一表達(dá)系統(tǒng)整合到第一種植物中，以便產(chǎn)生半純合的母本植物，并將根據(jù)本發(fā)明第六方面的第二表達(dá)系統(tǒng)整合到第二種植物中，以便產(chǎn)生半純合的父本植物；將一種外源化學(xué)誘導(dǎo)物施加在所述轉(zhuǎn)化體上，以便使所述植物自花授粉；由所得的種子長成植株；篩選雄性和雌性純合的植株；讓所述篩選的雄性和雌性植株雜交；和獲得所產(chǎn)生的雜交種子。
根據(jù)本發(fā)明的第八方面，提供了一種用上述任一種表達(dá)框轉(zhuǎn)化的植物組織和由所述轉(zhuǎn)化的植物組織產(chǎn)生的材料。
根據(jù)本發(fā)明的第九方面，提供了包括上述組織或材料的可育的全植株。
根據(jù)本發(fā)明的第十方面，提供了按照本發(fā)明第七方面生產(chǎn)的篩選植株的后代，所述后代包括整合的上述表達(dá)框，優(yōu)選穩(wěn)定地整合到其基因組中，以及所述植物和所述后代的種子。
根據(jù)本發(fā)明的第十一方面，提供了一種植物，其基因組包括根據(jù)本發(fā)明第五方面的第一表達(dá)框。
根據(jù)本發(fā)明的第十二方面，提供了一種植物，其基因組包括根據(jù)本發(fā)明第六方面的第二表達(dá)框。
根據(jù)本發(fā)明的第十三方面，提供了通過讓上述兩種植物雜交所產(chǎn)生的雜交種子，并獲得由此產(chǎn)生的雜交種子。
根據(jù)本發(fā)明的第十四方面，提供了將本發(fā)明第二種方法用于生產(chǎn)雜交種子的用途。
根據(jù)本發(fā)明的第十五方面，提供了一種轉(zhuǎn)化植物的方法，包括將上述表達(dá)框整合到所述植物的基因組中，其中，所述有效連接于第三基因啟動(dòng)子序列上的恢復(fù)基因能在目標(biāo)組織中誘導(dǎo)表達(dá)，但可以在一種或幾種其他組織中以組成型形式表達(dá)，因此，所述破壞基因只能在所述目標(biāo)組織中起作用。所述第三啟動(dòng)子序列可以在特定的階段，例如在愈傷組織中以組成型形式表達(dá)。
本發(fā)明的第一種方法優(yōu)選是這樣的，其中，所述每一種親本植物的基因組DNA上業(yè)已整合了一種基因結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)包括對一種外源化學(xué)誘導(dǎo)物的存在或缺乏有反應(yīng)的啟動(dòng)子序列，可任選有效連接于一個(gè)或幾個(gè)反應(yīng)增強(qiáng)子或內(nèi)含子序列上，有效連接于能完全恢復(fù)每一種親本植物的育性的基因上，所述基因是通過在所述植物上使用一種外源化學(xué)誘導(dǎo)物而表達(dá)的，因此使得每一種親本能夠自花授粉。
所述母本植物的一種隱性基因優(yōu)選是純合的，該基因能破壞有活力的花粉的生物合成，或者能顯著降低花粉的生活力。
所述父本植物的一種隱性基因優(yōu)選是純合的，該基因能破壞諸如胚珠、花柱、柱頭的雌花結(jié)構(gòu)，以便阻止受精，或者抑制花粉的粘接、水合或萌發(fā)，或者抑制花粉管生長或?qū)颉?br> 所述誘導(dǎo)型啟動(dòng)子序列優(yōu)選是Alc A啟動(dòng)子序列或GST-27啟動(dòng)子序列。
所述親本植物優(yōu)選是小麥、大麥、稻、玉米、甜菜、番茄、向日葵、canola、棉花、大豆和諸如萵苣的其他蔬菜。
由本發(fā)明第一種方法所生產(chǎn)的F1雜交種子優(yōu)選能產(chǎn)生完全可育的植物。
由本發(fā)明第一種方法所生產(chǎn)的F2雜交種子優(yōu)選能產(chǎn)生不育性發(fā)生分離的植物，大約25％是雌性不育的。
所述親本的不育性優(yōu)選是通過天然或遺傳學(xué)操作的突變導(dǎo)致的。
上文所述的、并且用于本發(fā)明第二種方法中的所述第一表達(dá)框優(yōu)選包括一個(gè)編碼一種能破壞花粉產(chǎn)生的產(chǎn)物的破壞基因。
上述第一表達(dá)框優(yōu)選包括一個(gè)編碼一種能在所述植物的氈絨層細(xì)胞中表達(dá)的產(chǎn)物的破壞基因。
在所述第一表達(dá)框中的第三基因啟動(dòng)子序列優(yōu)選是AlcA啟動(dòng)子序列或GST-27啟動(dòng)子序列。
上文所述的并且用于本發(fā)明第二種方法中的所述第二表達(dá)框優(yōu)選包括一個(gè)編碼一種能恢復(fù)花粉生產(chǎn)的產(chǎn)物的恢復(fù)基因。
上述第二表達(dá)框優(yōu)選包括一個(gè)能夠克服所述氈絨層細(xì)胞破壞的恢復(fù)基因。
在所述第二表達(dá)框中的第三基因啟動(dòng)子序列優(yōu)選是AlcA啟動(dòng)子序列或GST-27啟動(dòng)子序列。
本發(fā)明第二種方法中的父本植物優(yōu)選包括一個(gè)恢復(fù)雄性育性的純合的顯性基因。
本發(fā)明第二種方法中的母本植物優(yōu)選包括一個(gè)恢復(fù)雌性育性的純合的顯性基因。
所生產(chǎn)的F1雜交種子優(yōu)選能產(chǎn)生這樣的植物，其花藥能產(chǎn)生大約50％的有活力的花粉，其中，所述第一表達(dá)框的第一基因啟動(dòng)子序列是配子體啟動(dòng)子序列。
所生產(chǎn)的F1雜交種子優(yōu)選能產(chǎn)生這樣的植物，所有植物是完全可育的，其中，所述第一表達(dá)框的第一基因啟動(dòng)子序列是孢子體啟動(dòng)子序列。
F2雜交種子優(yōu)選能產(chǎn)生不育性發(fā)生分離的植物，其中相當(dāng)數(shù)量是雌性不育的。
優(yōu)選通過在植物上使用一種外源化學(xué)誘導(dǎo)物，繁殖并保持通過本發(fā)明第二種方法所生產(chǎn)的父本和母本純合植物，以便使得所述植物自花授粉。就此而言，可以生產(chǎn)所選擇的父本和母本純合植物的自花授粉的其他世代，并且當(dāng)需要雜交種子時(shí)，讓所述植物雜交以便獲得雜交種子。
用于本發(fā)明第二種方法中的植物優(yōu)選小麥、大麥、稻、玉米、甜菜、番茄、向日葵、canola、棉花、大豆和其他蔬菜。
用于本發(fā)明轉(zhuǎn)化植物的方法中的恢復(fù)基因優(yōu)選在再生轉(zhuǎn)化植物的愈傷組織中以組成型形式表達(dá)。
所述恢復(fù)基因優(yōu)選在雄花或雌花結(jié)構(gòu)中以誘導(dǎo)型形式表達(dá)。
用于所述轉(zhuǎn)化方法的表達(dá)框中的第三基因啟動(dòng)子序列優(yōu)選為GST-27或Alc A啟動(dòng)子序列。
本發(fā)明的一種優(yōu)選實(shí)施方案是一種制備雜交種子的方法，包括相間種植雄性可育并且純合隱性雌性不育的父本植物和純合隱性雄性不育而雌性可育的母本植物，進(jìn)行異花授粉，并獲得由此產(chǎn)生的種子，其中，在每一種親本植物的基因DNA上業(yè)已整合了一種基因結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)包括一個(gè)對一種外源化學(xué)誘導(dǎo)物的存在或缺乏有反應(yīng)的啟動(dòng)子序列，它有效連接于一個(gè)能完全恢復(fù)每一種親本植物的育性的基因上，該基因是通過在所述植物上使用一種外源化學(xué)誘導(dǎo)物而得到表達(dá)的，以便在需要繁殖每一種親本植物的種子儲備時(shí)讓每一種親本自花授粉。
本發(fā)明的另一種優(yōu)選實(shí)施方案是一種表達(dá)系統(tǒng)，包括
(a)第一基因啟動(dòng)子序列，它是雄花特異性啟動(dòng)子序列；(b)編碼一種能夠破壞雄性育性的產(chǎn)物的破壞基因，該基因有效連接于所述第一基因啟動(dòng)子序列上；(c)第二基因啟動(dòng)子序列，它是可任選有效連接于一個(gè)或幾個(gè)翻譯增強(qiáng)子或內(nèi)含子序列上的雌花特異性啟動(dòng)子序列；(d)編碼一種能夠恢復(fù)雌性育性的產(chǎn)物的恢復(fù)基因，它有效連接于所述第二基因啟動(dòng)子序列上；(e)對一種外源化學(xué)誘導(dǎo)物的存在或缺乏有反應(yīng)的第三基因啟動(dòng)子序列，它可任選有效連接于一個(gè)或幾個(gè)翻譯增強(qiáng)子或內(nèi)含子序列上；(f)編碼一種能夠恢復(fù)雄性育性的產(chǎn)物的恢復(fù)基因，它有效連接于所述第三基因啟動(dòng)子序列上；其中，所述外源化學(xué)誘導(dǎo)物的存在可控制雄性育性，其中，所述能夠破壞雄性不育性的基因是一種編碼一種能在所述植物的氈絨層細(xì)胞中表達(dá)的產(chǎn)物的破壞基因。
本發(fā)明的另一種優(yōu)選實(shí)施方案是一種表達(dá)系統(tǒng)，包括(a)第一基因啟動(dòng)子序列，它是雌花特異性啟動(dòng)子序列；(b)編碼一種能夠破壞雌性育性的產(chǎn)物的破壞基因；(c)第二基因啟動(dòng)子序列，它是可任選有效連接于一個(gè)或幾個(gè)翻譯增強(qiáng)子或內(nèi)含子序列上的雄花特異性啟動(dòng)子序列；(d)編碼一種能夠恢復(fù)雄性育性的產(chǎn)物的恢復(fù)基因，它有效連接于所述第二基因啟動(dòng)子序列上；(e)對一種外源化學(xué)誘導(dǎo)物的存在或缺乏有反應(yīng)的第三種基因啟動(dòng)子序列，它可任選有效連接于一個(gè)或幾個(gè)翻譯增強(qiáng)子或內(nèi)含子序列上；和(f)編碼一種能夠恢復(fù)雌性育性的產(chǎn)物的恢復(fù)基因，它有效連接于所述第三基因啟動(dòng)子序列上；其中，所述外源化學(xué)誘導(dǎo)物的存在可控制雌性可育性，并且其中，所述能夠恢復(fù)雄性育性的基因是編碼一種能在氈絨層細(xì)胞中恢復(fù)花粉生產(chǎn)的產(chǎn)物的基因。
所述優(yōu)選的雄花特異性啟動(dòng)子序列是玉米MSF14和C5(源于果膠甲基酯酶)啟動(dòng)子序列。
術(shù)語“植物材料”包括發(fā)育中的穎果、萌發(fā)中的穎果或谷粒、或幼苗、小植株或植株、或其組織或細(xì)胞，如發(fā)育中的穎果的細(xì)胞或萌發(fā)的幼苗或發(fā)育中的谷?；蛑参锏慕M織(例如，根、葉和莖的組織)。
術(shù)語“框”與諸如“結(jié)構(gòu)”、“雜合體”和“綴合體”的術(shù)語同義，包括一個(gè)直接或間接連接在基因啟動(dòng)子序列上的感興趣的基因。間接連接的一個(gè)例子是，在所述啟動(dòng)子和感興趣的基因之間提供一個(gè)諸如內(nèi)含子或增強(qiáng)子序列的合適的間隔基團(tuán)。所述結(jié)構(gòu)還包括適用于轉(zhuǎn)化感興趣的細(xì)胞的質(zhì)粒和噬菌體。
術(shù)語“破壞基因”是一種以顯性方式起作用的基因，并且當(dāng)其在植物發(fā)育的合適階段表達(dá)時(shí)，可導(dǎo)致植物不能產(chǎn)生有正常功能的雌花結(jié)構(gòu)或有正常功能的雄花結(jié)構(gòu)，使得該植物雌性或雄性不育。所述基因可以通過破壞諸如氈絨層和內(nèi)皮的組織而發(fā)揮其作用。所述基因可以在花粉形成期間在雄花中以特異方式表達(dá)，導(dǎo)致花藥及相關(guān)組織、花粉母細(xì)胞、花粉及相關(guān)組織的細(xì)胞死亡。它還可以在柱頭或花柱的傳遞通道中表達(dá)，從而干擾花粉粘接、水合、花粉萌發(fā)和花粉管生長和導(dǎo)向的過程。所述破壞基因可源于多種天然存在的資源，例如，人類細(xì)胞、細(xì)菌細(xì)胞、酵母細(xì)胞、植物細(xì)胞、真菌細(xì)胞，或者可以是完全合成的基因，它可以包括一些DNA序列，其中的一些可以是天然存在的，另一些是正常情況下自然界中不存在的或二者的混合物。所述基因優(yōu)選對線粒體代謝有影響，正如所了解到的，良好的能量供應(yīng)對于可育花粉的產(chǎn)生是絕對必要的。不過，所述破壞基因可以有效針對其他基本生化功能，如DNA和RNA代謝、蛋白質(zhì)合成，以及其他代謝途徑。優(yōu)選的顯性破壞基因是芽孢桿菌RNA酶。
術(shù)語“恢復(fù)基因”是以顯性方式起作用的基因，當(dāng)該基因表達(dá)時(shí)可逆轉(zhuǎn)所述破壞基因的作用。優(yōu)選的顯性恢復(fù)基因是芽孢桿菌RNA酶抑制劑。
術(shù)語“雌花”意在包括雌性生殖器官的所有部分，包括，但不限于子房、卵細(xì)胞、雌蕊、花柱、柱頭、傳遞通道、胎盤。
術(shù)語“雄花”意在包括雄花的所有部分，包括，但不限于氈絨層、花藥、雄蕊、花粉。
