專利名稱：：微生物制備來自芳族代謝/Ⅲ的物質(zhì)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及微生物制備來自芳族代謝的物質(zhì)的方法，涉及基因結(jié)構(gòu)和轉(zhuǎn)化細(xì)胞。隨著例如對氨基酸的需求持續(xù)增加，通過微生物制備的來自芳族代謝的物質(zhì)，特別是芳族氨基酸，有巨大的經(jīng)濟(jì)利益。因此，例如L-苯丙氨酸用于制備藥物，尤其是也用于制備增甜劑天冬苯丙二肽酯(α-L-天冬氨酰-L-苯丙氨酸甲酯)。需要L-色氨酸作為藥物和作為飼料的添加劑；對于L-酪氨酸，也同樣有作為藥物以及作為制藥工業(yè)中的原料的需要。除了從天然材料中分離外，用生物技術(shù)制備也是在經(jīng)濟(jì)許可的條件下獲得所需光活性形式的氨基酸的一種很重要的方法?；蛘呤褂妹阜?，或者使用微生物實(shí)現(xiàn)生物技術(shù)制備。后一種制備方法即微生物制備享有以下優(yōu)點(diǎn)即可以使用簡單和價廉的原料。然而，盡管在細(xì)胞中氨基酸的生物合成以各種各樣的方式控制，人們已經(jīng)進(jìn)行了許多不同的嘗試，以增加產(chǎn)物生成。因此，例如為了切斷生物合成的調(diào)節(jié)，使用了氨基酸類似物。例如，通過選擇對苯丙氨酸類似物的抗性，獲得了大腸桿菌(E.coli)的突變體(GB-2,053,906)，使得有可能獲得L-苯丙氨酸的產(chǎn)量增加。相似的策略也產(chǎn)生了棒狀桿菌屬(Corynebacterium)(JP-19037/1976和JP-39517/1978)和芽孢桿菌屬(Bacillus)(EP-0,138,526)的過量生產(chǎn)菌株。而且，已知使用重組DNA技術(shù)構(gòu)建的微生物，通過克隆并表達(dá)編碼不再受反饋抑制的關(guān)鍵酶的基因，在所述微生物中同樣消除了生物合成的調(diào)節(jié)。作為模型，EP-0,077,196描述了一種生產(chǎn)芳族氨基酸的方法，其中在大腸桿菌中過量表達(dá)不再受反饋抑制的3-脫氧-D-阿拉伯庚酮糖酸(arabinoheptulosonate)-7-磷酸合酶(DAHP合酶)。EP-0,145,156描述了一種大腸桿菌菌株，其中為了生產(chǎn)L-苯丙氨酸，另外過量表達(dá)分支酸變位酶/預(yù)苯酸脫水酶。上述策略共有的特征是用于提高產(chǎn)量的干涉限于對芳族氨基酸特有的生物合成途徑。然而，為了更進(jìn)一步增加產(chǎn)量，必需努力提高生產(chǎn)芳族氨基酸所需的初級代謝物磷酸烯醇丙酮酸(PEP)和赤蘚糖4-磷酸(Ery4P)的供給。PEP是糖酵解產(chǎn)物丙酮酸鹽(丙酮酸)的活化前體；Ery4P是戊糖磷酸途徑的中間體。許多不同的用于增加產(chǎn)量的這些嘗試都致力于克服對胞質(zhì)合成氨基酸的限制。在芳族氨基酸的生產(chǎn)中，需要初級代謝物磷酸烯醇丙酮酸(PEP)和Ery4P兩者縮合，以形成3-脫氧-D-阿拉伯庚酮糖酸-7-磷酸(DAHP)。所述文獻(xiàn)描述了一些增加Ery4P可得性的策略，例如通過過量表達(dá)轉(zhuǎn)酮酶，使得增加Ery4P的供給，并因此增加L-色氨酸、L-酪氨酸或L-苯丙氨酸產(chǎn)物的生成成為可能(EP專利申請第0600463號；Frost和Draths,Ann.Rev.Microbiol.49(1995)557-579)。近來證實(shí)(Flores等，NatureBiotechnology14(1996)620-623)，大腸桿菌的PTS-陰性突變體的自發(fā)葡萄糖-陽性回復(fù)體通過GalP系統(tǒng)將葡萄糖集中到細(xì)胞中，并能夠在葡萄糖中生長。轉(zhuǎn)酮酶基因tktA的額外表達(dá)導(dǎo)致觀察到的中間體DAHP的生成增加(Flores等，NatureBiotechnology14(1996)620-623)。在2個德國專利申請(參考號碼為DE19644566.3和DE19644567.1，還沒有公開)中申請人證實(shí)，例如通過在大腸桿菌中增加轉(zhuǎn)醛酶酶活性或增加轉(zhuǎn)醛酶和轉(zhuǎn)酮酶的酶活性，或通過在大腸桿菌中增加葡糖激酶的活性，或通過在大腸桿菌中增加葡糖激酶和PEP不依賴性糖轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)的活性，或通過組合上述提及的酶和轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)，可能以更大量生產(chǎn)出苯丙氨酸。本發(fā)明的目的是利用另外的方法，通過它增強(qiáng)來自芳族代謝的物質(zhì)的微生物的合成。也要構(gòu)建一種微生物，在所述微生物中增加了來自芳族代謝的物質(zhì)的生成。令人驚奇的是，在生產(chǎn)來自芳族代謝的物質(zhì)的微生物中，通過增強(qiáng)氧化葡萄糖的酶的活性來轉(zhuǎn)化葡萄糖或含葡萄糖底物，實(shí)現(xiàn)了上述目的。由此提供了一種替代的代謝途徑。該途徑包括將游離的葡萄糖氧化成葡糖酸內(nèi)酯/葡糖酸，并將葡糖酸磷酸化以形成6-磷酸葡糖酸。該結(jié)果特別令人驚奇，因?yàn)閮H僅增加氧化葡萄糖的酶的活性在生產(chǎn)來自芳族代謝的物質(zhì)中起重要作用決不是不證自明的。在本發(fā)明的含義中，來自芳族代謝的物質(zhì)被理解為通過增加Ery4P或Ery4P和PEP的供給有利于其生化合成的所有化合物。例如芳族氨基酸、靛藍(lán)、吲哚乙酸、己二酸、黑色素、莽草酸、分支酸、醌和苯甲酸，也包括它們的潛在衍生物和次級產(chǎn)物。在本文中應(yīng)當(dāng)注意，除了需要按照本發(fā)明的干涉之外，也需要對生產(chǎn)物質(zhì)的微生物進(jìn)一步遺傳改變，用于制備靛藍(lán)、己二酸和其它非天然的次級產(chǎn)物(Frost和Draths,Ann.Rev.Microbiol.49(1995)557-579)。生產(chǎn)來自芳族代謝的物質(zhì)的微生物可以以各種方式代謝葡萄糖或含葡萄糖底物(即包含葡萄糖的二糖和寡糖)例如已知用ATP依賴性激酶(己糖激酶和葡糖激酶)磷酸化葡萄糖，并因此將葡萄糖集中于糖酵解中。另外許多細(xì)菌具有可利用的PEP依賴性系統(tǒng)，用于攝取葡萄糖并使其磷酸化。葡萄糖也可以被各種可溶性酶或膜結(jié)合酶氧化(通過葡糖酸內(nèi)酯氧化成葡糖酸)。這些酶包括氧化葡萄糖的酶或葡糖脫氫酶。氧化葡萄糖的酶將葡萄糖氧化成葡糖酸內(nèi)酯，同時還原分子氧。而葡糖脫氫酶也將葡萄糖氧化成葡糖酸內(nèi)酯，它們使用諸如吡咯并喹啉醌(PQQ)的其它電子受體或諸如煙堿腺嘌呤二核苷酸(NAD)或NADP的其它輔因子。