專利名稱：鑒定pkb激酶抑制劑的組合物及方法
發(fā)明所屬領域本發(fā)明屬于分子生物學領域，包括蛋白激酶B激酶的鑒定及其醫(yī)療用途。發(fā)明背景胰島素與其它生長因子啟動磷脂酰肌醇(PI)3-激酶的活化，該酶將PI4，5二磷酸(PIP2)轉(zhuǎn)化成推定的第二信使PI 3，4，5三磷酸(PIP3)。有多種形式的PI 3-激酶，它們都能將磷脂酰肌醇(PtdIns)、磷脂酰肌醇-4-磷酸(PtdIns-4P)和磷脂酰肌醇-4，5二磷酸(PtdIns-4，5-P2)的D-3位置磷酸化，從而分別產(chǎn)生磷脂酰肌醇-3-磷酸(PtdIns-3-P)、磷脂酰肌醇-3，4-二磷酸(PtdIns-3，4-P2)和磷脂酰肌醇-3，4，5-三磷酸(PtdIns-3，4，5-P3，或PIP3)。
蛋白激酶B(PKB)處于PIP3的信號轉(zhuǎn)導途徑，位于PI 3-激酶的下游。參見，F(xiàn)ranke等人，(1995)細胞(Cell)，81卷，727-736頁。例如，如果將細胞與PI 3-激酶的抑制劑(已知最好的是渥曼青霉素或LY 294002)預溫育或通過超量表達PI 3-激酶的顯性負性突變體，可阻止胰島素或生長因子活化PKB。參見，Burgering，B M.和Coffer，P.J.(1995)自然(Nature)，376卷，599-602頁。而且，在PDGF受體(該受體磷酸化時與PI 3-激酶結合)上的酪氨酸殘基的突變也可阻止PKBα(PKB的異構形式)的活化。最近的報道表明通過另一種PIP3下游的激酶PKB可自身活化。參見，Alessi，D.R.等人，Curr.Biol.7卷，261(1997)。該激酶稱為PKB激酶或磷脂酰肌醇(PtdIns)3-激酶(PDK1)，其活化需要PIP3。參見，Stokoe，D.等人(1997)科學(Science)，277卷，567-570頁。
PKB是PIP3途經(jīng)的關鍵酶，參與調(diào)節(jié)細胞生長。該酶可能在某些人類癌癥中起作用；例如，已知其在部分卵巢癌、乳腺癌和胰癌中可被擴增。參見，Bellacosa，A.等人(1995)國際癌癥雜志(Int.J.Cancer)64，280-285頁以及Cheng，J.Q.等人(1996)美國國家科學院院報(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A) 93卷，3636-3641。該酶的擴增給予腫瘤細胞防止編程性細胞死亡的機制。這樣，可以明顯地看到抑制PKB活性的藥物對于治療具有不希望的細胞生長的疾病(包括癌癥)有益。達到這種目的的一種方法是開發(fā)鑒定這種藥物的測定方法。發(fā)明概述本發(fā)明的第一個目的是描述PKB激酶、用于純化并表達激酶的方法和組合物，以及編碼這些激酶的cDNA序列。
本發(fā)明的第二個目的是描述由PtdIns(3，4，5)P3活化PKB激酶以促進PKB的磷酸化。
本發(fā)明的第三個目的是描述用于鑒定化合物的組合物和方法，其中的化合物對涉及不希望的細胞生長的疾病(包括癌癥)具有預防和治療效果。
對于本領域熟練技術人員，基于本發(fā)明的充分公開，本發(fā)明的這些或其它目的是顯而易見的。附圖簡述

圖1.得自綿羊腦的PKB激酶的純化A.該流程圖概述了得自綿羊腦胞質(zhì)溶膠的PKB激酶A-D的純化，并記錄了每一步驟所含的蛋白質(zhì)的量。最初胞質(zhì)溶膠級分的活性的總回收率為15.5％。
B.該圖顯示了Abs 280nm下PKB激酶活性圖以及考馬斯染色的SDS-PAGE凝膠，分析最后柱中蛋白質(zhì)的洗脫，在純化PKB激酶A-D時的所有HPLC體積排阻層析(SEC)。HPLC-SEC用Biosilect柱(VT11.6ml，BioRad)進行。裝載35-45μl的樣品，流量為40μl/分鐘，收集到80μl級分。SEC緩沖液包含0.15M NaCl、20mM HEPES pH7.4，40C、0.5mM EGTA、0.1mM EDTA、1％甜菜堿、0.03％Tween 20、0.01％疊氮化物、2mM B-甘油磷酸、1mM DTT以及胃蛋白酶抑制劑A、亮抑蛋白酶肽、抑肽酶、抗蛋白酶(均為2μg/ml)。
估計PKB激酶A-D的天然大小分別為58、58、68和54kD，其SDS-變性的大小分別為57、57、70和55kD(標明了在SDS-PAGE中相對于220、97、69、46和31kD分子量標準遷移的位置)。
C.PKB激酶活性與[32P]-PtdIns(3，4，5)P3結合蛋白質(zhì)共純化。將部分純化的PKB激酶制劑進行SEC，分析級分的PtdIns(3，4，5)P3依賴的PKB激酶活性(底部圖)、[32P]-PtdIns(3，4，5)P3結合蛋白質(zhì)(中間圖，通過用[32P]-PtdIns(3，4，5)P3(18)探查復性的Western印跡)、(C)SDS-變性的蛋白質(zhì)(上部圖，通過銀染SDS-PAGE凝膠)。
