專利名稱：玻璃微纖維柱及用其制備和純化質(zhì)粒dna的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及玻璃微纖維(GF)柱和用其制備和純化質(zhì)粒DNA的方法。更具體的是，本發(fā)明涉及將硼硅酸鹽或硅酸鹽玻璃微纖維與鹽酸胍聯(lián)合物用作DNA結(jié)合材料，從而在短時間內(nèi)制備和純化大量高純度DNA。
背景技術(shù)：
質(zhì)粒DNA是分子生物學(xué)中最基本的材料之一。因此，純化的質(zhì)粒DNA的制備是分子生物學(xué)研究中最常用的技術(shù)。本領(lǐng)域中已知許多質(zhì)粒DNA的手工制備方法，而且現(xiàn)在已在許多實驗室中被使用。然而，這些手工方法太耗時，且不可靠。另一方面，經(jīng)費富裕的實驗室購買DNA制備試劑盒，例如Qiagen,Germany和Promega,U.S.A.出售的那些。通常，這些產(chǎn)品利用了質(zhì)粒DNA可結(jié)合硅膠的優(yōu)點。
Volgelstein和Gillespie在他們的文章中公開了一種從瓊脂糖凝膠中分離DNA的方法(1977)。根據(jù)該方法，DNA結(jié)合在燧石玻璃上，該玻璃形式為大燧石玻璃顆粒，中等燧石玻璃顆?；蜢菔ＡХ?，而且DNA與燧石玻璃的結(jié)合可在NaI溶液中鑒定?；谠撛淼漠a(chǎn)品已經(jīng)投入市場，其品牌名稱為玻璃牛奶(glassmilk)，使得從瓊脂糖凝膠中分離DNA變得容易。至于DNA分離效果，發(fā)現(xiàn)燧石玻璃粉具有最有效的DNA結(jié)合能力，而中等燧石玻璃顆粒顯示DNA結(jié)合能力顯著下降。最差的是大燧石玻璃顆粒。換言之，隨著燧石玻璃顆粒大小的增加，DNA分離效果降低。
另外，開發(fā)了其它材料，包括大硼硅酸鹽玻璃顆粒，玻璃纖維濾膜和多孔玻璃珠，根據(jù)它們的結(jié)合能力可用來分離DNA。然而，這些材料也有它們自己的弱點。例如，大硼硅酸鹽玻璃顆粒和大燧石玻璃一樣，不能有效結(jié)合DNA。玻璃纖維濾膜的DNA結(jié)合很弱，因此以小體積制備得到的DNA太少，以致于不能使用。對于多孔玻璃珠，得到卓越的DNA結(jié)合力，但結(jié)合DNA耗時很長。當要從多孔玻璃珠回收DNA時，發(fā)生DNA降解。另外，回收率太低，因此其量不夠作定量分析。
當然，硅膠在DNA結(jié)合上像燧石玻璃粉一樣很有效。然而其在技術(shù)操作和DNA制品產(chǎn)量上有問題。無論如何，硅膠現(xiàn)在已用于DNA制備柱試劑盒并被一些公司(例如Qiagen和Promega)商品化。由于產(chǎn)物采用基于重力流動的過柱方式，因此其DNA制備需要很長時間。另外，使用的樹脂漿要用額外純化程序從DNA中除去。此外，采用現(xiàn)有的DNA制備試劑盒獲得的DNA溶液不是完全無內(nèi)切核酸酶的，因此可在長期儲藏中發(fā)生自身降解?，F(xiàn)有產(chǎn)品的另一個顯著問題是它們不能保證沒有蛋白雜質(zhì)(例如內(nèi)毒素)存在于制備的DNA中。如果在制備的DNA溶液中含有內(nèi)毒素，當DNA載體轉(zhuǎn)染入哺乳動物細胞時會引起細胞毒性，導(dǎo)致細胞死亡和細胞免疫應(yīng)答。因此需要更純的DNA制品用于動物轉(zhuǎn)染。制備動物試驗用DNA的商品化試劑非常昂貴。因此，對能用于制備高純度質(zhì)粒DNA以轉(zhuǎn)染動物，但不昂貴的試劑有強烈需要。
