專利名稱：生產(chǎn)水解蛋白的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及到一種生產(chǎn)水解蛋白的方法。更具體而言，它涉及這樣一種生產(chǎn)水解蛋白的方法，其中在酶水解含有固態(tài)蛋白的植物蛋白原料的步驟中，水解作用以一種特殊方式進(jìn)行，由此水解終產(chǎn)物不變褐或者水解終產(chǎn)物不變褐的時期被明顯地延長。
背景技術(shù)：
關(guān)于通過酶水解一種含有固態(tài)植物蛋白的蛋白原始原料來獲得氨基酸的方法，已經(jīng)知道大量的方法。
例如，JP-A-51-35461描述了一種液體調(diào)味品的生產(chǎn)方法，該方法組合起來包括，第一步反應(yīng)是將含有可溶性氮指標(biāo)為50或更少的未變質(zhì)處理過的脫脂大豆與pH 9～12的一種堿性蛋白酶反應(yīng)2小時，由此，溶解并抽提70％或者更多的蛋白衍生氮組成物，以便于進(jìn)行固-液分離，第二步是用一種多肽酶在一種密閉容器中在40～60℃水解抽提物。
再者，JD-A-6-125734描述了一種酶制劑及一種生產(chǎn)液體蛋白調(diào)味品的方法。該酶制劑是用有機(jī)溶劑浸提通過固態(tài)培養(yǎng)一種微生物而來的清酒曲產(chǎn)物而獲得，它含一種通過清酒曲自溶釋放的外肽酶；該方法包含用一種動物或植物蛋白原料與可溶性蛋白酶反應(yīng)，然后上述反應(yīng)產(chǎn)品與含外肽酶的酶制劑反應(yīng)。
再者，JD-A-9-75032描述了生產(chǎn)一種調(diào)味品的方法，其中在酒精存在的條件下，當(dāng)用于生產(chǎn)醬油(soy sauce)的清酒曲被用于35℃～45℃進(jìn)行的酶水解時，進(jìn)行強(qiáng)制性的蒸發(fā)使得酒精濃度在水解完成后是2％或者更少，并且這種水解產(chǎn)物是發(fā)酵和陳釀的。
此外，JP-A-9-121807描述了一種多用途的調(diào)味品，該調(diào)味品有高的谷氨酸含量和一種酸水解調(diào)味品的獨特風(fēng)味，沒有醬油味和釀造味。這種調(diào)味品是在培養(yǎng)一種清酒曲霉菌(Aspergillus曲霉)的同時，在缺乏鹽和存在少量鹽的條件下，用清酒曲霉菌的培養(yǎng)物中的酶水解培養(yǎng)基中的蛋白質(zhì)而生產(chǎn)的。
然而，存在的問題是，當(dāng)用這些傳統(tǒng)的方法生產(chǎn)的水解產(chǎn)物在貯存時，在相當(dāng)短的時期內(nèi)就會產(chǎn)生顏色并且會快速地褐變，導(dǎo)致其商業(yè)價值顯著地降低。
任何已知的通過酶水解含有固態(tài)蛋白的蛋白原料而生產(chǎn)氨基酸的方法都存在以下問題除了在水解步驟中作為酶源的微生物外，其它所謂的污染菌也生長，從而降低了水解產(chǎn)物質(zhì)量和減少氨基酸的產(chǎn)量。為了解決這些問題，在傳統(tǒng)方法的水解步驟中，用如酒精、氯化鈉和乙酸乙酯作為抑菌劑。在這些方法中，水解步驟完成后必須增加分離和除去這些抑菌劑的額外步驟。特別是氯化鈉被用作抑菌手段時，將氯化鈉減少到低于一個適當(dāng)濃度而不降低水解終產(chǎn)物的質(zhì)量十分困難。而且在水解步驟中使用抑菌劑獲得的產(chǎn)品，幾乎不可避免地會產(chǎn)生所謂的釀造味或醬油味，導(dǎo)致很大程度地限制了所獲得的水解蛋白的使用范圍。
除此之外，也是在傳統(tǒng)的方法中，要在除去或殺死在含有固態(tài)蛋白的蛋白原料中摻入或含有的污染物或作為酶源的微生物培養(yǎng)物后，水解步驟才進(jìn)行。原始原料在滅菌后進(jìn)行蛋白水解反應(yīng)的方法在實驗性的小量生產(chǎn)是相對容易的。但是，在工業(yè)化的大批量生產(chǎn)中，它就涉及到十分嚴(yán)重的問題如滅菌步驟和蛋白水解步驟中污染物的控制。
發(fā)明公開本發(fā)明的一個目標(biāo)是建立一種方法，該方法阻止了通過酶水解一種含固態(tài)植物蛋白的蛋白原料而獲得的水解蛋白的褐變，從而在長時間內(nèi)穩(wěn)定地保持其商業(yè)價值。
本發(fā)明的另一個目標(biāo)是提供一種生產(chǎn)水解蛋白的方法。該水解蛋白可用作多用途調(diào)味品原料或多用途食品原料，該水解蛋白甚至在缺乏抑菌物質(zhì)的情況下也沒有細(xì)菌污染，這使該方法可用于工業(yè)化的大批量生產(chǎn)。