已知膜結(jié)合葡糖脫氫酶可以用輔因子吡咯并喹啉醌(PQQ)氧化葡萄糖，反應(yīng)在所述膜外側(cè)發(fā)生。為了將產(chǎn)物(葡糖酸內(nèi)酯或葡糖酸)攝取到細(xì)胞中，就需要一個如已經(jīng)描述于vanSchie等，JournalofBacteriology163(1985)493-499；Isturiz等，JournalofGeneralMicrobiology132(1986)3209-3219；Izu等，JournalofMolecularBiology267(1997)778-793的特殊的轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)，通常(例如在大腸桿菌中)其表達(dá)因葡萄糖的存在而受阻遏，這描述于Izu等，JournalofMolecularBiology267(1997)778-793和Conway.FEMSMicrobiologyReviews103(1992)1-27。于細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的使用輔因子NAD或NADP的葡糖脫氫酶是可溶性酶。已知的生產(chǎn)者包括芽孢桿菌屬菌株，其中一些具有幾個葡糖脫氫酶的異構(gòu)酶(例如在巨大芽孢桿菌(Bacillusmegaterium)中的葡糖脫氫酶Ⅰ至Ⅳ；Mitamura等，1990,JournalofFermentationandBioengineering70,363-369)。葡糖脫氫酶的表達(dá)是受嚴(yán)格調(diào)節(jié)的，并已知例如僅在芽孢桿菌屬菌種的內(nèi)孢子形成過程中的前孢子階段發(fā)生；與在葡萄糖中生長相關(guān)的葡糖脫氫酶的生理作用還不清楚，這已由Lampel等，JournalofBacteriology166(1986)238-243和近來的Steinmetz或Foffnagel(“BacillussubtilisandotherGram-positiveBacteria”(Sonenshein,Hoch和Losick編輯)，M.Steinmetz157-170頁和P.Fortnagel171-180頁；ISBN1-55581-053-5；ASMPress,Washington,D.C.,1993)進(jìn)行了報(bào)導(dǎo)。特別是迄今尚未描述大腸桿菌、棒狀桿菌或短桿菌等中的NAD(P)依賴性葡糖脫氫酶。已經(jīng)將得自芽孢桿菌屬菌株的葡糖脫氫酶的基因克隆到大腸桿菌中，并在其中表達(dá)(Hilt等，BiochimicaetBiophysicaActa1076(1991)298-304)。具體地說目的在于獲得重組的葡糖脫氫酶，這被用作葡萄糖的檢測系統(tǒng)或輔因子再生的檢測系統(tǒng)(Hilt等，BiochimicaetBiophysicaActa1076(1991)298-304；DE專利申請3711811)。相反，迄今還沒有描述這些基因利用葡萄糖例如作為一種底物來獲得來自芳族代謝的物質(zhì)。根據(jù)本發(fā)明，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)引入葡糖脫氫酶或增加其活性令人驚奇地導(dǎo)致生成物質(zhì)。增加氧化葡萄糖的酶的活性導(dǎo)致由含葡萄糖底物于細(xì)胞內(nèi)形成葡糖酸內(nèi)酯和葡糖酸。在一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述葡糖脫氫酶得自巨大芽孢桿菌，具體的說是巨大芽孢桿菌葡糖脫氫酶Ⅳ，這描述于Mitamura等，JournalofFermentationandBioengineering70(1990)363-369，和Nagao等，JournalofBacteriology15(1992)5013-5020。葡糖酸依賴于使葡萄糖磷酸化的酶對其活化。已知這種酶例如可以是對葡糖酸特異性的磷酸烯醇丙酮酸依賴性酶Ⅱ，或是對葡糖酸特異性的ATP依賴性激酶。例如，已知描述于Izu等，F(xiàn)EBSLetters394(1996)14-16；Izu等，JournalofMolecularBiology267(1997)778-793，和Tong等，JournalofBacteriology178(1996)3260-3269的大腸桿菌ATP依賴性葡糖酸激酶GntK。在大腸桿菌中，產(chǎn)物6-磷酸葡糖酸是戊糖磷酸途徑和ED途徑二者的氧化分支的中間體，這描述于Fraenkel，在“EScherichiacoliandSalmonella”，第2版(Neidhardt等編輯)189-198頁，ASMPress，Washington，美國，ISBN-1-55581-084-5，1996。通過另外增加使葡萄糖磷酸化的酶的活性，可以提高物質(zhì)的產(chǎn)量。當(dāng)使用使葡萄糖磷酸化的酶時，例如來自各種微生物的使葡萄糖磷酸化的酶都是合適的，只要它們可以在生產(chǎn)來自芳族代謝的物質(zhì)的微生物中以功能方式表達(dá)。使用ATP依賴性葡糖酸激酶，優(yōu)選大腸桿菌葡糖酸激酶，特別是來自大腸桿菌K-12的葡糖酸激酶(GntK)，是特別可取的。其它的使葡萄糖磷酸化的酶的基因(其基因產(chǎn)物使葡糖酸磷酸化)，同樣適合于按照本發(fā)明的方法。來自其它腸細(xì)菌、運(yùn)動發(fā)酵單胞菌(Zymomonasmobilis)、枯草桿菌(Bacillussubtilis)和谷氨酸棒桿菌(Corynebacteriumglutamicum)的基因可以作為實(shí)例提及。葡糖酸激酶的作用限于活化葡糖酸，然而它不是由大腸桿菌或其它細(xì)菌在例如葡萄糖存在下代謝。例如在大腸桿菌中，葡糖酸激酶GntK只有當(dāng)所述生物靠葡糖酸生長且不促使葡萄糖代謝時才重要；實(shí)際上它的形成在葡萄糖存在時竟受到阻抑(如Izu等，JournalofMolecularBiology267(1997)778-793，和Tong等，JournalofBacteriology178(1996)3260-3269所述)，并在葡萄糖存在時不發(fā)生。因此，在此具體的實(shí)施方案中，額外增加使葡萄糖磷酸化的酶的活性，提供了一種能使使葡萄糖磷酸化的酶在不存在細(xì)胞外葡糖酸或存在葡萄糖時在微生物中成為可利用的酶，所述使葡萄糖磷酸化的酶特別是葡糖酸激酶，最好是大腸桿菌葡糖酸激酶，尤其是來自大腸桿菌K-12的葡糖酸激酶GntK。優(yōu)點(diǎn)是利用按照本發(fā)明的代謝途徑的物流增加了。這能使葡糖酸向6-磷酸葡糖酸的轉(zhuǎn)化即使在葡萄糖存在時也增加。