專利名稱：由巴豆基甜菜堿制備l－肉堿的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種由巴豆基甜菜堿、其鹽、它們的其它衍生物或類似物制備L-肉堿的方法。
現在已知，L-肉堿作為一種廣泛存在的化合物在物質代謝—尤其是在長鏈脂肪酸經線粒體膜的轉移過程中發(fā)揮重要作用。由于肉堿在真核生物體的物質代謝中的功能，導致了它有眾多的臨床應用，例如用于治療患肉堿缺乏綜合癥的病人、用于預防和治療不同類型心臟病和用于治療哈默透析病人(Hamodialysepatienten)中。因此L-肉堿就具有作為補充營養(yǎng)物質的價值，且它作為向發(fā)酵介質中的添加物，促進酵母和細菌的生長。對這些生物活性的L-肉堿對映體在這些和其它應用中增大的需求導致了在全世界范圍對旋光純的這些甜菜堿的合成途徑的研究，因為從抑制由堿乙?；D移酶和抑制由堿載體蛋白的角度看，化學合成的外消旋體不可用。
為了分離L-異構體，至今所采用的方法是，在使用旋光活性的酸時借助分級結晶方法來拆分外消旋體(例如US 4,254,053，1981)，其中D(+)-肉堿作為副產物產生。該問題可由便宜的手性前體出發(fā)，通過不同的生物學方法(高等生物化學工程，生物學工藝150，21-44，1993)來克服。特別感興趣的是，在使用Genera Escherichia菌株時(ED 0121444，1984；DD 221905，1987；EP 0320460，1989)或在使用Proteus(農業(yè)生物化學，52，2415-2421，1988；美國專利US5,300,430，1994)時，使反-巴豆基甜菜堿作立體特異性水合而成為L-肉堿。該方法的優(yōu)點在于，通過使副產物D-肉堿作化學脫水合，可得到該手性前體。
在文獻中描述了的、數量眾多的、在一個連續(xù)操作的反應系統(tǒng)中使用固定化了的微生物進行的方法具有下述優(yōu)點·可使用較純的反應介質，因而使提取和/或提純工藝變得容易；
·通過在反應介質中使用較高的生物催化劑濃度，獲得了較高的生產能力并同時抑制了受污染的可能性；·它對抑制劑或營養(yǎng)物質缺乏的敏感性降低了；·生物催化劑獲得了高的穩(wěn)定性。
上述優(yōu)點也適用于一種工業(yè)使用的方法。
一個連續(xù)操作的反應器—其中微生物通過微濾—或超濾膜持留—是一種固定化的方法，它除了具備前述的優(yōu)點外，還具有其固定化的成本低和同時使工業(yè)放大易于進行的優(yōu)點。
相應地，本發(fā)明的目的是提供一種在一個連續(xù)反應器中由巴豆基甜菜堿、巴豆基甜菜堿的鹽或其它巴豆基甜菜堿衍生物生產L-肉堿的方法，其中使用了游離的或固定化了的細胞、即大腸桿菌044 K74(DSM8828)的生長性的或靜態(tài)性的細胞，該細胞借助微濾或超濾膜持留在平面膜—或空心纖維模件中。
大腸桿菌在反應器中保持在20-40℃、pH為6.0-8.0和厭氧條件下，這些條件是誘導肉堿—代謝性酶所必須的。采用一種最小(Minimalmedium)或復合介質作為反應介質。在兩種情況下，加入巴豆基甜菜堿、巴豆基甜菜堿鹽或其它巴豆基甜菜堿衍生物，直至濃度為25mmol-1M。最小介質中含有不同濃度的酪蛋白水解物和鹽(NH4)2SO4、KH2PO4、K2HPO4、MgSO4·7H2O、MnSO4·4H2O、FeSO4·7H2O，而復合介質中含有不同濃度的胰蛋白胨和NaCl。為了改善大腸桿菌的生長，加入了甘油、葡萄糖、核糖、精糖或乳糖。另外，向介質中還加入了抑制巴豆基甜菜堿轉變成γ-丁酸甜菜堿的抑制劑(富馬酸鹽、葡萄糖或硝酸鹽)以及誘導劑肉堿—代謝性酶如D-、L-、DL-肉堿、其鹽和衍生物，或巴豆基甜菜堿、其鹽或衍生物。