為了解決這些問題，發(fā)明人進(jìn)行了大量試驗和艱苦的研究，研究了酶水解含有各種植物蛋白原料的方法和水解條件與水解終產(chǎn)物褐變的相關(guān)關(guān)系，最終，發(fā)明人獲得了以下(1)～(3)的新發(fā)現(xiàn)。
(1)水解產(chǎn)物褐變的發(fā)生和發(fā)展與水解反應(yīng)發(fā)生后反應(yīng)產(chǎn)品中還原糖濃度密切相關(guān)。那就是，當(dāng)還原糖濃度高時，水解反應(yīng)后褐變立即發(fā)生且甚至在普通的貯存條件下快速地進(jìn)行。
(2)一旦褐變發(fā)生，找到抑制褐變發(fā)展的有效方法就十分困難。
(3)通過特殊的水解方法和水解條件能夠控制水解后反應(yīng)產(chǎn)品中的還原糖的濃度，使其低于預(yù)定的濃度。除此之外，用這樣特殊的水解方法和條件，蛋白自身的水解率和最終氨基酸的組成比例基本上不變。
發(fā)明人也獲得了以下(4)～(6)的關(guān)于蛋白原料和培養(yǎng)基滅菌的新發(fā)現(xiàn)。
(4)水解步驟中生長的污染菌存在于固態(tài)的蛋白原料中和作為酶源的微生物培養(yǎng)物中。
(5)在蛋白原料和培養(yǎng)基能徹底滅菌的情況下，水解步驟能在無污染物的條件下充分地進(jìn)行。
(6)在存在有空氣和氣泡的地方，蛋白原料和培養(yǎng)基的滅菌受到極大程度的抑制。換言之，在空氣和氣泡被完全除去后進(jìn)行熱滅菌，就能得到基本上處于無菌狀態(tài)的蛋白原料和無細(xì)菌污染的作為酶源的微生物培養(yǎng)物。
基于這些新發(fā)現(xiàn)，發(fā)明人完成了本發(fā)明。
那就是，第一個發(fā)明是一種生產(chǎn)水解蛋白的方法，該方法是在一種液體反應(yīng)系統(tǒng)中將一種含糖的植物蛋白原料用一種真菌培養(yǎng)物進(jìn)行酶水解。包括混合植物蛋白原料與真菌培養(yǎng)物，首先在通氣、攪拌的條件下在15℃～39℃的溫度范圍內(nèi)進(jìn)行反應(yīng)，然后在停止通氣后，在40℃～60℃的溫度范圍內(nèi)進(jìn)行和完成反應(yīng)。
第二個發(fā)明是根據(jù)第一個發(fā)明的生產(chǎn)水解蛋白的方法，其中植物蛋白的原料選自小麥谷蛋白、玉米谷蛋白、脫脂大豆及其處理產(chǎn)物。
第三個發(fā)明是根據(jù)第一個發(fā)明的生產(chǎn)水解蛋白的方法，其中當(dāng)反應(yīng)開始后反應(yīng)進(jìn)行到從反應(yīng)開始到反應(yīng)完成所需總反應(yīng)時間的10～60％時，將在15℃～39℃的溫度范圍進(jìn)行的反應(yīng)轉(zhuǎn)為在40～60℃的溫度范圍內(nèi)進(jìn)行的反應(yīng)。
第四個發(fā)明是根據(jù)第一個發(fā)明的生產(chǎn)水解蛋白的方法，其中在反應(yīng)完成時存在于獲得的反應(yīng)產(chǎn)品中的還原糖比例被調(diào)整到反應(yīng)產(chǎn)品中總固體的含量的5％或更低。
第五個發(fā)明是根據(jù)第一個發(fā)明的生產(chǎn)水解蛋白的方法，其中真菌培養(yǎng)物的制備和植物蛋白原料的水解在一種深層培養(yǎng)的罐(或箱)型反應(yīng)容器中進(jìn)行。
第六個發(fā)明是根據(jù)第一個發(fā)明的生產(chǎn)水解蛋白的方法，其中植物蛋白原料至少部分呈固體狀態(tài)，且在酶水解之前被粉碎到300um或者更細(xì)，分散于高于80℃的熱水中，在含于粉碎產(chǎn)物中的氣泡被基本上除去后立即進(jìn)行滅菌。
本發(fā)明被詳細(xì)描述如下。
本發(fā)明所用的起始原料是含糖的植物蛋白原料。即它是一種富含可食用植物蛋白的植物蛋白起始原料，這種可食用植物蛋白原料至少部分呈現(xiàn)固體；還含有包括淀粉和除淀粉之外的其它糖類，如葡萄糖、果糖、蔗糖和半乳糖。
使用的這些植物蛋白原料的形態(tài)沒有特別限制。起始原料包含各種形態(tài)，如粉末狀、顆粒狀、片狀、在水溶劑中呈分散狀態(tài)或者膏狀物。更進(jìn)一步說，只要是植物蛋白的原料，來源不受限制。
植物蛋白原料具體的例子包括起始原料如小麥谷蛋白，玉米谷蛋白、脫脂大豆、分離的大豆蛋白、分離的土豆蛋白，以及已處理過的這些植物蛋白原料的產(chǎn)品。在這個發(fā)明中，這些植物蛋白原料中的小麥谷蛋白和脫脂大豆是特別重要的蛋白原料。
