專利名稱：：新型戊型肝炎病毒基因序列及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及肝炎病毒學(xué)領(lǐng)域。更具體地，本發(fā)明涉及一種新型戊型肝炎病毒株的核苷酸序列及其編碼的蛋白，以及這些核苷酸序列和編碼蛋白在肝炎的診斷、預(yù)防和治療上的用途。已經(jīng)報(bào)道，在亞洲、非洲和中美洲有戊型肝炎流行病，一種腸傳播的非甲型/非乙型肝炎(Balayan,M.S.(1987)，蘇聯(lián)醫(yī)學(xué)回顧，章節(jié)E，病毒學(xué)回顧，Zhdanov,0-V.M.(編輯)，Chur，瑞士Harwood學(xué)術(shù)出版社，2卷,235-261；Purcell,R.G.,等人(1988)Zuckerman,A.J.(編輯)，″病毒性肝炎和肝疾病"，NewYork:AlanR.Liss,131-137；Bradley,D.W.(1990)，英國醫(yī)學(xué)公告，46:442-461；Ticehurst,J.R.(1991)Hollinger,F.B.,Lemon,S.M.,Margolis,H.S.(編輯)″病毒性肝炎和肝疾病″，Williams和Wilkins,Baltimore,501-513)。在戊型肝炎病毒(HEV)是地方病的國家中，偶發(fā)性的肝炎病例(推測是戊型肝炎)占報(bào)道肝炎的90％。需要開發(fā)在受感染個(gè)體的血清中檢測出抗-HEV抗體的血清學(xué)測試方法是本領(lǐng)域中廣泛意識到的，但是從受感染的人或動(dòng)物中分泌出的HEV的濃度非常低，這使得不可能將這種HEV用作血清學(xué)測試的抗原源，盡管有少數(shù)在細(xì)胞培養(yǎng)中繁殖HEV的成功報(bào)道(Huang,R.T.等人，(1992)，普通病毒學(xué)雜志(J.Gen.Virol.),73:1143-1148)，但是目前細(xì)胞培養(yǎng)不能有效地產(chǎn)生血清測試所需數(shù)量的抗原。最近，世界范圍內(nèi)的為鑒別出與戊型肝炎關(guān)聯(lián)的病毒基因組序列而進(jìn)行的主要努力，已經(jīng)導(dǎo)致克隆出數(shù)目有限的HEV株的基因組(Tam,A.W.等人(1991)，病毒學(xué)，185:120-131；Tsarev,S.A.等人(1992)，美國科學(xué)院院報(bào)，89:559-563；Fry,K.E.等人(1992)，病毒基因，6:173-185)。目前，根據(jù)已報(bào)道的HEV全序列，將戊型肝炎病毒分為三個(gè)基因型，Ⅰ型為亞洲、非洲型，Ⅱ型為墨西哥型，Ⅲ型為美國型。在本發(fā)明之前，還沒有公開過其他基因型的戊型肝炎病毒。對DNA序列的分析使研究者假設(shè)HEV基因組被分成3個(gè)開放閱讀框(ORF)，并且假設(shè)這些ORF編碼完整的HEV蛋白。其中，由ORF2等基因片段所編碼的小蛋白已經(jīng)被用于免疫測定以檢測哺乳動(dòng)物血清中的抗HEV抗體。來自緬甸(Myanmar)的HEV株的一部分基因組DNA序列公開于Reyes等人，1990,科學(xué)，247:1335-1339。Tam等人(1991)和Reyes等人PCT專利申請WO91/15603(1991年10月17日出版)公開了HEV緬甸株的完整的核苷酸序列和推導(dǎo)的氨基酸序列。這些作者假設(shè)，在該毒株的序列中含有3個(gè)正向的開放閱讀框(ORF)。HEV墨西哥株和HEV緬甸株的ORF2的3′區(qū)域中所編碼的其他蛋白的表達(dá)，在Yarbough等人，1991，病毒學(xué)雜志，65:5790-5797中有描述。這篇文章描述分離出來自HEV的2種cDNA克隆。這些克隆編碼ORF2的3′區(qū)域中的蛋白質(zhì)。這些克隆在大腸桿菌中以融合蛋白形式表達(dá)。Purdy等人，1992，病毒學(xué)檔案，123:335-349和Favorov等人，1992，醫(yī)學(xué)病毒學(xué)雜志，36:246-250，公開了在大腸桿菌中表達(dá)來自緬甸株的更大的ORF2蛋白片段。這些文獻(xiàn)以及那些前面討論的文獻(xiàn)都僅公開了用細(xì)菌表達(dá)體系來表達(dá)一部分ORF2基因。因此，為了更好對付戊型肝炎，本領(lǐng)域需要鑒別出新的戊型肝炎基因型。本發(fā)明涉及一種新的分離出的人戊型肝炎病毒柱HEV-T1。本發(fā)明涉及分離的和基本純化的人戊型肝炎病毒株HEV-T1的制劑。本發(fā)明還涉及分離的和基本純化的人戊型肝炎病毒株HEV-T1基因組RNA的制劑。本發(fā)明還涉及人戊型肝炎病毒株HEV-T1的cDNA。本發(fā)明的一個(gè)目的是提供能夠指導(dǎo)產(chǎn)生重組HEV蛋白的合成的核酸序列，以及等價(jià)的天然核酸序列。這種天然的核酸序列可從cDNA或基因組文庫中分離出，即從這些文庫中鑒別和分離出能指導(dǎo)HEV蛋白合成的基因。較佳地，該核酸編碼含有SEQIDNO:1、2或3所示氨基酸序列的蛋白。出于本申請的目的，核酸序列指RNA、DNA、cDNA或其任何合成的編碼蛋白質(zhì)的變異體。本發(fā)明還涉及一種基于采用衍生自HEV-T1cDNA的引物而選擇性擴(kuò)增戊型肝炎基因片段，從而在生物樣品中檢測戊型肝炎的方法。本發(fā)明還涉及使用衍生自HEV-T1cDNA的單鏈反義多聚或寡聚核苷酸來抑制戊型肝炎基因的表達(dá)。本發(fā)明還涉及分離的和基本純化的、由HEV-T1的HEV基因組編碼的或由合成的核酸序列編碼的HEV蛋白或其變異體，尤其涉及由至少一個(gè)HEV的完整開放閱讀框所編碼的重組蛋白。較佳地，該蛋白的序列基本上由選自下組的氨基酸序列所構(gòu)成SEQIDNO1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3。本發(fā)明還涉及制備衍生自HEV基因組序列的重組HEV蛋白的方法，它通過克隆核酸和將cDNA插入表達(dá)載體，然后在宿主細(xì)胞中表達(dá)重組蛋白。本發(fā)明還涉及相關(guān)的載體和宿主細(xì)胞。本發(fā)明還涉及將得到的重組HEV蛋白作為診斷劑和疫苗的用途。本發(fā)明還包括在生物樣品中檢測對戊型肝炎特異的抗體的方法。它包括將該生物樣品與對權(quán)利要求1所述的戊型肝炎病毒蛋白特異的抗體接觸，以便與該戊型肝炎病毒形成復(fù)合物；檢測是否形成了免疫復(fù)合物，形成免疫復(fù)合物就表示存在戊型肝炎病毒。這些方法可用于診斷由HEV引起的感染和疾病，還可用于監(jiān)測疾病的進(jìn)展情況。這些方法還可用于監(jiān)測治療哺乳動(dòng)物HEV感染和疾病過程中治療劑的功效。本發(fā)明還涉及用于預(yù)防或治療人戊型肝炎的藥物組合物。它含有本發(fā)明的HEV蛋白和藥學(xué)上可接受的賦形劑、稀釋劑或載體的藥物組合物。本發(fā)明還涉及一種多肽片段，它具有選自本發(fā)明HEV-T1蛋白的連續(xù)15-100個(gè)氨基酸序列，且該多肽的氨基酸序列與Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型戊型肝炎病毒Z的相應(yīng)序列的同源性小于70％。還涉及一種DNA片段，它具有選自本發(fā)明HEV-T1DNA的連續(xù)15-1000個(gè)核酸序列，且該DNA片段的氨基酸序列與Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型戊型肝炎病毒Z的相應(yīng)序列的同源性小于70％。圖1是pCR*Ⅱ載體的結(jié)構(gòu)圖。圖2是HEV基因結(jié)構(gòu)圖。其中圖2A是HEVⅠ、Ⅱ和Ⅲ型的基因結(jié)構(gòu)圖；圖2B是HEV-T1的基因結(jié)構(gòu)圖。MT是甲基轉(zhuǎn)移酶；Pro是半胱氨酸蛋白酶；ORF上的兩個(gè)突起標(biāo)志是糖基化位點(diǎn)。圖3是HEV基因進(jìn)化樹。圖中，墨西哥株為M1，基因庫編號為M74506；緬甸株為B1和B2，基因庫編號分別為M73218,D10330；巴基斯坦株為P1，基因庫編號為M80581；中國株為C1,C2和C3，基因庫編號分別為L25547,M94177,D11093；印度株為I1和I2，基因庫編號分別為X98292,X99441；美國株為U1和U2，基因庫編號分別AF060668,AF060669.發(fā)明詳述本發(fā)明涉及分離的和基本純化的新的戊型肝炎病毒株HEV-T1。本發(fā)明還涉及克隆編碼HEV蛋白質(zhì)的病毒基因以及用表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)重組蛋白。更具體地，本發(fā)明涉及衍生自HEV-T1的開放閱讀框(ORF)的克隆和表達(dá)。本發(fā)明涉及分離的HEV蛋白質(zhì)。本發(fā)明的HEV蛋白質(zhì)較佳地是與天然的HEV蛋白質(zhì)基本同源，最佳地是與天然HEV蛋白質(zhì)在生物學(xué)上等價(jià)。如說明書和權(quán)利要求書中所用，“生物學(xué)上等價(jià)”指組份能夠形成病毒樣顆粒而且有免疫原性。一旦注射入哺乳動(dòng)物，本發(fā)明的HEV蛋白質(zhì)還可刺激產(chǎn)生保護(hù)性的抗體，這些抗體會(huì)保護(hù)哺乳動(dòng)物免受野生型HEV的侵襲。如隨后的說明書和權(quán)利要求書中所用，“基本同源”指與天然HEV蛋白質(zhì)氨基酸序列的同源程度。與天然HEV蛋白質(zhì)的同源程度較佳地為超過70％，更佳地超過90％，特別優(yōu)選的是同源性超過90％的蛋白質(zhì)。較佳的HEV蛋白質(zhì)是那些由ORF基因編碼的蛋白質(zhì)。特別感興趣的是由HEV的ORF2基因所編碼的蛋白質(zhì)，最感興趣的是由HEVHEV-T1株ORF2基因所編碼的蛋白質(zhì)。優(yōu)選的、由ORF2基因編碼的本發(fā)明蛋白質(zhì)可形成病毒樣顆粒。ORF-1、ORF2和ORF-3蛋白質(zhì)的氨基酸序列在下面分別示于SEQIDNO:1、SEQIDNO:2和SEQIDNO:3。優(yōu)選的重組HEV蛋白質(zhì)含有至少一個(gè)ORF蛋白質(zhì)?？梢灾苽淦渌梢粋€(gè)以上相同或不同ORF蛋白構(gòu)成的重組蛋白，以改變蛋白質(zhì)的生物特性。添加、置換或缺失個(gè)別氨基酸或個(gè)別氨基酸序列可能會(huì)提高HEV的生物活性，這也在本發(fā)明范圍之中。本發(fā)明還涉及一種核酸序列，它能夠指導(dǎo)產(chǎn)生上述的HEV蛋白質(zhì)或與HEV蛋白質(zhì)基本同源的蛋白質(zhì)。該核酸序列被稱為HEV-T1，它作為SEQIDNO:4示于下面，并且于1999年12月10日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)(CGMCC保藏號為0429)。按常規(guī)，在一個(gè)方向上的序列被稱為正鏈(“+”鏈)，因?yàn)樗荝NA病毒的蛋白質(zhì)編碼鏈，即在SEQIDNO:4中所示的序列。HEV-T1全長基因序列為7232個(gè)堿基。T、C、A、G的含量分別位27.1％，28.4％，18.6％，25.9％。5′非編碼區(qū)為25個(gè)堿基，3′非編碼區(qū)為68個(gè)堿基。5′和3′非編碼區(qū)之間有3個(gè)開放讀碼框架(ORF)。其中，(1)ORF1包括SEQIDNO:4的26-5149位核苷酸，全長5124個(gè)核苷酸。ORF1的序列被單獨(dú)列于SEQIDNO:5，編碼1707個(gè)氨基酸的ORF1蛋白。(2)ORF2包括SEQIDNO:4的5146-7164位核苷酸，全長2019個(gè)核苷酸。ORF2的序列被單獨(dú)列于SEQIDNO:6，編碼672個(gè)氨基酸的ORF2蛋白。(3)ORF3包括SEQIDNO:4的5174-5512位核苷酸，全長339個(gè)氨基酸。ORF3的序列被單獨(dú)列于SEQIDNO:7，編碼112個(gè)氨基酸的ORF3蛋白。在已報(bào)道的HEV中，ORF3分別與ORF1、ORF2重疊1個(gè)和328個(gè)核苷酸；而在本發(fā)明的新戊型肝炎病毒HEV-T1中，ORF3只與ORF2重疊339個(gè)核苷酸而與ORF1沒有重疊，ORFi和ORF2重疊1個(gè)核苷酸，基因結(jié)構(gòu)與其它已報(bào)道HEV明顯不同(詳見表3及圖2)。這是由于在戊型肝炎病毒HEV-T1的核苷酸序列中，第5160核苷酸位插入一個(gè)“T”，使ORF2的起始密碼前移42個(gè)核苷酸，ORF3的起始密碼后移28個(gè)核苷酸，使ORF2和ORF3多肽的氨基端發(fā)生了明顯的變化，而氨基端主要為信號多肽，通過計(jì)算機(jī)分析顯示，改變后的ORF2和ORF3仍有完整的信號多肽，說明雖然基因結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變，但仍能保證其正常的功能。