在此處所用的、連續(xù)式細胞循環(huán)反應器中的反應進程可劃分成兩階段。第一段由一個反應器罐—其中大腸桿菌細胞與反應介質巴豆基甜菜堿的大部分轉化，成為L-肉堿。該反應器罐具有控制pH值、溫度和攪拌速度以及用于控制和校正酸濃度的控制單元。借助一個計量泵將反應介質輸送到反應器中。必要時，反應器罐需對過量的介質進行卸料。第二段由一個外部返回環(huán)路構成，它接到反應器罐之后，并通過一個泵將反應器中的內容物導通經過一個過濾單元。在收集濾液以從中分離作為反應產物的L-肉堿時，過濾中的殘留物再返回反應器。為了過濾細胞懸浮體，可使用不同來源的市售過濾器系統(tǒng)，只要它們具有比大腸桿菌細胞粒子小的孔徑即可?；乇玫乃俣缺３植蛔?，以便達到最好的過濾速率，且以便在過濾過程中使極化膜的生成最小化。
術語“游離的大腸桿菌細胞”表示這樣一種狀態(tài)，在此狀態(tài)下，整個細胞懸浮在反應介質中，在通過流出溶液作細胞向外流出時不會受到阻礙。術語“固定化了的細胞”描述這樣一種狀態(tài)，其中，整個細胞結合于溶解的聚合物或不溶的載體上，或被包封在膜體系中(見酶工藝學中的方法，卷135，3-30，1987)。
概念“生長條件”定義為這樣一種情況，其中整個細胞在其生活周期中消耗底物并形成產物?！办o態(tài)性的細胞”應理解為未經觸動的但非生長性的細胞，它們在特定的條件下具有特定的物質代謝作用(見“生物技術”(Kieslich，K.；Eds.Rehm，H.J.and Reed，G.)化學出版社，魏海姆，德國，卷6a，5-30，1984)。
下面用一些實施例對本發(fā)明方法進行解釋實施例1將大腸桿菌044 K74放入一個填充至邊緣的、氣密封閉的錐形瓶中，在37℃、厭氧條件下、在一個旋轉式震動器上(150r.p.m.)培養(yǎng)。使用的復合介質具有下列組成50mM巴豆基甜菜堿、50mM富馬酸酯、5g/l NaCl和不同的胰蛋白胨濃度(介于0.5-10g/l之間)。用KOH將pH調節(jié)至7.5。表1中匯總列出了在不同的蛋白胨濃度下的特定的生長速率。表1大腸桿菌044 K74的最大的特定生長速率
<p>在所說條件下，大腸桿菌生長性細胞處于這樣的狀態(tài)，直至各試驗結束時產生20-30mM L-肉堿。
高于5g/l蛋白胨的濃度給出既相似的生長—和動力學參數，又給出生物物質含量(OD 600nm)。與此相對照的是，在低的蛋白胨濃度下，得到了較低的生長參數。實施例2將大腸桿菌044 K74放入一個裝填至邊緣的、氣密封閉的錐形瓶中，在37℃、厭氧條件下、在一個旋轉式震動器上(150r.p.m.)培養(yǎng)。所用的復合介質具有下列組成50mM巴豆基甜菜堿、5g/l胰蛋白胨、5g/l NaCl以及逐次變化的富馬酸鹽濃度(介于0至75mM)。用KOH將pH調節(jié)至7.5。
表2表明，添加富馬酸鹽造成了大腸桿菌044 K74較高的生長速率，且在穩(wěn)態(tài)下OD在600nm下接近1.0。因此，直到試驗結束時，富馬酸鹽導致產生了20-30mM的L-肉堿生成。在不存在富馬酸鹽時，僅得到了5mM的肉堿濃度。表2.在10小時試驗期后，在不同富馬酸鹽濃度下的生物物質(OD600nm)富馬酸鹽(mM) 0 25 50 75μ最大(h-1) 0.21 0.370.38 0.39生物物質OD(600nm) 0.980 0.910 1.00 0.950實施例3大腸桿菌044 K74由巴豆基甜菜堿生成L-肉堿的能力將通過巴豆基甜菜堿誘導產生。誘導試驗在使用靜態(tài)細胞且使用5-75mM巴豆基甜菜堿的條件下進行。在高的巴豆基甜菜堿濃度下，L-肉堿的轉化率達到大于60％(表3)。表3通過大腸桿菌044 K74的靜態(tài)細胞生產L-肉堿的量與不同巴豆基甜菜堿濃度的關系
實施例4將大腸桿菌044 K74裝入一個填充直至邊緣、氣密封閉的錐形瓶中，在37℃和厭氧條件下放在一個旋轉式震動器上(150r.p.m.)培養(yǎng)。所用的復合物介質具有下列組成50mM巴豆基甜菜堿、5g/l胰蛋白胨、5g/l NaCl和50mM富馬酸酯。用KOH將pH值調節(jié)到7.5。