植物蛋白原料的酶水解處理是如下一個步驟，將已滅菌的蛋白原料或保持在抑菌狀況下的蛋白原料分散于水溶劑中，并使之與分散于水溶劑中的含有高蛋白水解活性的真菌培養(yǎng)物接觸，進(jìn)行蛋白原料的水解。
使用以下一個實施方案非常重要在水解反應(yīng)的開始時期進(jìn)行通氣、攪拌，經(jīng)過一定時期后，確證水解反應(yīng)系統(tǒng)達(dá)到了預(yù)期狀態(tài)，然后清楚地將反應(yīng)溫度轉(zhuǎn)換到一個高溫區(qū)并繼續(xù)接觸。在這方面該方法明顯地不同于普通的酶水解蛋白原料的方法。因此這是本發(fā)明方法的主要特色特征。
為具體實施這一方案，必須有一個至少裝備有一個溫度控制裝置、一個通氣裝置和一個攪拌裝置的水解反應(yīng)容器或發(fā)酵罐。在反應(yīng)中，1/1vvm或更少的通氣比例已足夠。攪拌裝置沒有特別限制，只要與反應(yīng)容器大小相匹配和完全能承受如初始分散物的粘度或反應(yīng)系統(tǒng)的負(fù)荷。各種攪拌裝置都可以利用。例如，一種用于氨基酸產(chǎn)品發(fā)酵的深層培養(yǎng)設(shè)備就是一種特別優(yōu)選的反應(yīng)設(shè)備。
將所用的起始原料粉碎或精細(xì)的粉碎，使之不妨礙在起始原料的滅菌時期或水解反應(yīng)之前的攪拌過程。用發(fā)酵工業(yè)通常使用的方法和設(shè)備進(jìn)行滅菌處理。為了使水解反應(yīng)不被細(xì)菌污染，作為酶源的真菌的培養(yǎng)需在無污染的條件下進(jìn)行。此外，理所當(dāng)然的是要很好的實施防止細(xì)菌污染的措施和進(jìn)行反應(yīng)步驟期間程序的管理。
在進(jìn)行蛋白水解之前，優(yōu)選將蛋白原料粉碎到大小為300um或更細(xì)，并分散在80℃或更高的熱水中?？梢杂酶傻牡鞍自线M(jìn)行粉碎。但若將已初步粉碎的蛋白原料在進(jìn)行分散于熱水中的處理的同時進(jìn)行粉碎，則便于此步驟繼續(xù)轉(zhuǎn)換到滅菌步驟。
根據(jù)在不同蛋白原料上許多次實驗的結(jié)果，歸納確定了粉碎條件和用于分散的熱水溫度條件。若盡可能地在這些條件下粉碎和在接近于沸點的高溫下分散處理，在隨后的滅菌步驟中，預(yù)期能夠得到較好的滅菌效果。
也就是當(dāng)含有大小為300um或更大顆粒的分散物經(jīng)熱交換器處理時，在分散物中的這些蛋白原料顆粒就會沉淀，并且有阻塞熱交換器液流路徑的可能。因此，滅菌處理實際上已變得不可能。
同時，發(fā)現(xiàn)一種現(xiàn)象，那就是在80℃或更高的溫度下，細(xì)顆粒的蛋白原料分散物的粘度急劇下降。


圖1是一個線形圖，顯示了在60℃-90℃溫度范圍內(nèi)的熱水中，含32％濃度的小麥谷蛋白分散物的溫度與粘度的關(guān)系。在圖1中，縱坐標(biāo)表示粘度的單位刻度為104cps(Centiposes厘泊)，橫坐標(biāo)的單位刻度為℃。在此實施例中，可以看到在溫度80℃-85℃時，粘度顯著下降。
本發(fā)明中的技術(shù)進(jìn)步之一就在于此。即在特定的溫度范圍內(nèi)，由于蛋白原料分散物的粘度突然下降，而使得控制的顯著改進(jìn)與有效的熱滅菌相互銜接。
當(dāng)?shù)鞍自显馐芊鬯椴⒎稚⒂跓崴袝r，蛋白原料的分散物在許多場合呈現(xiàn)一種乳化狀態(tài)。但分散物的粘度不增加，而且分散物變成一個低粘度的不粘溶液，因此，這種處理過的分散物中不含有空氣和氣泡。
當(dāng)?shù)鞍自媳环鬯楹头稚⒂跓崴畷r，可以使用一種能滿足此目的的方法和裝置。例如可以使用這樣一種方法，其中將粉狀的蛋白原料輸入一個含有維持在預(yù)定溫度的水溶液的發(fā)酵罐中，并輸入乳化器進(jìn)行攪拌來乳化和分散。
在分散處理中重要的是要確保在分散處理后沒有空氣和氣泡粘附和存在于分散物中的細(xì)顆粒蛋白原料上。這時，在顯微鏡下用低倍放大的視野觀察經(jīng)分散物處理后的分散物，確定基本上沒有氣泡粘附在分散的細(xì)顆粒上，分散的細(xì)顆粒直接與液體部分接觸。
假如在分散處理后，有氣泡存在于分散物中，那么在緊接著進(jìn)行的滅菌步驟中即使高溫處理也不能達(dá)到預(yù)期的滅菌效果。而且，在滅菌操作過程中，可能出現(xiàn)如阻塞的嚴(yán)重問題。
當(dāng)氣泡存在于分散物中時，可以預(yù)測滅菌不能徹底地進(jìn)行，因為熱量不是被均勻的分散在滅菌物中，而且不能作用于氣泡包圍的細(xì)菌細(xì)胞和孢子。