通過將蛋白質(zhì)Western印跡到硝酸纖維素膜上(樣品僅與SDS樣品緩沖液加熱至50℃)測定[32P]PtdIns(3，4，5)P3結合。將濾膜在包含1％NP40、1mM EGTA、0.01％疊氮化物的PBS中于4℃下溫育12小時。將濾膜在另外還包含0.1％膽酸鹽、50μgml-1磷脂酰絲氨酸和磷脂酰膽堿、1mMMgCl2和1mM DTT的上述溶液中封閉30分鐘(室溫)。將[32P]PtdIns(3，4，5)P3(從重組的p101/p120-PI3K、PtdIns(4，5)P2和[γ32P]-ATP制備(參見，L.R.Stephens等人，細胞89，105-114(1997))超聲處理進封閉溶液中(10μCi，10ml)，加入到經(jīng)封閉的濾膜中保持20分鐘(室溫)，然后用新鮮封閉溶液洗滌(5次，每次5分鐘以上)，最后用包含1％NP40的PBS洗滌。將濾膜在空氣中干燥并放射自顯影。圖2.PKB激酶A-D的特性A.純化的PKB激酶是PtdIns(3，4，5)P3依賴的并可活化PKB。
測定分兩步進行。第一步與混合的脂囊泡進行，其中有或無D-D-S/A-PtdIns(3，4，5)P3(最終濃度為5μM)，有或無PKB激酶(6nM)、野生型(EE)-PKB(2.5μM)或T308A/S473A-(EE)-PKB)和[γ32P]-ATP(50μM)。終止測定，用α(EE)-珠粒免疫沉淀PKB蛋白質(zhì)并洗滌，然后與[32p]-ATP(10μM)和髓磷脂堿性蛋白質(zhì)(MBP；7μM)溫育以確定固定化的PKB的活性。結果得自單個試驗并表示為平均值±SE(n＝3-5)，另外四個試驗得出了相似的結果。PKB激酶B、C和D得出十分相似的結果。
B.PKB磷酸化活化的磷脂特異性測定包含恒定濃度的混合脂囊泡，該脂囊泡包含指定濃度的肌醇磷脂、(EE)-PKB(2.5μM)、PKB激酶A(5nM)和[γ32P]-ATP(1μM，總體積12μl)。所示的數(shù)據(jù)收集自12個分離的試驗，是平均值(n＝3-6，其平均SE為6％)。在PKB激酶B、C和D中觀察到了相同方式的活化。
為了測定PKB和PKB激酶與脂囊泡的結合以及不同脂類對PKB磷酸化的影響，通過下述方法制備脂囊泡將干燥脂膜超聲處理進0.2M蔗糖、20mM KCl、20mM HEPES，pH7.4 30℃、0.01％疊氮化物中(在測定中最終濃度為200μM磷脂酰膽堿、150μM磷脂酰絲氨酸、20μM磷脂酰乙醇胺、10μM spingomylin加指定濃度的肌醇脂)。將這些物質(zhì)與相關激酶在包含下列物質(zhì)的測定緩沖液中混合1mgml-1BSA、0.12 M NaCl、1mM EGTA、0.2mM鈣、1.5mM MgCl2、1mM DTT、0.01％疊氮化物、5mM KCl、20mM HEPES，pH 7.4，30℃(大約50nM游離鈣，均為在測定中的最終濃度)、有或無[γ32P]-ATP(1μM最終濃度)和(EE)-PKB(2.5μM最終濃度)。如果該測定用于估計激酶與脂囊泡的結合，在30℃下保持4分鐘后離心測定物(airfuge(Beckman)最大速率離心30分鐘)。取出上清液的等分試樣以用于測定和免疫印跡。用測定緩沖液快速漂洗沉淀物，再次離心并溶解在SDS-樣品緩沖液中。如上所述定量PKB的磷酸化。
C.PKB與脂囊泡的結合將(EE)-PKB(40nM)與以蔗糖填充的脂囊泡(或其載體)在與上述B部分中相似的條件下溫育。4分鐘后通過離心沉淀囊泡，通過用α-(EE)單克隆抗體免疫印跡測定上清液和沉淀中的PKB的量。插圖免疫印跡顯示了使用D-D-S/A-PtdIns(3，4，5)P3(在測定中最大濃度為16μM，參見，A.Toker，L.C.Cantley，自然386，673-67642(1997))試驗的結果。數(shù)據(jù)從共7個獨立的試驗中收集并表示為平均值(n＝2-3，這些平均值的平均范圍為11.0％)。
D.PKB激酶與脂囊泡的結合將PKB激酶A(5nM)與包含如圖2B所示多種濃度肌醇磷脂的以蔗糖填充的脂囊泡(或僅其載體)混合。30℃下4分鐘后，通過離心沉淀囊泡，在5μM D-D-S/A-PtdIns(3，4，5)P3存在下測定PKB激酶活性。在不包含添加的肌醇磷脂的脂囊泡存在下，沉淀平均8.2％的總活性。在不包含添加的肌醇脂的脂囊泡離心后留在上清液中的活性被定義為100％以供其它處理參考。所顯示的數(shù)據(jù)是平均值(n＝4-6，從16個分離的試驗中收集，平均SE是8％)。圖3.PKB激酶的一級結構顯示了分離自人U937細胞文庫的cDNA定義的最小可能的ORF。源自綿羊腦PKB激酶A的四個肽序列在所述序列上以黑體顯示。與其它蛋白激酶催化結構域同源的區(qū)域以實線框框出；與其它PH-結構域同源的區(qū)域以虛線框框出。