DNA純化的例子包括分離放射性標記探針，純化PCR產(chǎn)物，以及從DNA制備物中除去RNA和蛋白雜質(zhì)例如內(nèi)切核酸酶和內(nèi)毒素。另外，DNA純化可應(yīng)用于細胞增殖試驗。例如，當將在含同位素的培養(yǎng)液中生長的細胞離心沉降加到DNA制備柱中時，未被細胞攝取的同位素通過柱；只有細胞攝取的同位素被柱捕獲。因此，不用任何其它昂貴儀器就可定量測定細胞攝取的同位素。
本發(fā)明公開內(nèi)容記住上述背景，本發(fā)明者重復(fù)了對DNA制備和純化的深入細致與廣泛的研究，導(dǎo)致發(fā)現(xiàn)硼硅酸鹽和鹽酸胍聯(lián)合物具有強DNA結(jié)合能力。本發(fā)明的基礎(chǔ)在于硼硅酸鹽的各種優(yōu)點。硼硅酸鹽在化學(xué)和物理學(xué)上是惰性的，在弱酸和弱堿中穩(wěn)定。它的1.0微米顆粒顯示了卓越的吸濕效力。另外，硼硅酸鹽具有優(yōu)良的除去雜質(zhì)的能力，它即使在長時間內(nèi)也不會被微生物污染，而且即使吸附容量小也能提供精確的分析結(jié)果。通過與硅膠的比較證實了本發(fā)明在DNA結(jié)合能力上的優(yōu)越。已發(fā)現(xiàn)鹽酸胍與硼硅酸鹽混合物的DNA結(jié)合能力比硅膠高2-4倍。本發(fā)明通過使用硼硅酸鹽與鹽酸胍混合物作為一種DNA制備和純化試劑盒的樹脂而得以實現(xiàn)。
因此，本發(fā)明的一個目的是克服現(xiàn)有技術(shù)碰到的上述問題，并提供用于質(zhì)粒DNA制備和純化的柱試劑盒，用其可在短時間內(nèi)簡便的獲得大量高純度DNA材料。
本發(fā)明的另一個目的是提供制備這種用于質(zhì)粒DNA制備和純化的柱試劑盒的方法。
本發(fā)明的另一個目的是提供一種DNA制備和純化方法，該方法可應(yīng)用于從瓊脂糖凝膠或聚丙烯酰胺凝膠中純化DNA，純化放射性標記探針，制備PCR產(chǎn)物，純化制備的質(zhì)粒DNA，制備基因組DNA，制備RNA，以及對攝取入細胞內(nèi)的同位素進行定量。
在本發(fā)明中，制造了用于微型、中型和大型質(zhì)粒DNA制備試劑盒的硼硅酸鹽玻璃微纖維多層柱，以及用于DNA制備的硼硅酸鹽玻璃微纖維膜/顆粒雙層柱。使用該試劑盒，制備了高純度質(zhì)粒DNA，并用于不同試驗，包括將純化的DNA轉(zhuǎn)染和轉(zhuǎn)導(dǎo)入細胞、35S dATP堿基測序和自動化堿基測序分析、制備的PCR產(chǎn)物的堿基測序分析以及表達純化的DNA，從而證實了本發(fā)明DNA制備試劑盒的優(yōu)越性。
附圖簡述

圖1a是分解圖，顯示本發(fā)明的硼硅酸鹽玻璃微纖維微型柱試劑盒；圖1b是橫截面視圖，顯示圖1a的柱試劑盒的已裝配狀態(tài)；圖2是柱狀圖，其中繪出了相對于硼硅酸鹽玻璃微纖維膜厚度的質(zhì)粒DNA制品產(chǎn)量。