在分散處理后，分散于熱水中的蛋白原料接著進(jìn)行滅菌步驟。滅菌的方法和設(shè)備沒有特別的限制。在水解裝置中進(jìn)行連續(xù)滅菌或分批滅菌的方法對順利地實施整個步驟是有利的。通過這種滅菌處理，蛋白原料的分散物基本上變成無菌狀態(tài)。另外也可根據(jù)需要進(jìn)行樣品收集并確定其為所需的無菌狀態(tài)。
對于用于連續(xù)滅菌的設(shè)備，一種板式熱交換器或一種噴嘴式加熱器非常適合。在常規(guī)操作條件下，用這些熱滅菌設(shè)備處理上述方法生產(chǎn)的及被確證無氣泡的蛋白原料熱水分散物時，設(shè)備中如堵塞、燒焦的事件就不會發(fā)生。另外在處理完成后，設(shè)備的清洗和保養(yǎng)就十分容易。
對于用于水解反應(yīng)的真菌培養(yǎng)物，通過培養(yǎng)一種具有高蛋白酶產(chǎn)率的真菌菌株而新鮮制備的培養(yǎng)物是合適的，由這種培養(yǎng)物預(yù)期可得到產(chǎn)生的蛋白酶的活性。
對于具有高蛋白酶產(chǎn)率的真菌，不管其分類學(xué)地位如何，各種真菌都能被利用?？紤]到產(chǎn)品是用于食品的這一事實，選用迄今為止被用于食品和釀造工業(yè)的真菌，尤其是一種清酒曲霉菌(曲霉)是可取的。在蛋白水解反應(yīng)的實踐中，清酒曲霉菌在水解反應(yīng)的控制或在水解產(chǎn)品的純化和后處理方面是方便的。
至于清酒曲霉菌，可以使用從商品清酒曲霉菌的米中和用于釀造醬油的商品清酒曲中新近分離的、具有固定的菌株屬性的菌株。不用說，也可以利用這些微生物的保藏菌株。
用于水解反應(yīng)的具有高蛋白酶活性的真菌培養(yǎng)物，以液體清酒曲的形式滅菌后添加到蛋白原料中，并與其混合。液體清酒曲的生產(chǎn)原料可以相同于也可不同于被水解的蛋白原料。但是當(dāng)水解反應(yīng)在無細(xì)菌污染的狀態(tài)下進(jìn)行時，在制備的液態(tài)清酒曲中不應(yīng)該存在有細(xì)菌。因此，制備液體清酒曲所用的蛋白原料的滅菌需要特別小心。
順便說一下，當(dāng)害怕滅菌處理在水解反應(yīng)系統(tǒng)中可能沒有有效地進(jìn)行的時候，或者當(dāng)滅菌處理由于一些原因未能滿意地進(jìn)行的時候，也可在存在有抑菌物質(zhì)的情況下進(jìn)行水解反應(yīng)，抑菌物質(zhì)是為了抑制共存于此系統(tǒng)中細(xì)菌的生長。
加入到水解反應(yīng)系統(tǒng)中的抑菌物質(zhì)的例子包括氯化鈉、乙醇和乙酸乙酯。而且，根據(jù)加入的方式，將適當(dāng)量的抑菌物質(zhì)添加到系統(tǒng)中，此外，關(guān)于乙醇，具有有效形成酒精能力的酵母，可能導(dǎo)致系統(tǒng)中的共存。
假如使用了以上任何一種抑菌物質(zhì)，都需要在水解反應(yīng)完成后，通過分離將抑菌物質(zhì)從反應(yīng)混合物中除去。在不降低水解終產(chǎn)物質(zhì)量的情況下，通過分離有效地除去抑菌物質(zhì)是相當(dāng)困難的，而且是不經(jīng)濟(jì)的。特別是要通過分離完全除去氯化鈉，需要新的設(shè)備。因此，除了獲得含有相當(dāng)大量的氯化鈉的水解產(chǎn)物外，沒有其它選擇。自然這種產(chǎn)品的用途受到限制。
圖2是一個線形圖，顯示了在每一反應(yīng)時間后在每一溫度處，水解反應(yīng)系統(tǒng)中谷氨酸(GH)形成和積累的濃度(單位mg/dl毫克/10升)。此外，圖3是一線形圖，顯示了每一反應(yīng)時間后在每一溫度處，水解反應(yīng)系統(tǒng)中葡萄糖(G1c)的濃度(單位mg/dl毫克/10升)比較圖2和圖3可清楚地看到，可以理解，通過在水解反應(yīng)期間有目的地改變反應(yīng)溫度，在基本不影響蛋白水解反應(yīng)速度，即用形成并積累的谷氨基酸濃度代表的氨基酸形成的速度的條件下，用形成和積累的葡萄糖濃度代表的糖類含量，尤其是還原糖含量被選擇性地降低。此外也可理解，存在于最終得到的反應(yīng)產(chǎn)品的糖濃度和量能被調(diào)整到預(yù)期水平以下。
圖2揭示了隨著反應(yīng)溫度的增加和反應(yīng)時間的延長，形成和積累的谷氨酸濃度也隨之增加。同時，圖3揭示了在36℃～39℃的反應(yīng)溫度，隨著反應(yīng)時間的延長(5～10小時之后)，形成和積累的葡萄糖濃度急劇地下降。根據(jù)這一事實，可以預(yù)期在36℃～39℃反應(yīng)溫度條件下，葡萄糖一旦形成就快速地被真菌在反應(yīng)過程中分解和消耗掉了。