圖4.PKB激酶在cos-7細胞中的表達將如圖3所示的包含NH2-端被標記的PKB激酶開放讀框的哺乳動物表達載體((EE)-II是指整個ORF，(EE)-I是指‘激酶被折衷的’剪接變體)在cos-7細胞中瞬時表達。通過蛋白質(zhì)的(EE)標記純化蛋白質(zhì)(使用myc抗體作為對照)，將等分試樣進行Western印跡。然后將用α(EE)單克隆抗體探查的PVDF濾膜(由ECL檢測；右上圖)用考馬斯藍染色(左上圖；所顯示的數(shù)據(jù)僅適用于(EE)-II；用(EE)-I可獲得相似的結果)。在脂囊泡的存在下(有或無D-D-S/A-PtdIns(3，4，5)P3和[γ32P]-ATP(300nM；分別為3μM和1μM的最終濃度))測定等分試樣中的PKB激酶活性。放射自顯影圖顯示了在PKB中的[32P]。
圖5顯示了一種cDNA(SEQ ID.No.1)及其所編碼的PKB激酶的氨基酸序列。發(fā)明詳述在本說明書中提到的所有出版物和專利申請都被本發(fā)明引用作為參考，其程度就如本發(fā)明特定而單個地指出引用每個出版物或?qū)＠暾堊鳛閰⒖家粯?。定義在開始時值得注意的是除非特別指出，本文使用的所有技術和科技術語的意義與本發(fā)明所屬領域的普通技術人員通常理解的意義相同。通常，本文所使用的術語和下述的試驗室操作步驟是本領域熟知的和常用的。使用標準技術進行重組核酸方法、多核苷酸合成以及微生物培養(yǎng)和轉(zhuǎn)化(例如，電穿孔、脂轉(zhuǎn)染)。酶反應和純化步驟通常按照制造廠商的說明進行。技術和操作步驟通常按照本領域的常規(guī)方法以及多種常用的參考文獻進行(通常參見，Sambrook等人，分子克隆試驗室手冊(MolecularCloningA Laboratory Manual，第二版(1989)冷泉港試驗室出版社，冷泉港，紐約，此處引用作為參考)，這些參考文獻在全文中提到。本文使用的術語和下述分析化學、有機合成化學和藥物制備試驗室操作步驟是本領域熟知的和常用的。使用標準技術用于化學合成、化學分析、藥物制備和遞送以及患者的治療。
本文使用PKB(或蛋白激酶B)指大約60kD激酶，該酶與蛋白激酶c和蛋白激酶a具有同源性，如Coffer，P.J.和Woodgctt，J.R.(1991)歐洲生物化學雜志(Eu r.J.Biochem.)，201卷，475-481頁和Jones，P.F.等人，(1991)美國國家科學院院報，88卷，4171-4175所述。也參見WO 97/22360和Stokoe，D.等人(1997)科學，277卷，567-570頁。該定義包括所述酶的同工形式，其中四種是目前已知的。PKB也稱作c-Akt或Rac-Pk。
磷脂酰肌醇(3，4，5)-三磷酸的‘生物立體異構體’的正式名稱為(對于一個特定的脂肪酸組合物)(1-硬脂?；?，2-花生四烯?；?sn-磷脂?；鵇-肌醇(3，4，5)-三磷酸。在保留了所有用于定義特定異構體有關的可區(qū)別的精確度的同時，我們將其簡稱為D-D-S/A-PtdIns(3，4，5)P3，第二個D是指甘油主鏈的手性，即D-L-S/A-PtdIns(3，4，5)P3是(2-花生四烯?；?-硬脂?；?sn-磷脂酰基D-肌醇(3，4，5)-三磷酸。二棕櫚酰衍生物簡稱為D-D-P/P-PtdInS(3，4，5)P3。D-D-S/A-PtdIns(3，4，5)P3的對映異構體是L-L-S/A-PtdIns(3，4，5)P3。
本文使用的術語“天然產(chǎn)生的”當用于物體時是指該物體可以在自然界中找到這一事實。例如，存在于生物體(包括病毒)中、可以從天然來源分離并且沒有被人類在試驗室中特意修飾的多肽或多核苷酸是天然產(chǎn)生的。
本文使用的術語“多核苷酸”是指長度至少為10個堿基的核苷酸的聚合形式，為核糖核苷酸或脫氧核糖核苷酸或其中一種核苷酸的修飾形式。該術語包括單鏈或雙鏈形式的DNA。
本文使用的術語“寡核苷酸”包括通過天然產(chǎn)生的和非天然產(chǎn)生的寡核苷酸連鍵連接在一起的天然產(chǎn)生的和修飾的核苷酸。寡核苷酸長度為200個堿基或更短的多核苷酸子集。寡核苷酸長度優(yōu)選地為10-60個堿基，更優(yōu)選地長度為12、13、14、15、16、17、18、19或20-40個堿基。盡管寡核苷酸可以是雙鏈(例如，用于構建基因突變體的寡核苷酸)，但寡核苷酸通常為單鏈(例如，用于探針的寡核苷酸)。本發(fā)明的寡核苷酸可以是有義或反義寡核苷酸。本文使用的術語“天然產(chǎn)生的核苷酸”包括脫氧核糖核苷酸和核糖核苷酸。本文使用的術語“修飾的核苷酸”包括具有被修飾的或取代的糖基等的核苷酸。本文使用的術語“寡核苷酸連鍵”包括如下的寡核苷酸連鍵，如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硒代磷酸酯、二硒代磷酸酯、苯胺硫代磷酸酯、苯胺磷酸酯、氨基磷酸酯等。如果需要，寡核苷酸可以包括用于檢測的標記。