本發(fā)明生產(chǎn)雜交種子的方法在很多方面不同于現(xiàn)有方法，并且具有多種優(yōu)于現(xiàn)有方法的優(yōu)點(diǎn)。雄性和雌性不育性的使用以前尚沒有披露過。這一特征避免了另一種親本的自花授粉，不需要父本和母本的分離的種植區(qū)就能生產(chǎn)雜交種子。這樣相間種植的父本和母本植物能使得作物異花授粉的機(jī)會最大，所述作物如小麥和稻，它們主要是自花授粉作物。在小麥和稻的例子中，其中，不進(jìn)行小區(qū)種植，該方法能夠生產(chǎn)雜交種子，而不必使用除草劑，以便在母本受精之后去除父本植物。只需要一種化學(xué)誘導(dǎo)的恢復(fù)系統(tǒng)來保持純化的母本品系，而不是用于雜交種子生產(chǎn)方法。這意味著，所述化合物僅使用在有限的土地面積上，并且僅僅是偶爾使用?？蓪⒍喾N破壞-恢復(fù)系統(tǒng)，或操縱子-抑制子系統(tǒng)用于本發(fā)明中。
含有能控制雄性和雌性育性的本發(fā)明表達(dá)框的植物還可分別用于與不含所述表達(dá)框的其他親本系一起生產(chǎn)F1雜種，如果在其所述系中使用其他合適方法控制雄性或雌性育性的話(如機(jī)械去除花藥或胚珠，或使用化學(xué)殺配子劑)。如果讓所述F1雜種的后代與所述其他雜交親本回交合適次數(shù)的世代，同時(shí)用分子、生化或后代測驗(yàn)技術(shù)篩選所述表達(dá)框的存在的話，可將所述用于控制雄性或雌性育性的系統(tǒng)轉(zhuǎn)移或漸滲到新的親本背景中。另外，與其他親本系的F1雜種可以自花授粉，視需要，通過使用一種外源化學(xué)誘導(dǎo)物恢復(fù)雄性或雌性育性，以便通過普通植物育種方法篩選含有所述表達(dá)框的新的雜交親本。使用所述漸滲和植物育種方法，使得本發(fā)明的雜交種子生產(chǎn)方法能用于多種新的和現(xiàn)有的F1雜交親本組合。
可通過施加外源化合物誘導(dǎo)的啟動(dòng)子在本領(lǐng)域中是公知的。合適的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子是通過施加一種諸如除草劑安全劑的化合物而激活的啟動(dòng)子。誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的例子包括披露于我們的國際專利申請?zhí)朩O93/21334中的Alc A/R開關(guān)系統(tǒng)，披露于國際專利申請?zhí)朩O90/08826和WO93/031294中的GST開關(guān)系統(tǒng)，或披露于國際專利申請?zhí)朩O96/37609中的蛻皮激素開關(guān)。所述啟動(dòng)子系統(tǒng)在本文中被稱為“開關(guān)啟動(dòng)子”。與所述開關(guān)啟動(dòng)子組合使用的所述開關(guān)化合物是農(nóng)業(yè)上可以接受的化合物，使得所述啟動(dòng)子特別適用于本發(fā)明的方法。
在本發(fā)明中使用Alc A啟動(dòng)子(它是Alc A/R開關(guān)系統(tǒng)的一個(gè)部分)的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是所使用的化學(xué)誘導(dǎo)物是乙醇。該化合物的優(yōu)點(diǎn)是，它作為灌根劑、含水噴霧劑或氣體使用。它能在1％的濃度下起作用，并且對操作者和環(huán)境無害。
本發(fā)明可用于育種者或種植者想要生產(chǎn)F1雜交種子的任何單子葉或雙子葉植物，并用于有合適的轉(zhuǎn)化技術(shù)可供利用的植物，特別是小麥和稻作物。本發(fā)明具有降低與F1雜交種子生產(chǎn)相關(guān)的管理成本、容易控制雜交種子的純度和保持親本系的優(yōu)點(diǎn)。
在具體應(yīng)用中，本發(fā)明涉及生產(chǎn)父本和母本植物，利用分子工程技術(shù)使得所述親本植物不育。通過化學(xué)處理可以逆轉(zhuǎn)所述植物的不育性，導(dǎo)致育性的恢復(fù)。
花藥是有花植物的雄性生殖過程的部位。它由若干類型的組織和細(xì)胞組成，并且決定含有精細(xì)胞的花粉粒的產(chǎn)生。氈絨層是特化的組織，它在花粉形成中起著關(guān)鍵作用。它在花粉發(fā)育的初期包圍花粉囊，在發(fā)育的晚期降解，并且在成熟花藥的組構(gòu)形式中不存在。氈絨層能產(chǎn)生多種化合物，這些化合物有助于花粉或者結(jié)合到花粉外壁中，并且業(yè)已證實(shí)很多天然雄性不育突變具有受損的氈絨層分化或功能。因此，氈絨層組織對于有功能的花粉粒的形成是重要的。
業(yè)已鑒定并克隆了在氈絨層組織中特異表達(dá)的多個(gè)基因。其中包括Osg6B，Osg4B(Tsuchiya等1994，Yokoi，S等1997)，pE1，pT72(WO9213957)，pCA55玉米(WO92/13956)，TA29，TA13(Seurinck等1990)，RST2玉米(WO9713401)，MS14，18，19和源于歐洲油菜(Brassica napus)的A6，A9(Hird等1993)。
業(yè)已證實(shí)，從稻中分離的氈絨層特異啟動(dòng)子在用于在煙草中啟動(dòng)β1，3-葡聚糖酶表達(dá)時(shí)能產(chǎn)生雄性不育植物(Tsuchiya等1995)。所述氈絨層特異啟動(dòng)子TA29業(yè)已被用于生產(chǎn)雄性不育煙草(Mariani等1990)，而pCA55，pE1和pT72在用于驅(qū)動(dòng)芽孢桿菌RNA酶表達(dá)時(shí)，能產(chǎn)生雄性不育小麥(De Block等1997)。
業(yè)已從包括玉米(Hanson等1989，Hamilton等1989)和番茄(Twell等1990，1991)在內(nèi)的多種物種中獲得了花粉特異性克隆。
除此之外，業(yè)已從源于歐洲油菜的Bp4A和C(Albani等1990)，源于矮牽牛、稻(Xu等1993，Zou等1994)的chs的多種類型中分離了其他特異克隆。
可以通過諸如簡并PCR的方法獲得上述克隆及其他克隆的小麥同系物，使用披露于所述文獻(xiàn)中的序列，然后篩選小麥和其他基因組文庫，并利用報(bào)導(dǎo)基因的表達(dá)分析組織特異性。所述方法在文獻(xiàn)中有大量報(bào)導(dǎo)。
在高等植物中，雌性生殖器官以雌蕊為代表，它包括子房、花柱和柱頭。業(yè)已證實(shí)所述雌器官含有高達(dá)10,000個(gè)不存在于其他器官中的不同mRNA(Kamalay和Goldberg1980)。其中包括決定控制雌蕊發(fā)育的調(diào)控基因以及編碼與雌蕊中分化的細(xì)胞類型相關(guān)的蛋白的“下游”基因。決定自交不親和性的基因及其同系物是具有雌蕊優(yōu)勢表達(dá)形式的一類基因(Nasrallah等1993)。其他克隆的基因包括在傳遞組織中表達(dá)的β葡聚糖酶(Ori等1990)，果膠裂合酶(Budlier等1990)和殼多糖酶(Lotan等1989)，和在花柱中表達(dá)的蛋白酶抑制劑(Atkinson等1993)。其他基因是與致病性相關(guān)的或參與糖苷鍵裂解的基因的同系物。所述酶可以通過降解有關(guān)組織中的蛋白促進(jìn)花粉管的生長，所述花粉管是通過所述組織生長的。
業(yè)已在擬南芥屬中鑒定了多種雌性不育突變。例如，sin1(短珠被)(Robinson-Beers等1992)和bel1(bell)(Robinson-Beers等1992)能影響胚珠發(fā)育。無珠被突變能在四分體階段抑制大孢子發(fā)生(Elliot，R.C.等1996，Klucher，K.M.1996)。在玉米上業(yè)已觀察到致死胚珠2突變，但尚未克隆(Nelson等1952)。業(yè)已從多種物種上克隆了以雌蕊特異型為基礎(chǔ)的內(nèi)切殼多糖酶(Sicker等1997，Czelzkalas等1993，Harikrishan等1996，Wemmer等1994)，并且業(yè)已證實(shí)伸展蛋白樣基因能在花煙草(Nicotiana alata)的花柱中表達(dá)(Chen C-G等1992)。
以下是胚珠特異型克隆ZmOV23，13(Greco R.等，未發(fā)表)，OsOsMAB3A(Kang H.G.等1995)，ZmZmM2(Theissen G.等1995)和柱頭特異型stig1(Goldman，M.H.等1994)，STG08，STG4B12(EP-412006-A)。Goldman等使用源于STIG1基因的啟動(dòng)子啟動(dòng)芽孢桿菌RNA酶在柱頭分泌區(qū)的表達(dá)。這會導(dǎo)致在雌蕊上出現(xiàn)沒有分泌區(qū)的花，因此是雌性不育的。花粉粒能夠萌發(fā)，但不能穿透其表面。
業(yè)已從蘭花上分離到7種胚珠特異型cDNA(Nadeau等1996)。同樣，可以用標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)獲得上述基因的小麥同系物及任何其他同系物。
本發(fā)明方法的另一方面是鑒定影響雄性和雌性不育性的基因。所述基因可用于多種系統(tǒng)中控制育性。
業(yè)已回顧了用轉(zhuǎn)座因子標(biāo)記玉米基因的方法(Doring，1989)?？梢允褂玫纳鲜龇椒ㄖ皇亲尵哂谢钚赞D(zhuǎn)座因子和所述靶基因的一個(gè)顯性等位基因的玉米品系與不具有轉(zhuǎn)座因子的普通玉米品系雜交?？梢宰屗鲭s交的后代自交并篩選最理想的突變，即能導(dǎo)致不育性的突變。所述不育植株代表了潛在情況，其中，一種轉(zhuǎn)座因子業(yè)已轉(zhuǎn)座到對育性很關(guān)鍵的基因的基因座上。然后可以用多種方法回收所述基因。US5,478,369披露了通過該方法分離被稱為MS45的基因。
業(yè)已用En/Spm-I/dSpm轉(zhuǎn)座子標(biāo)記系統(tǒng)在擬南芥(Arabidopsisthaliana)上鑒定到雄性育性基因，以便獲得雄性不育性2(MS2)突變型和MS2基因(Aarts等1993)。業(yè)已證實(shí)MS2基因參與雄配子發(fā)生，細(xì)胞壁合成在小孢子母細(xì)胞減數(shù)分裂之后不能繼續(xù)，并且小孢子最終分解。業(yè)已在歐洲油菜、玉米(Zea mays)上鑒定到MS2的同系物，以及存在于小麥線粒體DNA中的一個(gè)開放讀框。因此，對擬南芥屬育性重要的基因的分離可導(dǎo)致在其他種上同系物的克隆。該方法顯然可用于分離對育性重要的其他基因。
現(xiàn)在已經(jīng)有牧草物種之間在遺傳水平上存在廣泛的保守性共線性區(qū)的證據(jù)。Ahn和Tanksley(1993)證實(shí)了稻和玉米之間的關(guān)系，而Kurata等(1994)證實(shí)了小麥基因組可以與稻比較，而Moore等(1995)證實(shí)了所有三種圖譜都可以比較。由此開辟了利用比較基因組作圖作為基因分析方法的途徑。
基因克隆的微同線性方法是基于在進(jìn)化上相關(guān)的物種之間分子標(biāo)記和基因次序相似性的出現(xiàn)。該方法特別適用于農(nóng)業(yè)上重要的大基因組禾本科物種，如小麥、玉米和小麥，這些作物具有小的基因組的稻所沒有的優(yōu)點(diǎn)。Kilian等(1997)報(bào)導(dǎo)了用稻作為基因組間作圖載體，基于作圖的大麥RpgI和rpg4的基因的克隆進(jìn)展。
由于上述方法局限于遺傳學(xué)上業(yè)已作圖的靶基因，在水稻上利用玉米Ac/Ds系統(tǒng)開發(fā)了另一種基因分離方法，該方法是一種有效的轉(zhuǎn)座子標(biāo)記系統(tǒng)，Izawa等(1997)。
業(yè)已提出了多種可用于使育性所必需的基因失活或在有關(guān)組織中產(chǎn)生細(xì)胞毒性化合物以便阻止配子體正常發(fā)育的方法。
我們的國際專利申請?zhí)朠CT/GB96/01675披露了一種在利用選自zANT，微管蛋白，T-URS，ATP酶亞基，cdc25，ROA，MOT的破壞基因在目標(biāo)植物組織中抑制基因表達(dá)的方法。
存在若干其他已知的失活系統(tǒng)。例如，芽孢桿菌RNA酶(Mariani等1990)，白喉毒素A-鏈，果膠裂合酶。早先披露的表達(dá)細(xì)胞毒性化合物的兩個(gè)例子是親和素表達(dá)和IamH/IamS。
業(yè)已證實(shí)β-1，3-葡聚糖酶在氈絨層細(xì)胞中的表達(dá)能產(chǎn)生雄性不育植物(Worrall等1992)。業(yè)已提出反義是一種能夠下調(diào)對花粉發(fā)育重要的基因表達(dá)的機(jī)制，并且業(yè)已證實(shí)(Van der Meer1992)，類黃酮生物合成的反義抑制確實(shí)能導(dǎo)致雄性不育性。在玉米上業(yè)已證實(shí)黃酮醇表達(dá)的減弱可導(dǎo)致雄性不育(WO9318171先鋒Hi-Bred國際公司)。業(yè)已披露了其他機(jī)制(Spena等1992)。