圖3a是分解圖，顯示本發(fā)明的硼硅酸鹽玻璃微纖維大型柱試劑盒；圖3b是橫截面視圖，顯示圖3a的柱試劑盒的已裝配狀態(tài)；圖4a是分解圖，顯示玻璃微纖維膜/顆粒中型柱試劑盒；圖4b是橫截面視圖，顯示圖4a的柱試劑盒的已裝配狀態(tài)；圖5是柱狀圖，其中繪出了相對于中型柱試劑盒的玻璃微纖維膜/顆粒雙層厚度的質(zhì)粒DNA制品產(chǎn)量。
圖6是柱狀圖，其中繪出了相對于硼硅酸鹽和硅酸鹽玻璃微纖維濾膜厚度的質(zhì)粒DNA制品產(chǎn)量；圖7是通過本發(fā)明柱試劑盒制備的質(zhì)粒DNA用限制性酶消化和在瓊脂糖凝膠上電泳后拍攝的照片；圖8是通過本發(fā)明柱試劑盒制備的DNA的35S dATP測序自顯影圖；圖9a是顯微照片，其中用常規(guī)柱試劑盒制備的、含β-半乳糖苷酶基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細胞通過染色鑒定到的β-半乳糖苷酶表達；圖9b是顯微照片，其中用本發(fā)明柱試劑盒制備的，含β-半乳糖苷酶基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的細胞通過染色鑒定到的β-半乳糖苷酶表達；圖10是自動測序分析照片，從通過本發(fā)明柱試劑盒用T7引物制備的pGEM 7Z獲得；圖11是自動測序分析照片，從通過本發(fā)明柱試劑盒用SP7引物制備的pGEM 7Z獲得；圖12是用通過本發(fā)明柱試劑盒制備的質(zhì)粒DNA作為模板，獲得的PCR產(chǎn)物，在瓊脂糖凝膠上電泳后的照片；圖13是質(zhì)粒DNA用RNase處理但不用乙醇處理，并通過本發(fā)明柱試劑盒，隨后電泳得到的照片；以及圖14是從瓊脂糖凝膠上切下的DNA條帶，通過本發(fā)明柱試劑盒純化，并電泳后的照片。
實施本發(fā)明的最佳模式在本發(fā)明中，根據(jù)制備能力提供了不同的DNA制備和純化試劑盒。為此目的，制造了含有硼硅酸鹽玻璃微纖維膜或玻璃微纖維膜與顆?；旌衔锏闹?。例如，制造了用于DNA微型和大型制備的硼硅酸鹽玻璃微纖維多層柱，以及用于DNA中型制備的硼硅酸鹽玻璃微纖維基質(zhì)柱。用這些柱試劑盒，可高產(chǎn)量制備高純度質(zhì)粒DNA。因為本發(fā)明的柱試劑盒在結(jié)合DNA上非常優(yōu)秀，它們不僅能用于制備細菌質(zhì)粒DNA，還能從不同污染物或基質(zhì)材料中純化DNA。例如，用常規(guī)方法獲得的質(zhì)粒DNA可進一步通過本發(fā)明的柱試劑盒純化。另外，該柱試劑盒可應(yīng)用于從瓊脂糖凝膠和聚丙烯酰胺凝膠中純化DNA。例如對于PCR產(chǎn)物，在它們在瓊脂糖凝膠上電泳后，從凝膠上切下所需DNA條帶，并通過本發(fā)明的柱試劑盒得到。當然，本發(fā)明柱試劑盒的純化能力對聚丙烯酰胺凝膠中的DNA條帶也是有效的。
通過本發(fā)明柱試劑盒獲得的高質(zhì)量DNA制備物在高級分子生物學(xué)研究中是十分有用的，包括基因克隆，轉(zhuǎn)染入哺乳動物細胞和轉(zhuǎn)導(dǎo)，堿基測序分析，PCR，放射性標記DNA探針定量，用放射性標記DNA進行細胞增殖生物試驗等。
下列實施例是用來更清楚的對本領(lǐng)域技術(shù)人員闡明本發(fā)明的原理和實踐。同樣的，它們不意味限制了本發(fā)明，只是說明一些優(yōu)選例。