這導(dǎo)致在細(xì)胞內(nèi)存在的6-磷酸葡糖酸的比例增加，所述6-磷酸葡糖酸可以利用已知的代謝次序轉(zhuǎn)化為所述物質(zhì)。葡糖酸內(nèi)酯是氧化葡萄糖的酶的反應(yīng)產(chǎn)物。盡管葡糖酸內(nèi)酯可以自發(fā)轉(zhuǎn)化為葡糖酸，但已經(jīng)描述了催化促進(jìn)這種轉(zhuǎn)化的酶(例如Kanagasundaram和Scopes,BiochimicaetBiophysicaActa1171(1992)198-200中描述的運(yùn)動發(fā)酵單胞菌葡糖酸內(nèi)酯酶)。因此在另一個實(shí)施方案中，為了促進(jìn)葡糖酸內(nèi)酯分別向葡糖酸(或向6-P-葡糖酸)轉(zhuǎn)化，除了氧化葡萄糖的酶或除了氧化葡萄糖的酶和使葡萄糖磷酸化的酶之外，還表達(dá)了葡糖酸內(nèi)酯酶(例如來自運(yùn)動發(fā)酵單胞菌)基因。應(yīng)當(dāng)注意到，葡糖脫氫酶和葡糖酸激酶的基因天然存在于一些芽孢桿菌物種中；然而，所述酶的基因排列在不同的操縱子中，并明顯地未結(jié)合用于代謝葡萄糖，如Steinmetz或Fortnagel所述(“BacillussubtilisandotherGram-positiveBacteria”(Sonenshein，Hoch和Losick編輯)，Steinmetz157-170頁和Fortnagel171-180頁；ISBN1-55581-053-5；ASMPress,Washington,D.C.,1993)。此外，因?yàn)樵阪咦有纬蓷l件下特異性誘導(dǎo)所述葡糖脫氫酶，所以未曾預(yù)料這兩種酶一起促進(jìn)物質(zhì)的生成。因此，在本發(fā)明范圍內(nèi)描述的、與靠葡萄糖或含葡萄糖底物生長有關(guān)的氧化葡萄糖的酶的活性增加、或與靠葡萄糖或含葡萄糖底物生長有關(guān)的氧化葡萄糖的酶和磷酸化葡糖酸的酶的活性分別增加對于來自芳族代謝的物質(zhì)的生產(chǎn)的效應(yīng)，是完全預(yù)料不到的。在本發(fā)明另一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，除了增加氧化葡萄糖的酶活性或增加氧化葡萄糖的酶和使葡萄糖磷酸化的酶的活性外，也增加用于PEP不依賴性糖攝取的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的活性。該實(shí)施方案也包括在一種生產(chǎn)來自芳族代謝的物質(zhì)的微生物中，增加用于PEP不依賴性葡萄糖或含葡萄糖底物攝取的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的活性，其中所述微生物也能夠利用PEP依賴性轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)攝取糖。另外整合PEP不依賴性轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)使得在生產(chǎn)所述物質(zhì)的微生物中增加所述糖的供給成為可能。按照本發(fā)明，這種糖可以通過細(xì)胞內(nèi)氧化葡萄糖的酶轉(zhuǎn)化為葡糖酸內(nèi)酯，接著轉(zhuǎn)化為葡糖酸。葡糖酸就是使葡萄糖磷酸化的酶的底物。通常，PEP不需要作為這些反應(yīng)的能量供體，因此，在糖酵解和戊糖磷酸途徑恒定的物流基礎(chǔ)上，PEP可以更大量的PEP可被利用，同Ery4P縮合，形成用于芳族化合物(即3-脫氧-D-阿拉伯庚酮糖酸-7-磷酸合酶(DAHP))的共有生物合成途徑的初級代謝物，并隨后用于生產(chǎn)來自芳族代謝的物質(zhì)。在所述轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的情況下，將該蛋白的活性理解為是蛋白介導(dǎo)的攝取速率。關(guān)于用于PEP不依賴性攝取葡萄糖或含葡萄糖底物的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，使用轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，尤其是使用易化蛋白(facilitator)是合理的，易化蛋白是按照蛋白介導(dǎo)的易化擴(kuò)散的原理起作用的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。使用來自運(yùn)動發(fā)酵單胞菌的葡糖易化蛋白(Glf)是特別合適的。當(dāng)使用后者時，從例如運(yùn)動發(fā)酵單胞菌中獲得編碼該蛋白的基因，即glf，特別是從運(yùn)動發(fā)酵單胞菌ATCC31821中分離出的易化蛋白基因glf，如Parker等，1995,MolectllarMicrobiology15(1995)795-802和Weisser等，1995,JournalofBacteriology177(1995)3351-3354所述。然而，得自其它細(xì)菌的、其基因產(chǎn)物轉(zhuǎn)運(yùn)葡萄糖且在這樣做時不使用任何PEP的糖轉(zhuǎn)運(yùn)基因，例如大腸桿菌的GalP系統(tǒng)，同樣適合于按照本發(fā)明的方法。而且，可以使用糖轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)的基因，諸如HXT1至HXT7(它們得自諸如釀酒酵母(Saccharomycescerevtsiae)、樹干畢赤酵母(pichiastipitis)或乳酸克魯維酵母(Kluyveromyceslactis)的真核微生物)，或者更通常使用得自其它生物的糖轉(zhuǎn)運(yùn)基因，只要它們在所述微生物中以功能方式表達(dá)，以及同時所述基因產(chǎn)物可以不需PEP而操作葡萄糖的磷酸化和/或轉(zhuǎn)運(yùn)。在氨基酸生產(chǎn)者中可以表達(dá)所述糖轉(zhuǎn)運(yùn)基因，這特別合理。在本發(fā)明的定義范圍內(nèi)，可以將用于增加活性的措施理解為適用于以下的所有措施增加氧化葡萄糖的酶的活性，或增加氧化葡萄糖的酶的活性和另外增加使葡萄糖磷酸化的酶、葡糖酸內(nèi)酯酶和用于PEP依賴性糖攝取的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白中的至少一種的活性。