也就是說，在一個水解反應(yīng)容器中混合無菌的植物蛋白原料和真菌培養(yǎng)物-液體清酒曲。此后，混合物首先在15℃～39℃的溫度范圍內(nèi)反應(yīng)，優(yōu)選25℃～38℃，并且通氣和攪拌，然后停止通氣，在40℃～60℃的溫度范圍內(nèi)完成反應(yīng)，優(yōu)選41～50℃。結(jié)果，在基本上不影響蛋白水解速度，即氨基酸形成的速度的情況下，糖含量尤其是形成、積累和存在于水解反應(yīng)系統(tǒng)中的還原糖的含量被選擇性地降低，且存在于最終得到的反應(yīng)產(chǎn)品中的還原糖比例可被調(diào)整到反應(yīng)產(chǎn)品中總固體含量的5％或更低。
另外，從15℃～39℃的溫度范圍內(nèi)進(jìn)行的反應(yīng)轉(zhuǎn)換到40～60℃的溫度范圍內(nèi)進(jìn)行的反應(yīng)的時間被設(shè)置為，當(dāng)反應(yīng)進(jìn)行到從反應(yīng)開始到反應(yīng)完成所需的總反應(yīng)時間的10％～60％的時候。結(jié)果，在基本上不影響蛋白水解速度，即氨基酸形成的速度的情況下，糖含量，尤其是形成、積累和存在于水解反應(yīng)系統(tǒng)中的還原糖的含量被選擇性地降低，且存在于最終得到的反應(yīng)產(chǎn)品中的還原糖比例可被調(diào)整到反應(yīng)產(chǎn)品中總固體的含量5％或更低。
根據(jù)反應(yīng)產(chǎn)品的總固體含量，調(diào)整存在于最終反應(yīng)產(chǎn)品中的還原糖比例到5％或更低，由此所得到的水解反應(yīng)產(chǎn)品能長期穩(wěn)定地維持其質(zhì)量而不變褐。
圖4是一線形圖，顯示了使用上述試驗產(chǎn)品和對照產(chǎn)品進(jìn)行的劇烈加熱試驗的結(jié)果，對照產(chǎn)品是在水解反應(yīng)期間不改變反應(yīng)溫度、整個反應(yīng)過程一直在45℃進(jìn)行所得到的。
在圖4中，縱坐標(biāo)表示波長為545nm的光吸收的增長速度，橫坐標(biāo)表示溫度維持在105℃的時間。此外，圖4中的空箭頭表明產(chǎn)品的褐變能被顯著地抑制，如這個箭頭的下垂度顯示的那樣。
劇烈加熱試驗的進(jìn)行是在密封狀態(tài)下，將液體產(chǎn)品和調(diào)整到20％白利糖度的對照液體產(chǎn)品在105℃下維持6小時。這種試驗條件相當(dāng)于產(chǎn)品維持在室溫12個月的條件。這表明即使產(chǎn)品貯存12個月，仍能保持穩(wěn)定的質(zhì)量而不變褐。
在水解反應(yīng)中，兩種類型溫度范圍的設(shè)置、溫度轉(zhuǎn)換時間的設(shè)置及存在于最終反應(yīng)產(chǎn)品中的還原糖比例是從用不同的植物蛋白原料和不同條件下、大量不同菌種的液體清酒曲所進(jìn)行的大量詳細(xì)試驗所得的結(jié)果歸納確定的。
此外，根據(jù)這些詳細(xì)的實驗結(jié)果，盡可能清楚地區(qū)分上述兩種類型的溫度范圍是可取的。即水解反應(yīng)先在相對低的溫度條件下開始，在溫度改變后，反應(yīng)在相對高的溫度條件下進(jìn)行是可取的。此外，考慮到在許多情況下水解反應(yīng)所需的總時間大約是24小時，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)溫度轉(zhuǎn)換的時間設(shè)置在從反應(yīng)開始后大約8小時的時候，即經(jīng)過了大約30％的預(yù)期總時間的時候，由此可得到好的結(jié)果。此外，存在于反應(yīng)終產(chǎn)品中的還原糖比例應(yīng)該是總固體含量的5％或更低，優(yōu)選3％或更低，更優(yōu)選1.5％或更低。即5％的比例是其上限。
因此，至于用某一種具體的植物蛋白原料、液體清酒曲和溫度轉(zhuǎn)換時間的設(shè)置進(jìn)行水解反應(yīng)時，使用的兩種溫度范圍，必須根據(jù)具體的蛋白原料，在上述范圍內(nèi)進(jìn)行初步的試驗，以確定最適范圍和值。
在上述水解反應(yīng)條件下獲得的水解產(chǎn)物是一種淡黃色、半透明液體，有清酒曲霉菌細(xì)胞分散于其中。在添加活性炭進(jìn)行脫色和除臭處理后，通過固液分離得到的一種淡黃色、清澈的液體是一種氨基酸溶液，該溶液具有濃烈的、令人愉快的味道，沒有特別的令人不愉快的味道或令人討厭的氣味。