通過對同一基因型的另一株病毒進(jìn)行該片段的基因序列分析，也發(fā)現(xiàn)了同樣的基因結(jié)構(gòu)，說明這一結(jié)構(gòu)為戊肝病毒ⅣV型的特征性結(jié)構(gòu)。這是在國際上首次發(fā)現(xiàn)戊肝病毒ⅣV型，并首次完成該型全基因的克隆及序列的分析。在構(gòu)思之中的還有DNA序列的變異體，它們導(dǎo)致產(chǎn)生能夠指導(dǎo)產(chǎn)生ORF1、ORF2、和/或ORF3蛋白類似物的DNA序列。如說明書和權(quán)利要求書中所用，“ORF蛋白類似物”指氨基酸序列與此處具體給出的SEQIDNO:1、2或3序列基本上相同的蛋白質(zhì)，其中此處所述序列中的一個(gè)或多個(gè)殘基被生物學(xué)上等價(jià)的殘基所替代，這樣形成的蛋白質(zhì)(即“類似物”)能夠形成病毒顆粒而且是免疫原性的。應(yīng)注意，上面給出的DNA序列代表了本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選例子。由于遺傳密碼的簡并性，所以可以制備許多種核苷酸，它們都是能夠指導(dǎo)合成該ORF蛋白質(zhì)或其類似物的DNA序列。因此，功能上與上述序列等價(jià)的DNA序列，或者功能上與指導(dǎo)合成ORF蛋白質(zhì)類似物(按照上述的氨基酸序列產(chǎn)生的)的序列等價(jià)的DNA序列都被包括在本發(fā)明之內(nèi)。本發(fā)明還涉及一種基于選擇性地?cái)U(kuò)增戊型肝炎基因片段而在生物樣品中檢測戊型肝炎的方法。較佳地，這種方法采用一對單鏈引物，這一對引物來自DNA雙鏈片段的相對鏈的非同源區(qū)域，而該DNA雙鏈片段又來自在基因組中含有與SEQIDNO:4所示的HEV-T1序列同源的區(qū)域的戊型肝炎病毒。這些引物可用于擴(kuò)增選定核酸序列的方法。本發(fā)明還涉及使用衍生自HEV-T1cDNA的單鏈反義多聚或寡聚核苷酸來抑制戊型肝炎基因的表達(dá)。這些反義的多聚或寡聚核苷酸可以是DNA或RNA。靶序列典型地是信使RNA，更佳地是加工或翻譯RNA所需的信號序列。反義的多聚或寡聚核苷酸可偶連于聚陽離子比如聚賴氨酸，如Lemaitre,M.等人(1989)美國科學(xué)院院報(bào)84:648-652中所公開的那樣；然后該偶聯(lián)物可給哺乳動(dòng)物施用，用量足以雜交并抑制信使RNA的功能。本發(fā)明還涉及一種重組DNA方法，它用于制備HEV蛋白質(zhì)，較佳地是含有至少一個(gè)ORF蛋白的蛋白質(zhì)，最佳地是含有至少一個(gè)ORF2蛋白的蛋白質(zhì)。重組的ORF蛋白可以由一個(gè)ORF構(gòu)成，或者由相同或不同的ORF蛋白組合而成。可使用天然的或合成的核酸序列來指導(dǎo)產(chǎn)生HEV蛋白。在本發(fā)明的一個(gè)例子中，該方法包括(a)制備能夠指導(dǎo)宿主有機(jī)體產(chǎn)生HEV-T1蛋白質(zhì)的核酸序列；(b)將核酸序列克隆入能夠轉(zhuǎn)入并在宿主有機(jī)體中復(fù)制的載體，該載體含有用于該核酸序列的可操作元件；(c)將含有該核酸和可操作元件的載體轉(zhuǎn)入能夠表達(dá)蛋白質(zhì)的宿主有機(jī)體；(d)在適合擴(kuò)增載體和表達(dá)蛋白質(zhì)的條件下，培養(yǎng)宿主有機(jī)體；和(e)收獲蛋白質(zhì)。在本發(fā)明的另一例子中，公開了一種用重組DNA技術(shù)產(chǎn)生蛋白質(zhì)的方法，其中該蛋白質(zhì)是HEV-T1核酸序列所編碼的蛋白質(zhì)，較佳地由HEV-TI的至少一個(gè)ORF所編碼的蛋白質(zhì)或者相同或不同ORF蛋白質(zhì)的組合，最佳地由至少一個(gè)ORF2核酸序列所編碼的蛋白質(zhì)，該方法包括(a)在適合產(chǎn)生蛋白質(zhì)的條件下，培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的或轉(zhuǎn)染的宿主有機(jī)體，該宿主有機(jī)體含有能夠指導(dǎo)宿主有機(jī)體產(chǎn)生某蛋白質(zhì)的核酸序列，該蛋白質(zhì)與從HEV分離出的，具有SEQIDNO.1、SEQIDNO.2或SEQIDNO.3或其組合的氨基酸序列的天然HEV蛋白質(zhì)基本同源。可用于本發(fā)明的載體包括任何載體，只要在該載體中可以插入所述的核酸序列，以及任何優(yōu)選的或所需的可操作元件，并且該載體可以隨后被轉(zhuǎn)入宿主有機(jī)體并在該有機(jī)體中復(fù)制。優(yōu)選的載體是，那些限制性位點(diǎn)已記載清楚而且含有轉(zhuǎn)錄核酸序列所需的或優(yōu)選的可操作元件的載體。如此處所用，“可操作元件”包括至少一個(gè)啟動(dòng)子、至少一個(gè)操縱基因、至少一個(gè)前導(dǎo)序列、至少一個(gè)終止密碼子和其他任何對于載體核酸序列的合適轉(zhuǎn)錄和隨后翻譯所必需或優(yōu)選的DNA序列。尤其是這樣的載體它含有至少一個(gè)被宿主有機(jī)體識別的復(fù)制起始點(diǎn)和至少一個(gè)供選擇的標(biāo)記以及至少一個(gè)能夠引發(fā)核酸序列轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子序列。在構(gòu)建本發(fā)明的克隆載體過程中，還應(yīng)注意，可在每個(gè)載體中插入多拷貝的核酸序列及其可操作元件。在這樣的例子中，對于每個(gè)載體而言，每個(gè)宿主有機(jī)體會(huì)產(chǎn)生更多的所需HEV蛋白質(zhì)?？梢圆迦胼d體的多拷貝DNA序列的數(shù)目僅取決于形成的載體的能力，這些能力受其大小、轉(zhuǎn)入以及在合適的宿主微生物中復(fù)制和轉(zhuǎn)錄等因素的影響。在另一例子中，將含有HEV蛋白編碼序列的限制性消化片段插入合適的、會(huì)在原核或真核細(xì)胞中起作用的表達(dá)載體?！昂线m的”指載體能夠攜帶和表達(dá)為HEV蛋白(較佳地，至少一個(gè)完整的ORF蛋白)編碼的完整核酸序列。在ORF2的情況下，表達(dá)的蛋白質(zhì)會(huì)形成病毒樣顆粒。優(yōu)選的表達(dá)載體是那些能在真核細(xì)胞中起作用的種類。這類載體的例子包括但并不限于用于在酵母中表達(dá)的載體(如pPIC9載體-Invitrogen)、痘苗病毒載體、腺病毒或皰疹病毒，尤其是桿狀病毒轉(zhuǎn)化載體、pBlueBac。此外，選定的重組表達(dá)載體也可被轉(zhuǎn)染入合適的真核細(xì)胞系統(tǒng)，以便表達(dá)重組蛋白。這種真核細(xì)胞系統(tǒng)包括但并不限于酵母和諸如HeLa、MRC-5或Cv-1之類的細(xì)胞系。一種優(yōu)選的真核細(xì)胞系統(tǒng)是SF9昆蟲細(xì)胞。一種優(yōu)選的方法涉及使用pBlueBac表達(dá)載體，其中通過鈣沉淀法用重組pBlueBac和AcMNPV桿狀病毒共轉(zhuǎn)染昆蟲細(xì)胞SF9。表達(dá)的重組蛋白可用本領(lǐng)域中已知的方法進(jìn)行檢測，其中包括考馬斯藍(lán)染色法和Western印跡法(使用含有抗HEV抗體的血清)。另一方法是用免疫電子顯微鏡檢測病毒樣顆粒。在另一例子中，由細(xì)胞表達(dá)的重組蛋白可以粗裂解液形式獲得，或者用本領(lǐng)域中已知的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)純化程序加以純化。純化方法包括差示沉淀、分子篩色譜、離子交換、等電聚焦、凝膠電泳、親和色譜和免疫親和色譜等。在免疫親和色譜中，重組蛋白可通過含有樹脂的柱而純化，其中在樹脂上結(jié)合有對ORF蛋白特異的抗體。表達(dá)的本發(fā)明的重組蛋白可被用于免疫分析，以診斷或預(yù)后哺乳動(dòng)物中的戊型肝炎。其中哺乳動(dòng)物包括但并不限于人、黑猩猩、其他靈長目動(dòng)物。在一個(gè)優(yōu)選例子中，免疫分析被用于診斷人的戊型肝炎感染。使用HEV蛋白，尤其是ORF蛋白，特別是ORF2蛋白而進(jìn)行免疫分析，提供了高特異性的、靈敏的、可重復(fù)的、診斷HEV感染的方法，這與采用不完整的ORF蛋白而進(jìn)行的免疫分析形成了鮮明的對比。本發(fā)明的免疫分析可以是放射免疫分析、Western印跡分析、免疫熒光分析、酶免疫分析、化學(xué)發(fā)光分析、免疫組織化學(xué)分析等。本領(lǐng)域中已知的ELISA標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)在“免疫診斷方法”(MethodsinImmunodiagnosis)，第2版，Rose和Bigazzi編輯，JohnWiley和Sons,1980和Campbell等人，“免疫學(xué)方法”(MethodsofImmunology),W.A.Benjamin,Inc.,1964中有描述，這兩篇文獻(xiàn)都在此引用作為參考。這種分析可以是本領(lǐng)域中所述的直接的、間接的、競爭性的或非競爭性的免疫測定。(Oellerich,M.1984.“臨床化學(xué)臨床生物化學(xué)雜志”(J.Clin.Chem.Clin.Biochem.)22:895-904)。適用于這種檢測分析的生物樣品包括但并不限于組織解剖抽提物、全血、血漿、血清、腦脊液、胸膜液、尿液等。在一個(gè)例子中，測試血清與一固相試劑進(jìn)行反應(yīng)，該固相試劑表面結(jié)合有作為抗原的重組HEV蛋白，較佳地為ORF蛋白或不同ORF蛋白的組合形式如ORF2和ORF-3、ORF-1和ORF-3等。較佳地，HEV蛋白是會(huì)形成病毒樣顆粒的ORF2蛋白?？梢杂靡阎膶⒌鞍踪|(zhì)結(jié)合于固相載體材料的技術(shù)制備固相表面試劑。這些結(jié)合方法包括蛋白質(zhì)與載體的非特異吸附或蛋白質(zhì)與載體上反應(yīng)基團(tuán)的共價(jià)結(jié)合。在抗原與抗HEV抗體反應(yīng)之后，通過洗滌而除去未結(jié)合的血清組份，然后抗原-抗體復(fù)合物再與次級抗體(如標(biāo)記的抗-人抗體)反應(yīng)。標(biāo)記物可以是在合適熒光試劑或生色試劑的存在下孵育固相載體而被檢測出的酶。其他的合適標(biāo)記物也可使用，如放射性標(biāo)記物或膠體金等。此外，由含有HEV-T1ORF2或ORF3序列的重組載體所表達(dá)的蛋白被用作特異性結(jié)合劑，以檢測抗HEV抗體。本發(fā)明的蛋白質(zhì)還能檢測出針對不同HEV株而產(chǎn)生的抗體，但是不會(huì)檢測出針對甲型、乙型、丙型或丁型肝炎而產(chǎn)生的抗體。HEV蛋白和類似物可以單獨(dú)地或與其他試劑如次級抗體一起被制成試劑盒形式用于免疫測定。本發(fā)明的重組HEV蛋白，較佳地為ORF蛋白或ORF蛋白的重組蛋白，更佳地為ORF2蛋白和基本同源的蛋白質(zhì)及類似物，可以被用作疫苗以保護(hù)哺乳動(dòng)物免受戊型肝炎的侵襲。作為免疫原的疫苗，可以是細(xì)胞、用重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)染過的細(xì)胞的細(xì)胞裂解液或含有表達(dá)蛋白的培育上清液?；蛘呙庖咴遣糠只蚧炯兓闹亟M蛋白。盡管可以將免疫原以純的或基本純的形式進(jìn)行施用，但是最好還是以藥物組合物、藥劑或制劑形式使用。本發(fā)明的藥劑可用作獸藥或用于人類，它含有上述的免疫原和一種或多種藥學(xué)上可接受的載體和任選的其他治療成分。載體必須是“可接受的”，意味著與藥劑的其他成分相容而且對接受者無害。藥劑可以方便地作為單位劑量形式，并且可用藥物領(lǐng)域中公知的方法制備。所有的方法包括將活性成分與作為一種或多種附屬成分的載體混合起來。一般，藥劑的制備是通過將活性成分與液態(tài)載體或細(xì)分固相載體，或與兩者一起均勻地和緊密地混合在一起，然后如果需要將產(chǎn)品制成所需的藥劑。適用于靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、皮下或腹膜內(nèi)給藥的藥劑，可以是活性成分與其他溶液(最好與接受者的血液是等滲的溶液)形成的無菌水溶液。這種藥劑可以方便地將固體的活性成分溶解在含有生理相容物質(zhì)如氯化鈉(如0.1-2.0M)、甘油等并且具有與生理?xiàng)l件相容的緩沖pH的水中，以產(chǎn)生水溶液，然后使該溶液無菌。它們可以裝在單劑量或多劑量容器中如密封的安瓿或小瓶。本發(fā)明的藥劑可以加入穩(wěn)定劑。代表性的穩(wěn)定劑是聚乙二醇、蛋白質(zhì)、糖類、氨基酸、無機(jī)酸和有機(jī)酸，它們可以單獨(dú)使用或混合使用。這些穩(wěn)定劑較佳的加入量相對每份重量的免疫原而言為0.11-10,000重量份數(shù)。