下述措施尤其適用于該目的-引入基因，例如使用載體或溫和噬菌體；-增加所述基因拷貝數(shù)，例如為了將按照本發(fā)明的基因以增加的拷貝數(shù)引入到所述微生物中，使用質(zhì)粒，所述增加的拷貝數(shù)是稍微(例如2-5倍)增加的拷貝數(shù)至大幅(例如15-50倍)增加的拷貝數(shù)；-增加基因表達(dá)，例如通過提高轉(zhuǎn)錄速率，例如通過使用諸如Ptac、Ptet或其它調(diào)節(jié)核苷酸序列的啟動子元件，和/或通過提高翻譯速率，例如通過使用共有核糖體結(jié)合位點(diǎn)；-增加現(xiàn)存酶的內(nèi)源活性，例如利用通過常規(guī)方法(例如使用紫外照射或產(chǎn)生突變的化學(xué)藥品)以非定向方式產(chǎn)生的突變，或者利用諸如缺失、插入和/或核苷酸交換重組DNA方法以特異性方式產(chǎn)生的突變；-通過改變酶的結(jié)構(gòu)增加酶的活性，例如通過使用物理、化學(xué)、分子生物學(xué)或其它微生物學(xué)方法誘變；-使用去調(diào)節(jié)的酶，例如不再受反饋抑制的酶；-引入相應(yīng)的編碼所述去調(diào)節(jié)酶的基因。組合使用上述方法和其它類似的用于增加活性的方法也是可能的。在轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的情況下，例如通過使用上述方法克隆所述基因，或者例如通過選擇顯示底物轉(zhuǎn)運(yùn)增加的突變體，可以增加內(nèi)源活性。最好是通過將所述一種或多種基因整合到一種或幾種基因結(jié)構(gòu)中，并且將所述一種或多種基因以單拷貝或以增加的拷貝數(shù)引入到所述基因結(jié)構(gòu)中，實(shí)現(xiàn)活性的增加。按照本發(fā)明的定義，可以將基因結(jié)構(gòu)理解為一個基因或攜帶按照本發(fā)明的基因的任何核苷酸序列。合適的核苷酸序列可以是，例如質(zhì)粒、載體、染色體、噬菌體或不是以環(huán)狀方式閉合的其它核苷酸序列。在朝向Ery4P的物質(zhì)流增加的微生物中，用于生產(chǎn)芳族氨基酸代謝物的第一個中間體的PEP的利用率可能受到限制。在這些情況下，減少或關(guān)閉在代謝中的其它PEP消耗反應(yīng)(如果存在)是有利的，諸如PEP糖磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)(PTS)的反應(yīng)，其催化PEP依賴性糖攝取。按照本發(fā)明，可以使用顯示出天然水平的PTS活性的生物；然而為了進(jìn)一步改進(jìn)所述方法，也可能使用其中所述PTS活性已經(jīng)降低的PTS突變體。或者可以在酶水平上實(shí)現(xiàn)這種性質(zhì)的減少，或者通過使用遺傳方法實(shí)現(xiàn)這種性質(zhì)的減少，例如通過使用用于表達(dá)pts基因的替代的強(qiáng)阻抑型啟動子，或通過將glf基因插入到染色體中，特別是插入到ptsⅠ基因的基因座中，該方法同時包括在所述染色體中使重組DNA穩(wěn)定(分離穩(wěn)定性)，并因此能夠無需使用載體。此外，連接一個可調(diào)節(jié)啟動子的PTS的活性，也可以在培養(yǎng)過程中通過加入所述相關(guān)啟動子的誘導(dǎo)物或抑制物來影響。在按照本發(fā)明的用于生產(chǎn)來自芳族代謝的物質(zhì)的方法中，優(yōu)選使用另外參與合成這些物質(zhì)的一種或多種酶去調(diào)節(jié)和/或其活性增加的微生物。這些酶具體的說是芳族氨基酸代謝的酶，尤其是DAHP合酶、莽草酸激酶和分支酸變位酶/預(yù)苯酸脫水酶，以及參與合成來自芳族代謝的物質(zhì)的所有其它酶，特別是轉(zhuǎn)醛酶、轉(zhuǎn)酮酶和葡糖激酶。除了按照本發(fā)明的酶外，特別是去調(diào)節(jié)和過量表達(dá)DAHP合酶對制備諸如己二酸、膽汁酸和醌化合物以及它們的衍生物的物質(zhì)很重要。另外，為了實(shí)現(xiàn)過量合成例如L-色氨酸、L-酪氨酸、靛藍(lán)以及羥基苯甲酸和氨基苯甲酸和萘醌和蒽醌和它們次級產(chǎn)物的衍生物，應(yīng)當(dāng)去調(diào)節(jié)莽草酸激酶，并增加其活性。此外，去調(diào)節(jié)和過量表達(dá)的分支酸變位酶/預(yù)苯酸脫水酶對于有效生產(chǎn)苯丙氨酸和苯丙酮酸以及它們的衍生物也特別重要。然而，這也將包括其活性有助于下述物質(zhì)生物化學(xué)合成的所有其它酶，所述物質(zhì)的產(chǎn)量通過供給Ery4P或Ery4P和PEP而增加?？梢宰⒁獾?，除了按照本發(fā)明的干涉之外，為了制備靛藍(lán)、己二酸和其它非天然次級產(chǎn)物，需要對所述微生物做進(jìn)一步遺傳改變。這些措施是技術(shù)熟練人員已知的(Frost和Draths,Ann.Rev.Microbiol.49(1995)557-579)。按照本發(fā)明的方法適用于制備芳族氨基酸，特別是L-苯丙氨酸。在L-苯丙氨酸的情況下，最好是同時增加去調(diào)節(jié)的DAHP合酶(例如大腸桿菌中的AroF或AroH)和/或同樣去調(diào)節(jié)的分支酸變位酶/預(yù)苯酸脫水酶(PheA)的基因表達(dá)和/或酶活性。合適的生產(chǎn)生物為埃希氏菌屬(Escherichia)物種，還有沙雷氏菌屬(Serratia)、芽孢桿菌屬、棒狀桿菌屬(Corynebacterium)或短桿菌屬(Brevibacterium)的微生物，和由經(jīng)典氨基酸方法可知的其它菌株。同樣包括來自諾卡氏菌科(Nocardiaceae)和放線菌目(Actinomycetales)科的細(xì)菌。大腸桿菌特別適合。本發(fā)明也涉及提供合適的基因結(jié)構(gòu)和攜帶這些基因結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)化細(xì)胞，這些使得能夠特別成功地完成所述方法。在本發(fā)明的范圍內(nèi)，現(xiàn)在可以得到新基因結(jié)構(gòu)，所述重組形式的基因結(jié)構(gòu)或者包括編碼氧化葡萄糖的酶的基因和a)編碼使葡萄糖磷酸化的酶的基因或者b)編碼用于PEP不依賴性糖攝取的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的基因或者c)以下三種基因中的至少兩種編碼使葡萄糖磷酸化的酶的基因、編碼葡糖酸內(nèi)酯酶的基因或編碼用于PEP不依賴性糖攝取的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的基因。具體而言，所述氧化葡萄糖的酶的基因編碼葡糖脫氫酶，而所述使葡萄糖磷酸化的酶的基因編碼葡糖酸激酶。