本文使用的術語“序列同源性”描述了兩個核酸序列之間堿基匹配的比例或兩個氨基酸序列之間氨基酸匹配的比例。當序列同源性以百分比(例如，50％)表示時，百分比是指與一些其它序列相比，PKB激酶序列長度匹配的比例。可以允許使用間隙(在兩個序列之一上)以使匹配最大化；通常使用15個堿基或更短的間隙長度，優(yōu)選的為6個堿基或更短，更優(yōu)選的為2個堿基或更短。當使用寡核苷酸作為探針或處理時，在20個可能的寡核苷酸堿基對配對中，靶核酸或寡核苷酸序列之間的序列同源性通常不少于17個靶堿基匹配(85％)。優(yōu)選地在10個可能的寡核苷酸堿基對配對中不少于9個匹配(90％)，最優(yōu)選地在20個可能的寡核苷酸堿基對配對中不少于19個匹配(95％)。
如果兩個氨基酸序列部分或完全相同，則兩個氨基酸序列同源。例如，85％的同源性是指當兩個序列進行序列對比以找出最大匹配性時85％氨基酸序列相同。可以允許使用間隙(在對比的兩個序列之一上)以使匹配最大化；5或更短的間隙長度是優(yōu)選的，更優(yōu)選的是2或更短。替代的和優(yōu)選的是，如果使用程序ALIGN(使用突變數(shù)據(jù)矩陣，間隙罰為6或更多)時兩個蛋白質(zhì)序列序列對比得分大于5(標準誤差單位)，這兩個蛋白質(zhì)序列(或源自其的長度至少為30個氨基酸的多肽序列)是同源的(即本文使用的術語)。參見Dayhoff，M.O.，蛋白質(zhì)序列和結構圖譜(Altas of ProteinSequence and Structure)，1972，5卷，國家生物醫(yī)學研究基金會，101-110頁以及該卷的增刊21-10頁。當使用ALIGN程序進行最佳序列對比時，如果兩個序列或其部分的氨基酸大于或等于50％相同，它們是更優(yōu)選的同源。
本文使用的“基本上純的”是指一種物質(zhì)是存在的主要物質(zhì)(即在摩爾基礎上，該物質(zhì)比組合物中的任何其它種類的物質(zhì)都多)，優(yōu)選地基本上純化的級分是其中所述物質(zhì)占存在的所有大分子物質(zhì)的至少大約50％(在摩爾的基礎上)的組合物。通常基本上純的組合物占存在于組合物中的所有大分子物質(zhì)的大約80％以上，更優(yōu)選地占大約85％、90％、95％和99％以上。最優(yōu)選的是，將該物質(zhì)純化至基本上均質(zhì)(通過常規(guī)的檢測方法不能檢測到組合物中的雜質(zhì))，其中所述組合物基本上由單一大分子物質(zhì)組成。
本文所使用的化學術語按照本領域的常規(guī)用法使用，由McGraw-Hill化學術語字典(McGraw-Hill Dictionary of Chemical Terms)(編者Parker，S.，1985)，McGraw-Hill，舊金山，此處引用作為參考。
通過遺傳工程從所克隆的基因生產(chǎn)蛋白質(zhì)的方法是熟知的。參見，例如美國專利4,761,371，Bell等人，第6列第3行至第9列第65行(本文引用的所有專利參考的說明書在此引用作為參考)。因而，下述討論意在作為本領域的概述，而并不意在反映本領域的全部現(xiàn)狀。
當DNA區(qū)域功能性地相互相關時，可以有效地連接這些區(qū)域。例如，如果一種啟動子控制序列的轉(zhuǎn)錄，可將其有效地連接到編碼序列上；如果核糖體結合位點處于可允許翻譯的位置時，可將其有效地連接到編碼序列上。通常，有效地連接是指相連，在前導序列的情況下是指相連并位于讀框內(nèi)。
適合的宿主細胞包括原核生物、酵母細胞或高等真核細胞。原核生物包括革蘭氏陰性或革蘭氏陽性生物體，例如大腸桿菌(Escherichia coli(E.coli))或芽孢桿菌屬(Bacillii)。高等真核細胞包括如下所述的來源于哺乳動物的建立的細胞系(即cos細胞)。例證的宿主細胞為DH5a、大腸桿菌W3110(ATCC 27,325)、大腸桿菌B、大腸桿菌X1776(ATCC 31,537)和大腸桿菌294(ATCC 31,446)。假單胞菌屬(Pseudomonas)的種、芽胞桿菌屬(Bacillus)的種和沙雷氏菌屬(Serratia)的種也是適合的。
在一種昆蟲系統(tǒng)中，苜蓿銀紋夜蛾(Autographa californica)核型多角體病毒(AcNPV)可用作表達外源基因的載體。(例如，參見Smith等，1983，病毒學雜志(J.Virol.)46584；Smith，美國專利4,215,051)。在一個下述的實施方案中，用桿狀病毒載體感染Sf9昆蟲細胞，其中桿狀病毒載體可表達具有6×組氨酸標記、或myc或EE-標記(即Glu-Glu-標記)的PKB激酶構建體?！癊”指氨基酸谷氨酸。