實施例ⅠGF柱的制造和質(zhì)粒DNA的純化實驗性實施例1用于DNA微型制備試劑盒的GF多層膜柱的制造及其用途如圖1a所示，首先，將硼硅酸鹽玻璃微纖維膜切成直徑8毫米的圓，并堆疊在直徑為13毫米、深31毫米的旋轉(zhuǎn)微型柱11中，形成高2-10毫米的多層結(jié)構(gòu)13。然后，將直徑7.5毫米的環(huán)12插入該柱中，以固定多層GF結(jié)構(gòu)，然后將該組合件蒸汽滅菌。為了使用，將制造的GF柱插入收集管10中。圖1b顯示了柱11在收集管10中的組裝情況。
為了檢測可獲得最高純度最大量DNA的玻璃微纖維多層膜的最適厚度，制備了不同柱，其多層膜各相差2毫米。使用這些柱制備質(zhì)粒DNA，結(jié)果描述于圖2。如該圖中所見，當多層膜厚8毫米時，可得到最大量(200微克)。10毫米或厚于10毫米的膜厚度不能使DNA產(chǎn)量進一步提高。
實驗性實施例2用于DNA大型制備試劑盒的GF多層膜柱的制造及其用途用與實驗性實施例1相似方法制造了用于DNA大型制備試劑盒的玻璃微纖維多層膜柱。如圖3a所示，在深86毫米，直徑22毫米的大柱31中裝入大約1克切成直徑22毫米圓形的硼硅酸鹽玻璃微纖維膜33，圓形膜用十字圖案環(huán)32固定。為了使用，用50毫升錐形管作為收集管30。圖3b顯示大GF柱31在收集管30中的組裝情況。
使用該大柱，可以從250毫升大腸桿菌培養(yǎng)液中獲得大約1.2ml質(zhì)粒DNA。
實驗性實施例3用于微型和中型試劑盒的GF膜/顆粒柱的制造及其用途將硼硅酸鹽玻璃微纖維與溶于pH7.5、10mM Tris/HCl的lmM EDTA溶液在混合器中混合得到玻璃微纖維顆粒懸液。如圖4a所示，在高80毫米，直徑15毫米的聚丙烯酰胺柱中，將直徑8毫米的玻璃微纖維膜24堆疊至高2毫米，然后在其中裝入玻璃微纖維顆粒懸液。該內(nèi)容物用搖擺轉(zhuǎn)子離心機離心沉降，以形成玻璃微纖維膜/顆粒雙層柱，然后用直徑8毫米的玻璃環(huán)固定，蒸汽滅菌。為了使用，將該柱連接一個Effendorf管21，然后置于收集管20中。圖4b顯示該柱的組裝情況。
檢測了相對于玻璃微纖維膜/顆粒雙層柱深度的質(zhì)粒DNA制品產(chǎn)量，結(jié)果在圖5中給出。如所見，當深度為8毫米時，得到最大產(chǎn)量。
用裁紙刀將硼硅酸鹽玻璃微纖維膜切成直徑3毫米或更小的顆粒。將這些樹脂以大約0.1g裝入微型柱中，以0.42g裝入中型柱，然后在柱上加上4.2M鹽酸胍，離心沉降得到活性柱。微型柱能以大約100微克量制備質(zhì)粒DNA，而中型柱可制備大約200微克的質(zhì)粒DNA。在下文表1中，顯示了當使用這些柱時獲得的質(zhì)粒DNA制品的產(chǎn)量和純度。
表1質(zhì)粒DNA純度和制品產(chǎn)量

實驗性實施例4用硼硅酸鹽GF柱和用硅酸鹽GF柱制備的DNA制品產(chǎn)量為了檢測硼硅酸鹽和硅酸鹽吸附力的差異，將硼硅酸鹽玻璃微纖維柱的DNA制品產(chǎn)量與硅酸鹽玻璃微纖維柱的比較。如實驗性實施例1中制造該柱，并用于從大腸桿菌培養(yǎng)液中制備質(zhì)粒DNA。分析了獲得的質(zhì)粒DNA的產(chǎn)量和純度，結(jié)果描述于圖6。如圖所見，硅酸鹽玻璃微纖維的DNA制品產(chǎn)量比硼硅酸鹽玻璃微纖維柱的低約20％。分光光度計測定用硅酸鹽玻璃微纖維柱獲得的質(zhì)粒DNA純度大約為1.5(OD260/OD280)，而用硼硅酸鹽玻璃微纖維柱制備的質(zhì)粒DNA純度在1.7到1.8范圍之間。