通過上述水解反應(yīng)得到的酶水解蛋白溶液可被直接用作調(diào)味品原料。但是，在許多情況下，該溶液要經(jīng)過脫色、除臭處理，例如活性炭處理，或純化處理，如為制備一種產(chǎn)品而進(jìn)行的濃縮處理。此外，根據(jù)使用目的，它可被制成濃縮膏狀物、小薄片粉末、噴霧干燥粉末、顆?；蛄⒎襟w大塊。在水解反應(yīng)步驟中，偶爾沒有用抑菌物質(zhì)如氯化鈉所得到的產(chǎn)品，除了具有不容易變褐的特性外還具有多種用途的特征，得到廣泛的接受。
附圖簡述圖1是一個線形圖，表明在熱水中小麥蛋白分散物的粘度與溫度的關(guān)系。
圖2是一個線形圖，表明在不同反應(yīng)溫度下，水解反應(yīng)系統(tǒng)中形成和積累的谷氨酸的濃度與時間的關(guān)系。
圖3是一個線形圖，表明在不同反應(yīng)溫度下，水解反應(yīng)系統(tǒng)中形成和積累的葡萄糖的濃度與時間的關(guān)系。
圖4是一個線形圖，表明在反應(yīng)期間通過轉(zhuǎn)換溫度所得的產(chǎn)品與不轉(zhuǎn)換溫度條件所得的產(chǎn)品在進(jìn)行劇烈加熱試驗中，光吸收的增加有顯著區(qū)別。
實施本發(fā)明的最佳方式通過參考本發(fā)明的具體實施例來說明本發(fā)明。并且以下實施例不限制本發(fā)明的技術(shù)范圍。
例1抗褐變的小麥谷蛋白水解產(chǎn)物的生產(chǎn)。
(小麥谷蛋白的乳化預(yù)處理)將400升自來水引入1000升的、連接有乳化器的罐中，用沖擊剪切式Homoicline Mill(Tokushu Kikako K K提供)進(jìn)行乳化。加熱罐中的水。當(dāng)水溫達(dá)到95℃時，開始乳化操作。將20公斤的活性小麥谷蛋白加入罐中，操作開始后，小麥谷蛋白在30分鐘內(nèi)變成一種完全乳化的分散物，此時，小麥谷蛋白特有的粘彈性消失。在低倍放大的顯微鏡視野中，根本觀察不到這種分散物中的小麥谷蛋白凝聚成塊和含有氣泡。
乳化分散物中小麥谷蛋白粒子的直徑平均為150um，最小的10um，最大的900um。此外，小麥谷蛋白粒子的濃度為50g/l。
(生產(chǎn)液體清酒曲的脫脂大豆的預(yù)處理)經(jīng)初步粉碎未變質(zhì)的脫脂大豆得到的脫脂大豆粉末，在用一種能進(jìn)行加熱處理的混合器混合時，在98℃加熱處理20分鐘。
(生產(chǎn)液體清酒曲的脫脂大豆的滅菌處理)將3千克熱處理過的脫脂大豆粉末，加入到已經(jīng)裝入生產(chǎn)氨基酸產(chǎn)品的深層培養(yǎng)發(fā)酵罐的200升溫度為25℃的水中，同時攪拌，以獲得均勻的、無氣泡的脫脂大豆粉的分散物。隨后，該分散物進(jìn)行分批滅菌，用高溫蒸汽在120℃滅菌20分鐘。
(液體清酒曲的生產(chǎn))在這種熱滅菌的脫脂大豆粉末分散物中，接種1％體積的清酒曲霉菌種子培養(yǎng)物，該霉菌為米曲霉(Aspergillus oryzae ATCC15240)，種子培養(yǎng)物是在5升的發(fā)酵罐中、裝入含1.5％的脫脂大豆粉培養(yǎng)基、接種104/ml的清酒曲霉菌孢子后培養(yǎng)得到的。接種后，在通氣率為1/4vvm、攪拌速度為520rpm、30℃條件下培養(yǎng)24小時獲得液體清酒曲。
(液體清酒曲的評價)最終的液體清酒曲的蛋白酶活性為304單位/ml，除了清酒曲霉菌外，既沒有觀察到除清酒曲霉以外的細(xì)菌污染，也沒有觀察到它們的生長。
(小麥谷蛋白的水解)用上述方法獲得的乳化了的小麥谷蛋白分散物全部轉(zhuǎn)入一個用于氨基酸產(chǎn)品生產(chǎn)的1000升發(fā)酵罐中。隨后，這種小麥谷蛋白分散物進(jìn)行分批熱滅菌，用高溫蒸汽在120℃滅菌20分鐘。完成熱滅菌后，當(dāng)溶液溫度降低至50℃時，在其中加入1/2數(shù)量的液體清酒曲。水解反應(yīng)從反應(yīng)開始到第8小時，通氣率為1/4vvm，攪拌速度為200 rpm，同時控制分散物的溫度為35℃，水解反應(yīng)的第8小時到第24小時反應(yīng)完成，不通氣，同時控制分散物的溫度為45℃。
在反應(yīng)期間，從反應(yīng)開始，反應(yīng)系統(tǒng)中用谷氨酸濃度表示的氨基酸濃度持續(xù)地增加。同時，在反應(yīng)的前3小時，反應(yīng)系統(tǒng)中用葡萄糖濃度表示的還原糖濃度迅速地增加，并在反應(yīng)的3～8小時基本上維持在最大值。然而從第8小時，當(dāng)反應(yīng)系統(tǒng)中分散物的溫度升高、維持并控制在45℃時，隨著反應(yīng)的繼續(xù)進(jìn)行，還原糖濃度急劇地下降。到24小時反應(yīng)完成時，葡萄糖濃度降低至反應(yīng)產(chǎn)品總固體含量的1.0％或更低。