可得到多種適合的微生物載體。通常，微生物載體包含可被預定的宿主識別的復制起點、在宿主中起作用的啟動子以及表型選擇基因，如編碼賦予抗生素抗性或提供自養(yǎng)需要的蛋白質(zhì)的基因?？梢越ㄔ煊糜谄渌拗鞯南嗨茦嫿w。一般使用pBR322轉(zhuǎn)化大腸桿菌。參見Bolivar等，基因(Gene)2，95(1977)。pBR322包含氨芐青霉素和四環(huán)素抗性的基因，這樣就提供了簡便的鑒別已轉(zhuǎn)化的細胞的方法。表達載體應包含可被宿主生物體識別的啟動子。這通常是指獲自預定的宿主的啟動子。最常用于重組微生物表達載體的啟動子包括β-內(nèi)酰胺酶(青霉素酶)、乳糖啟動子系統(tǒng)(Chang等人，自然275，615(1978)；Goeddel等人，核酸研究(NucleicAcids Res.)8，4057(1980)；EPO申請公開文本36,776)以及tac啟動子(H.De Boer等人，美國國家科學院院報80，21(1983))。
PKB激酶的鑒別可以使用幾種不同的技術鑒別PKB激酶，其中包括用于檢測蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的方法。在PKB激酶活性檢測的某些點，預期可以確定PIP3對它的活化。參見，Stokoe，D.等人(1997)科學，277卷，567-570頁。
可以使用的常規(guī)方法為細胞裂解物或獲自細胞裂解物的蛋白質(zhì)的免疫共沉淀、交聯(lián)和通過梯度或?qū)游鲋布兓?，并鑒定在將靶蛋白質(zhì)(優(yōu)選的為PKB)或其它適合底物磷酸化的細胞裂解物中的蛋白質(zhì)。這樣的測定可以使用全長PKB靶或一個肽。一旦分離后，就可以鑒定這樣的胞內(nèi)PKB激酶，并與標準技術結合用于鑒別與其相互作用的其它蛋白質(zhì)。例如，可以使用本領域技術人員熟知的技術(如Edman降解技術)確定與PKB相互作用的PKB激酶的至少部分氨基酸序列。(參見，例如，Creighton，1983，“蛋白質(zhì)結構及分子原理”(ProteinsStructures and MolecularPrinciples)，W.H.Freeman&Co.，紐約，34-49頁)。所獲得的氨基酸序列可以用作產(chǎn)生寡核苷酸混合物的指導，該寡核苷酸混合物可用于篩選編碼這樣的胞內(nèi)蛋白質(zhì)的基因序列。篩選可以通過，例如，標準雜交或PCR技術完成。產(chǎn)生寡核苷酸混合物和篩選的技術是周知的。(參見，例如，Ausubel，同上以及PR草案方法和應用指導(PR ProtocolsA Guide toMethods and Applications)，1990，Innis，M.等人，學術出版公司，紐約)。
另外，也可以使用可同時鑒別編碼與PKB激酶相互作用的胞內(nèi)蛋白質(zhì)的基因的方法。這些方法包括，例如，以與熟知的λgtl 1文庫抗體探查技術相似的方式使用標記的蛋白質(zhì)或融合蛋白(例如，融合到標記(如酶、熒光、發(fā)光蛋白質(zhì)或染料)上)或Ig-Fc結構域探查表達文庫。
一種檢測蛋白質(zhì)在體內(nèi)相互作用的而且不依賴于PKB激酶的激酶活性的方法是雙雜交系統(tǒng)，對其詳細描述僅是為了說明而非限制。對該系統(tǒng)已有描述(美國專利5,283,173 Chien等人，1991，美國國家科學院院報，889578-9582)，可以從Clontech(Palo Alto，CA)購買。簡而言之，使用這樣的系統(tǒng)，可以構建編碼雙雜交蛋白質(zhì)的質(zhì)粒一種質(zhì)粒包含編碼轉(zhuǎn)錄活化劑蛋白質(zhì)的DNA結合結構域的核苷酸(該核苷酸融合到編碼PKB、或肽或融合蛋白的PKB核苷酸序列上)，另一種質(zhì)粒包含編碼轉(zhuǎn)錄活化劑蛋白質(zhì)的活化結構域的核苷酸(該核苷酸融合到編碼未知蛋白質(zhì)的cDNA上，該cDNA已被重組進所述質(zhì)粒并作為cDNA文庫的一部分)。將DNA結合結構域融合質(zhì)粒和cDNA文庫轉(zhuǎn)化進包含報導基因(例如HBS或lacZ)的釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的菌株中，其中報道基因的調(diào)節(jié)區(qū)域包含轉(zhuǎn)錄活化劑結合位點。任何一種雜合蛋白質(zhì)單獨不能活化報道基因的轉(zhuǎn)錄；DNA結合結構域雜合體不能這樣是因為其不提供活化功能，活化結構域雜合體不能這樣是因為其不能定位活化劑結合位點。兩種雜合體蛋白質(zhì)的相互作用重新組成了有功能的活化劑蛋白質(zhì)，導致了報道基因的表達，其表達是通過測定報道基因產(chǎn)物檢測的。