如果使用兩種或多種穩(wěn)定劑，那么它們的重量最好在上述范圍之內(nèi)。這些穩(wěn)定劑被用于合適濃度和pH下的水溶液中。這種水溶液的比滲透壓一般為0.1-3.0滲透壓摩爾，較佳地為0.8-1.2滲透壓摩爾。水溶液的pH被調(diào)節(jié)至范圍5.0-9.0，較佳地為6-8之內(nèi)。在配制本發(fā)明的免疫原時(shí)，可使用抗吸附劑。還可采用額外的藥物學(xué)方法來控制作用的持續(xù)時(shí)間。通過使用聚合物來復(fù)合或吸附蛋白質(zhì)或其衍生物，可以獲得控釋劑。還可以通過選擇合適的大分子(如聚酯、聚氨基酸、乙烯類聚合物、吡咯烷酮、乙烯乙酸乙烯酯、甲基纖維素、羧甲基纖維素或硫酸魚精蛋白)和大分子濃度以及控釋的摻入方法，來實(shí)施受控的給藥。另一種通過控釋制劑而控制作用持續(xù)時(shí)間的可行方法是，將蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)類似物或其功能衍生物摻入聚合物材料如聚酯、聚氨基酸、水凝膠、聚(乳酸)或乙烯乙酸乙烯酯共聚物?；蛘撸粚⑦@些試劑摻入聚合物顆粒，而是將這些顆粒截留在例如通過團(tuán)聚技術(shù)或界面聚合反應(yīng)制備的微囊中，如羥甲基生物素或明膠微囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微囊，或者截留在膠體藥物給藥系統(tǒng)中如脂質(zhì)體、白蛋白微球、微乳、納米級顆粒和納米級膠囊，或者截留在大乳狀液中。當(dāng)需要口服制劑時(shí)，組合物可以與典型的載體混合，其中有如乳糖、蔗糖、淀粉、滑石硬脂酸鎂、結(jié)晶纖維素、甲基纖維素、羥甲基纖維素、甘油、藻酸鈉或阿拉伯膠。本發(fā)明的蛋白質(zhì)可以單獨(dú)作為試劑盒形式提供，也可以上述的藥物組合物的形式提供。接種疫苗可以用常規(guī)方法進(jìn)行。例如，可以使用在適當(dāng)稀釋劑如鹽水或水，或完全或不完全的佐劑中的免疫原。此外，為了使蛋白質(zhì)有免疫原性，免疫原可以結(jié)合或不結(jié)合于載體。載體分子的來自包括但并不限于牛血清白蛋白(BAS)、匙孔血藍(lán)蛋白(KLH)、破傷風(fēng)類毒素等。免疫原可以通過任何適合抗體產(chǎn)品的途徑進(jìn)行給藥，如靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、肌內(nèi)、皮下等給藥。免疫原可以給藥一次或者按固定間隔給藥，直至產(chǎn)生大量的抗HEV抗體?？贵w可用免疫測定在血清中檢測出。在另一例子中，免疫原是能指導(dǎo)宿主有機(jī)體合成HEVORF蛋白的核酸序列。這種核酸序列可以用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法插入合適的表達(dá)載體。適合在體內(nèi)產(chǎn)生高效基因轉(zhuǎn)化的表達(dá)載體包括但并不限于反轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒和痘苗病毒載體。這些表達(dá)載體的可操作元件在本說明書之前已經(jīng)公開并且為本領(lǐng)域技術(shù)人員所知曉。這些表達(dá)載體可以靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、皮下、腹膜內(nèi)或口服施用。在另一例子中，通過肌內(nèi)注射例如基于質(zhì)粒的真核表達(dá)載體(該載體含有能指導(dǎo)宿主有機(jī)體合成HEVORF蛋白的核酸序列)而實(shí)現(xiàn)直接基因轉(zhuǎn)化。這種方法以前被用過，以便在體內(nèi)產(chǎn)生乙型肝炎表面抗原并導(dǎo)致了針對表面抗原的抗體應(yīng)答(Davis,H.L.等人(1993)“人類分子遺傳學(xué)”，2:1847-1851；還參見Davis等人(1993)“人類基因治療”，4:151-159和733-740)。當(dāng)免疫原是部分純化或基本純化的重組HEVORF蛋白時(shí)，引發(fā)保護(hù)性的、針對HEV的抗體應(yīng)答的有效劑量約為2微克-100微克。更佳的范圍約為5微克-70微克，最佳的范圍約為10微克-60微克。對于編碼HEVORF蛋白的核酸序列而言，引發(fā)保護(hù)性的、針對HEV的抗體應(yīng)答的有效劑量約為1微克-5000微克。更佳的范圍約為300微克-1000微克。含有能指導(dǎo)宿主有機(jī)體合成HEVORF蛋白的核酸序列的表達(dá)載體，可以單獨(dú)作為試劑盒形式提供，也可以以上述的藥物組合物的形式提供?？梢猿鲇陬A(yù)防或治療目的而施用本發(fā)明的免疫原。當(dāng)預(yù)防性地施用時(shí)，免疫原是在暴露于HEV之前或在出現(xiàn)HEV感染癥狀之前施用。預(yù)防性施用免疫原起到在哺乳動(dòng)物體中防止或減輕隨后的HEV感染的作用。當(dāng)治療性地施用時(shí)，免疫原在感染發(fā)生時(shí)(或發(fā)生后不久)，或者在出現(xiàn)HEV感染或疾病的癥狀時(shí)施用。治療性施用免疫原起到減輕感染或疾病的作用。一個(gè)優(yōu)選例子是用重組ORF2蛋白制備的疫苗。該重組ORF2蛋白由HEV株HEV-T1的ORF2序列或其等價(jià)序列所表達(dá)。因?yàn)橐驯砻髦亟MORF2蛋白可與多種HEV陽性血清反應(yīng)，所以表明可用于防止多種HEV株。除了用作疫苗之外，可用組合物制備針對HEV病毒樣顆粒的抗體。這些抗體可直接用作抗病毒劑。為了制備抗體，用病毒顆粒免疫宿主動(dòng)物，或者合適的話，將產(chǎn)生在病毒顆粒上的非顆?？乖Y(jié)合在載體上，如上對疫苗所述的那樣。按適當(dāng)?shù)臅r(shí)間間隔收集宿主的血清或血漿，從而提供含有與病毒顆粒反應(yīng)的抗體的組合物。例如通過使用飽和硫酸銨或DEAESephadex，或者本領(lǐng)域技術(shù)人員知曉的其他技術(shù)，可以獲得T球蛋白或IgG抗體。這些抗體基本上沒有那些伴隨其他抗病毒劑如藥物的不良副作用。通過減弱潛在的不良的免疫系統(tǒng)應(yīng)答，可以使抗體組合物與宿主系統(tǒng)更相容。這是通過除去外來物種抗體的全部或部分Fc區(qū)，或者使用與宿主動(dòng)物同物種的抗體(如使用來自人/人雜交瘤的抗體)而實(shí)現(xiàn)的。通過用相應(yīng)的但是無免疫原性的部分來替換抗體的免疫原性部分(即嵌合抗體)，可以產(chǎn)生人源化抗體(即在人體中無免疫原性)。這種嵌合抗體可含有一個(gè)物種抗體的活性或抗原結(jié)合部分和另一個(gè)物種抗體的Fc區(qū)(無免疫原性)。這種嵌合抗體的例子包括但并不限于非人哺乳動(dòng)物-人嵌合體、嚙齒動(dòng)物-人嵌合體、鼠科動(dòng)物-人嵌合體和大鼠-人嵌合體(Robinson等人，國際專利申請184,187；TaniguchiM.,歐洲專利申請171,496；Morrison等人，歐洲專利申請173,494；Neuberger等人，PCT申請WO86/01533；Cabilly等人，1987“美國科學(xué)院院報(bào)”84:3439；Nishimura等人，1987“癌癥研究”47:999；Wood等人，1985“自然”314:446；Shaw等人，1988，“國家癌癥研究院雜志”(″J.Natl.CancerInst.″)80:15553，這些文獻(xiàn)都在此引用作為參考)?！叭嗽椿鼻逗峡贵w的總回顧由MorrisonS.,1985“科學(xué)”229:1202和Oi等人，1986“生物技術(shù)”(″BioTechniques″)4:214中提供。合適的“人源化”抗體也可以用CDR或CEA取代法而制備(Jones等人，1986“自然”321:552；Verhoeyan等人，1988“科學(xué)”239:1534；Biedler等人，1988，“免疫學(xué)雜志”141:4053，這些文獻(xiàn)都在此引用作為參考)。還可通過遺傳工程來產(chǎn)生抗體或抗原結(jié)合片段。在大腸桿菌中表達(dá)重鏈和輕鏈基因的技術(shù)是PCT專利申請出版號WO901443。WO901443和WO9014424，以及Huse等人，1989“科學(xué)”246:1275-1281中的主題?？贵w還可用作增加免疫應(yīng)答的手段。可以按與其他治療性地施用抗體時(shí)相類似的劑量來施用抗體。例如在其他病毒疾病如狂犬病、麻疹和乙型肝炎的潛伏早期，按0.02-0.1毫升/磅體重施用混合的T球蛋白以干擾病毒進(jìn)入細(xì)胞。因此，與HEV病毒顆粒反應(yīng)的抗體可被動(dòng)地單獨(dú)或與其他抗病毒劑一起給受HEV感染的宿主施用，以增加抗病毒藥物的功效。或者，通過將抗獨(dú)特型抗體作為免疫原施用，可以誘導(dǎo)出抗HEV抗體。方便地，可以用上述制備的、純化的抗HEV抗體制劑在宿主動(dòng)物中誘導(dǎo)抗獨(dú)特型抗體。將在合適稀釋劑中的組合物施用給宿主動(dòng)物。在施用(通常是重復(fù)施用)后，宿主會(huì)產(chǎn)生抗獨(dú)特型抗體。為了消除對Fc區(qū)的免疫應(yīng)答，可使用與宿主動(dòng)物相同物種產(chǎn)生的抗體，或者將所用抗體的Fc區(qū)去除。在宿主動(dòng)物中誘導(dǎo)抗獨(dú)特型抗體之后，取出血清或血漿，從而提供抗體組合物。組合物可用上述抗HEV抗體的純化方法進(jìn)行純化，或者使用結(jié)合于親和基質(zhì)的抗HEV抗體通過親和色譜而純化。產(chǎn)生的抗獨(dú)特型抗體在構(gòu)象上與真的HEV抗原相似，它可在不使用HEV顆?？乖那闆r下用于制備HEV疫苗。當(dāng)用作在動(dòng)物中誘導(dǎo)抗HEV病毒抗體的手段時(shí)，可以用與疫苗一樣的方式即肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、皮下等注射有效濃度的、在生理上合適的稀釋劑中的抗體，其中可以有或沒有佐劑。進(jìn)行一次或多次的加強(qiáng)注射是有利的。本發(fā)明的HEV衍生蛋白也可用于產(chǎn)生暴露前或暴露后預(yù)防用的抗血清。其中，HEV蛋白或蛋白混合物與合適的佐劑一起配制，然后根據(jù)已知方法通過注射給志愿者而進(jìn)行給藥，以便產(chǎn)生人抗血清。在免疫后數(shù)周期間，通過定期采集血清樣本，用此處所述的免疫測定檢測抗HEV血清抗體的存在與否從而監(jiān)測對注入蛋白質(zhì)的抗體應(yīng)答情況。來自免疫個(gè)體的抗血清可作為受接觸感染威脅的個(gè)體的暴露前預(yù)防手段?？寡暹€可用于治療暴露后的個(gè)體，這類似于使用高效價(jià)的針對乙型肝炎病毒的抗血清進(jìn)行暴露后預(yù)防。當(dāng)然，本領(lǐng)域的技術(shù)人員會(huì)輕易地理解，用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)從免疫個(gè)體的抗血清中純化出的免疫球蛋白(HEV免疫球蛋白)，可用作暴露前預(yù)防措施或用于治療暴露后的個(gè)體。對于體內(nèi)使用針對HEV病毒樣顆粒和蛋白的抗體和抗獨(dú)特型抗體以及診斷用途，優(yōu)選使用單克隆抗體。單克隆抗病毒顆粒的抗體或抗獨(dú)特型抗體可如下產(chǎn)生。用本領(lǐng)域技術(shù)人員知曉的方法，從免疫動(dòng)物中取出脾或淋巴細(xì)胞，并進(jìn)行使之無限增殖化，或者用于制備雜交瘤(Goding,J.W.1983.“單克隆抗體原理和實(shí)踐(″MonoclonalAntibodies:Principles和Practice″),PladermicPress,Inc.,NY,NY,pp.56-97)。為了產(chǎn)生人-人雜交瘤，可選擇人淋巴細(xì)胞供體。已知可被HEV感染的供體(其中通過例如在血液中存在抗病毒抗體或通過病毒培育而表明發(fā)生了感染)可作為合適的淋巴細(xì)胞供體。淋巴細(xì)胞可從外周血樣品中分離出，或者如果供體進(jìn)行脾切除術(shù)，那么可使用脾細(xì)胞。可用Epstein-Barr病毒(EB病毒)使人淋巴細(xì)胞無限增殖化，或者使用人融合配偶物(partner)來產(chǎn)生人-人雜交瘤。用肽進(jìn)行的原發(fā)性體外免疫也可用于產(chǎn)生人單克隆抗體?？珊Y選由無限增殖化細(xì)胞分泌的抗體，以確定分泌具有所需特異性的抗體的克隆。對于單克隆的抗病毒顆?？贵w，抗體必須結(jié)合HEV病毒顆粒。對于單克隆抗獨(dú)特型抗體，抗體必須結(jié)合抗病毒顆?？贵w。選擇出產(chǎn)生具有所需特異性的抗體的細(xì)胞。上述的抗體和抗原結(jié)合片段可以單獨(dú)地以試劑盒形式提供，或者作為藥物組合物提供，供體內(nèi)使用。