實驗性實施例5用硅膠柱和用硅膠/硅酸鹽GF雙層柱制備的DNA制品產(chǎn)量和純度如實驗性實施例3中所示，在5根中型柱中每根都形成2毫米厚的硼硅酸鹽玻璃微纖維膜/顆粒層，然后在其上形成6毫米厚的硅膠層。通過這些柱的幫助制備了質(zhì)粒DNA，并如實驗性實施例2分析了其純度和產(chǎn)量。結(jié)果在下表2中給出，表明在硅膠上加入硼硅酸鹽玻璃微纖維層，與單用硅膠比較，顯著了提高DNA制品的產(chǎn)量和純度。
在下列實施例中，使用的所有質(zhì)粒DNA是通過硅酸鹽玻璃微纖維柱制備的。表2質(zhì)粒DNA的純度和制品產(chǎn)量

實施例Ⅱ質(zhì)粒DNA的制備使用實施例Ⅰ制造的GF微型柱試劑盒、GF中型柱或GF大型柱試劑盒制備了質(zhì)粒DNA。首先，在肉湯中培養(yǎng)帶有某種質(zhì)粒的大腸桿菌菌株，離心培養(yǎng)液，得到(粒狀)沉淀。將該細胞沉淀用緩沖液A(50mM Tris,10mM EDTA pH8.0,100微克/ml RNaseA)懸浮，用緩沖液B(20mM NaOH,1.0％SDS(w/v))裂解，并用緩沖液C(3.2mM醋酸鉀，pH5.0)中和。離心該中和裂解液，將上清液加到GF柱試劑盒上(該柱先前用鹽酸胍活化)，使DNA結(jié)合到柱上。除去核酸酶后，洗滌并洗脫結(jié)合的DNA。為了除去核酸酶，使用了4.2M鹽酸胍。作為洗滌液，使用了10mMTris/HCl(pH7.5),50mMNaCl,0.1mM EDTA,70％乙醇。
實施例Ⅲ分子生物學(xué)試驗和分析實驗性實施例1用限制性酶消化用限制性酶EcoRⅠ和HindⅢ處理實施例Ⅱ中制備的質(zhì)粒DNA，并在瓊脂糖凝膠上與完整質(zhì)粒DNA一起電泳。如圖7中所見，制備的質(zhì)粒DNA清楚的已被內(nèi)切核酸酶消化。
實驗性實施例2:35S dATP測序分析使實施例Ⅱ中制備的10微克質(zhì)粒DNA與測序試劑盒(例如United StatesBiochemical出售的試劑盒，稱為SequenaseTM2.0版)反應(yīng)，使用35S dATP作為放射性標記，以及通過Qiagen試劑盒制備的10微克質(zhì)粒DNA作為對照。通過放射性自顯影從測序凝膠上讀出測序結(jié)果。如在圖8中所見，通過本發(fā)明的柱制備的質(zhì)粒DNA的自顯影條帶已清楚的分開，而通過Qiagen試劑盒獲得的條帶未能有效的分開。
實驗性實施例3細胞轉(zhuǎn)染和轉(zhuǎn)導(dǎo)將通過本發(fā)明的柱試劑盒制備的質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染和轉(zhuǎn)導(dǎo)入哺乳動物細胞，而通過Qiagen試劑盒制備的質(zhì)粒DNA用作對照。如圖9b所示，通過本發(fā)明柱試劑盒制備的質(zhì)粒DNA如用染色蛋白質(zhì)所鑒定的那樣，在細胞中得到有效表達。相反，對照DNA顯示微弱表達效率，如圖9a所示。