Baulcombe(1997)披露了一種通過使用可復(fù)制的病毒RNA載體(AmpliconsTM)在轉(zhuǎn)基因植物中使基因沉默的方法，該方法還可用作內(nèi)源基因失效表達(dá)的手段。該方法的優(yōu)點(diǎn)是，它能產(chǎn)生一種顯性突變，即在雜合狀態(tài)下就可以觀察到，并能剔除靶基因的所有拷貝，還可剔除同種型。在作為六倍體的小麥上這是一個(gè)突出的優(yōu)點(diǎn)，然后通過利用誘導(dǎo)型啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)所述剔除基因的功能性拷貝的表達(dá)恢復(fù)育性。
Kempin等(1997)報(bào)導(dǎo)了利用同源重組定向破壞一種功能性基因。不過，該方法通常產(chǎn)生一種隱性突變，即只能在純合體中觀察到。為了在雜合狀態(tài)下能夠檢測到，它必須是能夠直接致死的，或者例如，導(dǎo)致一種途徑的抑制，以便導(dǎo)致致死性的細(xì)胞毒性化合物的積累。為了檢測一種不育性突變，必須通過自花授粉產(chǎn)生一種隱性純合體，其中，四個(gè)后代中的一個(gè)應(yīng)當(dāng)是不育的。使得所述剔除基因能夠表達(dá)的開關(guān)結(jié)構(gòu)必須導(dǎo)入一種通過所述純合體凝膠獲得的雜合體中。這是一種用于制備在下面的例1所述方法所必須的隱性突變體的潛在的有用方法。
核酶是能夠催化內(nèi)切溶核裂解反應(yīng)的RNA分子。它能以反式形式催化反應(yīng)，并能針對不同的序列，因此，可以作為反義的潛在替代方法調(diào)節(jié)基因表達(dá)(Hasselhof和Gerlach)。Wener等(1994)業(yè)已證實(shí)，通過在植物中表達(dá)核酶基因能產(chǎn)生反式顯性突變。
已有若干用于改變植物自交不親和系統(tǒng)的方法，該系統(tǒng)通過改變S-基因表達(dá)導(dǎo)入雄性不育性，其中，用一種結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化植物，該結(jié)構(gòu)采用一種配子體S-基因編碼一種核糖核酸酶，用這種方法將自交不親和的植物轉(zhuǎn)變成自交親和的植物，或者將自交親和的植物轉(zhuǎn)變成自交不親和的植物，從而避免自花授粉。
破壞基因/恢復(fù)基因的組合的例子包括芽孢桿菌RNA酶和芽孢桿菌RNA酶抑制劑，以及TPP和TPS。業(yè)已披露了首先利用芽孢桿菌RNA酶/芽孢桿菌RNA酶抑制劑系統(tǒng)產(chǎn)生不育性，然后恢復(fù)育性(Mariani等1992)。當(dāng)利用源于金魚草屬的氈絨層特異型啟動(dòng)子Tap1(Nacken等1991)在煙草氈絨層細(xì)胞中表達(dá)海藻糖磷酸磷酸酶(TPP)時(shí)，可導(dǎo)致雄性不育性。這被認(rèn)為是改變了表達(dá)這種物質(zhì)的組織中糖類代謝和光合能力所造成的。與野生型煙草回交可導(dǎo)致正常種子的形成。對其后代進(jìn)行的分析表明，不育性與所述轉(zhuǎn)基因發(fā)生分離。TreC，海藻糖-6-磷酸水解酶是第二種基因，其表達(dá)擾亂了海藻糖-6-磷酸的水平，并且業(yè)已證實(shí)，當(dāng)它利用組成型質(zhì)體藍(lán)素啟動(dòng)子表達(dá)時(shí)，其結(jié)果是花芽在開花之前脫落。因此，如果表達(dá)局限于氈絨層的話，雄性不育性可導(dǎo)致與TPP在氈絨層中表達(dá)時(shí)相同的結(jié)果。另外，業(yè)已證實(shí)，在使用GA之后花芽保留在植株上，并且會產(chǎn)生一些花粉，在某些場合下導(dǎo)致結(jié)實(shí)。
業(yè)已證實(shí)，海藻糖磷酸合酶(TPS)和TPP的同時(shí)、等摩爾表達(dá)對植物生理學(xué)沒有影響，即TPS抵消了TPP對表達(dá)這種物質(zhì)的組織中的糖類代謝和光合能力的影響。業(yè)已證實(shí)，通過用一種在氈絨層中表達(dá)TPS的結(jié)構(gòu)再次轉(zhuǎn)化不育的煙草品系可以恢復(fù)其育性。很顯然，TPS表達(dá)可以受一種誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的控制，使得在必要時(shí)可以恢復(fù)育性，或者將優(yōu)化的GA使用作為恢復(fù)育性的另一種方法。源于在環(huán)繞胚珠或位于胚珠內(nèi)的組織中特異表達(dá)的基因的啟動(dòng)子，如MADS框基因FBP7可用于啟動(dòng)TPP或TreC的表達(dá)，以便獲得雌性不育性。很可能，某些密碼子使用的優(yōu)化可能是在諸如小麥或玉米的單子葉作物中獲得相同效果所必須的(Merlo和Folkerts)，(種子和Haas)。
業(yè)已披露了可將多種操縱子/阻抑蛋白系統(tǒng)用作控制基因在植物中表達(dá)的手段。Wilde等證實(shí)，使用大腸桿菌lac系統(tǒng)可以抑制受玉米cab啟動(dòng)子控制的GUS表達(dá)(由35S CaMV啟動(dòng)子啟動(dòng)的lacI表達(dá))。將操縱子序列插入CAB啟動(dòng)子的各種位點(diǎn)上，并測定抑制的程度。根據(jù)所述操縱子序列的位置，觀察到多種抑制作用。當(dāng)所述操縱子序列是通過取代TATA框和轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)之間的部分整合的時(shí)，獲得大約90％的抑制作用。通過添加IPTG可以解除這種抑制作用。這種現(xiàn)象在煙草原生質(zhì)體和穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化體中都得到證實(shí)。
Lehming等報(bào)導(dǎo)，通過修飾lac阻抑蛋白的識別螺旋上的氨基酸，可以顯著改變其結(jié)合親和力，從而實(shí)現(xiàn)對表達(dá)更嚴(yán)格的控制。業(yè)已披露了其他諸如此類的系統(tǒng)，其中包括由Gatz等(1991，1992)研制的四環(huán)素誘導(dǎo)型啟動(dòng)子系統(tǒng)，其中，在高水平表達(dá)四環(huán)素阻抑蛋白的植物中，修飾過的35S CaMV啟動(dòng)子受到抑制，但當(dāng)加入四環(huán)素時(shí)得到恢復(fù)。
蛋白活性的類固醇誘導(dǎo)可以提供一種化學(xué)誘導(dǎo)型表達(dá)系統(tǒng)，該系統(tǒng)不存在化學(xué)毒性問題。哺乳動(dòng)物的配體結(jié)合域和昆蟲類固醇受體，如糖皮質(zhì)素受體(GR)，雌激素受體等可被用于在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中調(diào)節(jié)蛋白活性(Picard等1993)。配體結(jié)合域與一種蛋白融合，保持該蛋白處于失活狀態(tài)，直到引入配體。Lloyd等(1994)披露了一種玉米轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)物與GR的融合體。Simon等(1996)披露了一種GR與擬南芥屬開花時(shí)序基因產(chǎn)物的融合物，由它控制轉(zhuǎn)錄的誘導(dǎo)，而Aoyama等(1995)披露了一種Gal4或VP16與植物反式激活蛋白Athb-1的融合物，通過GR配體結(jié)合域受類固醇的控制。眾所周知，轉(zhuǎn)錄激活物結(jié)合DNA并同時(shí)激活轉(zhuǎn)錄的能力局限于所述轉(zhuǎn)錄因子的特定區(qū)域。業(yè)已證實(shí)(Ptashne1988，Mitchell和TIJAN1989)，轉(zhuǎn)錄激活物因子是由獨(dú)立起作用的組件構(gòu)成的。Ptashne和Gann(1980)以及其他人業(yè)已證實(shí)，可以將一個(gè)控制一種因子的轉(zhuǎn)錄激活的部分與另一個(gè)因子的DNA部分結(jié)合，并得到在酵母細(xì)胞中有活性的雜合蛋白?？蓪⒉捎昧松鲜霾糠值南到y(tǒng)用于解除抑制作用，并由此誘導(dǎo)基因以受控制的方式表達(dá)。另外，還披露了通過受體介導(dǎo)的反式激活用保幼激素或它的拮抗物之一作為化學(xué)受體控制基因在植物中表達(dá)的方法。
用于誘導(dǎo)表達(dá)所述恢復(fù)基因的開關(guān)系統(tǒng)優(yōu)選為AlcA/R開關(guān)系統(tǒng)。我們業(yè)已證實(shí)了GUS在番茄花藥和花粉中的誘導(dǎo)型表達(dá)，并且業(yè)已將類似結(jié)構(gòu)導(dǎo)入小麥，證實(shí)雄性和雌性組織利用AlcA/R開關(guān)系統(tǒng)表達(dá)GUS。我們業(yè)已利用安全劑誘導(dǎo)型GST開關(guān)系統(tǒng)證實(shí)了在玉米雄花、長須、胚和胚乳中誘導(dǎo)型GUS表達(dá)(Jepson等1994)。其他開關(guān)系統(tǒng)無疑也可用于本發(fā)明中。
在植物轉(zhuǎn)化期間細(xì)胞毒性或破壞基因的表達(dá)(這種表達(dá)是在雄花和雌花特異啟動(dòng)子的作用下以極低的水平在除目標(biāo)組織之外的組織中“滲漏”表達(dá)的結(jié)果)，可導(dǎo)致細(xì)胞死亡而不能回收到轉(zhuǎn)化體。在本發(fā)明中用于啟動(dòng)所述恢復(fù)基因表達(dá)的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子可以在一定程度上在隨后的季節(jié)避免以上可能性。
對GST-27啟動(dòng)子來說，業(yè)已在愈傷組織中觀察到組成型表達(dá)。對由乙醇誘導(dǎo)的AlcA啟動(dòng)子來說，業(yè)已在7ng/100ml空氣的濃度下觀察到能誘導(dǎo)GUS表達(dá)。可將乙醇濃度加入組織培養(yǎng)基中，以確保組織基因的表達(dá)。
破壞基因/恢復(fù)基因組合的例子包括芽孢桿菌RNA酶和芽孢桿菌RNA酶抑制劑，以及TPP和TPS。
在本發(fā)明中優(yōu)選使用翻譯增強(qiáng)序列，特別是TMVΩ序列(Gallie等)以便用組成型組織特異性和誘導(dǎo)型啟動(dòng)子提高表達(dá)水平，以便恢復(fù)基因的表達(dá)，例如，芽孢桿菌RNA抑制劑遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過抑制所述破壞基因，例如所產(chǎn)生的芽孢桿菌RNA酶的量。Gallie等證實(shí)，利用被稱為Ω的煙草花葉病毒U1菌株的5’前導(dǎo)序列的68個(gè)核苷酸的連續(xù)衍生物可大大加強(qiáng)原核和真核mRNA的翻譯。業(yè)已證實(shí)若干其他病毒前導(dǎo)序列也能增強(qiáng)表達(dá)，如苜?；ㄈ~病毒(A1MV)和金鵲花花葉病毒(BMV)。在煙草葉肉原生質(zhì)體中觀察到大約增強(qiáng)20倍。還可將諸如煙草蝕刻病毒的其他增強(qiáng)子序列用于本發(fā)明。
另外，有大量報(bào)導(dǎo)披露利用內(nèi)含子序列增強(qiáng)表達(dá)水平。上述研究包括玉米adh1內(nèi)含子1序列，業(yè)已證實(shí)，該序列在插入被導(dǎo)入玉米原生質(zhì)體的嵌合結(jié)構(gòu)上的5’翻譯序列之后可提高表達(dá)水平12-20倍(Mascarenhas等1990)，還包括同樣源于玉米的Sh1內(nèi)含子。將該內(nèi)含子加入由CaMV35S啟動(dòng)子啟動(dòng)CAT表達(dá)的結(jié)構(gòu)中，可導(dǎo)致表達(dá)增強(qiáng)11-90倍(Vasil等1989)。
還可以用以下方法平衡或調(diào)節(jié)所述恢復(fù)基因和破壞基因的表達(dá)水平?？蓪⒛苓M(jìn)行高水平表達(dá)的啟動(dòng)子用于啟動(dòng)恢復(fù)基因的表達(dá)，而將能進(jìn)行較低水平表達(dá)的啟動(dòng)子用于啟動(dòng)破壞基因的表達(dá)。這樣可以確保破壞基因的產(chǎn)物被恢復(fù)基因產(chǎn)物淹沒，從而使所有細(xì)胞毒性或破壞分子失活，以便完全恢復(fù)育性。調(diào)節(jié)表達(dá)水平的另一種方法可以通過誘變實(shí)現(xiàn)，通過誘變改變環(huán)繞AUG起始密碼子的序列，以便所述破壞基因的表達(dá)不是最佳(Kozak1989)，并因此得以下調(diào)。