葡糖脫氫酶的基因最好得自巨大芽孢桿菌，而葡糖酸激酶的基因最好得自大腸桿菌，葡糖酸內(nèi)酯酶和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的基因最好得自運(yùn)動發(fā)酵單胞菌。下述基因結(jié)構(gòu)特別有利，在所述基因結(jié)構(gòu)中葡糖脫氫酶的基因是來自巨大芽孢桿菌的葡糖脫氫酶Ⅳ(gdhⅣ)，葡糖酸激酶的基因gntK是來自大腸桿菌的GntK，轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和葡糖酸內(nèi)酯酶的基因是來自運(yùn)動發(fā)酵單胞菌的glf和gnl基因。按照通用方法分離相關(guān)的基因，轉(zhuǎn)化所述細(xì)胞例如當(dāng)克隆大腸桿菌葡糖酸激酶基因gntK、巨大芽孢桿菌葡糖脫氫酶Ⅳ(gdhⅣ)基因或運(yùn)動發(fā)酵單胞菌葡糖酸內(nèi)酯酶(gnl)基因或轉(zhuǎn)運(yùn)基因glf時，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)方法適用于例如分別用大腸桿菌K-12(gntK)、巨大芽孢桿菌(gdhⅣ)和運(yùn)動發(fā)酵單胞菌株ATCC29191或ATCC31821(gnl，glf)的染色體DNA特異性擴(kuò)增所述基因。在擴(kuò)增所述DNA并在體外將其同已知載體(pGEM7、pUCBM20、pUC19或其它載體)重組后，使用化學(xué)方法、電穿孔、接合或轉(zhuǎn)導(dǎo)來轉(zhuǎn)化所述宿主細(xì)胞。來自所述三種供體生物的gntK、gdhⅣ、gnl和glf基因的完整的核苷酸序列是已知的，并一般從可獲得的來源得到，例如貯藏在諸如Heidelberg的EMBL/HUSAR的數(shù)據(jù)庫中，入藏登記號為D84362(gntK)、D10626(gdhⅣ)、X67189(gnl)和M60615(glf)。使用來自大腸桿菌K-12菌株的染色體DNA特異性擴(kuò)增所述基因的PCR以及由Izu等，JournalofMolecularBiology267(1997)778-793和Tong等，JournalofBacteriology178(1996)3260-3269所述的基因序列適用于克隆大腸桿菌gntK基因。來自巨大芽孢桿菌的染色體DNA例如適于克隆巨大芽孢桿菌gdhⅣ基因(Nagao等，JournalofBacteriology174(1992)5013-5020)。可以將分離的葡糖脫氫酶Ⅳ基因與在本發(fā)明正文所述的一種或多種基因，以任何組合一起整合到一個或幾個基因結(jié)構(gòu)內(nèi)。不考慮對基因結(jié)構(gòu)的精確定位，這產(chǎn)生了諸如gdhⅣ+gntK、gdhⅣ+glf、gdhⅣ+gntK+glf、gdhⅣ+gntK+gnl、gdhⅣ+gnl+glf、gdhⅣ+gntK+gnl+glf的組合。除了上述基因結(jié)構(gòu)以外，任何基因結(jié)構(gòu)是指另外包括一種或多種編碼轉(zhuǎn)酮酶、轉(zhuǎn)醛酶、葡糖激酶、DAHP合酶、分支酸變位酶/預(yù)苯酸脫水酶、分支酸變位酶/預(yù)苯酚鹽脫氫酶或其它確實(shí)影響來自芳族代謝的物質(zhì)合成的酶的基因。當(dāng)定位所述基因時，為了避免由于膜蛋白的過量表達(dá)引起的可能的負(fù)面影響，最好將glf基因以低拷貝數(shù)x(諸如x=l至l0)引入到所述一種或多種基因結(jié)構(gòu)中。包括至少一個分配給所述基因之一的調(diào)節(jié)基因序列的基因結(jié)構(gòu)是有利的。因此，最好可以在轉(zhuǎn)錄水平上，特別是通過強(qiáng)化轉(zhuǎn)錄信號實(shí)現(xiàn)調(diào)節(jié)元件的強(qiáng)化。這可以例如通過提高一種或多種啟動子的活性而實(shí)現(xiàn)，而提高一種或多種啟動子的活性通過改變位于所述結(jié)構(gòu)基因上游的啟動子序列，或通過用更有效的啟動子完全替換所述啟動子而實(shí)現(xiàn)。也可以通過在分配給所述基因的調(diào)節(jié)基因上施加合適的影響強(qiáng)化轉(zhuǎn)錄；然而，除此之外，例如通過提高信使RNA(mRNA)的穩(wěn)定性，也可能強(qiáng)化翻譯。此外，在本發(fā)明的范圍內(nèi)，也可以利用帶有可復(fù)制形式的按照本發(fā)明的基因結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)化細(xì)胞。按照本發(fā)明的定義，將轉(zhuǎn)化細(xì)胞理解為攜帶按照本發(fā)明的基因結(jié)構(gòu)的任何微生物，所述基因結(jié)構(gòu)在所述細(xì)胞中引起來自芳族代謝物質(zhì)的生成增加。利用化學(xué)方法(HanahanJ.Mol.Biol.166(1983)557-580)，也可以利用電穿孔、接合或轉(zhuǎn)導(dǎo)轉(zhuǎn)化所述宿主細(xì)胞。對于所述轉(zhuǎn)化，優(yōu)選使用其中另外參與所述物質(zhì)合成的一種或多種酶去調(diào)節(jié)和/或活性增加的宿主細(xì)胞。用包含所述相關(guān)基因的基因結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化生產(chǎn)芳族氨基酸或來自芳族代謝的另一物質(zhì)的微生物菌株，特別是大腸桿菌。對于用所述基因結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化，優(yōu)選使用其中PEP依賴性糖攝取系統(tǒng)(如果存在)的活性同時降低或切斷的宿主細(xì)胞。具體而言，提供能夠生產(chǎn)芳族氨基酸的轉(zhuǎn)化細(xì)胞，芳族氨基酸優(yōu)選是L-苯丙氨酸。因此可以提供用于微生物制備來自芳族代謝物質(zhì)的方法，所述方法使用如上所述的具有如上所述基因結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)化細(xì)胞。在按照本發(fā)明的方法的特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，使用下述轉(zhuǎn)化細(xì)胞，除了Ery4P以外，所述轉(zhuǎn)化細(xì)胞也含有利用率增加的中心代謝的其它代謝物。這些代謝物的實(shí)例為α-氧代戊二酸或草酰乙酸，它們是由細(xì)胞內(nèi)合成過程產(chǎn)生的要么是生長中的細(xì)胞通過喂養(yǎng)在相關(guān)化合物或其前體中可得到的，所述相關(guān)化合物諸如作為檸檬酸循環(huán)代謝物的延胡索酸或蘋果酸。