實驗性實施例4自動堿基測序分析使用ABI PRIMTM染料末端循環(huán)測序讀取反應(yīng)試劑盒(商業(yè)可得自PerkinElmer)進行了自動堿基測序分析。將通過本發(fā)明柱制備的0.4微克模板DNA和3pM引物，以及8微升末端讀取反應(yīng)混合物混合，并調(diào)整到總體積20微升。該溶液進行25輪反應(yīng)，各輪包括在熱循環(huán)儀(例如Bio Rad出售的，稱作Gene CyclerTM)中的96℃/30分鐘，50℃/15秒和60℃/4分鐘。用乙醇沉淀延伸的DNA產(chǎn)物，在真空離心蒸發(fā)濃縮器中干燥，并在自動測序儀(例如Applied Biosystem出售的)中分析。用其中插入了長1.2kbDNA片段的質(zhì)粒pGEM7z作模板。使用了T7或SP6引物。
實驗性實施例5:PCR反應(yīng)和PCR產(chǎn)物的純化使用通過實施例Ⅰ柱制備的CMV-TNF質(zhì)粒DNA作為模板進行了PCR反應(yīng)。將含有20納克CMV-TNF質(zhì)粒，2微升的1mM dNTP,5微升的10x反應(yīng)緩沖液，2UTag聚合酶，和啟動子近側(cè)有義引物或啟動子遠側(cè)有義引物聯(lián)合TNF反義引物的反應(yīng)混合物95℃預(yù)熱2分鐘，然后進行30輪反應(yīng)，每輪包括95℃/1分鐘，55℃/1分鐘和72℃/1分鐘，以及最后在72℃延伸反應(yīng)10分鐘。將反應(yīng)產(chǎn)物分成兩等分。一等分與等體積的4.2M鹽酸胍混合，通過微量DNA純化柱并用WA溶液洗滌。在瓊脂糖凝膠上電泳該純化的DNA，而另一等分作為對照。電泳結(jié)果顯示于圖12。如該圖所見，在用微量DNA純化柱純化的PCR產(chǎn)物泳道中發(fā)現(xiàn)了所有的引物條帶。
實驗性實施例6:DNA純化從三個250毫升體積的培養(yǎng)液中，使用實施例Ⅰ制造的GF基質(zhì)大型柱制備了質(zhì)粒DNA。首先，對第一個培養(yǎng)物應(yīng)用了用WA溶液的典型方法。用乙醇沉淀，不用WA溶液洗滌獲得了第二個培養(yǎng)物的DNA，然后溶解在500微升去離子水中。對于最后一個培養(yǎng)物，如第二個培養(yǎng)物那樣獲得了DNA，等分成250微升的體積。在各等分中加入20微升RNaseA(3mg/ml)，37℃反應(yīng)30分鐘，65℃滅活10分鐘，并通過微量柱。使如此獲得的DNA產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠上電泳，如圖13所示。數(shù)據(jù)在下面表3中給出。如表3數(shù)據(jù)所闡明的，當不用乙醇處理時，可獲得大量的質(zhì)粒DNA，但有RNA污染。另一方面，用RNaseA處理并過柱純化獲得的質(zhì)粒DNA完全無RNA雜質(zhì)，并顯示DNA純度(OD280/OD260)從1.72提高到1.90。因此，本發(fā)明能克服常規(guī)DNA制備方法的嚴重缺點，即，RNA污染和低DNA產(chǎn)量和純度。表3