為了升高反應器中生物催化劑的濃度，且為了在稀釋率高于最大的特定生長率的情況下使L-肉堿生產成為可能，采用了一個膜反應器。細胞用一個排除極限為0.1μm的聚砜微濾膜持留并再次使用。膜以一種平面方式排布。表4中匯總列出了在該體系中生物物質含量，表5中匯總列出了該系統(tǒng)中肉堿生產，巴豆基甜菜堿轉化率和生產能力。表4在一個連續(xù)操作的膜反應器中大腸桿菌044 K74的生物物質含量
表5在一個用大腸桿菌044 K74進行連續(xù)操作的細胞反應器中L-肉堿生產巴豆基甜菜堿轉化和生產能力
從表中可明顯看出，在一個細胞循環(huán)反應器中，使用大腸桿菌044K74的固定了的細胞，由巴豆基甜菜堿生成了6.5/1/小時的L-肉堿，其代謝率接近40％。
權利要求
1.由巴豆基甜菜堿制備L-肉堿的方法，其特征在于，在一種連續(xù)操作的細胞反應器中，使用一種固定化了的微生物將以其本身形式或其鹽形式或衍生物形式的原料巴豆基甜菜堿轉化為L-肉堿。
2.按權利要求1的方法，其特征在于，微生物是大腸桿菌044 K74(DSM8828)。
3.按權利要求1或2的方法，其特征在于，大腸桿菌在一種載體材料上固定化而不影響其存活能力。
4.按權利要求3的方法，其特征在于，使用陶瓷體、玻璃珠、聚氨酯片作為載體材料。
5.按權利要求1-4的方法，其特征在于，反應混合物經由載有微生物的陶瓷體過濾，以已知的方式分離L-肉堿，并將巴豆基甜菜堿送回至反應循環(huán)中。
6.按權利要求1-5的方法，其特征在于，巴豆基甜菜堿在反應介質中的濃度介于25mM至1M之間。
7.按權利要求1-6的方法，其特征在于，向流入反應器中的、通常市購的復合介質或良好限定的大腸桿菌-最小介質中，加入抑制劑呼吸的電子受體如富馬酸鹽、硝酸鹽、氧、N-氧化物或葡萄糖，它們抑制巴豆基甜菜堿加氫成為r-丁酸甜菜堿的過程。
8.按權利要求1-7的方法，其特征在于，向最小介質中加入誘導劑肉堿—代謝酶，如L-、D-、或DL-肉堿、其衍生物和鹽，以及巴豆基甜菜堿、其衍生物和鹽。
9.按權利要求1的方法，其特征在于，將大腸桿菌044 K74在一種復合介質中作厭氧或部分厭氧培養(yǎng)，其間保持富馬酸鹽濃度為50mM。
10.按權利要求1的方法，其特征在于，將大腸桿菌044 K74在一種復合介質中作厭氧或部分厭氧培養(yǎng)，其中復合介質含有50mM巴豆基甜菜堿、5g/l胰蛋白胨、5g/l NaCl和50mM富馬酸鹽，pH值為7.5，且反應在一個連續(xù)操作的膜反應器中進行。
11.按權利要求1的方法，其特征在于，使用市售的橫流過濾—或中空纖維模式過濾器來連續(xù)地使細菌返回反應器中，過濾器由本身已知的、具有不同化學組成的如纖維素、聚砜或聚噻砜化了的(polysalphoniertem)聚砜材料制成的超—或微濾膜組成，過濾器流出孔徑大小為300KDa至0.2μ。
12.按權利要求1-10的方法，其特征在于，合成在厭氧或部分厭氧條件下進行。
13.按權利要求1的方法，其特征在于，在一個連續(xù)操作的反應器中、在不同的稀釋率—稀釋率通過兩臺泵、即計量泵和過濾泵來調節(jié)-下、在不同的攪拌速度和生物物質濃度下進行肉堿生產。
14.按權利要求13的方法，其特征在于，過濾物流的流出速率受工藝進程控制。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種制備L－肉堿的方法。本發(fā)明方法能用一種經濟上有利的方式、在一種連續(xù)操作的細胞反應器中,通過固定化了的大腸桿菌044K74、由巴豆基甜菜堿、其鹽或衍生物制備L－肉堿。生長性的或靜態(tài)性的大腸桿菌細胞通過微—或超濾膜保留在一個連續(xù)操作的細胞循環(huán)反應器中,所說濾膜布置成一種平面膜模式或中空纖維模式。
文檔編號C12P1/00GK1278303SQ98810854
公開日2000年12月27日 申請日期1998年11月9日 優(yōu)先權日1997年11月8日
發(fā)明者H－P·克萊伯, M·卡諾瓦斯－狄亞茲, J·M·奧邦, J·L·伊波拉 申請人:希格馬托制藥工業(yè)公司