菌種大腸桿菌AT2471/pGEM7gntKgdhⅣ根據(jù)布達(dá)佩斯條約的條款，于1998年4月15日保藏在DSMZ(德意志微生物和細(xì)胞培養(yǎng)物保藏中心)，保藏號DSM12118。使用的宿主生物，即AT2471，已由Taylor和Trotter(Bacteriol.Rev.13(1967)332-53)保藏于CGSC中，保藏號為4510，并可免費(fèi)得到。接下來的正文將表明使用的材料和方法，并以實(shí)驗(yàn)實(shí)施例和對比例支持本發(fā)明通用方法在所述遺傳研究范圍內(nèi)，除非另有說明，否則在由Difco細(xì)菌用胰蛋白胨(10g/l)、Difco酵母提取物(5g/l)和NaCl(10g/l)組成的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)大腸桿菌菌種。根據(jù)所使用的菌種的抗性特性，如果必要，向所述培養(yǎng)基中加入氨芐青霉素(100mg/l)和氯霉素(17-34mg/l)。關(guān)于這一點(diǎn)預(yù)先將氨芐青霉素溶解在水中，將氯霉素預(yù)先溶解在乙醇中，然后在過濾除菌后，將所述溶液加入到已經(jīng)高壓滅菌的培養(yǎng)基中。向所述LB培養(yǎng)基中加入Difco細(xì)菌用瓊脂(1.5％)，以制備瓊脂平板。使用市售的系統(tǒng)(Qiagen,Hilden)通過堿裂解法從大腸桿菌中分離質(zhì)粒DNA。使用Chen和Kuo的方法(Nucl.AcidRes.21(1993)2260)從大腸桿菌和巨大芽孢桿菌DSM319中分離染色體DNA。按照生產(chǎn)商(Boehringer,Mannheim，德國或Promega,Heidelberg，德國)的說明使用限制酶、TaqDNA聚合酶、DNA聚合酶Ⅰ、堿性磷酸酶、RNA酶和T4DNA連接酶。對于限制性分析，在瓊脂糖凝膠(0.8％)中分離DNA片段，并使用市售的系統(tǒng)(QuiaExⅡ,Hilden，德國)通過提取從所述瓊脂糖中分離DNA片段。在轉(zhuǎn)化之前，在LB培養(yǎng)基中(5ml試管)于37℃和200rpm培養(yǎng)所述細(xì)胞2.5-3小時。在光密度(620nm)大約為0.4時，將所述細(xì)胞離心下來，并將其懸浮于十分之一體積的TSS(含有10％(w/v)PEG8000、5％(v/v)DMSO和50mMMgCl2的LB培養(yǎng)基)中。于4℃同0.1-100ng的DNA一起溫育30分鐘，接著于37℃溫育1小時后，在包含合適抗生素的LB培養(yǎng)基上將所述細(xì)胞鋪平板。通過BamHI和SacI雙重限制酶切打開載體pGEM7gntK，從而組合所述gntK和gdhⅣ基因。然后將限制酶切載體pGEM7gdhⅣ后獲得的含有g(shù)dhⅣ基因的800個堿基對的片段與已經(jīng)以此方式打開的該載體連接。再次進(jìn)行轉(zhuǎn)化，并在氨芐青霉素上選擇。按照本發(fā)明的新基因結(jié)構(gòu)pGEM7gntKgdhⅣ介導(dǎo)葡糖脫氫酶Ⅳ和葡糖酸激酶GntK的活性的T7聚合酶不依賴性活性表達(dá)(參見表2)。將已經(jīng)獲得的轉(zhuǎn)化體以甘油培養(yǎng)物(30％)的形式于-80℃在LB培養(yǎng)基中儲存。需要時，在使用前直接將所述甘油培養(yǎng)物解凍。在100mMtris/HCl緩沖液(pH8.0)中洗滌收獲的細(xì)胞。利用超聲處理(裝有微電極頭(microtip)的Branson超聲波儀250)，使用25％超聲處理循環(huán)和40瓦強(qiáng)度，對每毫升細(xì)胞懸浮液處理4分鐘，破碎沉淀的細(xì)胞。在以18,000g于4℃離心30分鐘后，使用上清液(粗提物)檢測所述葡糖脫氫酶和/或葡糖酸激酶的活性。按照Harwood和Cutting,MolecularBiologicalMethodsforBacillus,JohnWiley＆sons檢測所述葡糖脫氫酶的活性。葡糖脫氫酶催化葡萄糖氧化成葡糖酸內(nèi)酯。在波長340nm利用還原的輔因子NADH+H+濃度的增加用分光光度計(jì)檢測所述酶的活性。在總體積1ml的石英比色杯中進(jìn)行所述檢測。反應(yīng)混合物組成為TrisHCl(終濃度250mM，pH8.0)，2.5mM乙二胺四乙酸鈉，100mMKCl和2mMNAD。在所述緩沖液中于25℃預(yù)溫育粗提物5分鐘。加入葡萄糖(終濃度100mM)開始所述檢測反應(yīng)。在340nm監(jiān)測消光度的增加。在每種情況下將不含葡萄糖的混合物用作對照。給出的葡糖脫氫酶活性的單位為U/mg，定義為每分鐘每毫克蛋白形成1μmolNADH，這相當(dāng)于每分鐘每毫克蛋白轉(zhuǎn)化1μmol葡萄糖。如Izu等，F(xiàn)EBSLetters394(1996)14-16所述檢測所述粗提物中的葡糖酸激酶。葡糖酸激酶催化葡糖酸ATP依賴性磷酸化為6-磷酸葡糖酸。在所述酶測試中，當(dāng)使用NADP依賴性輔助酶6-磷酸葡糖酸脫氫酶(BoehringerMannheim，第108405號)時，在波長340nm利用NADPH濃度的增加用分光光度計(jì)檢測形成的6-磷酸葡糖酸。在該方面，形成1μmolNADPH相當(dāng)于磷酸化1μmol葡糖酸。在總體積1ml的石英比色杯中于25℃進(jìn)行酶檢測。反應(yīng)混合物含有50mMTrisHCl,pH8.0,100mMATP,0.25mMNADP，1.2單位輔助酶6-磷酸葡糖酸脫氫酶和可變量的粗提物。所述混合物于25℃預(yù)溫育5分鐘，通過加入葡糖酸(pH6.8；在混合物中的終濃度為10mM)開始所述反應(yīng)。未加入葡糖酸的混合物用作對照。按照BradfordM.M.(Anal.Biochem.72(1976)248-254)，使用市售顯色試劑檢測所述粗提物中的蛋白濃度。牛血清白蛋白用作標(biāo)準(zhǔn)。表2顯示了在使用宿主菌株大腸桿菌W3110和帶有質(zhì)粒pGEM7gdhⅣ、pGEM7gntK或pGEM7gntKgdhⅣ的其突變體時酶檢測的結(jié)果。我們發(fā)現(xiàn)，當(dāng)使用已經(jīng)描述的按照本發(fā)明的基因結(jié)構(gòu)時，可以按照本發(fā)明在細(xì)胞中以功能方式表達(dá)所述酶。利用高壓液相層析(HPLC,HewlettPackard，慕尼黑，德國)結(jié)合熒光檢測(消光335nm，發(fā)射570nm)確定苯丙氨酸濃度，使用nucleosil-120-8C18柱(250×4.6毫米)作為固相；利用梯度進(jìn)行洗脫(洗脫液A90％50mM磷酸，10％甲醇，pH2.5；洗脫液B20％50mM磷酸，80％甲醇，pH2.5；梯度0-8分鐘，100％A；8-13分鐘，0％A；13-19分鐘，100％A)。