實驗性實施例7從瓊脂糖凝膠或聚丙烯酰胺凝膠上分離DNADNA溶液在瓊脂糖凝膠/TAE或TBE上電泳，而從膠上切下一條DNA條帶，置于透析袋中，然后在其中裝入TAE溶液，并進行電泳從凝膠上分離DNA。在TAE溶液中加入等體積的4.2M鹽酸胍，并加到本發(fā)明的GF微量柱上。旋轉(zhuǎn)柱并用WA溶液(10mM Tris/HCl pH7.5,30mM EDTA,70％乙醇)洗滌。然后用50微升去離子水旋轉(zhuǎn)洗脫DNA。DNA通過在瓊脂糖凝膠上電泳來鑒定并分析，如圖14所示。
分析結(jié)果總結(jié)于下文表4。根據(jù)這些結(jié)果，本發(fā)明具有下列優(yōu)點。第一，本發(fā)明的柱試劑盒使簡便快速的制備質(zhì)粒DNA成為可能。第二，本發(fā)明的柱試劑盒顯示了極高的DNA制品產(chǎn)量。和常規(guī)旋轉(zhuǎn)柱試劑盒比較，本發(fā)明GF微型柱試劑盒可得到量高約50到100倍(約200微克)的DNA。使用本發(fā)明的GF中型柱試劑盒，能獲得多至400微克的DNA，而GF大型柱試劑盒得到2.2mg質(zhì)粒DNA。第三，通過本發(fā)明柱試劑盒得到的質(zhì)粒DNA的DNA純度(OD260/OD280)用分光光度計測定范圍為1.7到1.9?？捎行е苽滟|(zhì)粒DNA的最大的質(zhì)粒DNA產(chǎn)量的條件見下文表5。最后，核酸酶(其常出現(xiàn)在大腸桿菌的DNA制備物中)，以及碳水化合物(它是出現(xiàn)于JM109菌株的DNA制備物中的污染物)在用本發(fā)明柱試劑盒獲得的DNA制備物中從未被發(fā)現(xiàn)過。表4用GF中型柱試劑盒制備的質(zhì)粒DNA

表5用GF柱試劑盒制備的質(zhì)粒DNA

*GF微型柱和中型柱基質(zhì)類型；GF大型柱多層類型工業(yè)應(yīng)用性如本文上文所述，本發(fā)明的GF柱試劑盒對從細菌培養(yǎng)液中簡便快速的制備大量質(zhì)粒DNA是有用的。該質(zhì)粒DNA純度非常高，因此無需進一步純化就可應(yīng)用于各種高級實驗，例如堿基測序分析、轉(zhuǎn)染和轉(zhuǎn)導(dǎo)、克隆等。另外，本發(fā)明的柱試劑盒可用于從瓊脂糖凝膠或聚丙烯酰胺凝膠中純化DNA，而且其純化能力還可應(yīng)用于分離放射性標記探針，純化PCR產(chǎn)物，從DNA制備物中除去RNA和蛋白質(zhì)雜質(zhì)(例如內(nèi)切核酸酶和內(nèi)毒素)，以及細胞增殖試驗。因此，本發(fā)明在生物醫(yī)藥工業(yè)中非常有價值。
雖然本發(fā)明參照一些優(yōu)選例已作了詳細描述，但可以理解的是，在本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)可進行不同的修改。本發(fā)明除權(quán)利要求的那些外不受限制。
權(quán)利要求
1．一種用于制備和純化DNA的玻璃微纖維多層柱試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括一個柱，該柱中含有樹脂，所述樹脂由多層玻璃微纖維膜形成。
2．一種用于制備和純化DNA的玻璃微纖維基質(zhì)柱試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括一個柱，該柱中含有樹脂，所述樹脂由雙層玻璃微纖維膜和玻璃微纖維顆粒形成。