可以通過任何現(xiàn)有方法將本發(fā)明的表達(dá)系統(tǒng)導(dǎo)入植物或植物細(xì)胞，如植物細(xì)胞和原生質(zhì)體的農(nóng)桿菌屬轉(zhuǎn)化，電穿孔，顯微注射，微粒轟擊，細(xì)菌轟擊，特別是“纖維”或“頸須”方法，所用方法取決于待轉(zhuǎn)化的具體植物物種。然后可以在合適條件下將轉(zhuǎn)化細(xì)胞再生成全植株，其中，所述新的核材料穩(wěn)定地整合到其基因組上。用這種方法可以獲得轉(zhuǎn)化的單子葉和雙子葉植物。有關(guān)所述已知方法的詳細(xì)內(nèi)容可以參考有關(guān)文獻(xiàn)。
Christou和Heie(1997)披露了利用轟擊方法轉(zhuǎn)化稻，和由根癌農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)介導(dǎo)的稻轉(zhuǎn)化的進(jìn)展。
用于轉(zhuǎn)化小麥的其他公開方法包括Becker等(1994)的方法，該方法披露了利用小盾片組織進(jìn)行微粒轟擊，還包括Vasil等(1993)的方法，該方法披露了在直接轟擊未成熟胚之后快速產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因小麥。圖22披露了通過轟擊進(jìn)行小麥轉(zhuǎn)化的等時(shí)線。
在篩選攜帶所述不育性結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)化方法中需要使用一種選擇標(biāo)記。所述標(biāo)記可以是一種抗生素選擇標(biāo)記或除草劑抗性基因。對于雜交種子生產(chǎn)方法來說除草劑抗性基因或其他標(biāo)記的使用不是必須的(但可視為更方便)。可以用化合物處理用于本發(fā)明第二種方法中的半純合植物，以便誘導(dǎo)所述恢復(fù)基因的表達(dá)，從而能夠進(jìn)行自花授粉。所述自花授粉的后代會發(fā)生分離，并可以長成植株，用化合物處理并自花授粉。來自純合品系的后代的不育性不會發(fā)生分離?？梢灾貜?fù)進(jìn)行以上過程，以便生產(chǎn)純合的不育種子。
可將本發(fā)明表達(dá)框的單個(gè)組分提供到一個(gè)或多個(gè)載體上?？梢杂盟鲚d體轉(zhuǎn)化或共轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞，以便使所述因子之間發(fā)生合適的相互作用。
下面將僅通過舉例方式對本發(fā)明進(jìn)行說明，其中，將結(jié)合附圖進(jìn)行說明，其中

圖1表示用純合的隱性雄性不育母本生產(chǎn)雜交種子的第一種方法中的表達(dá)框的示意圖。
圖2a和2b表示本發(fā)明的第一種方法用純合隱性雄性不育母本和雌性不育父本生產(chǎn)F1雜種，及其在F2代中的分離。
圖3表示用第二種雜種生產(chǎn)方法中的表達(dá)框的示意圖。
圖4表示用于利用雄花特異性啟動(dòng)子和雌性組織特異性啟動(dòng)子生產(chǎn)雄性不育雌性可育親本植物中的表達(dá)框的示意圖。
圖5表示用于利用雄花特異性啟動(dòng)子和雌花特異性啟動(dòng)子生產(chǎn)雌性不育父本植物的表達(dá)框的示意圖。
圖6a、6b和6c表示按照本發(fā)明第二種方法，利用雄性不育母本植物和雌性不育父本植物生產(chǎn)F1雜交植物的方法，這兩種植物都受孢子體啟動(dòng)子的控制，以及F1雜交種子的產(chǎn)生和F2代的分離。
圖7a、7b和7c表示按照本發(fā)明第二種方法，利用雄性不育母本植物和雌性不育父本植物生產(chǎn)F1雜交植物的方法，雄性不育性是受配子體啟動(dòng)子的控制，而雌性不育性是受一種孢子體啟動(dòng)子的控制，以及F1雜交種子的產(chǎn)生和F2代的分離。
圖8表示二元植物轉(zhuǎn)化載體pMOG1006。
圖9表示二元植物轉(zhuǎn)化載體pMOG1006-FSE。
圖10表示克隆載體pFSE4。
圖11表示通過Northern分析證實(shí)的GST在各種玉米組織中的表達(dá)。
圖12表示在煙草葉片中由GST啟動(dòng)子誘導(dǎo)的GUS報(bào)導(dǎo)基因的誘導(dǎo)型表達(dá)。
圖13表示在玉米葉片中由GST啟動(dòng)子誘導(dǎo)的GUS報(bào)導(dǎo)基因的誘導(dǎo)型表達(dá)。
圖14表示在玉米雄花中由GST啟動(dòng)子誘導(dǎo)的GUS報(bào)導(dǎo)基因的誘導(dǎo)型表達(dá)。
圖15表示GUS報(bào)導(dǎo)基因在玉米胚乳中的誘導(dǎo)型表達(dá)。
圖16表示pPUG和RMS-3克隆方法。
圖17表示pGSTTAK載體。
圖18表示RMS-3載體。
圖19表示一種用于雙子葉植物中的誘導(dǎo)型GUS表達(dá)載體pSRN.AGS的圖譜。
圖20表示一種用于雙子葉植物中的誘導(dǎo)型GUS表達(dá)載體pSRN.AGS的克隆方法。
圖21表示一種用于單子葉植物中的誘導(dǎo)型GUS表達(dá)載體pUIRN.AGS的圖譜。
圖22表示通過轟擊進(jìn)行的小麥轉(zhuǎn)化等時(shí)線。
圖23表示pSRN圖譜。
圖24表示pAGS圖譜。
圖25表示一種稻轉(zhuǎn)化載體pMOG1006-SRN.AGS的圖譜。
圖26表示pGUN的圖譜。
圖27表示pdvh405的圖譜。
圖28表示Tap1AlcR-AlcAGluGUSIntnos。
圖29表示Stig1AlcR-AlcAGluGUSIntnos。
圖30表示玉米轉(zhuǎn)化載體Zm/RMS14。
圖31表示一種稻轉(zhuǎn)化載體pMOG1006-C5-GUS。
圖32表示克隆載體pFSE。
圖33表示一種稻轉(zhuǎn)化載體pMOG1006-MFS14-GUS。
圖34表示框A，MFS14-芽孢桿菌RNA酶/芽孢桿菌RNA酶抑制劑-nos。
圖35表示框B，C5-芽孢桿菌RNA酶/芽孢桿菌RNA酶抑制劑-nos。
圖36表示框C，CaMV35S-AlcR-nos。
圖37表示框D，AlcA.Glu11-芽孢桿菌RNA酶抑制劑-nos。
圖38表示框E，MFS14.Glu11-芽孢桿菌RNA酶抑制劑-nos。
圖39表示框F，Stig1-芽孢桿菌RNA酶/芽孢桿菌RNA酶抑制劑-nos。
圖40表示框G，Stig1.Glu11-芽孢桿菌RNA酶抑制劑-nos。
圖41表示RMS30。
圖42表示RMS32。
圖43表示在未誘導(dǎo)過的和乙醇誘導(dǎo)過的野生型和轉(zhuǎn)基因Alc-GUS煙草愈傷組織中的表達(dá)。
圖44表示在未誘導(dǎo)過的和乙醇蒸汽誘導(dǎo)過的野生型和轉(zhuǎn)基因Alc-GUS煙草花藥中的表達(dá)。
圖45與上文所述相同，不過是通過用水和乙醇灌根誘導(dǎo)。
圖46表示GUS在源于9-10毫米煙草花芽的未誘導(dǎo)的和誘導(dǎo)過的雌蕊中的表達(dá)。
圖47表示GUS在源于17-22毫米煙草花芽的未誘導(dǎo)的和誘導(dǎo)過的雌蕊中的表達(dá)。
圖48表示GUS在源于33-35毫米煙草花芽的未誘導(dǎo)的和誘導(dǎo)過的雌蕊中的表達(dá)。
圖49表示GUS在未誘導(dǎo)的和誘導(dǎo)過的油菜花中的表達(dá)。
圖50表示未誘導(dǎo)的油菜花。
圖51表示GUS在灌根誘導(dǎo)2天之后在油菜雌蕊中的表達(dá)。
圖52-55表示GUS在乙醇誘導(dǎo)的油菜花的柱頭和花柱中的表達(dá)。
圖56表示野生型和水誘導(dǎo)的Alc-GUS油菜雌蕊。
圖57表示在用2％乙醇灌根2天之后Alc-GUS油菜雌蕊。
圖58表示水處理和50％乙醇處理的Alc-GUS雌蕊。
圖59表示誘導(dǎo)之后的油菜花。
圖60a表示在番茄花藥中由Alc A啟動(dòng)子啟動(dòng)的GUS表達(dá)，而60b表示在番茄花粉中由Alc A啟動(dòng)子啟動(dòng)的GUS表達(dá)。
圖61表示在玉米中編碼ZmC5啟動(dòng)子序列的DNA序列。
在下面劃線的A是推測的轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)，而加粗并在下面劃線的ATG是翻譯起點(diǎn)。例1在該實(shí)施例中，由于天然或工程突變的結(jié)果，父本植物是雄性可育的，并且是純合的雌性不育的。母本植物是純合隱性雄性不育的，并且雌性可育。所述雄性不育性可以進(jìn)行遺傳學(xué)操作或者通過雜交導(dǎo)入或者由于天然突變產(chǎn)生。例如，它可以是由于在諸如MS45的基因上的突變產(chǎn)生，業(yè)已證實(shí)該基因以隱性方式起作用，只能在純合時(shí)導(dǎo)致不育性。
所述親本系還含有編碼一種誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的DNA序列，所述啟動(dòng)子有效連接于所述不育性基因的功能性拷貝上，從而恢復(fù)其育性，以便分別保持所述母本和父本系(參見圖1)。
以上兩種親本植物雜交，產(chǎn)生F1雜種，該雜種在所述隱性雄性不育性和雌性不育性等位基因上是雜合的，因此是完全可育的。不過，如果農(nóng)民收獲并種植F1種子，F(xiàn)2代會發(fā)生不育性的分離，導(dǎo)致雜種優(yōu)勢和產(chǎn)量損失，因?yàn)橛写蠹s25％的母本植物是不育的(參見圖2a、2b和2c)。
盡管在玉米上雌性隱性突變是已知的，但有關(guān)基因尚未克隆。例2生產(chǎn)雜交種子的第二種方法是基于完全通過遺傳操作產(chǎn)生的不育性形成的(參見圖3)。母本母本是雄性不育系，即通過一種雄性孢子體啟動(dòng)子表達(dá)失活的基因，從而阻止有活力的功能性花粉的產(chǎn)生。另外，在其雌性組織中表達(dá)一種恢復(fù)基因。通過連接于一個(gè)恢復(fù)基因上的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子可以恢復(fù)自交可育性。用這樣一種表達(dá)框(參見圖4)進(jìn)行轉(zhuǎn)化可產(chǎn)生半純合的植物MSRFRCS......。
RCS＝可通過化學(xué)方法恢復(fù)的雄性和雌性育性MS＝顯性雄性不育性RM＝顯性雄性可育恢復(fù)基因FS＝顯性雌性不育性RF＝顯性雌性育性恢復(fù)基因?yàn)榱双@得用于雜種生產(chǎn)的純合植物，必須用一種外源化學(xué)誘導(dǎo)物誘導(dǎo)所述半純合植物，例如對Alc A/R基因開關(guān)來說，所述誘導(dǎo)物是乙醇，并進(jìn)行自花授粉。
由于不育性基因具有顯性效應(yīng)，3/4的植物產(chǎn)生100％的不育花粉，僅有無效品系是雄性可育的。通過種植自花授粉所得到的種子，重復(fù)所述誘導(dǎo)和自花授粉過程，可以區(qū)分純合植物和雜合植物。其后代的不育性會發(fā)生分離，并可以按照上文所披露的方法根據(jù)基因型方便地進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。還可將除草劑抗性或其他選擇標(biāo)記基因用于統(tǒng)計(jì)。對于純合植物來說，所有后代都是雄性不育的(并且是抗除草劑的)，對于雜合植物來說，其后代會連續(xù)發(fā)生不育性分離。
因此，可以用這種方法篩選純合雄性不育、純合雌性可育品系。父本父本植物是完全雄性可育的，但雌性不育，即具有純合的雌性不育，雄性可育。在這種情況下，雌性不育性是通過在雌花器官中表達(dá)一種抑制基因而產(chǎn)生的，如上文所述，所述抑制基因?qū)Υ苹ㄆ鞴侔l(fā)育有破壞作用。另外，花粉管可以受到破壞，或者植物以其他方式阻止形成種子。還在雄花組織中表達(dá)一種恢復(fù)基因。
所述父本植物是用與母本植物相同方法獲得的，所不同的是，使用圖5所示結(jié)構(gòu)。在這里，半純合的植物具有以下基因型FSRMRCS……而純合植物具有以下基因型FSFSRMRMRCSRCS例3
在該實(shí)施例中，有關(guān)表達(dá)框包括一種配子體(例如，花粉特異型啟動(dòng)子(參見圖5)。父本植物如上文例2中所述?；ǚ厶禺愋蛦?dòng)子的例子包括于1998年1月26日保存在國立工業(yè)和海洋微生物保藏有限公司的Zm13(Hanson等)和C5，其保藏號為NCIMB40915。C5啟動(dòng)子序列如圖61所示。同樣，必須獲得純合的雄性不育品系，并對半純合的植物進(jìn)行化學(xué)處理和進(jìn)行自花授粉。
在這里，所述純合品系，即MSMSRFRFRCSRCS能產(chǎn)生100％的不育花粉，這些花粉可以用DAPI染色鑒定。這些花粉可以與來自雜合植物的花粉加以區(qū)分，雜合植物能產(chǎn)生50％不育的和50％可育的花粉，這些花粉也是通過DAPI染色鑒定的。
因此，可以篩選MSMSRFRFRCSRCS品系。
因此，可以看出的是，雄性或雌性純合親本都不能自花授粉。
例2和3中的母本植物都攜帶一種表達(dá)框，該表達(dá)框包括一種啟動(dòng)恢復(fù)基因表達(dá)的雌性特異型啟動(dòng)子，而父本植物攜帶一種表達(dá)框，該表達(dá)框包括一種啟動(dòng)一種恢復(fù)基因表達(dá)的雄性特異型啟動(dòng)子。在所述親本植物中，由于所述啟動(dòng)子的特異性，所述表達(dá)框?qū)τ詻]有影響。