如本文所述，抗體可用于治療用途、免疫測定中的診斷用途或作為純化ORF蛋白的免疫親和劑。下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件如Sambrook等人，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。實(shí)施例材料及方法1、病人來自于一名臨床急性肝炎病人，其抗-HAVIgM,HBsAg,抗-HbcIgM，抗-HCV,HBVDNA,HCVRNA均為陰性.2、檢測用引物設(shè)計(jì)用Oligo4和5軟件，根據(jù)引物設(shè)計(jì)的一般原則進(jìn)行引物設(shè)計(jì)。一端參考所得到的兩段基因序列設(shè)計(jì)特異性PCR引物，另一端則參考其它已發(fā)表的序列的保守區(qū)設(shè)計(jì)引物，檢測全序所用引物如表1所示。3、糞便樣品處理及病毒RNA提取取5g糞便樣品加PBS50ml,并徹底震蕩使之懸浮，然后4℃條件下3000rpm離心10分鐘，取上清并保存在-70℃冰箱中備用.用QIAamp病毒RNA提取試劑盒(QIAGEN公司)，按操作說明提取病毒RNA,140ul糞便懸液可獲得50ul純化的病毒RNA液體.4、反轉(zhuǎn)錄采用二種酶即AMV和Superscript反轉(zhuǎn)錄酶，一般情況下，第一輪PCR產(chǎn)品若大于1000bp時(shí)，則采用Superscript,若小于1000bp時(shí)，則采用AMV反轉(zhuǎn)錄酶。(見表2)。4.1AMV反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)9ul純化RNA,50pmolPCR的反義外引物混合。在70℃中加熱10分鐘，然后冰浴2分鐘。再離心后加入4ul5×AMV緩沖液，1ul10mMdNTP,0.75ulRNasin(40u/ul),0.2ul100mMDTT，然后用DEPC處理過的水調(diào)整體積至20ul，并在37℃的條件下反應(yīng)1小時(shí)。4.2Superscript反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)9ul純化RNA,50pmolPCR的反義外引物混合，在70℃中加熱10分鐘，然后冰浴2分鐘，離心后加入4ul5×SuperscriptBuffer,1ul10mMdNTP,0.75ul(40u/ul)的RNasin及2ul100mMDTT,然后用DEPC處理過的水調(diào)整體積至20ul，并在42℃的條件下反應(yīng)1小時(shí)。5、PCR反應(yīng)第一輪PCR反應(yīng)液為10ul反轉(zhuǎn)錄液，二個(gè)外引物各25ul,5ul10×PCR反應(yīng)液,4ul25mMMgCl2，及5uTag酶，并用無菌水調(diào)整終體積至50ul，然后加2滴石蠟油，并在PCR擴(kuò)增儀進(jìn)行PCR反應(yīng)，具體反應(yīng)條件見表2。取第一輪PCR反應(yīng)產(chǎn)物5ul，25ul內(nèi)引物及其它與第一輪相同的反應(yīng)液進(jìn)行第二輪PCR反應(yīng)，具體反應(yīng)條件見表2。6、末端快速擴(kuò)增方法(RACE)6.1、5′RACE20ulcDNA中加入1ulRNaseH，在37℃中反應(yīng)30分鐘，并用QIAEX提取單鏈cDNA。取10ul純化的單鏈cDNA加入20uMdGTP和20單位的末端轉(zhuǎn)移酶，在37℃中反應(yīng)30分鐘，并再次用QIAEX純化加尾的cDNA.然后用Set1(表2)按方法5進(jìn)行半套式PCR擴(kuò)增。6.2、3＇RACE用16聚合T的引物按方法4作反轉(zhuǎn)錄，并用Set17引物按方法5進(jìn)行半套式PCR擴(kuò)增。7、克隆及測序7.1、克隆PCR產(chǎn)物用2％的瓊脂糖膠電泳檢測，將預(yù)計(jì)大小相當(dāng)?shù)臈l帶切下，并用德國Qiagen公司的QIAquickⅡDNA決速提取試劑盒進(jìn)行純化，然后取2ul純化的PCR產(chǎn)物，加T4連接酶緩沖液1ul,pCR*Ⅱvector(圖1)1ul，T4連接酶4單位(Weiss單位)，并加水至10ul，然后置14℃過夜。7.2、感受態(tài)細(xì)菌的轉(zhuǎn)化將5ul的連接液加入100ul試劑盒提供的感受態(tài)細(xì)菌并置冰浴30min，然后嚴(yán)格在42℃熱休克30s，并置37℃搖床以低至200rpm的速度振蕩1h；同時(shí)將含50ug/ml氨芐青霉素的瓊脂平皿置37℃孵箱烘干并加上40ulX-gal涂平，再置37℃孵箱30min，然后將已轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細(xì)菌鋪于該瓊脂平皿上，37℃過夜。7.3、克隆后重組質(zhì)粒的小量制備挑選白色菌落并轉(zhuǎn)入5ml含100ug/ml氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基，于37℃的搖床中以225rpm速度振蕩過夜。按以下方法提取質(zhì)粒(1)取1.5ml細(xì)菌并以15000rpm離心2min，然后棄上清。(2)用100mlTNE(10mMTrisHClPH7.5-8,150mMNaCl,1mMEDTA)溶液懸浮沉淀，并加入100mlTNE平衡的酚氯仿混勻。(3)取一干凈的1.5ml離心管，并加入25ul10M的醋酸氨，備用。(4)以10000rpm離心B管5min，然后取上清并放置于C管中，混勻，然后加入250ul分析純的乙醇并混勻，以15000rpm離心12min，棄上清；沉淀于室溫干燥后，加入30ul水備用。7.4、重組質(zhì)粒的檢定(1)酶切反應(yīng)按以下配方進(jìn)行酶切反應(yīng)。酶反應(yīng)緩沖液1ulBSA(1mg/ml)1ulRNase(0.5mg/ml)0.5ulEcoRⅠ0.5ulDNA3ul加無菌雙蒸水至10ul，然后37℃反應(yīng)1h。(2)電泳酶切反應(yīng)液用2％的瓊脂糖電泳進(jìn)行檢定。7.5、重組質(zhì)粒的純化用QIAgen公司的QIAGENtips質(zhì)粒純化試劑盒進(jìn)行純化，所有操作均按說明書進(jìn)行。7.6、測序反應(yīng)所用測序引物為質(zhì)粒的M13Reverse和M13(-20)Forward測序引物，其序列分別為5′-CAGGAAACAGCTATGAC-3′和5＇-GTTTTCCCAGTCACGAC-3＇。其測序反應(yīng)如下(1)質(zhì)粒DNA5ul測序引物(10pmol/ul)2ul氫氧化鈉1M1ul孵育30min。(2)在以上反應(yīng)液中加入1MHCl1ul,1MTrisCl1ul和5倍的測序反應(yīng)液2ul，然后置37℃20min。(3)每套反應(yīng)各準(zhǔn)備G、A、T和C4個(gè)管，分別加入相對應(yīng)的ddNTP混合液2.5ul。(4)將(2)反應(yīng)中加入以下試劑標(biāo)記混合液2ul0.1MDTT1ul35S-dATP0.5ul稀釋后的測序酶2ul室溫放置2.5min。(5)向含ddNTP混合液的G,A,T,C管中分別加入(3)反應(yīng)液3.5ul，并在37℃孵育5min。(6)向每個(gè)反應(yīng)管中加4ul終止液，并放-20℃貯存。7.7、聚丙烯酰胺凝膠的制備及電泳將丙烯酰胺和N、N′-亞甲叉雙丙烯酰胺按19∶1配制成40％的儲存液；變性工作液濃度為6％，內(nèi)含尿素46g/100ml，按常規(guī)方法灌制膠，并放置過夜使之凝固。將樣品放置85℃變性5min；同時(shí)用80W預(yù)電泳30min，然后按A、C、G、T的順序上樣，每孔上樣量為3ul。然后以80W功率電泳以至預(yù)計(jì)的時(shí)間。7.8、膠、壓片及沖洗用3mm濾紙將凝膠揭下，于干膠儀內(nèi)80℃真空干燥1h，然后室溫壓片過夜至3天不等。然后在Koda洗片機(jī)內(nèi)洗片。7.9、讀片在X光閱片燈下，有2人輪流閱讀、登記，兩次結(jié)果不一致時(shí)，再進(jìn)行第3次閱片確證。實(shí)施例1鑒別戊型肝炎病毒HEV-T1基因組的DNA序列按“材料與方法”中所述，用表1所示的引物和表2所示的RT-PCR條件，對戊型肝炎病毒HEV-T1進(jìn)行PCR擴(kuò)增和測序，得出SEQIDNO:4所示的戊型肝炎病毒HEV-T1的DNA序列。表1HEV-T1全基因序列分析所用的引物<tablesid="table2"num="002"><table>TGTCGGGCAGAAGCTAGTGTTCCGAGACACATCCACGGCTGC3424-4198774Set9ACATTTGAATTAACAGACATTGTGCAGTGGCGGAAGTCATAACAGTGCATGGTCGAGAAGGGCCAGGATGGGACCGCCATGTTCCAGACAGT4126-4666540Set10ATCTCTGCGTGGCTTCTGGTTGTACTGGCGGCGTAGAATCGGCACCTTATTATGGAACACAGCAGGAGCCACAGCAGTCA4627-5529902Set11TTGTATGCTGGTGTGGTTGTAGTTGTACTGGCGGCGTAGAATGGATGTTGTTTCGCAGGTTTATGAGCAGGAGCCACAGCAGTCA4996-5529533Set13GTGACGGGGTTGATTCTCAGCCTCGACGCAATTTGTGACGCTATCGCCTATATTCATCCAGCGGTATAAGGTGTATTAG5335-6047712Set14AA(CT)TATGC(AC)CAGTACCGGGTTGCTTGTTCRTGYTGGTTRTCATAATCGT(CT)ATG(CT)T(CT)TGCATACATGGCTGTTCRTGYTGGTTRTCATAATCCTG6007-6526519Set15AA(CT)TATGC(AC)CAGTACCGGGTTGCCCTTATCCTGCTGAGCATTCTCGT(CT)ATG(CT)T(CT)TGCATACATGGCTAGCCGACGAAAT(CT)AATTCTGTC6007-6354347Set16GACAGAATTRATTTCGTCGGCTGGCTTGTTCRTGYTGGTTRTCATAATCCTYTCTCRGCCAATGGCGAGCGTTCRTGYTGGTTRTCATAATCCTG6382-6526144Set17GACAGAATTRATTTCGTCGGCTGGGCTCTAGAAGCTTTTTTTTTTTTTTTTTTCTYTCTCRGCCAATGGCGAGC6441-7230+29818</table></tables>注Y=C或T；R=A或G*指所用引物為HEV-T1特異性序列表2RT-PCR的反應(yīng)參數(shù)<tablesid="table3"num="003"><table>引物反轉(zhuǎn)錄酶Taq聚合酶反應(yīng)參數(shù)Set1AMV10u2.5(Promega)94℃1分50℃1分72℃2分30循環(huán)Set2AMV10u2.5(Promega)94℃1分50℃1分72℃1分30循環(huán)Set3Superscript200u2.5(Promega)94℃1分50℃1分72℃3分30循環(huán)Set4Superscript200u2.5(Promega)94℃1分50℃1分72℃3分30循環(huán)Set5AMV10u2.5(Promega)94℃1分50℃1分72℃(3分)*2.5分30循環(huán)Set6AMV10u2.5(Promega)94℃1分50℃1分72℃(2.5分)*2分30循環(huán)Set7Superscript200u2.5(Promega)94℃1分50℃1分72℃3分30循環(huán)Set8Superscript200u2.5(Promega)94℃1分50℃1分72℃3分30循環(huán)Set9AMV10u2.5(Promega)94℃1分50℃1分72℃(2.5分)*2分30循環(huán)Set10AMV10u和Superscript200u2.5(Promega)94℃1分50℃1分72℃3分30循環(huán)Set11AMV10u和Superscript200u1.25u(MBI)#94℃20秒55℃30秒(-0.5℃/循環(huán))72℃1分30循環(huán)Set12AMV10u2.5(Promega)94℃1分50℃1分72℃2.5分30循環(huán)Set13AMV10u2.5(Promega)94℃1分50℃1分72℃(2.5分)2分30循環(huán)Set14AMV10u2.5(Promega)94℃1分50℃1分72℃(2.5分)1分30循環(huán)Set15AMV10u2.5(Promega)94℃1分50℃1分72℃1分30循環(huán)Set16Supercript200u2.5(Promega)94℃1分50℃1分72℃3分30循環(huán)</table></tables>“*”指第一輪PCR和第二輪PCR的延伸時(shí)間不同，括號內(nèi)為第一輪PCR的延伸時(shí)間；“#”指PCR擴(kuò)增儀為PE2400反應(yīng)管為薄壁。