3．如權(quán)利要求1所述的玻璃微纖維多層柱試劑盒，其特征在于，所述柱包括一個微型旋轉(zhuǎn)柱試管；用于結(jié)合DNA的由玻璃微纖維膜組成的多層樹脂；一個將玻璃微纖維膜固定在微型旋轉(zhuǎn)柱試管中的環(huán)或玻璃；和一個收集通過玻璃微纖維膜的材料的收集管。
4．如權(quán)利要求2所述的玻璃微纖維基質(zhì)柱試劑盒，其特征在于，所述柱包括一個中型柱試管；用于結(jié)合DNA的玻璃微纖維膜和玻璃微纖維顆粒組成的雙層樹脂；一個收集通過雙層樹脂的DNA的、可分離的與中型柱試管配套的1.5ml的微量離心管；一個收集通過雙層樹脂的材料的收集管，在該收集管中安置了所述中型柱和所述1.5ml微量離心管；一個將雙層樹脂固定在所述中型柱試管中的環(huán)或玻璃。
5．如權(quán)利要求1所述的玻璃微纖維多層柱試劑盒，其特征在于，所述玻璃微纖維膜由硼硅酸鹽或硅酸鹽與硼硅酸鹽的混合物形成。
6．如權(quán)利要求1所述的玻璃微纖維多層柱試劑盒，其特征在于，所述玻璃微纖維多層柱試管有微型、中型或大型。
7．如權(quán)利要求2所述的玻璃微纖維基質(zhì)柱試劑盒，其特征在于，所述玻璃微纖維膜和玻璃微纖維顆粒由硼硅酸鹽或硅酸鹽與硼硅酸鹽的混合物形成。
8．如權(quán)利要求1或2所述的柱試劑盒，其特征在于，所述玻璃微纖維基質(zhì)柱試管有微型、中型或大型。
9．一種制備質(zhì)粒DNA的方法，其特征在于，使用權(quán)利要求1所述的玻璃微纖維膜多層柱試劑盒或權(quán)利要求2所述的玻璃微纖維基質(zhì)柱試劑盒。
10．一種從瓊脂糖凝膠或聚丙烯酰胺凝膠中分離DNA的方法，其特征在于，使用權(quán)利要求1所述的玻璃微纖維膜多層柱試劑盒或權(quán)利要求2所述的玻璃微纖維基質(zhì)柱試劑盒。
11．一種定量分析細胞內(nèi)同位素的方法，其特征在于，使用權(quán)利要求1所述的玻璃微纖維膜多層柱試劑盒或權(quán)利要求2所述的玻璃微纖維基質(zhì)柱試劑盒。
12．一種純化DNA的方法，其特征在于，使用權(quán)利要求1所述的玻璃微纖維膜多層柱試劑盒或權(quán)利要求2所述的玻璃微纖維基質(zhì)柱試劑盒來除去DNA中的RNA或蛋白污染物。
13．一種純化放射性標記探針的方法，其特征在于，使用權(quán)利要求1所述的玻璃微纖維膜多層柱試劑盒或權(quán)利要求2所述的玻璃微纖維基質(zhì)柱試劑盒。
全文摘要
本發(fā)明公開了用于質(zhì)粒DNA制備和DNA純化的玻璃微纖維柱試劑盒及制備和純化DNA的方法。該柱試劑盒使用硼硅酸鹽玻璃微纖維膜和/或顆粒形成的樹脂。它們對從細菌培養(yǎng)物中大量制備高純度質(zhì)粒DNA和從瓊脂糖凝膠與聚丙烯酰胺凝膠中簡便快速純化DNA是有用的。DNA制備物的純度非常高,因此可用于各種高級實驗,包括基因克隆,轉(zhuǎn)染入哺乳動物細胞和轉(zhuǎn)導(dǎo),堿基測序分析,PCR,放射性標記的DNA探針定量,用放射性標記的DNA進行細胞增殖生物試驗等。
文檔編號C12N15/09GK1299413SQ99805651
公開日2001年6月13日 申請日期1999年4月1日 優(yōu)先權(quán)日1998年4月2日
發(fā)明者李璟日 申請人:李璟日