不過，當(dāng)讓以上兩種親本系雜交時(shí)，其結(jié)果是，根據(jù)是使用了配子體(例如花粉特異型)還是孢子體(例如氈絨層特異型)啟動(dòng)子而在所述母本中產(chǎn)生雄性不育性。在使用孢子體啟動(dòng)子時(shí)，可以獲得育性的完全恢復(fù)，并且F1種子是完全可育的，即產(chǎn)生大約100％的可育花粉(參見圖6a、6b)。不過，如果農(nóng)民保持并種植F1種子，其不育性會以上述方式分離(參見圖6c)。如果用配子體啟動(dòng)子獲得雄性不育性，不能實(shí)現(xiàn)育性的完全恢復(fù)，因?yàn)榛ǚ凼菃伪扼w，并且只有大約5％的花粉能遺傳產(chǎn)生花粉可育性功能性等位基因(參見圖7a，7b)。F2代按上述方式分離(圖7c)。
在必要時(shí)，通過所述系統(tǒng)的第三個(gè)部分實(shí)現(xiàn)純合不育品系的保持。因此，每一個(gè)親本系包括一種可任選連接于增強(qiáng)子序列或一個(gè)或幾個(gè)內(nèi)含子序列上的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，在使用所述誘導(dǎo)化合物時(shí)啟動(dòng)所述恢復(fù)基因在所有組織中的表達(dá)，從而在母本上產(chǎn)生花粉，并在父本上形成正常的胚珠和組織發(fā)育。然后可以進(jìn)行自花授粉，產(chǎn)生親本種子。
在所有實(shí)施例中，只有在生產(chǎn)親本系的種子時(shí)才有必要在大田中使用化合物，化合物的使用只需偶爾進(jìn)行，并且是在較小的土地面積上進(jìn)行。
在上述實(shí)施方案中，可以使用氈絨層特異型(圖6a，6b或6c)或花粉特異型啟動(dòng)子(圖7a，7b)啟動(dòng)所述失活基因的表達(dá)。優(yōu)選使用氈絨層特異型啟動(dòng)子，因此，育性可以完全恢復(fù)。由于花粉是單倍體，在使用花粉特異型啟動(dòng)子時(shí)，不可能完全恢復(fù)育性。不過，使用花粉特異型啟動(dòng)子是有利的。例如，花粉特異型啟動(dòng)子可能具有更高的組織專一性。只有在恢復(fù)育性以便進(jìn)行自花授粉時(shí)才有必要對所述植物進(jìn)行化學(xué)處理。例4制備通用克隆載體所有分子生物學(xué)技術(shù)是按照Maniatis等所述進(jìn)行(分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊，第2版(1989)冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社第1和2卷(D.N.Glover著1985))，或按照有關(guān)生產(chǎn)商的推薦進(jìn)行。制備pMOG1006-FsepMOG1006(圖8)是一種具有潮霉素抗性基因作為選擇標(biāo)記的二元載體，并且被用于農(nóng)桿菌屬介導(dǎo)的稻的轉(zhuǎn)化。所述修飾過的載體是通過用EcoRI消化pMOG1006并插入具有以下序列的退火的互補(bǔ)寡核苷酸對而制備的LinklA AATTGATCGGCCGGCCCTAG
LinklBAATTCTAGGGCCGGCCGATC以上序列可導(dǎo)入一個(gè)單一的FseI位點(diǎn)。通過與用γ32P標(biāo)記的LinklA寡核苷酸雜交選擇含有正確的寡核苷酸序列的克隆，并在通過測序鑒定之后選擇含有處于所需取向的所述序列的克隆(圖9)。
pVB6pVB6是上述二元載體的類似物，即它含有單一的FseI位點(diǎn)，但攜帶npt11選擇標(biāo)記，并且被用于農(nóng)桿菌屬介導(dǎo)的煙草轉(zhuǎn)化。制備pFse4(圖10)構(gòu)建該載體，以便組裝含有多種表達(dá)框的載體。這一目的是通過在多克隆位點(diǎn)區(qū)使用罕見的8堿基識別限制酶位點(diǎn)而實(shí)現(xiàn)的。用FseI消化pFSE(圖32)DNA，并除去現(xiàn)有的多克隆區(qū)。插入具有以下序列的互補(bǔ)寡核苷酸DAA-1A5’CCGTTTAAACATTTAAATGGCGCGCCAAGCTTGCGGCCGCCGGGAATTCGGCCGG-3’DAA-1S5’CCGAATTCCCGGCGGCCGCAAGCTTGGCGCGCCATTTAAATGTTTAAACGGCCGG-3’該序列導(dǎo)入單一的EcoRI、NotI、HindIII、AscI、SwaI和PmeI位點(diǎn)，其旁側(cè)為FseI位點(diǎn)。在pSK+上組裝表達(dá)框，并將接頭插入每一個(gè)具有下文所述單一位點(diǎn)的表達(dá)框旁側(cè)。然后根據(jù)需要將完整的表達(dá)框插入pFSE4。然后可按上文所述方法將多個(gè)表達(dá)框以FseI片段形式從pMOG1006-FseI和VB6載體上除去。例5源于煙草的STIG1啟動(dòng)子的PCR克隆利用Stratagene’s PfuTurbo DNA聚合酶和寡核苷酸ST1-L2(5’-ATTCGACCTCGCCCCCGAGCTGTATATG-3’)和ST1-R2(5’-GCTGAGAATGAGAAGGTTGATAAAAGCC-3’)由100ng煙草基因組DNA通過PCR擴(kuò)增1.6kb片段。熱循環(huán)條件如下
95℃3分鐘，然后進(jìn)行35個(gè)輪次的95℃1分鐘，50℃1分鐘，72℃4分鐘，隨后在72℃下最終保溫5分鐘。利用QIAGEN’s QIA快速凝膠提取試劑盒對1.6kb的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行凝膠純化，并連接到Invitrogen’s pCR-ZERO Blunt載體上。測定插入片段的DNA序列，并具有與公開的STIG1序列100％的相同性(Goldman等1994)。然后將存在于SacI-NotI片段上的所述插入片段轉(zhuǎn)入pBluescriptSK+，作進(jìn)一步的操作(pSK-STIG1)。例6制備植物轉(zhuǎn)化載體，測試由化學(xué)誘導(dǎo)型啟動(dòng)子進(jìn)行的表達(dá)GST-GUS以前業(yè)已報(bào)導(dǎo)了玉米GST27 cDNA的鑒定，并且實(shí)驗(yàn)業(yè)已證實(shí)GST27在長須、葉片、胚或胚乳中的表達(dá)不是組成型的。在使用安全劑之后，在上述所有組織中檢測到表達(dá)(參見圖11-15)?？梢园凑誙S5,589,614所披露的方法制備利用GST27啟動(dòng)子啟動(dòng)GUS表達(dá)的植物轉(zhuǎn)化結(jié)構(gòu)(圖16)。所述結(jié)構(gòu)是用于煙草轉(zhuǎn)化的pGSTTAK(圖17)和用于玉米轉(zhuǎn)化的RMS-3(圖18)。所述載體可用于產(chǎn)生穩(wěn)定的煙草和玉米轉(zhuǎn)化體。如上述專利文件所述，制備的安全劑可以作為葉片涂抹劑(煙草)或作為灌根劑(玉米)使用，并觀察GUS的表達(dá)。在圖12中示出了在煙草葉片中誘導(dǎo)GUS表達(dá)的結(jié)果；表達(dá)的明確誘導(dǎo)發(fā)生高達(dá)100X。類似地，對玉米來說，在安全劑處理之后在葉片中誘導(dǎo)了GUS表達(dá)。還在雄花和胚乳組織以及胚胎中觀察到表達(dá)的誘導(dǎo)。
另外，用RMS-3轉(zhuǎn)化小麥，并研究GUS表達(dá)的誘導(dǎo)?？蓪⒂贸泵顾刈鳛檫x擇標(biāo)記的改性載體導(dǎo)入稻。GST-芽孢桿菌RNA酶抑制劑玉米轉(zhuǎn)化載體Zm/RMS14(如上文所述)具有與所述安全劑誘導(dǎo)GST27啟動(dòng)子融合的芽孢桿菌RNA酶抑制劑基因。通過PCR證實(shí)WU25含有該基因融合體。通過用R-29148對溫室生長的植物進(jìn)行灌根證實(shí)了不育性的逆轉(zhuǎn)。相對未處理過的植物而言，處理過的植物表現(xiàn)出增大了的雄花體積。所述安全劑對非轉(zhuǎn)基因可育植物的雄花的大小或育性沒有影響。與雄花大小增加相關(guān)的是，在取自溫室中的灌根樣品的花藥樣品中觀察到小孢子發(fā)育。在對大田生長的植物進(jìn)行葉面噴施之后觀察到類似效果，但在所有實(shí)驗(yàn)中在未處理過的植物上都沒有觀察到該效果。小孢子發(fā)育的恢復(fù)似乎與芽孢桿菌RNA酶抑制劑對芽孢桿菌RNA酶的抑制相關(guān)，通過所述抑制作用克服了氈絨層細(xì)胞的剝離。在用安全劑長時(shí)間處理的植物上，小孢子發(fā)生得以進(jìn)行，產(chǎn)生充滿了未成熟的有絲分裂后期花粉的花藥。相反，來自不育植物的花藥是癟的。
pSRNAGS按照在圖20中所述方法構(gòu)建二元植物轉(zhuǎn)化載體pSRNAGS(圖19)。該載體包括啟動(dòng)GUS表達(dá)的嵌合35S-AlcA啟動(dòng)子，和啟動(dòng)AlcR基因表達(dá)的35S CaMV啟動(dòng)子。
pUIRN.VGS制備用于轉(zhuǎn)化玉米和小麥的以pUC為基礎(chǔ)的載體，其中，用連接于遍在蛋白內(nèi)含子上的遍在蛋白啟動(dòng)子啟動(dòng)AlcR基因的表達(dá)(圖21)。在圖22中示出了用于獲得轉(zhuǎn)基因小麥的等時(shí)線。pMOG1006-SRNAGS(稻)用EcoRI和HindIII消化質(zhì)粒pSRN(圖23)，以便釋放出2.6kb的片段(AlcR-nos)，將該片段作為EcoRI-HindI片段克隆到pMOG1006中。然后將560bp的CaMV35S啟動(dòng)子片段克隆到EcoRI位點(diǎn)上，以便產(chǎn)生35S-AlcR-nos，通過序列分析篩選處于所需取向的克隆(pSRN)。用HindIII消化質(zhì)粒pAGS(圖24)，并將一個(gè)2.5kb的片段(AlcA-GUS-nos)克隆到pMOG1006-SRN的EcoRI和HindIII位點(diǎn)上，以便產(chǎn)生最終結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)被稱為PMOG1006-SRN-AGS(圖25)。通過限制和序列分析確定所述HindIII片段的方向。
為了優(yōu)化AlcR在氈絨層、雌蕊、花粉和其他生殖組織中的表達(dá)水平，制備以下載體，利用組織特異型啟動(dòng)子啟動(dòng)AlcR表達(dá)。AlcA-Glu11-GUSint-nos按常規(guī)方法，用QUIckChange試劑盒將位于pGUN(圖26)上的GUS基因末端的SacI位點(diǎn)改變成PstI位點(diǎn)，然后將含有GUS基因(+內(nèi)含子)的NcoI-SacI消化物用于取代框D上的芽孢桿菌RNA酶抑制劑基因(參見下文)，以便產(chǎn)生含有AlcA啟動(dòng)子-葡聚糖酶增強(qiáng)子-GUS-nos的載體。將該載體作為PmeI片段切除，并克隆到pFSE4上。Tapl-AlcR-nos-AlcA-Glu11-GUSint-nos將AlcA-Glu11-GUSint-nos(Glu11是葡聚糖酶5’非翻譯區(qū))作為PmeI片段克隆到PmeI裂解過的pFSE4上。