HEV-T1全長基因序列為7232個(gè)堿基。T、C、A、G的含量分別位27.1％,28.4％,18.6％,25.9％。5′非編碼區(qū)為25個(gè)堿基，3′非編碼區(qū)為68個(gè)堿基。5′和3′非編碼區(qū)之間有3個(gè)開放讀碼框架(ORF)。其中，(1)ORF1包括SEQIDNO:4的26到5149位核苷酸，全長5124個(gè)核苷酸。ORF1的序列被單獨(dú)列于SEQIDNO:5，它編碼1707個(gè)氨基酸的ORF1蛋白。(2)ORF2包括SEQIDNO:4的5146-7164位核苷酸，全長2019個(gè)核苷酸。ORF2的序列被單獨(dú)列于SEQIDNO:6，它編碼672個(gè)氨基酸的ORF2蛋白。(3)ORF3包括SEQIDNO:4的5174-5512位核苷酸，全長339個(gè)氨基酸。ORF3的序列被單獨(dú)列于SEQIDNO:7，它編碼112個(gè)氨基酸的ORF3蛋白。在已報(bào)道的HEV中，ORF3分別與ORF1、ORF2重疊1個(gè)和328個(gè)核苷酸；而在本發(fā)明的新戊型肝炎病毒HEV-T1中，ORF3只與ORF2重疊339個(gè)核苷酸而與ORF1沒有重疊，ORF1和ORF2重疊1個(gè)核苷酸，基因結(jié)構(gòu)與其它已報(bào)道HEV明顯不同(詳見表3及圖2)。這是由于在戊型肝炎病毒HEV-T1的核苷酸序列中，第5160核苷酸位插入一個(gè)“T”，使ORF2的起始密碼前移42個(gè)核苷酸，ORF3的起始密碼后移28個(gè)核苷酸，使ORF2和ORF3多肽的氨基端發(fā)生了明顯的變化，而氨基端主要為信號多肽，通過計(jì)算機(jī)分析顯示，改變后的ORF2和ORF3仍有完整的信號多肽，說明雖然基因結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變，但仍能保證其正常的功能。通過對同一基因型的另一株病毒進(jìn)行該片段的基因序列分析，也發(fā)現(xiàn)了同樣的基因結(jié)構(gòu)，說明這一結(jié)構(gòu)為戊肝病毒Ⅳ型的特征性結(jié)構(gòu)。這表明，戊型肝炎病毒HEV-T1是在國際上首次發(fā)現(xiàn)Ⅳ型戊肝病毒。表3各HEV分離株基因結(jié)構(gòu)的比較<tablesid="table4"num="004"><table>名稱長度(nt)5′非編碼區(qū)(nt)ORF1(aa)ORF2(aa)ORF3(aa)3′非編碼區(qū)(nt)B1B2C1C2C3I1I2P1M1U1U2T1719471947193719471947193719471387170718672517232272726272726270303525169416941694169416941694169416931692169917091708660660660660660660660660659660660672123123123123123123123123123123123112656565656565653974727268</table></tables>注本表中所用序列為墨西哥株為M1，基因庫編號為M74506；緬甸株為B1和B2，基因庫編號分別為M73218,D10330；巴基斯坦株為P1，基因庫編號為M80581；中國株為C1,C2和C3，基因庫編號分別為L25547,M94177,D11093；印度株為I1和I2，基因庫編號分別為X98292,X99441；美國株為U1和U2，基因庫編號分別AF060668,AF060669.實(shí)施例2戊型肝炎病毒HEV-T1全序列與其他已知戊型肝炎病毒的同源性比較根據(jù)已報(bào)道的HEV全序列，將戊型肝炎病毒分為三個(gè)基因型，Ⅰ型為亞洲、非洲型，Ⅱ型為墨西哥型，Ⅲ型為美國型。其中，Ⅰ型各株之間的核苷酸同源性為92.0％-98.8％，Ⅱ型只報(bào)道一株墨西哥病毒的全序列，Ⅲ型之間的同源性為92％。Ⅰ型和Ⅱ型之間的核苷酸同源性75.0-76.1％；和Ⅲ型之間的核苷酸同源性為73.5-74.5％；Ⅱ型和Ⅲ型之間的核苷酸同源性73.7-74.5％。本發(fā)明的HEV-T1全序列與已報(bào)道的Ⅰ型，Ⅱ型和Ⅲ型的同源性分別為74.8-75.5％，74.5％和75.3-76.3％。不同于任何已報(bào)道的基因型，因此被確定為HEVⅣ型。全序列核苷酸同源性比較見表4。表4HEV全基因序列的核苷酸同源性比較實(shí)施例3基因進(jìn)化樹分析采用PHYLIP分析軟件(給出文獻(xiàn)出處或程序的名稱即可)，采用基因進(jìn)化樹對已報(bào)道的基因型及本發(fā)明克隆的戊型肝炎病毒Z新基因型進(jìn)行基因進(jìn)化樹分析，結(jié)果如圖3所示。從圖3可見，亞洲株即Ⅰ型(C1-C3,B1-B2,I1-I2和P1)形成一個(gè)分支；墨西哥株即Ⅱ型單獨(dú)形成一個(gè)分支；美國株即Ⅲ型(U1和U2)形成一個(gè)分支；所分離的該株病毒(HEV-T1)不同于HEVⅠ型、Ⅱ型及Ⅲ型，單獨(dú)形成一個(gè)分支，可定為HEVⅣ型。實(shí)施例4ORF1蛋白的同源比較將本發(fā)明戊型肝炎病毒HEV-T1的ORF1蛋白與其他戊型肝炎病毒的ORF1蛋白進(jìn)行同源比較，結(jié)果表5所示。表5HEVORF1氨基酸同源性比較ORF1編碼1708個(gè)氨基酸，Ⅰ型各株之間的ORF1氨基酸同源性為94.4％-99.1％，Ⅱ型只報(bào)道一株墨西哥病毒的全序列，Ⅲ型之間的同源性為97.5％。Ⅰ型和Ⅱ型之間的ORF1氨基酸同源性82.8-84.2％；和Ⅲ型之間的核苷酸同源性為80.7-82.9％；Ⅱ型和Ⅲ型之間的氨基酸同源性82.0％。本發(fā)明的HEV-T1與已報(bào)道的Ⅰ型，Ⅱ型和Ⅲ型的ORF1氨基酸同源性分別為85.0-86.7％，85.0％和88.5-88.7％(見表5)。實(shí)施例5ORF2蛋白的同源比較將本發(fā)明戊型肝炎病毒HEV-T1的ORF2蛋白與其他戊型肝炎病毒的ORF2蛋白進(jìn)行同源比較，結(jié)果表6所示。表6HEVORF2氨基酸同源性比較ORF2編碼672個(gè)氨基酸，Ⅰ型各株之間的ORF2氨基酸同源性為98.0％-99.4％，Ⅱ型只報(bào)道一株墨西哥病毒的全序列，Ⅲ型之間的同源性為98.0％。Ⅰ型和Ⅱ型之間的ORF2氨基酸同源性92.4-93.3％；和Ⅲ型之間的核苷酸同源性為90.9-91.8；Ⅱ型和ⅢⅢ型之間的氨基酸同源性90.1-90.6％。本發(fā)明的HEV-T1與已報(bào)道的Ⅰ型，Ⅱ型和Ⅲ型的ORF2氨基酸同源性分別為91.6-92.4％,90.1％和91.9-93.0％(見表6)戊肝病毒ORF2是病毒的殼蛋白，是誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生免疫反應(yīng)的主要抗原。將該ORF2與其他戊肝病毒ORF2進(jìn)行比較，顯示免疫位點(diǎn)部位氨基酸變異較大，氨基酸同源性低于90％，因此其抗原性有可能發(fā)生改變。實(shí)施例6ORF3蛋白的同源比較將本發(fā)明戊型肝炎病毒HEV-T1的ORF3蛋白與其他戊型肝炎病毒的ORF3蛋白進(jìn)行同源比較，結(jié)果表7所示。表7HEVORF3氨基酸同源性比較<tablesid="table9"num="009"><table>U1U2B1B2I2C1C2P1C3I1M1T183.379.676.976.977.877.877.876.975.976.975.0100M178.780.387.087.087.085.485.487.085.488.6100I184.484.498.496.798.496.796.798.496.7100C382.882.898.496.798.497.696.798.4100P184.484.410098.410098.498.4100C284.482.898.496.798.496.7100C182.882.298.496.798.4100I284.484.410098.4100B283.683.698.4100B184.484.4100U296.7100U1100</table></tables>ORF3編碼112個(gè)氨基酸，Ⅰ型各株之間的ORF3氨基酸同源性為96.7-100％，Ⅱ型只報(bào)道一株墨西哥病毒的全序列，Ⅲ型之間的同源性為96.7％。Ⅰ型和Ⅱ型之間的ORF3氨基酸同源性85.4-88.6％；和Ⅲ型之間的核苷酸同源性為82.2-84.4％；Ⅱ型和Ⅲ型之間的氨基酸同源性78.7-80.3％。本發(fā)明的HEV-T1與已報(bào)道的Ⅰ型，Ⅱ型和Ⅲ型的ORF3氨基酸同源性分別為75.9-77.8％,75.0％和79.6-83.3％(見表7)。實(shí)施例7(1)在大腸桿菌系統(tǒng)的表達(dá)將ORF2和ORF3基因片段用PCR方法(方法同前，引物為SW2F:5′-aaggatccaccatgaataacatgttcttttgctctgtgcatg-3′；SP2F:5′-aaggatccgccatggctgtggctccggctcctgacactgcacctgt-3′；SP2R:5＇ggtctagatcaatactcccgggttttacccaccttcatttt-3＇；SW3F:5＇-aggatccttttgctctgtgcatggagatgccaccatg-3′和SW3R:5＇-ggtctagattgtactggcggcgtagaatagcaccac-3′。用W2F和P2R擴(kuò)增全長的ORF2；用P2F和P2R擴(kuò)增ORF23′端的550個(gè)氨基酸片段；用W3F和W3R擴(kuò)增全長的ORF3)分別擴(kuò)增出，并將該片段分別連接到大腸桿菌的表達(dá)質(zhì)粒pThioHisA,B和C中，將含ORF2和ORF3基因片段的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中(以上使用方法見前)，到細(xì)胞長到600mm波長下OD值為0.6時(shí)，加入1MmIPTG進(jìn)行誘導(dǎo)，然后再在37℃搖床中，培養(yǎng)5小時(shí)。收集細(xì)胞在5000rpm離心10分鐘，收集沉淀，并用裂解液進(jìn)行裂解，(50mMTrisHCl,pH8.0,1mMEDTA,50MmNaCl,1mMPMSF)，并在超聲波破碎3次，液氮中凍融3次，10000rpm離心10分鐘，收集沉淀，并加入8M尿素使包涵體溶解，以作進(jìn)以步純化。(2)在昆蟲細(xì)胞中表達(dá)將ORF2和ORF3基因片段用PCR方法(方法同前，引物為SW2F:5‘-aaggatccaccatgaataacatgttcttttgctctgtgcatg-3’；SP2F:5＇-aaggatccgccatggctgtggctccggctcctgacactgcacctgt-3’；SP2R:5＇ggtctagatcaatactcccgggttttacccaccttcatttt-3‘；SW3F:5’-aaggatccttttgctctgtgcatggagatgccaccatg-3′和SW3R:5＇-ggtctagattgtactggcggcgtagaatagcaccac-3′.用W2F和P2R擴(kuò)增全長的ORF2；用P2F和P2R擴(kuò)增ORF23′端的550個(gè)氨基酸片段；用W3F和W3R擴(kuò)增全長的ORF3)分別擴(kuò)增出，并將該片段分別連接到昆蟲細(xì)胞的質(zhì)粒Pfast中，將含目的片段的重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化DH10Bac感受態(tài)細(xì)胞，轉(zhuǎn)化方法同前。然后提取重組的Bacmid，將5ul重組的Bacmid加入100ulTC100培養(yǎng)基中，最后將以上兩種試劑混合，并加入到10個(gè)昆蟲細(xì)胞(SF21,SF9,HF5)室溫放置1小時(shí)，然后吸出液體，并加入正常培養(yǎng)液28培養(yǎng)3天。然后懸浮細(xì)胞，并5000rpm離心收集細(xì)胞沉淀，以作進(jìn)一步純化。(3)在酵母細(xì)胞系統(tǒng)中表達(dá)將ORF2和ORF3基因片段用PCR方法分別擴(kuò)增出(方法同前，引物為YW2F:5′-atggtcattacgtaccatgaataacatgttcttttgctctgtgcatg-3′；YP2F:5＇-atggtcattacgtaccatggctgtggctccggctcctgacactgcacctgt-3＇；YP2R:5′-aaggatcctcaatactcccgggttttacccaccttcatttt-3＇；YW3F:5＇-atggtcattacgtattttgctctgtgcatggagatgccaccatg-3′和SW3R:5＇-aaggatccttgtactggcggcgtagaatagcaccac-3′.