將洗脫速率設(shè)定在1.0ml/分鐘；將柱溫設(shè)定在40℃。在室溫下于反應(yīng)毛細(xì)管(14米×0.35毫米)中使用鄰苯二醛進(jìn)行柱后衍生。在所述條件下發(fā)現(xiàn)L-苯丙氨酸的保留時間為6.7分鐘。用酶測試條(strip)(Diabur,BoehringerMannheim，德國)檢測葡萄糖濃度，不管結(jié)果如何，接著計(jì)量加入2ml濃縮的葡萄糖溶液(500g/l)，確保在實(shí)驗(yàn)混合物中葡萄糖沒有成為限制因素。培養(yǎng)48小時后，僅僅引入質(zhì)粒pGEM7gdhⅣ造成描述苯丙氨酸濃度的指示值達(dá)到145，此值是與宿主菌株大腸桿菌AT2471的指示值(苯丙氨酸)100相比得出。這個結(jié)果證實(shí)，按照本發(fā)明在生產(chǎn)物質(zhì)的微生物中增加葡糖脫氫酶的活性具有增加芳族化合物合成的效應(yīng)。將載體pZY507glf和如實(shí)施例Ⅰ所述獲得的本發(fā)明的基因結(jié)構(gòu)一起轉(zhuǎn)化到宿主菌株AT2471中。在實(shí)施例Ⅲ所述的實(shí)驗(yàn)條件下，在所有情況下在兩個平行的混合物中培養(yǎng)突變體大腸桿菌AT2471glf、大腸桿菌AT2471glf/pGEM7、大腸桿菌AT2471glf/pGEM7gntK和大腸桿菌AT2471glf/pGEM7gntKgdhⅣ。48小時后，檢測培養(yǎng)基中的L-苯丙氨酸濃度。與起始菌株大腸桿菌AT2471glf(它獲得的L-苯丙氨酸濃度相當(dāng)于指示值100)相比，載體pGEM7的存在使指示值為96，并因此實(shí)際上獲得了同樣的濃度。相比之下，使用大腸桿菌AT2471glf/pGEM7gntK產(chǎn)生的L-苯丙氨酸濃度相當(dāng)于指示值為179(與先前提到的菌株相比)。在大腸桿菌AT2471glf/pGEMgntKgdhⅣ中同時表達(dá)兩個替代代謝基因，即葡糖脫氫酶和葡糖酸激酶，使得表示苯丙氨酸濃度的指示值進(jìn)一步增加到195成為可能。這個結(jié)果證實(shí)，通過引入葡糖脫氫酶活性和增加葡糖酸激酶的活性表達(dá)一個替代代謝途徑，特別是在同時轉(zhuǎn)化和表達(dá)PEP不依賴性糖攝取系統(tǒng)的那些微生物中對L-苯丙氨酸的合成有正面影響?？梢栽诘诙瓮唇粨Q中重組所述載體部分，導(dǎo)致羧芐青霉素抗性喪失。因?yàn)樵谶@種情況下，通過插入glf基因間斷pts基因，所以在這些突變體中沒有以功能方式表達(dá)所述PTS。如下選擇所需的PTS-突變體在沒有抗生素的LB培養(yǎng)基中重復(fù)傳代培養(yǎng)仍然是PTS+的轉(zhuǎn)化體后，將等份的細(xì)胞懸浮液在包含100μg/l磷霉素(phosphomycin)的LB板上倒平板。PTS-突變體能夠在這些平板上生長。在包含或者磷霉素或者20μg/l的羧芐青霉素的LB平板上將生長的克隆劃線接種。從在磷霉素平板上顯示重新生長、但在羧芐青霉素平板上不能生長的克隆中分離染色體DNA。通過DNA印跡分析證實(shí)了，glf基因整合到編碼PTS系統(tǒng)的基因中。對應(yīng)的突變體被鑒定為在表型上是PTS缺陷型。選擇一個克隆作為宿主生物大腸桿菌AT247lglfintPTS-，并將其用于用質(zhì)粒pGEM7gntKgdhⅣ的轉(zhuǎn)化(參見上文)。按照實(shí)施例Ⅲ和Ⅳ所述實(shí)驗(yàn)條件，在每種情況下在兩個平行混合物中，培養(yǎng)PTS陰性突變體大腸桿菌AT2471glfintPTS-/pGEM7gntKgdhⅣ和對應(yīng)的宿主菌株AT2471glfintPTS-。培養(yǎng)48小時后，由結(jié)果計(jì)算總體生物量-比產(chǎn)出率(integral，biomass-specificproduction)。與宿主菌株AT2471glfintPTS-(用指示值100表示其總體生物量-比產(chǎn)出率)相比，所述突變體AT2471glfintPTS-/pGEM7gntKgdhⅣ獲得的總體生物量-比產(chǎn)出率指示值為133。這個結(jié)果證實(shí)，引入活性葡糖脫氫酶和增加葡糖酸激酶的活性，特別在特征為PTS系統(tǒng)的活性減少或者完全切斷、同時已將PEP不依賴性糖攝取系統(tǒng)整合到其中的那些微生物中，對苯丙氨酸的合成產(chǎn)量有正面影響。表1菌株基因型/特征來源或參考文獻(xiàn)<tablesid="table1"num="001"><table>巨大芽孢桿菌DSM319gdhⅣ基因供體Nagao等，J.Bacteriol.174,5013-5020大腸桿菌AT2471tyrA4,relA1,spoT1,thi-1Taylor和Trotter,Bacteriol.Rev.13(1967)332-53JM109DE3Δ(pro-lac)/F′pro+lacZΔM15；具有T7RNA聚合酶的基因PromegaCo.大腸桿菌K-12W3110F-，原養(yǎng)野生型菌株，thi-1；gntK基因供體ColiGeneticStockCenter,YaleUniversity,NewHaven,CT，美國質(zhì)粒pZY507Cm2Weisser等，J.Bacteriol.177(1995)3351-4pZY507glf在pZY507中的運(yùn)動發(fā)酵單胞菌glf基因Weisser等，J.Bacteriol177(1995)3351-4pGEM7ApR；T7和SP6啟動子PromegaCo.pGEM7gntK含有大腸桿菌gntK基因的pGEM7本申請pGEM7gdhⅣ含有巨大芽孢桿菌gdhⅣ基因的pGEM7本申請pGEM7gntKgdhⅣ含有g(shù)ntK和gdhⅣ基因的pGEM7本申請</table></tables>表2具有不同基因結(jié)構(gòu)的大腸桿菌粗提物中葡糖脫氫酶和葡糖酸激酶的活性的檢測菌株葡糖脫氫酶的比葡糖酸激酶的比活活W3110/pGEM7n.d.a.n.d.a.W3110/pGEM7gdhⅣ0.4U/mgn.d.W3110/pGEM7gntKn.d.a.0.9U/mgW3110/pGEM7gntKgdhⅣ1.0U/mg0.9U/mgn.d.a.=無可檢測的活性；n.d.=未檢測權(quán)利要求1．用于微生物制備來自芳族代謝物質(zhì)的方法，其中在生產(chǎn)這些物質(zhì)的微生物中由于增加氧化葡萄糖的酶的活性而轉(zhuǎn)化含葡萄糖底物。2．按照權(quán)利要求1的方法，其特征在于，將葡糖脫氫酶活性引入到所述微生物中和/或在所述微生物中增加葡糖脫氫酶的活性。