將最初從金魚草屬中分離的現(xiàn)在由pvdh405(圖27)克隆的氈絨層特異Tap1啟動(dòng)子作為EcoRI片段克隆到pSK-AlcR-nos(通過將來自pSRN的EcoRI-HindIII克隆到pSK+上產(chǎn)生)，并將所得到的Tap1-AlcR-nos作為NotI片段克隆到pFSE4-AlcA-Glu11-GUSint-nos上。將所得到的FseI插入片段插入pVB6上，產(chǎn)生最終的煙草轉(zhuǎn)化載體(圖28)。Stig1-AlcR-nos-AlcA-Glu11-GUSint-nos該結(jié)構(gòu)是按上述方法制備的，所不同的是將由煙草克隆的雌蕊傳遞通道特異Stig1啟動(dòng)子(參見下文)作為EcoRI-EcoI片段克隆到pSK-AlcR-nos上，進(jìn)行上文所述的其他操作(圖29)。例7構(gòu)建載體，以便評價(jià)雄性啟動(dòng)子的組織專一性pMS14-GUS將源于MS14(Wright等1993)的5.8kb啟動(dòng)子片段融合到GUS報(bào)導(dǎo)基因上。僅僅在花芽發(fā)育的早期階段在花藥中檢測到GUS的表達(dá)，但在葉片中未檢測到其表達(dá)。pMS14-芽孢桿菌RNA酶將相同的啟動(dòng)子片段融合在芽孢桿菌RNA酶上，以便產(chǎn)生玉米轉(zhuǎn)化載體ZM/RMS14(圖30)。該融合體還含有一個(gè)框外芽孢桿菌RNA酶抑制劑基因和一個(gè)功能性細(xì)菌啟動(dòng)子，以便在克隆步驟中提供對芽孢桿菌RNA酶的保護(hù)。獲得轉(zhuǎn)基因玉米植物，并且進(jìn)行若干進(jìn)一步分析。通過分析由源于與完全可育的植物的花粉雜交產(chǎn)生的后代對植物WU25的某些細(xì)節(jié)進(jìn)行研究。通過PCR證實(shí)所有后代都遺傳了所述轉(zhuǎn)基因，并通過葉片涂抹檢測pat基因是完全不育的，而缺乏所述轉(zhuǎn)基因的后代是完全可育的。不育的雄花一般小于可育姊妹株的雄花，并攜帶缺乏花粉的花藥，并且不能從雄花上分離。在其他所有方面不育植株與其可育的非轉(zhuǎn)基因姊妹株沒有差別。pC5-GUS業(yè)已分離了源于玉米的果膠甲基酯酶基因組克隆(如圖61所示，被稱為C5)，并將所述啟動(dòng)子用于和GUS組成的轉(zhuǎn)錄融合體中，以便研究組織特異性。通過農(nóng)桿菌屬介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化將所述載體導(dǎo)入煙草，并在卡那霉素上選擇轉(zhuǎn)化體。收獲來自開裂花藥的花粉粒，并染色分析GUS活性。有兩個(gè)植株表現(xiàn)出大約50％的蘭色染色花粉。在非轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩形闯霈F(xiàn)染色。用包括各種發(fā)育階段的花藥在內(nèi)的多種組織制備提取物，并通過熒光測定分析GUS表達(dá)。在除了發(fā)育中的和開裂花藥以外的組織中僅觀察到極低水平的表達(dá)。小孢子染色表明，表達(dá)的時(shí)間與Northern數(shù)據(jù)十分吻合，Northern分析表明ZmC5啟動(dòng)子在其天然環(huán)境中在轉(zhuǎn)基因煙草和玉米中在花粉發(fā)育的后期起作用。pMOG1006-C5-GUS(稻)用EcoRI和BamHI裂解C5-GUS(Bin)，以便產(chǎn)生2.1kbBamHI-EcoRI片段(GUS-nos)，將該片段克隆到EcoRI-BamHI裂解的pMOG1006上，然后將1.9kb的BamHI片段(C5啟動(dòng)子)克隆到該pMOG1006-GUS-nos上，以便產(chǎn)生最終載體pMOG1006-C5-GUS，通過測序證實(shí)該啟動(dòng)子的取向(圖31)。pMOG1006-MFS14-GUS(稻)利用BamHI從RMS30(圖41)上分離2.3kb的MFS14啟動(dòng)子，并克隆到pFSE上(圖32)。然后將來自pGUN的GUS內(nèi)含子框作為PstI片段克隆到pFSE-MFS14載體上。然后將完整的MFS14-GUSint-nos片段作為FseI片段克隆到pMOG1006-Fse(圖33)上。例8制備產(chǎn)生不育性并恢復(fù)可育性的載體制備框A-MFS14-芽孢桿菌RNA酶nos-一種顯性孢子體雄性不育框以EcoRI-HindIII片段形式從RMS14中分離nos終止子，并克隆到用相同的兩種酶裂解過的pSK+上。用HindIII消化所得到的質(zhì)粒，并將具有以下序列的退火的互補(bǔ)寡核苷酸對Link2A AGCTTCTGGAATTCGTCT
Link2B AGCTAGACGAATTCCAGA即編碼與所述裂解載體連接的ΔHindIII-EcoRI-HindIII。將推測的轉(zhuǎn)化克隆劃線到尼龍膜上，并按常規(guī)方法用由γ32P標(biāo)記的Link2A寡核苷酸探測。通過測序分析多個(gè)陽性克隆，并選擇其取向?yàn)槠渲械腍indIII位點(diǎn)相對兩個(gè)EcoRI位點(diǎn)來說處于其內(nèi)部的克隆作進(jìn)一步操作。將從RMS14上分離的并攜帶MFS14啟動(dòng)子和芽孢桿菌RNA酶和芽孢桿菌RNA酶抑制劑編碼序列的HindIII連接到用HindIII裂解過，并用河蝦堿性磷酸酶處理過以防其再連接的上述載體上。通過序列分析鑒定含有處于所需取向的HindIII片段的轉(zhuǎn)化體(圖34)。以EcoRI片段形式將攜帶MFS14-芽孢桿菌RNA酶/芽孢桿菌RNA酶抑制劑-nos的完整片段插入pVB6和pMOG1006-Fse上，通過pFse4導(dǎo)入稻和煙草。制備框B-C5-芽孢桿菌RNA酶-一種顯性配子體雄性不育框通過將一種寡核苷酸接頭MKLINK4(5’TCGATTCGGCGGCCGCCGAA-3’)插入消化過的SalI位點(diǎn)，用NotI識別位點(diǎn)取代pBluescriptSK+(Stratagene)的單一的SalI位點(diǎn)。將攜帶芽孢桿菌RNA酶編碼區(qū)及其隨后的細(xì)菌啟動(dòng)子啟動(dòng)的芽孢桿菌RNA酶抑制劑編碼區(qū)的0.9kb的BamHI-HindIII片段插入修飾過的pBluescript的相應(yīng)片段上。將位于HindIII-NotI片段上的nos終止子插入所得到的載體的相應(yīng)片段上。然后用Stratagene的Quiak Change系統(tǒng)，按照生產(chǎn)商的說明使用寡核苷酸DAM-3A(5’-GGTCGACTCTAGAGGAACCCCGGGTACCAAC-3’)和DAM-3B(5’-GCTTTACCCGGGGTTCCTCTAGAGTCGACC-3’)除去不希望的BamHI位點(diǎn)。用BamHI完全消化得到的質(zhì)粒(被命名為pSK-BBN)，用河蝦堿性磷酸酶去磷酸化(37℃，1小時(shí))。將C5 5’旁側(cè)區(qū)的1.9kb的BamHI片段連接到它上面，然后用BamHI和PstI消化分別檢查所述插入片段的存在和方向。所得到的質(zhì)粒被命名為pSK-C5-BBN(圖35)。然后將整個(gè)框以EcoRI-NotI片段形式除去，連接到二元植物轉(zhuǎn)化載體pVB6上。然后通過凍融法將該結(jié)構(gòu)導(dǎo)入根癌農(nóng)桿菌中。用標(biāo)準(zhǔn)方法將所述DNA導(dǎo)入煙草。制備框C-35S-AlcR-nos
從被稱為pUC3的載體上分離EcoRI-HindIII片段，該片段含有AlcR編碼序列和nos終止子。將該片段克隆到EcoRI-HindIII裂解過的pSK+上。將具有ΔHindIII-NotI-PmeI-ΔHindIII的限制位點(diǎn)的具有以下序列的退火的互補(bǔ)寡核苷酸對插入所述HindIII位點(diǎn)，從而在該表達(dá)框的3’末端增加PmeI和NotI位點(diǎn)，并去掉HindIII位點(diǎn)Link5AAGC TAT TAG CGG CCG CTA TGT TTA AAC GCG TLink5BAGC TAC GCG TTT AAA CAT AGC GGC CGC TAA T將源于pUC3的攜帶35S CaMV啟動(dòng)子的EcoRI片段克隆到EcoRI位點(diǎn)上，并通過限制和序列分析定向(圖36)。可以NotI片段形式將整個(gè)框切除，作進(jìn)一步操作，它含有PmeI位點(diǎn)，可將AlcA-Glu11-芽孢桿菌RNA酶抑制劑-nos框插入該位點(diǎn)。制備框D-AlcA-Glu11-芽孢桿菌RNA酶抑制劑-nos用XhoI和NcoI消化載體pMJB1，并除去TMVΩ增強(qiáng)子。按常規(guī)方法將編碼葡聚糖115’UTR并且其旁側(cè)為XhoI和NcoI位點(diǎn)的兩種寡核苷酸退火，并連接到所述裂解過的載體上Glu1 TCG AGA CAA TTT CAG CTC AAG TGT TTC TTA CTC TCT CAT TTCCAT TTT AGCGlu11 CAT GGC TAA AAT GGT TTT GAG AGA GTA AGA AAC ACT TGA GCTGAA ATT GTC用HindIII和XhoI消化所述測序載體，以便除去35SCaMV啟動(dòng)子，并將AlcA啟動(dòng)子連接到HindIII-XhoI片段上。通過PCR由RMS9獲得具有NcoI和BamHI末端的編碼芽孢桿菌RNA酶抑制劑的片段。然后將該片段插入上述用NcoI-BamHI裂解過的載體，得到具有AlcA-Glu11-芽孢桿菌RNA酶抑制劑-nos的完整的框。為了便于對該框進(jìn)行操作，通過使用編碼ΔHindIII-PmeI-HindIII和ΔEcoRI-PmeI-ΔEcoRI的寡核苷酸在所述框的每一個(gè)末端添加一個(gè)PmeI位點(diǎn)(圖37)。這使得該框能插入上述35S-AlcR-nos框上，使得AlcA/R開關(guān)的兩個(gè)部分能作為NotI片段形式轉(zhuǎn)移到pFSE4上。制備框EMFS14-Glu11-芽孢桿菌RNA酶抑制劑-nos-一種雄性育性恢復(fù)框?qū)y帶MFS14啟動(dòng)子3’末端320bp的BamHI-SacI片段克隆到BamHI-SacI裂解過的pSK+上。用購自Qiagen的試劑盒按照標(biāo)準(zhǔn)方法除去HindIII位點(diǎn)。用于除去所述位點(diǎn)的寡核苷酸具有以下序列MKM1A CGG TAT CGA TAA GCT AGA TAT CGA ATT CCT GMKM1S CAG GAA TTC GAT ATC TAG CTT ATC GAT ACC G通過限制分析和測序證實(shí)所述位點(diǎn)的缺失。然后通過插入編碼ΔSacI-HindIII-SacI位點(diǎn)的退火寡核苷酸，將新的HindIII位點(diǎn)導(dǎo)入SacI位點(diǎn)附近。
SHSLINK1 CCT AAA GCT TAT ACA GCTSHSLINK1 GTA TAA GCT TTA TGA GCT通過限制分析證實(shí)所述新位點(diǎn)的存在，并通過測序證實(shí)所述接頭的正確取向。理想的取向使得所述HindIII位點(diǎn)相對BamHI位點(diǎn)而言位于SacI位點(diǎn)外面。然后用相同方法使用編碼ΔBamHI-XhoI-ΔBamHI的寡核苷酸除去BamHI位點(diǎn)，并導(dǎo)入一個(gè)新的XhoI位點(diǎn)。它具有以下序列Link6 GAT CGT ATC TCG AGA TAC按常規(guī)方法證實(shí)BamHI位點(diǎn)的缺乏和XhoI位點(diǎn)的導(dǎo)入。
用BamHI和SacI消化RMS14，并分析編碼MFS14啟動(dòng)子的其余部分的5.5kb的片段。然后將該片段插入上述用BamHI-SacI裂解過的載體上，并通過測序證實(shí)該啟動(dòng)子的完整性。然后以HindIII-XhoI框的形式將整個(gè)MFS14啟動(dòng)子切除，并插入框D，并在將接頭添加到其末端之前取代AlcA啟動(dòng)子，對該框來說，使用在每一個(gè)末端導(dǎo)入SwaI位點(diǎn)的接頭(圖38)。制備框F Stig1-芽孢桿菌RNA酶-nos-一種雌性孢子體不育框?qū)⒁粋€(gè)BamHI位點(diǎn)導(dǎo)入靠近載體pSK-STIG1上的STIG1啟動(dòng)子的翻譯起始位點(diǎn)處。這一目的是使用Stratagene的Quick Change試劑盒用以下寡核苷酸實(shí)現(xiàn)的ST1-BA(5’-GATAAAAGCCATAATTGGATCCTGGTGGTTTCTGC-3’)和ST1-BS(5’-GCAGAAACCACCAGGATCCAATTATGGCTTTTATC-3’).
然后以BamHI片段形式將1.6kb的STIG1啟動(dòng)子切除，并克隆到BamHI消化過的pSK-BBN上。通過在載體和啟動(dòng)子序列之間的PCR擴(kuò)增測定所述啟動(dòng)子的存在和正確方向。以NotI-EcoRI形式將STIG1-BBN框轉(zhuǎn)移到載體pFse4上，所得到的質(zhì)粒被稱為pFSE4-STIG1-BBN(圖39)上。然后將完整的框作為FseI片段轉(zhuǎn)入VB6上。制備框G Stig1-Glu11-芽孢桿菌RNA酶抑制劑-nos-一種雌性育性恢復(fù)框?qū)Y(jié)構(gòu)pAlcA-Glu11-芽孢桿菌RNA酶抑制劑-nos-pp進(jìn)行修飾，用EcoRI位點(diǎn)取代HindIII位點(diǎn)。這一目的是用Stratagene的Quick Change試劑盒和以下寡核苷酸實(shí)現(xiàn)的DAM-6A(5’-CGGAACTATCCCGAATTCTGCACCGTTTAAACGC-3’)和DAM-6S(5’-GCGTTTAAACGGTGCAGAATTCGGGATAGTTCCG-3’).
將XhoI位點(diǎn)導(dǎo)入載體pSK-STIG1上靠近STIG1啟動(dòng)子的翻譯起始位點(diǎn)。這一目的是用Stratagene的Quick Change試劑盒和以下寡核苷酸實(shí)現(xiàn)的ST1-XA(5’-GATAAAAGCCATAATTGGCTCGAGGTGGTTTCTGCTGAG-3’)ST1-XS(5’-CTCAGCAGAAACCACCTCGAGCCAATTATGGCTTTTATC-3’).