用YW2F和YP2R擴(kuò)增全長的ORF2；用YP2F和YP2R擴(kuò)增ORF23′端的550個(gè)氨基酸片段；用YW3F和YW3R擴(kuò)增全長的ORF3.)，并將該片段分別連接到酵母表達(dá)性質(zhì)粒SequencherTM，將含目的片段的重組酵母表達(dá)性質(zhì)粒用電轉(zhuǎn)化的方法轉(zhuǎn)染酵母菌，(如RB11,LR9等)，并在選擇性YNB培養(yǎng)基(含2.0％葡萄糖，1.8％瓊脂)上37℃培養(yǎng)4-5天后，挑選菌落。然后對表達(dá)菌進(jìn)行高密度發(fā)酵。收集液體并在5000rpm離心10分鐘，收集沉淀，并用玻璃珠的方法對菌體進(jìn)行破碎，然后5000rpm離心10分鐘收集上清以備進(jìn)一步純化。實(shí)施例8重組抗原的純化用如下方法對實(shí)施例8中獲得的重組抗原進(jìn)行純化(1)氣溶膠處理以上三種表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)后提取的沉淀物用生理鹽水溶解，并加入氣溶膠(62.5g/l)吸附，4℃過夜，然后20℃4000rpm離心10分鐘，棄上清，收集沉淀。并用生理鹽水懸浮沉淀。然后加入脫吸附緩沖液(5倍脫吸附緩沖液為硼砂95.35g,EDTA18.6g，脫氧膽酸62.5g加水至5000ml)，至脫吸附緩沖液的終濃度為22％，并在57℃200rpm搖床中震蕩2小時(shí)，然后4℃1000rpm離心30分鐘，并收集上清。(2)分子篩層析選用S200HR基質(zhì)，上樣前至少用5倍柱床體積的層析洗脫液平衡柱子(0.05M磷酸緩沖液)，然后上樣，并用洗脫液洗脫，在紫外檢測器的檢測下收集蛋白峰。(3)離子交換選用monoQ柱子，上樣前用500ml緩沖液A洗3次，再用緩沖液B將膠平衡。然后上樣，并進(jìn)行梯度洗脫(0-100mMNacl,10mMTrisClpH8.0)，在紫外檢測器的檢測下收集蛋白峰，并對蛋白進(jìn)行檢測。(4)脫鹽用SephadexG25進(jìn)行層析脫鹽，上樣前用5倍柱床體積的生理鹽水平衡柱子，然后上樣，并用生理鹽水洗脫，在紫外檢測器的檢測下收集蛋白峰。實(shí)施例9抗HEV診斷試劑的制備取實(shí)施例8中純化的HEVORF2和ORF3抗原，用0.1mol/LPH9.6碳酸氫鈉緩沖液適當(dāng)稀釋，在酶標(biāo)板上每孔加100ul，置4℃過夜。棄去包被液，用洗滌液充分洗滌各孔，隨之置37℃干燥4小時(shí)。干燥的酶標(biāo)板，迅速用塑料袋包裝并封口。用過碘酸鈉或其它適宜的方法用辣根過氧化物酶標(biāo)記抗人IgG，然后加入5％蔗糖和小牛血清等保護(hù)劑，適當(dāng)分裝并凍干。實(shí)施例10戊肝疫苗的制備配制20mg/mlAl(OH)3膠體，然后用生理鹽水將Al(OH)3稀釋成0.07mg/ml，然后再加入純化的抗原，使抗原純濃度達(dá)到20ug/ml，并在37℃攪拌2小時(shí)。然后在無菌條件下分裝，每支1ml。在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú)引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。序列表(1)一般信息(ⅱ)發(fā)明名稱新型戊型肝炎病毒基因序列及其應(yīng)用(ⅲ)序列數(shù)目7(2)SEQIDNO:1的信息(ⅰ)序列特征(A)長度1707氨基酸殘基(B)類型氨基酸(C)鏈型未知(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)未知(ⅹⅰ)序列描述SEQIDNO:1:MEAHQFIKAPGYTTAIEQAALAAANSALANAVVVRPFLSRLQTEILINLM50QPWQLVFRPEVLWNHPIQRVIHNELEQYCRARAGRCLEEGAHPRSINDDP100NVLHRCFLKPVGRDVQRWYTAPTRGPAANCRRSALRGLPPVDRTYCFDGF150SGCTFAAETGVALYSLHDLWPADVAEAMARHGMTRLYAALHLPPEVLLPP200GTYHTTSYLLIHDGDRAVITYEGDSSAGYNHDVSILRAWIRTTKVTGDHP250LVIERVRAVGCHFVLLLTAAPEPSPMPYVPYPRSTEVYVRSIFGPGGSPS300LFPSACSTKSTFHAVPVHIWDRLMLFGATLDDQAFCCSRLMTYLRGISYK350VTVGALVANEGWNASEDALTAVITAAYLTICHQRYLRTQAISKGMKRLEL400EHAQKFITRLYSWLFEKSGRDYIPGRQLQFYAQCRRWLSAGFHLDPRVLV450FDEAAPCRCRSFLRKAATKFCCFMRWLGQDCTCFLQPIEGRVGEQGYDNE500AFEGSDIDPAEEATVSIAGSYIVTGSQLQPLYQALGIPSDLAARASRLTA550TVEVSDADGRLTCKTTMGNKTFSTVFTDGTQLEANGPEQYVLSFDPAKQT600MAAGPHSLSYTLTSAGLEVHVVSAGLDCKVVFQSGVAAPSAAGEVTAFCS650ALYRFNRCVQRHSLIGGLWYHPEGLVGLFPPFSPGHSWESANPFCGESTL700YTRTWSVSGFSSCFSPLEPCVPSMPPPAEVNTPVVLDALPSEIMEPAQPP750ASEPAAPPSDSVDNSFSPTSSGAPIAPPAPALPVTHLSGPRRRLLHTYPD800GSKVYAGSLFESECTWLVNASNPGHRPGGGLCHAFYQRFPESFDPAEFIM850SDGFAAYTLTPRPIIHAVAPDYRVEHNPKRLEAAYRETCSRRGTAAYPLL900GVGIYRVPVGLSFDAWERNHRPGDELYLTEPAIAWFEANRPTLPALTITE950DTARTANLALELDAATEVGRACVGCRVEPGVIHYQFTAGVPGSGKSRSVQ1000QGDVDVIVVPTRELRNSWRRRGFAAYTPHTAVRVTRGRRVVIDEAPSLPP1050HLLLLHMQRASSVHLLGDPNQIPAIDFEHAGLVPAIRPELVPTKWWHLTY1100RCPADVCELIRGAYPKIQTASRVLRSLFWEEPPVGQNLVFTQAAKAANPG1150AITVHEAQGATFTETTIIATADARGLIQSSRAHAIVALTRHTEKCVVVDA1200PGLLREVGISDAIVNNFFLSGGQIGQHRPSVIRRGTIDNNVDTLDAFPPS1250CQFSAYHQLAEELGHRPAPIAAVLPPCPELEQGLLYMPQELTTSDSVLTF1300ELTDIVHCRMAAPSQRRAVLSTLVGRYGRRTKLYEAAHTDVRGSLNHFIP1350ELGPINVTTCELYELVEAMVEKGQDGSAVLELDLCSRDVSRITFFQKDCN1400KFTTGETIAHGKVGQGISAWSKTFCALFGPWFRAIEKEILAALAPNVFYG1450DAYEDTVLAAAVAGAPGCKVFENDFSEFDSTQNNFSLGLECIIMEECGMP1500QWMIRLYHLVRSAWILQAPKESLRGFWKKHSGEPGTLLWNTVWNMAVIAH1550CYEFRDLKVAAFKGDDSVVLCSDYRQSRDAAVLIAGCGLKLKVDFRPIGL1600YAGVVVAPGLGTLPDVVRFAGRLSEKNWGPGPERAEQLRLAVCDFLRKLT1650NVAQVCVDVVSQVYGVSPGLVHNLIGMLQTIADGKAHFTETIKPVLDLTS1700SIIYRVE1707(2)SEQIDNO:2的信息(ⅰ)序列特征(A)長度672氨基酸殘基(B)類型氨基酸(C)鏈型未知(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)未知(ⅹⅰ)序列描述SEQIDNO:2MNNMFFCSVHGDATMRSRALLFLLFVLLPMLPAPPAGQPSGRRRGQAGCG50GGFWGDRVDSQPFALPYIHPTNPFASDIPAAAGTGARPRQPIRPLGSAWR100DQSQRPAASTRRRPAPAGASPLTAVAPAPDTAPVPDADSRGAILRRQYNL150STSPLTSTIATGTNFVLYAAPLSPLLPLQDGTNTHIMATEASNYAQYRVV200RATIRYRPLVPNAVGGYAISISFWPQTTTTPTSVDMNSITSTDVRILVQP250GIASELVTPSERLHYRNQGWRSVETSGVAEEEATSGLVMLCIHGSPVNSY300TNTPYTGALGLLDFALELEFRNLTPGNTNTRVSRYSSSARHKLRRGPDGT350AELTTTAATRFMKDLHFTGTNGVGEVGRGIALTLFNLADTLLGGLPTELI400SSAGGQLFYSRPVVSANGELTVKLYTSVENAQQDKGVAIPHDIDLGESRV450VIQDYDNQHEQDRPTPSPAPSRPFSVLRANDVLWLSLTAAEYDQTTYGSS500TNPMYVSDTVTFVNVATGAQGVSRSLDWSKVTLDGRPLTTIQQYSKTFYV550LPLRGKLSFWEAGTTKAGYPYNYNTTASDQILIENAAGHRVCISTYTTNL600GSGPVSVSAVGVLAPHSALAALEDTADYPARAHTFDDFCPECRALGLQGC650AFQSTVGELQRLKMKVGKTREY672(2)SEQIDNO:3的信息(ⅰ)序列特征(A)長度112氨基酸殘基(B)類型氨基酸(C)鏈型未知(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)未知(ⅹⅰ)序列描述SEQIDNO:3MEMPPCALGLFCFCSSCFCLCCPRHRPVSRLAVAAGKRGAAVVSGVTGLI50LSPSPSPIFIQPTPSHLTFQPPPGLELALGSQSVHSAPLGVTSPSAPPLP100PVVDLPQLGLRR112(2)SEQIDNO:4的信息(ⅰ)序列特征(A)長度7232bp(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅹⅰ)序列描述SEQIDNO:4GCAGACCACGTATGTGGTCGACGCCATGGAGGCCCACCAGTTTATAAAGGCTCCTGGCGT60CACTACTGCTATTGAGCAGGCAGCTCTAGCAGCGGCCAACTCCGCCCTGGCGAATGCTGT120GGTGGTTCGGCCTTTCTTGTCCCGGCTTCAGACTGAGATTCTCATAAATTTGATGCAGCC180TTGGCAGCTTGTTTTCCGGCCTGAGGTCCTGTGGAATCACCCAATCCAGCGTGTGATCCA240CAATGAGCTTGAGCAATATTGCCGAGCCCGGGCTGGACGCTGTCTTGAGGAGGGTGCTCA300TCCACGTTCCATTAATGACGACCCTAACGTCCTGCACCGCTGCTTTCTTAAACCTGTTGG360CCGTGATGTTCAGCGGTGGTATACCGCTCCTACCCGTGGCCCTGCAGCTAACTGCCGGCG420GTCCGCTCTTCGCGGGCTTCCACCTGTTGACCGGACTTACTGCTTTGATGGTTTTTCAGG480CTGCACATTTGCCGCCGAGACGGGGGTTGCACTTTACTCACTGCACGACCTTTGGCCTGC540CGATGTTGCGGAGGCAATGGCCCGCCATGGCATGACTCGGTTGTATGCAGCCCTCCATCT600TCCCCCGGAGGTATTACTCCCCCCTGGCACTTACCATACCACCTCATACCTCCTAATTCA660TGATGGGGACCGTGCAGTGATTACATACGAGGGGGATTCTAGTGCCGGGTACAATCATGA720TGTGTCCATCTTACGTGCTTGGATCCGTACGACCAAAGTCACCGGTGATCACCCGCTGGT780GATTGAGCGGGTCCGGGCTGTGGGATGCCATTTTGTACTCCTCCTCACAGCTGCACCTGA840ACCGTCGCCGATGCCTTACGTCCCATACCCTCGTTCGACCGAGGTTTATGTTCGTTCTAT900CTTCGGCCCTGGCGGCTCACCATCCCTTTTTCCATCTGCCTGCTCGACTAAGTCAACATT960TCATGCCGTCCCTGTGCATATATGGGACAGGCTTATGCTTTTTGGAGCGACCCTTGATGA1020CCAGGCCTTCTGCTGCTCCAGGCTTATGACATATCTCCGTGGCATTAGTTATAAGGTTAC1080GGTTGGTGCCCTTGTCGCTAATGAAGGTTGGAATGCTTCCGAAGATGCACTGACTGCTGT1140AATTACTGCAGCCTATTTAACCATTTGTCATCAGAGATACCTCCGCACGCAAGCTATTTC1200TAAAGGGATGAAGAGGCTGGAGCTTGAGCATGCACAAAAGTTCATAACACGCCTTTACAG1260TTGGTTATTTGAGAAGTCTGGGCGTGATTACATCCCTGGCCGCCAGTTGCAGTTTTACGC1320CCAGTGCCGCCGGTGGTTATCTGCCGGCTTCCATCTTGATCCTCGGGTACTTGTATTTGA1380TGAGGCGGCCCCCTGTCGTTGCCGGAGTTTTCTTCGCAAGGCTGCCACAAAGTTCTGCTG1440CTTCATGCGGTGGCTCGGCCAGGATTGCACCTGTTTCCTCCAGCCCATTGAGGGGAGGGT1500CGGTGAGCAGGGTTATGACAATGAGGCATTTGAGGGGTCGGATATTGACCCCGCTGAAGA1560AGCCACCGTGAGTATCGCTGGGTCATATATCGTCACTGGTAGCCAGTTGCAGCCCCTCTA1620CCAAGCACTCGGCATACCTTCCGATCTTGCCGCTCGTGCAAGCCGACTCACTGCTACCGT1680TGAGGTTTCTGATGCTGATGGCCGTCTTACCTGTAAGACTACTATGGGTAATAAGACCTT1740TTCAACAGTTTTTACTGATGGCACCCAGCTGGAGGCCAATGGGCCAGAACAATATGTTTT1800GTCATTTGATCCGGCGAAACAAACTATGGCAGCAGGTCCACATAGTCTTAGTTACACTCT1860GACATCTGCTGGCCTTGAGGTACATGTGGTCTCGGCCGGGCTCGACTGCAAGGTCGTCTT1920CCAGTCCGGCGTAGCGGCCCCCTCTGCTGCTGGGGAGGTGACCGCTTTCTGCTCGGCCCT1980GTACAGGTTTAACCGCTGTGTTCAACGGCATTCTCTTATTGGAGGCCTATGGTATCACCC2040TGAGGGGCTTGTTGGCCTGTTCCCACCGTTCTCCCCCGGCCATAGTTGGGAGTCTGCTAA2100CCCTTTCTGTGGTGAAAGCACCCTTTACACTCGGACCTGGTCGGTTTCGGGCTTTTCTAG2160CTGCTTTTCACCGCTCGAACCTTGTGTCCCGAGTATGCCACCTCCCGCGGAGGTTAATAC2220ACCTGTGGTCTTAGATGCCCTACCTTCAGAGATTATGGAGCCGGCCCAACCTCCAGCTTC2280TGAGCCGGCGGCACCTCCATCCGATTCAGTCGATAATAGTTTTAGCCCCACCTCATCCGG2340TGCTCCCATTGCACCTCCGGCACCGGCGCTGCCTGTAACCCACCTATCTGGGCCCCGCCG2400GCGGTTGCTTCATACTTACCCTGACGGCTCAAAAGTGTATGCTGGCTCCCTTTTTGAGTC2460TGAGTGCACCTGGCTGGTTAATGCATCCAACCCCGGTCACCGCCCCGGTGGCGGTCTCTG2520TCATGCCTTCTACCAGCGGTTCCCAGA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(2)SEQIDNO:5的信息(ⅰ)序列特征(A)長度5124bp(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅹⅰ)序列描述SEQIDNO:5ATGGAGGCCCACCAGTTTATAAAGGCTCCTGGCGTCACTACTGCTATTGAGCAGGCAGCT60CTAGCAGCGGCCAACTCCGCCCTGGCGAATGCTGTGGTGGTTCGGCCTTTCTTGTCCCGG120CTTCAGACTGAGATTCTCATAAATTTGATGCAGCCTTGGCAGCTTGTTTTCCGGCCTGAG180GTCCTGTGGAATCACCCAATCCAGCGTGTGATCCACAATGAGCTTGAGCAATATTGCCGA240GCCCGGGCTGGACGCTGTCTTGAGGAGGGTGCTCATCCACGTTCCATTAATGACGACCCT300AACGTCCTGCACCGCTGCTTTCTTAAACCTGTTGGCCGTGATGTTCAGCGGTGGTATACC360GCTCCTACCCGTGGCCCTGCAGCTAACTGCCGGCGGTCCGCTCTTCGCGGGCTTCCACCT420GTTGACCGGACTTACTGCTTTGATGGTTTTTCAGGCTGCACATTTGCCGCCGAGACGGGG480GTTGCACTTTACTCACTGCACGACCTTTGGCCTGCCGATGTTGCGGAGGCAATGGCCCGC540CATGGCATGACTCGGTTGTATGCAGCCCTCCATCTTCCCCCGGAGGTATTACTCCCCCCT600GGCACTTACCATACCACCTCATACCTCCTAATTCATGATGGGGACCGTGCAGTGATTACA660TACGAGGGGGATTCTAGTGCCGGGTACAATCATGATGTGTCCATCTTACGTGCTTGGATC720CGTACGACCAAAGTCACCGGTGATCACCCGCTGGTGATTGAGCGGGTCCGGGCTGTGGGA780TGCCATTTTGTACTCCTCCTCACAGCTGCACCTGAACCGTCGCCGATGCCTTACGTCCCA840TACCCTCGTTCGACCGAGGTTTATGTTCGTTCTATCTTCGGCCCTGGCGGCTCACCATCC900CTTTTTCCATCTGCCTGCTCGACTAAGTCAACATTTCATGCCGTCCCTGTGCATATATGG960GACAGGCTTATGCTTTTTGGAGCGACCCTTGATGACCAGGCCTTCTGCTGCTCCAGGCTT1020ATGACATATCTCCGTGGCATTAGTTATAAGGTTACGGTTGGTGCCCTTGTCGCTAATGAA1080GGTTGGAATGCTTCCGAAGATGCACTGACTGCTGTAATTACTGCAGCCTATTTAACCATT1140TGTCATCAGAGATACCTCCGCACGCAAGCTATTTCTAAAGGGATGAAGAGGCTGGAGCTT1200GAGCATGCACAAAAGTTCATAACACGCCTTTACAGTTGGTTATTTGAGAAGTCTGGGCGT1260GATTACATCCCTGGCCGCCAGTTGCAGTTTTACGCCCAGTGCCGCCGGTGGTTATCTGCC1320GGCTTCCATCTTGATCCTCGGGTACTTGTATTTGATGAGGCGGCCCCCTGTCGTTGCCGG1380AGTTTTCTTCGCAAGGCTGCCACAAAGTTCTGCTGCTTCATGCGGTGGCTCGGCCAGGAT1440TGCACCTGTTTCCTCCAGCCCATTGAGGGGAGGGTCGGTGAGCAGGGTTATGACAATGAG1500GCATTTGAGGGGTCGGATATTGACCCCGCTGAAGAAGCCACCGTGAGTATCGCTGGGTCA1560TATATCGTCACTGGTAGCCAGTTGCAGCCCCTCTACCAAGCACTCGGCATACCTTCCGAT1620CTTGCCGCTCGTGCAAGCCGACTCACTGCTACCGTTGAGGTTTCTGATGCTGATGGCCGT1680CTTACCTGTAAGACTACTATGGGTAATAAGACCTTTTCAACAGTTTTTACTGATGGCACC1740CAGCTGGAGGCCAATGGGCCAGAACAATATGTTTTGTCATTTGATCCGGCGAAACAAACT1800ATGGCAGCAGGTCCACATAGTCTTAGTTACACTCTGACATCTGCTGGCCTTGAGGTACAT1860GTGGTCTCGGCCGGGCTCGACTGCAAGGTCGTCTTCCAGTCCGGCGTAGCGGCCCCCTCT1920GCTGCTGGGGAGGTGACCGCTTTCTGCTCGGCCCTGTACAGGTTTAACCGCTGTGTTCAA1980CGGCATTCTCTTATTGGAGGCCTATGGTATCACCCTGAGGGGCTTGTTGGCCTGTTCCCA2040CCGTTCTCCCCCGGCCATAGTTGGGAGTCTGCTAACCCTTTCTGTGGTGAAAGCACCCTT2100TACACTCGGACCTGGTCGGTTTCGGGCTTTTCTAGCTGCTTTTCACCGCTCGAACCTTGT2160GTCCCGAGTATGCCACCTCCCGCGGAGGTTAATACACCTGTGGTCTTAGATGCCCTACCT2220TCAGAGATTATGGAGCCGGCCCAACCTCCAGCTTCTGAGCCGGCGGCACCTCCATCCGAT2280TCAGTCGATAATAGTTTTAGCCCCACCTCATCCGGTGCTCCCATTGCACCTCCGGCACCG2340GCGCTGCCTGTAACCCACCTATCTGGGCCCCGCCGGCGGTTGCTTCATACTTACCCTGAC2400GGCTCAAAAGTGTATGCTGGCTCCCTTTTTGAGTCTGAGTGCACCTGGCTGGTTAATGCA2460TCCAACCCCGGTCACCGCCCCGGTGGCGGTCTCTGTCATGCCTTCTACCAGCGGTTCCCA2520GAATCGTTTGATCCCGCCGAGTTTATCATGTCGGACGGGTTTGCAGCCTACACCCTAACT2580CCCCGGCCCATTATCCATGCTGTTGCTCCCGACTATCGGGTTGAACATAACCCTAAGCGG2640CTTGAGGCCGCCTATCGGGAGACATGTTCTCGCCGGGGAACGGCTGCCTACCCTCTGCTC2700GGTGTCGGCATATACCGGGTCCCCGTTGGGTTGAGCTTCGATGCTTGGGAGCGTAACCAT2760CGACCTGGGGATGAACTATATCTGACTGAGCCAGCCATAGCCTGGTTTGAAGCCAATCGG2820CCCACCCTCCCTGCCTTGACTATAACTGAGGATACGGCCCGTACAGCGAATCTGGCGCTT2880GAGCTGGATGCGGCCACAGAGGTGGGCCGTGCGTGTGTTGGCTGTCGTGTGGAGCCCGGC2940GTGATTCACTATCAATTCACGGCGGGTGTCCCCGGCTCTGGTAAGTCCAGGTCGGTTCAA3000CAGGGGGATGTAGATGTGATAGTGGTGCCAACCCGCGAGCTGCGTAATTCATGGCGTCGT3060CGTGGGTTCGCAGCCTACACACCCCACACGGCAGTCCGTGTGACTCGCGGCCGCAGGGTC3120GTCATTGATGAGGCCCCTTCACTCCCACCACATCTGCTTCTGTTGCACATGCAGCGGGCC3180TCATCAGTCCATCTCCTTGGTGATCCTAACCAAATCCCTGCTATTGATTTTGAGCACGCC3240GGCCTTGTACCGGCAATTCGGCCTGAGCTGGTTCCTACAAAGTGGTGGCATCTTACCTAT3300AGATGCCCGGCGGATGTCTGTGAGCTAATCCGCGGTGCATACCCGAAGATCCAGACTGCA3360AGCCGCGTCCTCCGCTCTTTGTTTTGGGAGGAACCCCCTGTGGGTCAAAACCTCGTATTT3420ACCCAGGCGGCGAAGGCTGCAAACCCCGGCGCAATCACTGTTCATGAAGCCCAGGGTGCG3480ACATTCACTGAGACTACGATTATTGCCACGGCAGACGCTCGTGGGCTGATCCAGTCATCT3540AGAGCCCACGCAATCGTGGCCCTGACCCGCCACACGGAGAAGTGCGTGGTGGTCGATGCA3600CCGGGGCTCCTCCGTGAGGTAGGCATTTCTGATGCCATTGTTAATAATTTTTTCCTTTCT3660GGTGGTCAGATCGGCCAGCACCGTCCATCAGTCATACGGCGTGGCACTATTGATAACAAT3720GTTGACACACTTGATGCCTTCCCGCCCTCTTGCCAGTTTAGTGCTTACCACCAGTTAGCC3780GAGGAGCTCGGCCACCGGCCCGCTCCAATTGCTGCTGTTCTGCCTCCCTGCCCGGAGCTT3840GAACAGGGCCTGCTCTATATGCCTCAAGAATTGACAACATCGGATAGCGTGCTCACTTTT3900GAGCTCACGGACATAGTGCACTGTCGTATGGCGGCGCCCAGCCAGCGCAGAGCAGTCCTG3960TCAACTCTTGTTGGCAGGTACGGCCGTCGCACCAAGTTGTACGAGGCCGCACACACAGAT4020GTTCGTGGGTCCCTGAATCACTTTATTCCTGAGCTTGGCCCCATTAATGTTACCACCTGT4080GAGCTTTATGAGCTTGTGGAGGCTATGGTTGAGAAAGGCCAAGACGGTTCTGCGGTTCTG4140GAGCTTGATCTATGCAGCCGTGATGTGTCTCGGATAACATTCTTCCAGAAGGATTGTAAT4200AAGTTTACAACAGGTGAGACGATAGCGCATGGTAAAGTCGGCCAGGGGATATCCGCATGG4260AGCAAGACCTTCTGCGCTTTGTTTGGCCCCTGGTTCCGCGCTATTGAGAAAGAAATTCTG4320GCAGCGCTTGCACCTAATGTTTTCTACGGTGATGCGTATGAGGATACAGTTCTGGCCGCT4380GCTGTAGCCGGTGCCCCCGGTTGTAAGGTTTTTGAGAATGATTTTTCCGAGTTTGATAGC4440ACCCAAAATAATTTTTCACTCGGGTTAGAGTGTATAATCATGGAGGAGTGTGGCATGCCG4500CAGTGGATGATTCGGCTCTATCATCTCGTCCGCTCCGCCTGGATTTTGCAGGCCCCGAAG4560GAATCTCTGCGTGGCTTCTGGAAGAAACACTCTGGTGAGCCCGGCACCTTATTATGGAAC4620ACCGTTTGGAACATGGCTGTTATAGCACATTGTTATGAGTTCCGCGACCTCAAAGTCGCA4680GCATTTAAAGGGGATGACTCTGTTGTGCTTTGTAGTGACTACCGGCAGAGTCGTGATGCA4740GCTGTTTTGATCGCTGGTTGTGGCTTGAAGCTTAAAGTGGACTTTAGACCTATTGGGTTG4800TATGCTGGTGTGGTTGTAGCCCCAGGTCTTGGGACTCTGCCTGATGTTGTTAGGTTTGCT4860GGCCGGCTCTCGGAAAAGAACTGGGGGCCAGGCCCGGAGAGGGCGGAGCAGCTCCGGTTG4920GCCGTTTGCGATTTTCTGCGAAAGCTAACGAATGTGGCCCAGGTTTGTGTGGATGTTGTT4980TCGCAGGTTTATGGCGTTAGCCCTGGTTTGGTACATAACCTGATTGGGATGCTTCAGACC5040ATTGCCGATGGCAAGGCACATTTTACCGAGACAATTAAGCCTGTCCTTGACCTTACTAGC5100TCCATTATATACCGGGTGGAATGA5124(2)SEQIDNO:6的信息(ⅰ)序列特征(A)長度2019bp(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅹⅰ)序列描述SEQIDNO:6ATGAATAACATGTTCTTTTGCTCCGTGCATGGAGATGCCACCATGCGCTCTCGGGCTCTT60CTGTTTCTGCTCTTCGTGCTTCTGCCTATGTTGCCCGCGCCACCGGCCGGTCAGCCGTCT120GGCCGTCGCCGCGGGCAAGCGGGGTGCGGCGGTGGTTTCTGGGGTGACCGGGTTGATTCT180CAGCCCTTCGCCCTCCCCTATATTCATCCAACCAACCCCTTCGCATCTGACATTCCAGCC240GCCGCCGGGACTGGAGCTCGCCCTCGGCAGCCAATCCGTCCACTCGGCTCCGCTTGGCGT300GACCAGTCCCAGCGCCCCGCCGCTTCCACCCGTCGTCGACCTGCCCCAGCTGGGGCTTCG360CCGTTGACTGCTGTGGCTCCGGCTCCTGACACTGCACCTGTCCCCGATGCTGATTCCCGT420GGCGCTATTCTACGCCGCCAGTACAATTTGTCCACATCCCCGCTCACGTCCACTATTGCA480ACTGGCACCAATTTTGTGCTATATGCTGCCCCACTTAGTCCCCTGCTACCGCTTCAGGAT540GGCACCAATACCCACATCATGGCTACTGAAGCATCTAATTATGCCCAGTATCGTGTTGTT600CGTGCTACCATCCGATATCGCCCCTTGGTGCCGAATGCCGTTGGCGGGTATGCCATATCT660ATCTCCTTTTGGCCTCAGACAACGACCACCCCAACGTCTGTTGATATGAATTCAATTACC720TCCACTGATGTCCGCATTCTTGTCCAGCCTGGTATAGCTTCTGAGTTGGTAACTCCCAGT780GAGCGCCTGCATTATCGAAATCAAGGATGGCGTTCGGTTGAGACCTCTGGTGTCGCTGAG840GAAGAAGCGACCTCTGGCCTTGTTATGCTTTGCATTCATGGGTCACCTGTGAATTCCTAT900ACTAATACACCTTATACCGGTGCCCTCGGCTTACTTGACTTTGCACTCGAGCTCGAGTTT960CGCAATTTGACACCTGGTAACACCAATACGCGCGTTTCTCGTTATTCGAGTAGCGCGCGT1020CACAAACTGCGCCGAGGGCCTGATGGTACTGCTGAGTTGACTACTACTGCCGCCACACGT1080TTTATGAAAGACCTCCATTTTACGGGGACTAATGGTGTTGGTGAGGTCGGTCGTGGTATA1140GCGTTAACTTTGTTTAATCTTGCTGATACGCTTCTCGGTGGGCTTCCGACAGAATTGATT1200TCGTCGGCAGGGGGTCAGTTATTCTACTCCCGCCCCGTTGTCTCAGCCAATGGCGAGCTG1260ACAGTGAAACTTTACACTTCAGTCGAGAACGCTCAGCAGGACAAGGGTGTAGCTATTCCA1320CATGATATTGACCTTGGTGAGTCCCGTGTGGTTATTCAGGATTATGACAACCAACATGAG1380CAAGATCGTCCCACTCCCTCCCCTGCTCCCTCTCGTCCATTTTCTGTTCTTCGTGCTAAT1440GATGTGCTTTGGCTTTCACTTACTGCTGCTGAGTATGATCAAACGACTTATGGCTCCTCT1500ACCAACCCTATGTATGTTTCTGACACTGTTACATTTGTTAACGTAGCGACTGGTGCCCAG1560GGGGTTTCGCGCTCTCTGGATTGGTCTAAGGTCACTCTCGATGGCCGTCCACTCACCACC1620ATCCAGCAGTATTCTAAGACTTTCTATGTCTTGCCCCTTCGTGGTAAGCTTTCCTTTTGG1680GAGGCCGGCACCACTAAAGCCGGCTACCCTTATAATTATAACACTACTGCTAGTGACCAG1740ATCCTGATTGAGAATGCAGCGGGCCACCGAGTTTGCATCTCTACCTACACTACTAACCTG1800GGCTCCGGGCCTGTGTCTGTATCTGCTGTTGGTGTCCTCGCCCCTCACTCTGCGCTGGCT1860GCTTTGGAGGATACCGCTGACTACCCTGCTCGCGCCCATACTTTTGATGATTTCTGCCCT1920GAATGCCGTGCACTCGGCCTTCAGGGTTGTGCCTTCCAATCTACTGTTGGTGAGTTACAG1980CGTCTTAAAATGAAGGTGGGTAAAACCCGGGAGTATTGA2019(2)SEQIDNO:7的信息(ⅰ)序列特征(A)長度339bp(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅹⅰ)序列描述SEQIDNO:7ATGGAGATGCCACCATGCGCTCTCGGGCTCTTCTGTTTCTGCTCTTCGTGCTTCTGCCTA60TGTTGCCCGCGCCACCGGCCGGTCAGCCGTCTGGCCGTCGCCGCGGGCAAGCGGGGTGCG120GCGGTGGTTTCTGGGGTGACCGGGTTGATTCTCAGCCCTTCGCCCTCCCCTATATTCATC180CAACCAACCCCTTCGCATCTGACATTCCAGCCGCCGCCGGGACTGGAGCTCGCCCTCGGC240AGCCAATCCGTCCACTCGGCTCCGCTTGGCGTGACCAGTCCCAGCGCCCCGCCGCTTCCA300CCCGTCGTCGACCTGCCCCAGCTGGGGCTTCGCCGTTGA339權(quán)利要求1．一種分離的戊型肝炎病毒蛋白，其特征在于，其序列基本上由選自下組的氨基酸序列所構(gòu)成SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3。2．如權(quán)利要求1所述蛋白，其特征在于，該蛋白具有選自下組的序列SEQIDNO:1、SEQIDNO:2和SEQIDNO:3。3．一種分離的DNA分子，其特征在于，它含有編碼權(quán)利要求1所述的戊型肝炎病毒蛋白的核苷酸序列。4．如權(quán)利要求3所述的DNA序列，其特征在于，該序列基本上由選自下組的核苷酸序列構(gòu)成SEQIDNO:5、SEQIDNO:6和SEQIDNO:7。5．一種表達(dá)載體，其特征在于，它含有權(quán)利要求1的DNA。6．一種宿主細(xì)胞，其特征在于，它含有權(quán)利要求5所述的表達(dá)載體。7．一種產(chǎn)生免疫原性的肝炎蛋白的方法，其特征在于，它包括在適合表達(dá)該蛋白的條件下，培養(yǎng)含有權(quán)利要求6所述的表達(dá)載體的宿主有機(jī)體。8．一種在生物樣品中檢測針對戊型肝炎病毒HEV-T1的抗體的方法，其特征在于，該方法包括將樣品與權(quán)利要求1所述的戊型肝炎蛋白接觸；檢測是否形成了免疫復(fù)合物，形成免疫復(fù)合物就表示存在戊型肝炎的抗體。9．一種藥物組合物，其特征在于，它含有權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì)和藥學(xué)上可接受的賦形劑、稀釋劑或載體。10．一種用于使哺乳動(dòng)物免疫以抗戊型肝炎感染的疫苗，其特征在于，該疫苗含有權(quán)利要求1所述的戊型肝炎病毒蛋白。11．一種在生物樣品中檢測戊型肝炎病毒的方法，其特征在于，該方法包括將該生物樣品與對權(quán)利要求1所述的戊型肝炎病毒蛋白特異的抗體接觸，以便與該戊型肝炎病毒形成復(fù)合物，檢測是否形成了免疫復(fù)合物，形成免疫復(fù)合物就表示存在戊型肝炎病毒。12．一種抗體，其特征在于，它對具有權(quán)利要求1所述的蛋白有特異的結(jié)合親和力。13．一種多肽片段，其特征在于，它具有選自權(quán)利要求1所述蛋白的連續(xù)15-100個(gè)氨基酸序列，且該多肽的氨基酸序列與Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型戊型肝炎病毒Z的相應(yīng)序列的同源性小于70％。14．一種DNA片段，其特征在于，它具有選自權(quán)利要求3所述的DNA的連續(xù)15-1000個(gè)核酸序列，且該DNA片段的氨基酸序列與Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型戊型肝炎病毒Z的相應(yīng)序列的同源性小于70％。全文摘要本發(fā)明提供了一種新型戊型肝炎病毒株HEV-T1的核苷酸序列及其編碼的蛋白,以及這些核苷酸序列和編碼蛋白在肝炎的診斷、預(yù)防和治療上的用途。文檔編號C12N15/63GK1300771SQ9912574公開日2001年6月27日申請日期1999年12月23日優(yōu)先權(quán)日1999年12月23日發(fā)明者王佑春,張華遠(yuǎn),李河民,T·J·哈里森申請人:中國藥品生物制品檢定所