(作為對照的小麥谷蛋白的水解)將200升上述方式所得的乳化小麥谷蛋白分散物裝入到1000升用于氨基酸發(fā)酵的發(fā)酵罐中。然后，用高溫蒸汽進(jìn)行分批熱滅菌，在120℃滅菌20分鐘。熱滅菌后，當(dāng)分散物的溫度降至50℃時，在其中加入1/2數(shù)量的液體清酒曲。水解反應(yīng)在通氣、攪拌的條件下進(jìn)行，同時始終維持分散物的溫度為45℃，從反應(yīng)開始到反應(yīng)結(jié)束的整個24小時期間不進(jìn)行溫度轉(zhuǎn)換。
反應(yīng)期間，從反應(yīng)開始，在反應(yīng)系統(tǒng)中用谷氨酸濃度表示的氨基酸濃度持續(xù)地增加。同時，從反應(yīng)開始至第3小時，反應(yīng)系統(tǒng)中用葡萄糖濃度表示的還原糖濃度迅速地增加，并在反應(yīng)8小時至24小時反應(yīng)完成時，基本上維持在最大值。到24小時反應(yīng)完成時，葡萄糖濃度達(dá)到6.6％。已經(jīng)確定，與上述在反應(yīng)期間增加和控制溶液溫度的情況相比，在整個反應(yīng)期間谷氨酸濃度趨向于增加得要緩慢一些。
(獲得的水解產(chǎn)物的儲存試驗)通過上述方法獲得的小麥谷蛋白試驗水解產(chǎn)物(下文稱為試驗產(chǎn)品)和用于比較的小麥谷蛋白對照水解產(chǎn)物(下文稱為對照產(chǎn)品)進(jìn)行離心，以分離和除去其中的清酒曲霉菌細(xì)胞。然后，除去了霉菌細(xì)胞的余液通過一個用于調(diào)制的顆粒狀的活性炭層，獲得純化的水解產(chǎn)物。每種純化的水解產(chǎn)物裝入一個500ml帶有橡皮塞的無色透明玻璃瓶中，瓶的上半部分不留空間。
玻璃瓶中的樣品，儲存于不特別控制溫度、具有散射光的房間內(nèi)，在裝入后立即肉眼觀察褐變的發(fā)生和進(jìn)展?fàn)顩r和在1周、2周、1個月、3個月、6個月及12個月后觀察褐變的發(fā)生和進(jìn)展?fàn)顩r。表1顯示了褐變的結(jié)果，同時也顯示了各儲存期后打開橡皮塞時味道的變化狀況。在表1中，“褐變”欄中的“+”分5個等級表示評價結(jié)果。即褐變最嚴(yán)重的狀況定義為5，可輕微觀察到的褐變狀況定義為1。此外，“燒焦味”欄中的“+”分5個等級表示評價結(jié)果。即褐變伴隨有刺激性味道，所謂“燒焦味”顯著地發(fā)生的狀況定義為5，輕微發(fā)現(xiàn)有“燒焦味”的狀況定義為1。順便提及，評價由5位專家進(jìn)行。專家給的評價分?jǐn)?shù)被平均并四舍五入。所得的分?jǐn)?shù)用“+”的數(shù)目表示。
表1小麥谷蛋白水解產(chǎn)物的褐變

如表1所示，試驗產(chǎn)品甚至儲存12個月后，褐變程度微弱，且很少發(fā)現(xiàn)燒焦味的發(fā)生。由此，判斷試驗產(chǎn)品維持了滿意的商業(yè)價值。同時，在對照產(chǎn)品中，裝瓶后立即觀察就已發(fā)現(xiàn)了褐變的跡象，而且發(fā)現(xiàn)了燒焦味的存在，盡管微弱。1個月后，清楚地發(fā)現(xiàn)了褐變和“燒焦味”。3個月后，顯著地發(fā)現(xiàn)了褐變和“燒焦味”。因此，判斷對照產(chǎn)品極度地?fù)p害了商業(yè)價值。
例2來源于其它植物蛋白原料的抗褐變的水解蛋白的生產(chǎn)。
用如例1中的同樣方式從玉米谷蛋白和脫脂大豆生產(chǎn)抗褐變的水解蛋白。
(植物蛋白原料的預(yù)處理)來源于美國明尼蘇達(dá)州的粉狀玉米谷蛋白，如例1中的方式進(jìn)行乳化。此外，粉碎未變質(zhì)的脫脂大豆(Toyo seiyu K.K.提供)，然后如例1中的方式進(jìn)行乳化。任何一種以上的乳化產(chǎn)品既沒有凝聚成塊，也根本觀察不到包含和存在有氣泡。
(液體清酒曲的生產(chǎn))如例1中的同樣方式用脫脂大豆粉生產(chǎn)液體清酒曲。
(植物蛋白原料的水解)玉米谷蛋白的乳化分散物和脫脂大豆的乳化分散物分別被轉(zhuǎn)入30KL的發(fā)酵罐中，滅菌。當(dāng)分散物的溫度降至50℃時，如例1中的方式加入液體清酒曲到每一發(fā)酵罐。水解反應(yīng)的條件與例1中的一樣。即水解反應(yīng)從反應(yīng)開始到第8小時，通氣、攪拌、同時控制分散物的溫度為35℃。從第8小時至第24小時反應(yīng)完成，不通氣、同時控制分散物溫度為45℃。在水解反應(yīng)完成后，反應(yīng)產(chǎn)品中的葡萄糖濃度是反應(yīng)產(chǎn)品總固體含量的0.9％。