3．按照權(quán)利要求2的方法，其特征在于，將巨大芽孢桿菌葡糖脫氫酶活性引入到所述微生物中和/或在所述微生物中增加巨大芽孢桿菌葡糖脫氫酶活性。4．按照權(quán)利要求2或3的方法，其特征在于，將巨大芽孢桿菌葡糖脫氫酶Ⅳ活性引入到所述微生物中和/或在所述微生物中增加巨大芽孢桿菌葡糖脫氫酶Ⅳ活性。5．按照權(quán)利要求1-4之一的方法，其特征在于，額外增加使葡萄糖磷酸化的酶活性。6．按照權(quán)利要求5的方法，其特征在于，增加葡糖酸激酶活性。7．按照權(quán)利要求5或6的方法，其特征在于，增加大腸桿菌葡糖酸激酶活性。8．按照權(quán)利要求2-7之一的方法，其特征在于，額外增加葡糖酸內(nèi)酯酶活性，特別是增加運(yùn)動發(fā)酵單胞菌葡糖酸內(nèi)酯酶活性。9．按照權(quán)利要求1-8之一的方法，其特征在于，額外增加PEP不依賴性糖攝取的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的活性。10．按照權(quán)利要求9的方法，其特征在于，所述轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白是易化蛋白。11．按照權(quán)利要求9或10的方法，其特征在于，所述易化蛋白是運(yùn)動發(fā)酵單胞菌葡萄糖易化蛋白(Glf)。12．按照權(quán)利要求2-11之一的方法，其特征在于，a)通過引入所述基因b)和/或通過增加所述基因拷貝數(shù)c)和/或通過增加基因表達(dá)d)和/或通過增加所述酶的內(nèi)源活性e)和/或通過改變所述酶的結(jié)構(gòu)f)和/或通過使用去調(diào)節(jié)的酶g)和/或通過引入編碼去調(diào)節(jié)的酶的基因增加氧化葡萄糖的酶活性或增加氧化葡萄糖的酶，并另外增加使葡萄糖磷酸化的酶、葡糖酸內(nèi)酯酶和PEP不依賴性糖攝取的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的活性中的至少一種活性。13．按照權(quán)利要求12的方法，其特征在于，通過將一種或多種基因整合到一種或幾種基因結(jié)構(gòu)中實(shí)現(xiàn)所述活性的增加，而所述一種或多種基因作為單拷貝或以增加的拷貝數(shù)引入到所述基因結(jié)構(gòu)中。14．按照權(quán)利要求9-13之一的方法，其特征在于，如果存在PEP依賴性糖攝取系統(tǒng)，則另外降低或消除其活性。15．按照權(quán)利要求1-14之一的方法，其特征在于，使用另外參與所述物質(zhì)合成的一種或多種酶去調(diào)節(jié)和/或顯示活性增加的微生物。16．按照權(quán)利要求1-15的方法，其特征在于，制備的所述物質(zhì)是芳族氨基酸。17．按照權(quán)利要求16的方法，其特征在于，所述芳族氨基酸是L-苯丙氨酸。18．按照權(quán)利要求1-17之一的方法，其特征在于，使用的微生物屬于埃希氏菌屬、沙雷氏菌屬、芽胞桿菌屬、棒狀桿菌屬或短桿菌屬。19．按照權(quán)利要求18的方法，其特征在于，所述微生物是大腸桿菌。20．基因結(jié)構(gòu)，以重組形式包括或者編碼氧化葡萄糖的酶的基因和編碼使葡萄糖磷酸化的酶的基因；或者編碼氧化葡萄糖的酶的基因和編碼PEP不依賴性糖攝取的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的基因；或者編碼氧化葡萄糖的酶的基因和以下三種基因中的至少兩種基因，即編碼使葡萄糖磷酸化的酶的基因、編碼葡糖酸內(nèi)酯酶的基因或編碼PEP不依賴性糖攝取的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的基因。21．按照權(quán)利要求20的基因結(jié)構(gòu)，其特征在于，所述氧化葡萄糖的酶的基因編碼葡糖脫氫酶，而所述使葡萄糖磷酸化的酶的基因編碼葡糖酸激酶。22．按照權(quán)利要求20或21的基因結(jié)構(gòu)，其特征在于，所述葡糖脫氫酶的基因得自巨大芽孢桿菌，所述葡糖酸激酶的基因得自大腸桿菌，而所述葡糖酸內(nèi)酯酶和所述轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的基因得自運(yùn)動發(fā)酵單胞菌。23．轉(zhuǎn)化細(xì)胞，帶有可復(fù)制形式的按照權(quán)利要求20-22的一種基因結(jié)構(gòu)。24．按照權(quán)利要求23的轉(zhuǎn)化細(xì)胞，其特征在于，在所述細(xì)胞中，另外參與所述物質(zhì)合成的一種或多種酶去調(diào)節(jié)和/或顯示活性增加。25．按照權(quán)利要求23或24的轉(zhuǎn)化細(xì)胞，其特征在于，所述細(xì)胞是大腸桿菌細(xì)胞。26．按照權(quán)利要求23-25之一的轉(zhuǎn)化細(xì)胞，其特征在于，如果存在PEP依賴性糖攝取系統(tǒng)，那么另外降低或消除所述系統(tǒng)的活性。27．按照權(quán)利要求23-26之一的轉(zhuǎn)化細(xì)胞，其特征在于，它能夠生產(chǎn)芳族氨基酸。28．按照權(quán)利要求27的轉(zhuǎn)化細(xì)胞，其特征在于，所述芳族氨基酸是L-苯丙氨酸。29．按照權(quán)利要求1-19之一的微生物制備物質(zhì)的方法，其特征在于，使用按照權(quán)利要求23-28之一的轉(zhuǎn)化細(xì)胞，在所述轉(zhuǎn)化細(xì)胞中，存在按照權(quán)利要求20-22之一的基因結(jié)構(gòu)。全文摘要本發(fā)明涉及微生物制備來自芳族代謝物質(zhì)的方法;尤其是制備芳族氨基酸的方法。另外,本發(fā)明涉及基因結(jié)構(gòu)和轉(zhuǎn)化細(xì)胞。按照本發(fā)明,通過引入或增加葡糖脫氫酶的活性,觀察到物質(zhì)產(chǎn)量的增加,特別是芳族氨基酸產(chǎn)量的增加。增加氧化葡萄糖的酶的活性導(dǎo)致由含葡萄糖底物于細(xì)胞內(nèi)形成葡糖酸內(nèi)酯和葡糖酸。在一個優(yōu)選的實(shí)施方案中,所述葡糖脫氫酶來自巨大芽抱桿菌、按照本發(fā)明的方法可以用于提供廣譜的物質(zhì)。文檔編號C12N15/53GK1298448SQ99805381公開日2001年6月6日申請日期1999年4月22日優(yōu)先權(quán)日1998年4月24日發(fā)明者M(jìn)·克雷默,M·卡盧茨,G·斯普倫格,H·薩姆申請人:荷蘭加甜劑公司,于利奇研究中心有限公司,Dsm生物技術(shù)股份有限公司