雙雜交系統(tǒng)或相關的方法可用于篩選與“誘餌”基因產(chǎn)物相互作用的蛋白質(zhì)的活化結構域文庫。為了例證而非限制，PKB或肽或其融合蛋白可用作誘餌基因產(chǎn)物。將全部基因組或cDNA序列融合到編碼活化結構域的DNA上。將該文庫和編碼融合到DNA結合結構域的誘餌PKB基因產(chǎn)物雜合體的質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化進酵母報道菌株中，在形成的轉(zhuǎn)化體中篩選表達報道基因的轉(zhuǎn)化體。純化這些菌落，分離負責報道基因表達的文庫質(zhì)粒。然后使用DNA測序鑒定由文庫質(zhì)粒編碼的蛋白質(zhì)。
可以使用本領域常用的方法建造細胞系的cDNA文庫，在該cDNA文庫中可以檢測與誘餌細胞周期靶基因產(chǎn)物相互作用的蛋白質(zhì)。例如，按照本文所述的具體的系統(tǒng)，可以將cDNA片段插入載體中以便其可以在翻譯時融合到GAL4的轉(zhuǎn)錄活化結構域上?？梢詫⒃撐膸炫c誘餌細胞周期靶基因-GAL4融合質(zhì)粒一起共轉(zhuǎn)染進酵母菌株中，該酵母菌株包含由含有GAL4活化序列的啟動子驅(qū)動的lacZ基因。融合到GAL4轉(zhuǎn)錄活化結構域上的cDNA編碼的蛋白質(zhì)(該蛋白質(zhì)可與誘餌周期靶基因產(chǎn)物相互作用)可重新組成活性的GAL4蛋白質(zhì)，由此驅(qū)動HIS3基因的表達。可以通過表達HIS3的菌落在缺乏組氨酸的半固體瓊脂培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿上的生長檢測它們。然后從這些菌株中純化cDNA，并使用本領域常用的技術將其用于生產(chǎn)和分離與誘餌周期靶基因相互作用的蛋白質(zhì)。
一旦使用雙雜交測定分離到蛋白質(zhì)后，就可進行獨立的測定以確定該蛋白質(zhì)是否具有激酶活性。這樣的測定在本領域是熟知的，其例子由Stokoe，D.等人(1997)，科學，277卷，567-570頁描述。
編碼PKB激酶的核酸按照本發(fā)明的編碼PKB激酶的核酸可從多種不同來源獲得。它可獲自DNA或RNA，如聚腺苷酸化的mRNA，該mRNA可分離自，例如，組織、細胞或整個生物體。核酸可以直接獲自DNA或RNA，或獲自cDNA文庫。核酸可以獲自特定發(fā)育階段并具有所需的基因型、表型的細胞(例如致癌轉(zhuǎn)化的細胞或癌細胞)等。
包含編碼按照本發(fā)明的多肽的核苷酸的核酸可包括僅包含PKB激酶的編碼序列、PKB激酶的編碼序列和其它編碼序列(例如，編碼前導、分泌、導向、酶促、熒光或其他診斷肽的序列)、PKB激酶的編碼序列和非編碼序列(例如，在5＇或3＇端任一端或分散在編碼序列中的不翻譯的序列，如內(nèi)含子)。包含不中斷地編碼PKB激酶多肽的核苷酸序列的核酸是指所述核苷酸序列包含編碼PKB激酶多肽的氨基酸的序列，在編碼序列中無非編碼核苷酸中斷或干擾，例如，無內(nèi)含子。這樣的核苷酸序列也可以描述為連續(xù)的。
按照本發(fā)明的核酸也可包含表達控制序列，該序列可有效地連接到如上所述的核酸上。短語“表達控制序列”是指調(diào)節(jié)多肽表達的核酸序列，其中多肽由與它有效連接的核酸編碼。表達可以在mRNA或多肽的水平上調(diào)節(jié)。這樣，表達控制序列包括與mRNA相關的元件和與蛋白質(zhì)相關的元件。這樣的元件包括啟動子、增強子(病毒的或細胞的)、核糖體結合序列、轉(zhuǎn)錄終止子等。當表達控制序列以這樣的方式起作用或完成編碼序列的表達時，表達控制序列為有效地連接到核苷酸編碼序列上。例如，當啟動子有效地連接到編碼序列5＇上時，編碼序列的表達由啟動子驅(qū)動。表達控制序列相對于正常的基因可以是外源的或內(nèi)源的。
按照本發(fā)明的核酸可以基于核酸雜交進行選擇。雙鏈核酸制劑相互雜交的能力是其核苷酸序列互補性的表現(xiàn)，例如，核苷酸之間的堿基配對，如A-T、G-C等。這樣，本發(fā)明也涉及可與包含圖5所示的核苷酸序列(SEQID NO1)的核酸雜交的核酸?？膳c后一種序列雜交的核苷酸序列具有互補的核酸鏈，或在聚合酶(即適當?shù)暮怂岷铣擅?存在下作為核酸的模板。本發(fā)明包括核酸的兩條鏈，如有義鏈和反義鏈。
可以選擇雜交條件以選擇與圖5所示的核苷酸序列(SEQ ID NO1)具有所需數(shù)量的核苷酸互補的核酸。能與這樣的序列雜交的核酸在序列之間優(yōu)選地具有50％的互補性，更優(yōu)選地為70％互補性。具體地說，本發(fā)明涉及可與圖5所示的核苷酸序列(SEQ ID NO1)在嚴格條件下雜交的DNA序列。本文所使用的“嚴格條件”是指任何在核酸之間至少有95％核苷酸互補性、優(yōu)選地97％互補性時可以雜交的條件。這樣條件包括例如Northern雜交在42℃下的5×SSPE、10×Denhardts溶液、100μg/ml新變性并剪切的鮭精DNA、50％甲酰胺、2％SDS；用于從cDNA文庫克隆的雜交在42℃下的1×PAM、0.1％SDS、50％甲酰胺。