然后以XhoI-EcoRI片段形式將1.6kb的STIG1啟動(dòng)子切除，并克隆到通過用XhoI和EcoRI消化pAlcA-gluII-芽孢桿菌RNA酶抑制劑-nos-pp產(chǎn)生的較大的片段，用STIG1啟動(dòng)子取代AlcA啟動(dòng)子(圖40)。以PmeI片段形式將所述完整的框切除，并克隆到pVB6和pMOGl006-Fse上。制備可以開關(guān)的TPS載體-AlcA-TPS-nosTap1-AlocR-nos業(yè)已披露了Tap1-AlcR-nos框。用TPS取代pAGS上的GUS基因，并將新的框作為HindIII框克隆到pFSE4上。將上文所披露的Tap1-AlcR-nos作為NotI片段克隆到pFSE4-AlcA-TPS-nos載體上。切除完整的Fse1片段，并克隆到pVB6上?，F(xiàn)在將該載體用于重新轉(zhuǎn)化煙草，通過用具有Tap1-TPP-nos表達(dá)框的結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化使其不育。例9制備植物轉(zhuǎn)化載體可以在pFSE4上對上述框進(jìn)行任意組合，然后將所得到Fse1片段轉(zhuǎn)入pMOG1006-Fse或pVB6上，以便轉(zhuǎn)化到煙草或稻中。
業(yè)已進(jìn)行了以下組合，作為植物轉(zhuǎn)化載體A+C+D＝孢子體雄性不育植物，其育性可以通過對恢復(fù)基因進(jìn)行化學(xué)誘導(dǎo)恢復(fù)E＝孢子體雄性可育恢復(fù)植物，當(dāng)它授粉到上述植物上時(shí)，在其后代中恢復(fù)育性F+C+D＝孢子體雌性不育植物，其育性可以通過對恢復(fù)基因進(jìn)行化學(xué)誘導(dǎo)恢復(fù)G＝孢子體雌性可育恢復(fù)植物，當(dāng)它由上述植物授粉時(shí)產(chǎn)生雌性可育后代B+D＝配子體雄性不育植物，其育性可以通過對恢復(fù)基因進(jìn)行化學(xué)誘導(dǎo)恢復(fù)本文所披露的F1雜交植物的親本的產(chǎn)生是通過以下方式實(shí)現(xiàn)的父本，即雌性不育框F Stig1-芽孢桿菌 雌性不育性RNA酶框E MFS14-Glu11-芽孢 雄性恢復(fù)基因桿菌RNA酶抑制劑框C 35S-AlcA-nos 開關(guān)部分框DAlcA-Glu11-芽 孢 “”桿菌RNA酶抑制劑母本，即雄性不育框AMFS14-芽孢桿菌 雄性不育性RNA酶框GStig1-Glull-芽孢 雌性恢復(fù)基因桿菌RNA酶抑制劑框C35S-AlcA-nos 開關(guān)部分框DAlcA-Glu11-芽孢 “”桿菌RNA酶抑制劑例10構(gòu)建載體，測定新的豬基因RMS30和RMS32(煙草)將來自ptubulin的Hinf1片段形式的微管蛋白基因克隆到上面制備的pFSE-MFS14上。將所得到MFS14-微管蛋白-nos作為FSE片段克隆到pVB6上，產(chǎn)生RMS30(圖41)。
以BamHI片段形式將MFS14+lac操縱子啟動(dòng)子從RMS32上切除，并克隆到pFSE上。在插入所述微管蛋白基因之后，將MFS14-lac-op-微管蛋白-nos FseI片段克隆到pVB6上，產(chǎn)生RMS32(圖42)。RMS30和RMS32(稻)將含有MFS14啟動(dòng)子(+/-lac op)-微管蛋白-nos的FseI片段克隆到pMOG1006-Fse上，產(chǎn)生植物轉(zhuǎn)化載體。優(yōu)化海藻糖-磷酸磷酸酶(TPP)和海藻糖-6-磷酸水解酶(TreC)，以便用于在玉米上產(chǎn)生不育性用于在玉米中表達(dá)的TPP和TreC編碼區(qū)的優(yōu)化形式(在每一個(gè)密碼子的豐余位點(diǎn)具有對G或C的偏嗜)是由Operon技術(shù)公司合成的。核苷酸序列是由其氨基酸序列推導(dǎo)的，使用在活體中以高于1.0％的比例存在、并且以能代表天然發(fā)生比例的頻率出現(xiàn)的密碼子(按照Genbenk密碼子使用數(shù)據(jù)庫，Release108)。還包括靠近翻譯起始位點(diǎn)的有用的限制酶位點(diǎn)，包括BamHI和NcoI，以及位于3’末端的PstI位點(diǎn)，以便于克隆。測定優(yōu)化的TPP和TreC玉米密碼子使用的結(jié)構(gòu)使用Stratagene的Quick Change系統(tǒng)用以下核苷酸除去位于載體pFSE-MFS14上的MFS14啟動(dòng)子的5’末端的BamHI位點(diǎn)DAM-7A 5’-CGATGCTTTCGGAACCGGTACCGAATTCG-3’DAM-7S 5’-CGAATTCGGTACCGGTTCCGAAAGCATCG-3’然后以BamHI和PstI片段形式將合成的TPP和PreC基因切除，并克隆到修飾過的pFSE-MFS14載體的MFS14啟動(dòng)子和nos終止子之間。將adh1內(nèi)含子插入所述啟動(dòng)子和編碼序列之間，以便提高表達(dá)水平。然后將完成的框轉(zhuǎn)入以pUC為基礎(chǔ)的克隆載體上，該載體含有IGPD細(xì)菌選擇標(biāo)記和除草劑抗性基因框，以便選擇轉(zhuǎn)基因植物。例11生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因植物業(yè)已通過農(nóng)桿菌屬介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化將pSRN.AGS導(dǎo)入煙草、油菜和番茄(這些植物被稱為Alc-GUS植物)，將pMOG1006-Fse-SRNAGS和pMOG1006-C5-GUS導(dǎo)入稻。
業(yè)已通過農(nóng)桿菌屬介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化將含有上述任一種表達(dá)框組合的植物轉(zhuǎn)化載體導(dǎo)入煙草和/或稻。通過PCR分析外殖體，將含有完整插入片段的外殖體無性繁殖，并轉(zhuǎn)移到溫室中生長到開花。另外，業(yè)已將RMS30和32導(dǎo)入煙草。
業(yè)已通過微粒轟擊方法將pUIRN.AGS導(dǎo)入小麥和玉米，通過與攜帶一種選擇標(biāo)記的質(zhì)粒同時(shí)進(jìn)行轟擊回收轉(zhuǎn)基因植物。通過微粒轟擊將用于測定各種部分的其他載體轉(zhuǎn)入玉米。例12分析轉(zhuǎn)基因植物對由AlcA啟動(dòng)子啟動(dòng)的GUS表達(dá)的研究在組織培養(yǎng)物中為了確定在用含有諸如芽孢桿菌RNA酶的細(xì)胞毒性基因連接的啟動(dòng)子的結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化之后植物是否能夠恢復(fù)，特別是所述啟動(dòng)子在轉(zhuǎn)化過程的愈傷組織階段具有某些表達(dá)的情況下，研究了在煙草愈傷組織中的表達(dá)，以便確定GST27啟動(dòng)子的表達(dá)是否是組成型的，或者是否可以通過使用乙醇誘導(dǎo)。
將在標(biāo)準(zhǔn)組織培養(yǎng)條件下生長的4周齡Alc-GUS(35S-AlcR-nos/AlcA-GUS-nos)煙草植物，用于測定AlcA啟動(dòng)子在愈傷組織中使用和不使用乙醇的條件下的表達(dá)。產(chǎn)生葉片，并放置到添加了3％(w/v)蔗糖和0.8％(w/v)細(xì)菌用瓊脂、1微克/毫升6-BAP和100ng/ml NAA激素的MS培養(yǎng)基上。將其中的某些葉片放置到含有0.1％(v/v)乙醇的同一種培養(yǎng)基上。3周之后，當(dāng)愈傷組織已經(jīng)形成時(shí)，將愈傷組織的樣品用于熒光GUS測定，其結(jié)果如圖43所示。GUS含量表明，AlcA啟動(dòng)子在愈傷組織中是滲漏的，并且其含量隨著向植物組織培養(yǎng)基中添加乙醇而提高。因此，可以用啟動(dòng)恢復(fù)基因的AlcA啟動(dòng)子恢復(fù)轉(zhuǎn)基因，該啟動(dòng)子與用于啟動(dòng)細(xì)胞毒性基因的啟動(dòng)子處于相同的結(jié)構(gòu)上。在溫室中業(yè)已證實(shí)，在通過噴霧、蒸汽或灌根使用化學(xué)誘導(dǎo)物乙醇時(shí)，AlcA/R基因開關(guān)能在煙草葉片中對報(bào)導(dǎo)基因或性狀基因進(jìn)行高水平誘導(dǎo)(Caddick等，Salter等)。將轉(zhuǎn)基因AlcA-GUS煙草、油菜和番茄植物用于在花組織中檢測基因誘導(dǎo)。煙草1)用一個(gè)塑料袋密封AlcA-GUS煙草花莖，并將一個(gè)裝有50ml 5％乙醇的小罐放在袋里面。3天之后，收集來自不同花芽階段的花藥，分析GUS表達(dá)。結(jié)果如圖44所示。圖中示出了來自野生型、未誘導(dǎo)過的AlcA-GUS和誘導(dǎo)過的AlcA-GUS植物的4種獨(dú)立的花芽的GUS值。花芽長度用毫米表示，每一個(gè)棒表示5個(gè)花藥。以上曲線表明，與未接受乙醇蒸汽處理的AlcA-GUS植物相比，來自誘導(dǎo)過的植物的花藥含有較高水平的GUS。
2)切割野生型和Alc-GUS煙草植物的花莖，并放入裝有300毫升水、1％、2％或5％乙醇的燒杯中，并在溫室中放置2天，然后從花芽上收集花藥用于熒光GUS分析。圖45是表示來自該實(shí)驗(yàn)的GUS數(shù)據(jù)的棒圖，表示源于野生型、水處理的Alc-GUS花莖和1％、2％或5％乙醇處理的Alc-GUS花莖。該實(shí)驗(yàn)還證實(shí)，在所述花藥中通過乙醇誘導(dǎo)的報(bào)導(dǎo)基因的表達(dá)水平高于在用水處理的花中的表達(dá)水平。來自誘導(dǎo)過的AlcA-GUS花藥的GUS表達(dá)水平高于MSF14-GUS植物的表達(dá)水平。
3)在溫室中用250毫升水或5％乙醇對成熟AlcA-GUS煙草植物進(jìn)行灌根。同樣用乙醇處理野生型和35S-GUS植物。2天之后，解剖來自各種大小花芽的雌蕊，并染色進(jìn)行GUS活性分析。圖46表示來自水和5％乙醇處理的Alc-GUS植物的9-10毫米花芽的雌蕊。照片清楚地表明，乙醇處理在雌蕊中導(dǎo)致了GUS誘導(dǎo)。圖47和48表示，來自同樣用水處理和乙醇處理的Alc-GUS植物的17-22毫米和33-35毫米花芽的雌蕊的柱頭/花柱區(qū)。與類似于野生型的水處理過的植物相比，在整個(gè)該部位出現(xiàn)GUS染色。
4)另外，試驗(yàn)了Alc-CAT植物(35S-AlcR-nos/AlcA-CAT-nos)，并證實(shí)了在用乙醇誘導(dǎo)之后在花組織中報(bào)導(dǎo)基因水平的提高。
油菜1)在第0天和第1天用250毫升水、1％或2％乙醇對油菜(OSR)AlcA-GUS植物進(jìn)行灌根。在第一次誘導(dǎo)之后2天從上述植物采集花的樣品。用于熒光GUS分析的樣品是來自成熟花的花藥(成熟表示它們是完全開裂的)，來自成熟花的柱頭/花柱，來自未成熟花的花藥(具有未開裂花瓣的花芽)，來自未成熟花的柱頭/花柱以及包括子房在內(nèi)的花雌蕊的其余部分。
圖49圖解表示GUS數(shù)據(jù)，并且從左至右表示來自水誘導(dǎo)的Alc-GUS，1％乙醇誘導(dǎo)的Alc-GUS和2％乙醇誘導(dǎo)Alc-GUS油菜植物的結(jié)果。每一部分中的頭兩個(gè)棒分別表示未誘導(dǎo)過的花藥和未誘導(dǎo)過的柱頭/花柱GUS含量。每一個(gè)棒表示3次重復(fù)，每一次重復(fù)含有來自3種不同花的花藥或來自8種不同花的柱頭/花柱或來自6種不同花的子房。
以上數(shù)據(jù)清楚地表明，與水處理的油菜相比，在乙醇誘導(dǎo)的植物上在花組織中GUS含量提高。在2％乙醇處理過的植物上所檢查過的所有組織中，均表現(xiàn)出GUS高于未誘導(dǎo)過的含量和水處理的對照植物的含量。
2)在用乙醇誘導(dǎo)之后，對油菜Alc-GUS花進(jìn)行GUS染色。圖50是在誘導(dǎo)之前Alc-GUS花的照片，而圖51是在用250毫升5％乙醇灌根之后2天用來自同一株植物的花的照片。圖中表明，所述處理導(dǎo)致了報(bào)導(dǎo)基因在柱頭/花柱部位以及花絲中的誘導(dǎo)。
圖52表示去掉了萼片和花的未成熟花芽。與左側(cè)的水處理的對照相比，右側(cè)的乙醇處理的植物表現(xiàn)出在柱頭/花柱部位表達(dá)GUS。圖53-55是其進(jìn)一步例子。圖56表示來自野生型和水誘導(dǎo)油菜Alc-GUS植物的雌蕊切片。圖57表示來自用2％乙醇灌根的植物的在取得花的樣品之前2天的雌蕊切片。圖中表明了GUS在整個(gè)雌蕊部位的誘導(dǎo)。圖58表示來自水處理植物和5％乙醇處理植物的雌蕊。再次證實(shí)了使用化合物乙醇在雌性組織中導(dǎo)致了GUS誘導(dǎo)。
圖59表示來自一種實(shí)驗(yàn)的花，其中切割花莖，并放入5％乙醇的燒杯中，在其中放置2天，然后對整個(gè)花進(jìn)行染色檢測GUS活性。在所述花的花絲、萼片、花瓣和柱頭/和花柱部位藍(lán)色染色是明顯的。番茄以上述誘導(dǎo)煙草花的方法，用乙醇蒸汽誘導(dǎo)Alc-GUS番茄花。在誘導(dǎo)之后2天，對花藥和花粉進(jìn)行染色，以便檢測GUS表達(dá)。從圖60a和60b中可以看出，在兩種組織中觀察到藍(lán)色染色。稻前面測試Alc開關(guān)的誘導(dǎo)能力實(shí)驗(yàn)包括水培試驗(yàn)，包括對葉片進(jìn)行2天的乙醇蒸汽處理，然后測定GUS活性。一旦放入溫室中，在脂膜形成/開花期之前和期間用1-5％乙醇灌根，以便研究GUS在花組織中表達(dá)的誘導(dǎo)。GUS測定在2-300微升提取緩沖液(100mM磷酸鈉緩沖液pH7，10mM EDTA，0.1％Triton X-100，1％十二烷基肌氨酸鈉，10mM b-巰基乙醇)中研磨花材料。在離心機(jī)中離心樣品15分鐘，并將5微升上清液用于Bradford蛋白測定，用BSA做標(biāo)準(zhǔn)物。用提取緩沖液以1∶5的比例稀釋20微升樣品，并加入400微升測定緩沖液(與提取緩沖液相同，所不同的是含有l(wèi)mM 4-MUG和20％甲醇)。取100微升(T0樣品)并加入900微升終止緩沖液(0.2M碳酸鈉)中，其余部分在37℃下溫育2小時(shí)，然后再取100微升(T2樣品)，加入900微升終止緩沖液中。
在分光光度計(jì)上測定樣品的熒光，GUS以每小時(shí)每毫克蛋白的nM4M U表示。小麥用pUIRN.AGS對小盾片組織進(jìn)行轟擊，并用乙醇蒸汽處理該組織。2-3天之后染色分析GUS表達(dá)，當(dāng)出現(xiàn)多個(gè)藍(lán)色斑點(diǎn)時(shí)，表明AlcA啟動(dòng)子被誘導(dǎo)，導(dǎo)致了GUS表達(dá)。
將所獲得的轉(zhuǎn)基因Alc-GUS植物生長到成熟并收獲種子，以與上文所述水稻相同方式測定其后代植物中誘導(dǎo)型GUS表達(dá)。GUS組織化學(xué)為了進(jìn)行GUS染色，使用Blume和Grierson(1997)的方法。不育性研究1)雄性不育植物a)根據(jù)花粉的缺乏或死花粉的存在，鑒定由框A轉(zhuǎn)化產(chǎn)生的孢子體雄性不育植物。通過以野生型煙草作為花粉供體進(jìn)行回交生產(chǎn)種子。