(作為對照的植物原始原料的水解)根據(jù)上述方法所得的玉米谷蛋白乳化分散物和脫脂大豆乳化分散物分別被轉(zhuǎn)入30KL發(fā)酵罐，滅菌。當(dāng)分散物的溫度降至50℃時，加入液體清酒曲到每一發(fā)酵罐。水解反應(yīng)在攪拌下進(jìn)行，同時控制溫度為45℃，從反應(yīng)開始到反應(yīng)結(jié)束的24小時期間不進(jìn)行溫度轉(zhuǎn)換。當(dāng)水解反應(yīng)完成時，反應(yīng)產(chǎn)品中的葡萄糖濃度是總固體含量的6.4％。
(水解終產(chǎn)物的儲存試驗)用例1中的同樣方式進(jìn)行水解終產(chǎn)物的儲存試驗。其比較結(jié)果顯示于表2、表3。
表2玉米谷蛋白水解產(chǎn)物的褐變

表3脫脂大豆水解產(chǎn)物的褐變

如表2、表3所示，在玉米谷蛋白和脫脂大豆的試驗產(chǎn)品中，甚至12個月后，褐變程度微弱且燒焦味的發(fā)生很少發(fā)現(xiàn)，這樣，判斷試驗產(chǎn)品維持了滿意的商業(yè)價值。同時，在它們的對照產(chǎn)品中，裝瓶后立即觀察就已發(fā)現(xiàn)了褐變跡象，盡管與試驗產(chǎn)品比較只有輕微的區(qū)別，且發(fā)現(xiàn)了燒焦味的存在，盡管微弱。1個月后，清楚地發(fā)現(xiàn)了褐變和“燒焦味”。3個月后，顯著地發(fā)現(xiàn)了褐變和“燒焦味”。因此，判斷對照產(chǎn)品極度地?fù)p害了商業(yè)價值。
工業(yè)實用性按照本發(fā)明的方法，用一種真菌培養(yǎng)物、在一個液體反應(yīng)系統(tǒng)中用植物蛋白原料生產(chǎn)的水解蛋白能長期不變褐而維持穩(wěn)定的商業(yè)價值。
權(quán)利要求
1．在液體反應(yīng)系統(tǒng)中，用真菌培養(yǎng)物進(jìn)行含糖植物蛋白原料的酶水解而生產(chǎn)水解蛋白的方法，包括混合植物蛋白原料和真菌培養(yǎng)物，首先在15℃～39℃的溫度范圍內(nèi)、在通氣、攪拌條件下進(jìn)行反應(yīng)，然后，在停止通氣后，在40℃～60℃的溫度范圍內(nèi)進(jìn)行和完成反應(yīng)。
2．權(quán)利要求1的生產(chǎn)水解蛋白的方法，其中，植物蛋白原料選自小麥谷蛋白、玉米谷蛋白脫脂大豆及其處理產(chǎn)品。
3．權(quán)利要求1的生產(chǎn)水解蛋白的方法，其中，當(dāng)反應(yīng)進(jìn)行到從反應(yīng)開始至反應(yīng)結(jié)束所需總反應(yīng)時間的10％～60％時，反應(yīng)從15℃～39℃轉(zhuǎn)換到40℃～60℃進(jìn)行。
4．權(quán)利要求1的生產(chǎn)水解蛋白的方法，其中，在反應(yīng)完成時，存在于獲得的反應(yīng)產(chǎn)品中的還原糖比例被調(diào)整到反應(yīng)產(chǎn)品中總固體含量的5％或更低。
5．權(quán)利要求1的生產(chǎn)水解蛋白的方法，其中，真菌培養(yǎng)物的制備和植物蛋白原料的水解在一深層培養(yǎng)罐型反應(yīng)容器中進(jìn)行。
6．生產(chǎn)水解蛋白的方法，其中，植物蛋白原料至少部分呈固體狀態(tài)，在酶水解之前，先被粉碎到300um或更細(xì)，分散于高于80℃的熱水中，在含于粉碎產(chǎn)品中的空氣氣泡基本上被除去后立即進(jìn)行滅菌。
全文摘要
本發(fā)明涉及到一種能防止水解蛋白褐變的方法,該水解蛋白是通過植物蛋白原料酶水解而獲得的。在液體反應(yīng)系統(tǒng)中,含糖植物蛋白原料和真菌培養(yǎng)物混合,進(jìn)行酶的水解作用。首先,反應(yīng)在15℃～39℃的溫度范圍內(nèi)、通氣、攪拌條件下進(jìn)行,然后,在停止通氣后,在40℃～60℃的溫度范圍內(nèi)進(jìn)行和完成反應(yīng)。
文檔編號A23L1/238GK1298454SQ9980557
公開日2001年6月6日 申請日期1999年4月23日 優(yōu)先權(quán)日1998年4月30日
發(fā)明者中村通伸, 關(guān)光義, 繩田美代子, 中澤英次, 岡村英喜 申請人:味之素株式會社