按照本發(fā)明，核酸或多肽可包含與在圖5所示的核苷酸或氨基酸序列(SEQ ID NO1)有一個或多個不同。對核苷酸和/或氨基酸序列的改變或修改可以通過任何可使用的方法(包括定點和隨機突變)完成。
編碼按照本發(fā)明的PKB激酶的核酸可以包括天然產(chǎn)生的PKB激酶基因中的核苷酸，例如，天然產(chǎn)生的多態(tài)性、正?；蛲蛔兊牡任换?核苷酸或氨基酸)中的核苷酸、在天然哺乳動物(人、猴、豬、小鼠、大鼠或兔)群體中發(fā)現(xiàn)的突變中出現(xiàn)的核苷酸。術語天然產(chǎn)生的是指核酸獲自天然來源，如動物組織和細胞、體液、組織培養(yǎng)細胞、法醫(yī)樣品。PKB激酶天然產(chǎn)生的突變可包括核苷酸序列的缺失(例如，截短的氨基或羧基末端)、取代或添加?？梢詸z測這些基因并按照本領域技術人員所知的方法通過核酸雜交分離?？梢哉J識到，與其它致癌基因類似，天然產(chǎn)生的PKB激酶變體包括缺失、取代和添加，其產(chǎn)生了在宿主細胞和生物體中病理條件。
本發(fā)明的編碼PKB激酶多肽的核苷酸序列可以包含在天然產(chǎn)生的基因、轉(zhuǎn)錄物或cDNA(例如，如在圖5中所示的(SEQ ID NO1))中發(fā)現(xiàn)的密碼子，該核苷酸序列也可以包含編碼相同氨基酸序列的簡并密碼子。
本發(fā)明的另一個方面是PKB激酶獨特的核苷酸序列。PKB激酶獨特的核苷酸序列是指存在于PKB激酶(例如，在圖5的核苷酸序列中(SEQ IDNO1))中、但卻很少或不常出現(xiàn)在其它核酸中的確定順序的核苷酸，尤其是不出現(xiàn)在動物核酸中，優(yōu)選地為哺乳動物，如人、大鼠、小鼠等。有義和反義核苷酸序列都包括在內(nèi)。按照本發(fā)明的獨特的核酸可使用常規(guī)方法確定。包含PKB激酶的獨特序列的核酸可用作雜交探針(例如，Northern印跡)以鑒定PKB激酶在包含核酸混合物的樣品中的存在。雜交可以在嚴格條件下進行以選擇與探針至少有95％相同(即互補)的核酸，但是也可以使用嚴格程度較低的條件。獨特的PKB激酶核苷酸序列也可在其5＇或3＇端符合讀框地融合到本專利全文提到的多種核苷酸序列，包括PKB激酶編碼序列的其它部分、酶、GFP等、表達控制序列等。
雜交可依賴于所需的選擇性在不同條件下進行，如Sambrook等人，分子克隆(Molecular Cloning)，1989描述。例如，為了特異性地檢測PKB激酶，可以使寡核苷酸與靶核酸在一定條件下雜交，其中寡核苷酸僅與PKB激酶雜交，例如，當寡核苷酸與靶100％互補時。如果需要選擇少于100％核苷酸互補(例如至少大約99％、97％、95％、90％、70％、67％)的靶核酸，可以使用不同的條件。因為PKB激酶基因中的突變可以引起疾病或病理情況，例如，癌癥、良性腫瘤，可以在診斷時使用按照本發(fā)明的寡核苷酸。例如，具有癌癥癥狀或其它與PKB激酶信號傳遞途徑相關的情況的患者可以通過使用按照本發(fā)明的寡核苷酸診斷疾病，使用聚合酶鏈式反應與其后的DNA測序鑒定序列是否正常。在一個優(yōu)選的方法中，本發(fā)明涉及診斷癌癥的方法，該方法包括使包含靶核苷酸的樣品與寡核苷酸在靶核苷酸和該寡核苷酸可以雜交的條件下接觸；檢測雜交，其中所述寡核苷酸包含PKB激酶序列，優(yōu)選地包含PKB激酶的獨特序列；確定與寡核苷酸雜交的靶核酸的核苷酸序列。該序列可以按照多種方法確定，這些方法包括分離靶核酸或其cDNA并按照所需方法確定其序列。
細胞生長紊亂的診斷可以使用多種方法診斷和預測細胞生長紊亂(包括癌癥)，并可鑒定具有這種紊亂傾向的受治療者。
這樣的方法可以使用試劑，例如，如上所述的PKB激酶核苷酸序列和PKB激酶抗體。具體地說，這樣的試劑可以用于，例如(1)PKB激酶基因突變存在的檢測，或者檢測相對于非細胞生長紊亂狀態(tài)而言PKB激酶mRNA的過量表達或表達不足；(2)相對于非細胞生長紊亂狀態(tài)而言PKB激酶基因過度豐富或不足；(3)檢測PKB激酶調(diào)節(jié)的信號傳遞途徑的紊亂或失常。
本文描述的方法可以通過，例如，使用預先包裝的診斷試劑盒進行，該試劑盒包含至少一種本文所述的特定的PKB激酶核苷酸序列或PKB激酶抗體試劑，它可以很方便地在，例如，臨床裝置中使用以診斷表現(xiàn)出細胞活化紊亂失常的患者。
要檢測PKB激酶，可以使用任何有核細胞作為基因組核酸的最初來源。要檢測PKB激酶表達，可以使用PKB激酶在其中表達的任何細胞類型或組織。
基于核酸的檢測技術描述如下。肽檢測技術也敘述如下。
PKB激酶基因及轉(zhuǎn)錄物的檢測在PKB激酶基因內(nèi)的突變可以利用許多技術檢測。得自任何有核細胞的核酸可以作為這種測定技術的開始，可按照本領域技術人員熟知的標準核酸制備方法分離。