b)通過對花粉進(jìn)行活體染色，鑒定由框B轉(zhuǎn)化產(chǎn)生的配子體不育植物，50％的花粉是不育的，50％的花粉可育。
2)雌性不育植物根據(jù)其不能由野生型花粉授粉雜交的特征，鑒定由框F轉(zhuǎn)化產(chǎn)生的孢子體雌性不育植物。在兩種情況下通過框E和G轉(zhuǎn)化產(chǎn)生的恢復(fù)植物是自花授粉的，種植后代，并按常規(guī)方法通過對T2種子進(jìn)行卡那霉素選擇，篩選純合品系。育性的誘導(dǎo)恢復(fù)預(yù)計(jì)孢子體不育植物和野生型植物雜交的后代會出現(xiàn)1∶1的不育性分離，同時(shí)出現(xiàn)轉(zhuǎn)基因，并在生長早期階段通過PCR分析進(jìn)行選擇。進(jìn)行誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)，以便研究育性的恢復(fù)，因?yàn)樗霾挥参锟梢酝ㄟ^灌根或噴霧或使用蒸汽用乙醇處理以便誘導(dǎo)芽孢桿菌RNA酶抑制劑在相關(guān)菌株中表達(dá)。預(yù)計(jì)在合適的時(shí)期誘導(dǎo)能進(jìn)行自花授粉并產(chǎn)生種子，然后，可以方便地進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。用常規(guī)方法從所得到的后代中篩選純合植物，并用于通過與純合的恢復(fù)植物雜交測定組成型恢復(fù)。
不過，讓C5-芽孢桿菌RNA酶.AlcA-芽孢桿菌RNA酶抑制劑植物與野生型植物回交或自交可以導(dǎo)致一種群體的恢復(fù)，其中50％是完全可育的，50％產(chǎn)生花粉僅有50％是可育的。不過，這些植物可以用乙醇噴霧、灌根或蒸汽處理進(jìn)行誘導(dǎo)，以便在發(fā)育中的花粉中表達(dá)芽孢桿菌RNA酶抑制劑，從而進(jìn)行自花授粉。在這種情況下，純合植物是100％不育的，而半純合的植物是50％不育的。通過染色所獲得的結(jié)果的差別，可以歸結(jié)為誘導(dǎo)和自花授粉的效力。異花授粉對育性的組成型恢復(fù)雄性不育植物與雄性恢復(fù)植物的雜交是通過將恢復(fù)植物的花粉轉(zhuǎn)移到雄性不育植物的雌蕊上實(shí)現(xiàn)的(在除去所有花藥之后進(jìn)行，即使這些花藥僅含有死花粉)。然后對授粉的雌蕊進(jìn)行套袋，以防被野生型或其他環(huán)境中的其他花粉污染。收獲所產(chǎn)生的種子。種植后代，觀察并測定花粉的產(chǎn)生。用這種方法恢復(fù)育性可導(dǎo)致正?；ǚ郛a(chǎn)生。
雌性不育植物的雜交是通過將該植物上的花粉轉(zhuǎn)移到雌性可育性恢復(fù)植物的雌蕊上而實(shí)現(xiàn)的，同樣是在所述植物上除去花藥之后進(jìn)行。按上述方法將花套袋。收獲所產(chǎn)生的種子。種植其后代并對花進(jìn)行套袋。觀察這些植物自花授粉的能力。以這種方法恢復(fù)的育性使得自花授粉可以發(fā)生。用相同方法分析由框E和F，即用雌性不育、并攜帶雄性恢復(fù)基因轉(zhuǎn)化產(chǎn)生的植物，和用框A和G，即雄性不育并攜帶雌性恢復(fù)基因轉(zhuǎn)化產(chǎn)生的植物。
在不超出本發(fā)明范圍的前提下，對本發(fā)明的其他改進(jìn)在本領(lǐng)域技術(shù)人員看來是顯而易見的。
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WO94/13822穩(wěn)定轉(zhuǎn)化小麥的方法，Ciba Geigy。
權(quán)利要求
1.一種制備雜交種子的方法，包括相間種植雄性可育并且純合隱性雌性不育的父本植物和純合隱性雄性不育并且雌性可育的母本植物，進(jìn)行異花授粉，并獲得由此產(chǎn)生的種子。
2.如權(quán)利要求1的方法，其中，在每一種親本植物的基因組DNA上整合了一種基因結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)包括對外源化學(xué)誘導(dǎo)物的存在或缺乏有反應(yīng)的啟動(dòng)子序列，該序列任選有效連接于一個(gè)或幾個(gè)翻譯增強(qiáng)子或內(nèi)含子序列上，后者有效連接于一個(gè)能完全恢復(fù)每一種親本植物的育性的基因上，所述基因是通過在所述植物上使用一種外源化學(xué)誘導(dǎo)物而表達(dá)的，從而每一種親本能自花授粉。
3.如權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)的方法，其中，所述母本植物具有純合的隱性基因，該基因能明顯破壞有活力的花粉的生物合成，或減弱花粉的生活力。
4.如權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)的方法，其中，所述父本植物的隱性基因是純合的，該基因能破壞胚珠、花柱、柱頭產(chǎn)生或功能或花粉萌發(fā)，粘接，水合，花粉管生長或?qū)颉?br> 5.如權(quán)利要求2-4中任一項(xiàng)的方法，其中，所述對外源化學(xué)誘導(dǎo)物的存在或缺乏有反應(yīng)的啟動(dòng)子序列是AlcA啟動(dòng)子序列或GST-27啟動(dòng)子序列。
6.如上述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中，所述親本植物是小麥、大麥、稻、玉米、番茄、向日葵、甜菜、canola、棉花、大豆和其他蔬菜。
7.如上述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中，所產(chǎn)生的F1雜交種子所產(chǎn)生的植物是完全可育的。
8.如上述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中，所產(chǎn)生的F2雜交種子所產(chǎn)生的植物會發(fā)生不育性分離，大約25％是雌性的不育的。
9.如上述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中，所述親本的不育性是由天然或遺傳操作的突變導(dǎo)致的。
10.將上述上述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述方法用于生產(chǎn)雜交種子的用途。
11.通過權(quán)利要求1-9的方法生產(chǎn)的可育植物。
12.如權(quán)利要求11的植物的后代，所述植物和所述后代的種子。
13.一種表達(dá)框，包括(a)第一基因啟動(dòng)子序列，它是雄花特異性啟動(dòng)子；(b)編碼一種能夠破壞雄性育性的產(chǎn)物的破壞基因，該基因有效連接于所述第一基因啟動(dòng)子序列上；(c)第二基因啟動(dòng)子序列，它是可任選有效連接于一個(gè)或幾個(gè)翻譯增強(qiáng)子或內(nèi)含子序列上的雌花特異性啟動(dòng)子序列；(d)編碼一種能夠恢復(fù)雌性育性的產(chǎn)物的恢復(fù)基因，它有效連接于所述第二基因啟動(dòng)子序列上；(e)對一種外源化學(xué)誘導(dǎo)物的存在或缺乏有反應(yīng)的第三基因啟動(dòng)子序列，它可任選有效連接于一個(gè)或幾個(gè)翻譯增強(qiáng)子或內(nèi)含子序列上；和(f)編碼一種能夠恢復(fù)雄性育性的產(chǎn)物的恢復(fù)基因，它有效連接于所述第三基因啟動(dòng)子序列上；因此，所述外源化學(xué)誘導(dǎo)物的存在能夠控制雄性可育性。
14.如權(quán)利要求13的表達(dá)框，其中，所述破壞基因編碼一種能夠破壞花粉產(chǎn)生的產(chǎn)物。
15.如權(quán)利要求13的表達(dá)框，其中，所述破壞基因編碼一種能在植物的氈絨層細(xì)胞中表達(dá)的產(chǎn)物。
16.如權(quán)利要求13-15中任一項(xiàng)的表達(dá)框，其中，所述第三基因啟動(dòng)子序列是AlcA啟動(dòng)子序列或GST-27啟動(dòng)子序列。
17.一種表達(dá)框，包括(a)第一基因啟動(dòng)子序列，它是雌花特異性啟動(dòng)子序列；(b)編碼一種能夠破壞雌性育性的產(chǎn)物的破壞基因；(c)第二基因啟動(dòng)子序列，它是可任選有效連接于一個(gè)或幾個(gè)翻譯增強(qiáng)子或內(nèi)含子序列上的雄性組織特異性啟動(dòng)子序列；(d)編碼一種能夠恢復(fù)雄性育性的產(chǎn)物的恢復(fù)基因，它有效連接于所述第二基因啟動(dòng)子序列上；(e)對一種外源化學(xué)誘導(dǎo)物的存在或缺乏有反應(yīng)的第三基因啟動(dòng)子序列，它可任選有效連接于一個(gè)或幾個(gè)翻譯增強(qiáng)子或內(nèi)含子序列上；和(f)編碼一種能夠恢復(fù)雌性育性的產(chǎn)物的恢復(fù)基因，它有效連接于所述第三基因啟動(dòng)子序列上；因此，所述外源化學(xué)誘導(dǎo)物的存在能夠控制雌性可育性。
18.如權(quán)利要求17的表達(dá)框，其中，所述恢復(fù)基因編碼一種能夠恢復(fù)花粉生產(chǎn)的產(chǎn)物。
19.如權(quán)利要求17的表達(dá)框，其中，所述恢復(fù)基因編碼一種能在氈絨層細(xì)胞中恢復(fù)花粉產(chǎn)生的產(chǎn)物。
20.如權(quán)利要求17-19中任一項(xiàng)的表達(dá)框，其中，所述第三基因啟動(dòng)子序列是AlcA啟動(dòng)子序列或GST-27啟動(dòng)子序列。
21.一種生產(chǎn)雜交種子的方法，包括將權(quán)利要求13-16中任一項(xiàng)所述的表達(dá)框整合到第一種植物中，以便產(chǎn)生半純合的母本植物，并將權(quán)利要求17-20中任一項(xiàng)所述的表達(dá)框整合到第二種植物中，以便產(chǎn)生半純合的父本植物；將一種外源化學(xué)誘導(dǎo)物施加在所述轉(zhuǎn)化體上，從而使得該植物自花授粉；由所得到的種子長成植物；選擇雄性和雌性純合植物；讓所選擇的雄性和雌性植物雜交；和獲得所產(chǎn)生的雜交種子。
22.如權(quán)利要求21的方法，其中，所述雄性植物包括能恢復(fù)雄性育性的純合顯性基因。
23.如權(quán)利要求21或22的方法，其中，所述雌性植物包括能恢復(fù)雌性育性的純合顯性基因。
24.如權(quán)利要求21-23中任一項(xiàng)的方法，其中，所述產(chǎn)生的F1雜交種子能產(chǎn)生植物，該植物的花藥產(chǎn)生大約50％的可育花粉，而權(quán)利要求13-16中任一項(xiàng)所述的表達(dá)框的第一基因啟動(dòng)子序列是配子體啟動(dòng)子序列。
25.權(quán)利要求21-23中任一項(xiàng)的方法，其中，所述產(chǎn)生的F1雜交種子能產(chǎn)生全部是完全可育的植物，而權(quán)利要求13-16中任一項(xiàng)所述的表達(dá)框的第一啟動(dòng)子序列是孢子體啟動(dòng)子序列。
26.權(quán)利要求21-25中任一項(xiàng)的方法，其中，所述F2雜交種子所產(chǎn)生的植物會發(fā)生不育性分離，其中大量的植物是雌性不育的。
27.權(quán)利要求21的方法，其中，所述雄性和雌性純合植物可以繁殖并通過在該植物上使用外源化學(xué)誘導(dǎo)物從而使得該植物能自花授粉而得以保持。
28.權(quán)利要求21-27中任一項(xiàng)的方法，其中，所述植物是小麥、稻、玉米、番茄、向日葵、甜菜、canola、棉花、大豆或其他蔬菜。
29.用權(quán)利要求13-20中任一項(xiàng)所述表達(dá)框中的一種或幾種轉(zhuǎn)化的植物組織或其部分和由所述轉(zhuǎn)化的植物組織產(chǎn)生的材料。
30.包括權(quán)利要求29的組織或材料的可育的全植株。
31.上述權(quán)利要求的植物的后代，所述后代包括整合，優(yōu)選穩(wěn)定整合到其基因組上的權(quán)利要求13-20中任一項(xiàng)所述表達(dá)框中的一種或幾種，或其部分，以及所述植物和所述后代的種子。
32.一種植物，其基因組包括權(quán)利要求13-16中任一項(xiàng)的表達(dá)框。
33.一種植物，其基因組包括權(quán)利要求17-20中任一項(xiàng)的表達(dá)框。
34.通過讓權(quán)利要求32的植物與權(quán)利要求33的植物雜交并獲得由此產(chǎn)生的雜交種子所生產(chǎn)的雜交種子。
35.將權(quán)利要求21-28中任一項(xiàng)所述方法用于生產(chǎn)雜交種子的用途。
36.一種轉(zhuǎn)化植物的方法，包括將權(quán)利要求13-16或權(quán)利要求17-20中任一項(xiàng)所述的表達(dá)框整合到所述植物的基因組上，其中，所述有效連接于第三種基因啟動(dòng)子序列上的恢復(fù)基因在目標(biāo)組織中是誘導(dǎo)型形式表達(dá)的，但也可以在一種或幾種其他組織中以組成型形式表達(dá)，以便所述破壞基因只能在目標(biāo)組織中起作用。
37.如權(quán)利要求36的方法，其中，所述恢復(fù)基因在愈傷組織中是以組成型形式表達(dá)的。
38.如權(quán)利要求36或37的方法，其中，所述恢復(fù)基因在雄花或雌花結(jié)構(gòu)中是以誘導(dǎo)型形式表達(dá)的。
39.如權(quán)利要求36-38中任一項(xiàng)的方法，其中，所述第三基因啟動(dòng)子序列是GST-27啟動(dòng)子序列。
40.如權(quán)利要求36-38中任一項(xiàng)的方法，其中，所述第三基因啟動(dòng)子序列是AlcA啟動(dòng)子序列。
41.一種大體上如上文所述并參照圖2、6和7中任一個(gè)的生產(chǎn)雜交種子的方法。
42.一種大體上如上文所述并參照圖1和3-5中任一個(gè)的表達(dá)框。
全文摘要
披露了制備雜交種子的方法,上述方法包括將雄性可育并且純合隱性雌性不育的父本植株和純合隱性雄性不育和雌性可育的母本植株相間種植在一起,進(jìn)行異花授粉,并獲得由此所產(chǎn)生的種子。每一種親本植株的基因組材料上還可以整合一種基因結(jié)構(gòu),該結(jié)構(gòu)包括對一種外源化學(xué)誘導(dǎo)物的存在或缺乏有反應(yīng)的啟動(dòng)子序列,并可任選有效連接于一個(gè)或幾個(gè)增強(qiáng)子或內(nèi)含子序列上,有效連接于能完全恢復(fù)每一種親本植株的育性的基因上,所述基因是通過在所述植株上使用一種外源化學(xué)誘導(dǎo)物,以便使得每一種親本異花授粉而得到表達(dá)。
文檔編號C12N9/24GK1298450SQ99805258
公開日2001年6月6日 申請日期1999年1月22日 優(yōu)先權(quán)日1998年2月20日
發(fā)明者M·E·奈特, I·杰普森, A·達(dá)利, M·W·貝利斯 申請人:曾尼卡有限公司