DNA可以用于生物樣品的雜交或擴增測定以檢測基因結構的失常，這些失常包括點突變、插入、缺失和染色體重新排列。這樣的測定可以包括，但并不限于Southern分析、單鏈構象多態(tài)性分析(SSCP)以及PCR分析。
這樣的檢測PKB激酶特定突變的診斷方法可以包括，例如，使包括重組DNA分子、克隆的基因或其簡并突變體的核酸與一種或多種標記的核酸試劑接觸并溫育，所述核酸獲自樣品，如源自患者的樣品或其它適當?shù)募毎麃碓?，所述核酸試劑包括如上所述的重組DNA分子、克隆的基因或其簡并突變體，接觸并溫育的條件適合于這些試劑對PKB激酶內(nèi)與其互補的序列的特異性退火。這些核酸試劑的長度優(yōu)選地為至少15至30個核苷酸。在溫育后，從核酸分子雜交體中除去所有非退火的核酸，然后檢測雜交后的核酸分子的存在(如果存在這樣的分子的話)。使用這樣的檢測方法，可以將得自目標細胞類型或組織的核酸固定化到，例如，固體支持物(如在微滴定板或聚苯乙烯珠粒上的膜或塑料表面)上。在這種情況下，在溫育后，上述的非退火的、標記的這類核酸試劑易于除去。剩余的退火并標記的PKB激酶核酸試劑的檢測可以通過使用本領域技術人員熟知的標準技術完成。為了確定基因突變是否存在，可以比較核酸試劑退火的PKB激酶基因序列與正常基因預期的退火方式。
檢測在患者樣品中或其它的適當?shù)募毎麃碓粗械腜KB激酶基因特異性核酸分子的另一種診斷方法可以包括其擴增(例如，通過PCR，在Mullis，K.B.，1987，美國專利4,683,202中提出的試驗性實施方案)，其后為使用本領域技術人員熟知的技術檢測擴增的分子。將形成的擴增序列與如果所擴增的核酸僅包含正?？截惖腜KB激酶基因時預期的序列進行比較，以確定是否存在基因突變。
PKB激酶基因產(chǎn)物的檢測針對上述野生型或突變的PKB激酶基因產(chǎn)物或其保守的變體或肽片段的抗體也可用于本文所述的細胞生長紊亂診斷和預測。這樣的診斷方法可用于檢測PKB激酶基因表達水平的失常，或在PKB激酶的結構和/或瞬間、組織、細胞或亞細胞位點的失常，該方法可在體內(nèi)或體外進行，如在活組織檢查時。
要分析的組織或細胞類型通常包括已知或可能包含表達PKB激酶的細胞(例如，如滲入發(fā)炎組織的中性細胞)的組織或細胞類型。本文使用的蛋白質(zhì)分離方法可以，例如，是Harlow和Lane描述的方法(Harlow，E.和Lane，D.，1988，“抗體試驗室手冊”(AntibodiesLaboratoryManual)，冷泉港試驗室出版社，冷泉港，紐約)，本文引用其全部作為參考。所分離的細胞可以源自細胞培養(yǎng)物或患者。分析得自培養(yǎng)物的細胞在評價可以用作基于細胞的基因治療技術的一部分的細胞時是必須的步驟，或替代的是，在測定化合物對PKB激酶基因表達的影響時是必須的步驟。
例如，如上所述的抗體或抗體片段在本發(fā)明中可用于PKB激酶基因產(chǎn)物或其保守變體或肽片段的定量和定性檢測。這可以通過，例如，使用熒光標記的抗體的免疫熒光技術(見下)與光學顯微鏡、流式細胞儀、熒光測定法檢測相結合完成。
用于本發(fā)明的抗體(或其片段)或融合蛋白或偶聯(lián)蛋白質(zhì)可以在組織學上(如免疫熒光、免疫電子顯微鏡或非免疫測定)用于PKB激酶基因產(chǎn)物或其保守變體或肽片段的原位檢測。
原位檢測可以通過從患者身上取出組織樣品、向其加入本發(fā)明標記的抗體或融合蛋白完成。抗體(或片段)或融合蛋白優(yōu)選地通過將標記的抗體(或片段)覆蓋到生物樣品上使用。通過使用這種方法，不僅可以確定PKB激酶基因產(chǎn)物或保守變體或肽片段的存在，也可以確定其在所檢測的樣品中的分布。使用本發(fā)明，本領域的普通技術人員易于認識到可以修改多種組織學方法的任何一種(如染色方法)以完成這樣的原位檢測。
PKB激酶基因產(chǎn)物或其保守的變體或肽片段的免疫測定或非免疫測定一般包括在可檢測的標記抗體存在下溫育樣品(如在細胞培養(yǎng)基上培養(yǎng)的生物液體、組織提取物、新收獲的細胞或細胞裂解產(chǎn)物)，其中的標記抗體可以鑒定PKB激酶基因產(chǎn)物或其保守的變體或肽片段；通過任何一種本領域熟知的技術檢測結合的抗體。
可以將生物樣品接觸并固定化在固相支持物或載體(如硝酸纖維素膜)或其它可固定細胞、細胞顆?；蚩扇苄缘鞍踪|(zhì)的固體支持物上。然后用適合的緩沖液洗滌支持物，隨后用可檢測地標記的PKB激酶抗體或融合蛋白處理。第二次用緩沖液洗滌固相支持物以除去未結合的抗體或融合蛋白。然后可通過常規(guī)方法檢測在固體支持物上結合的標記的數(shù)量。
“固相支持物或載體”意在包括任何可結合抗原或抗體的支持物。熟知的支持物或載體包括玻璃、聚苯乙烯、聚丙烯、聚乙烯、葡聚糖、尼龍、淀粉酶、天然或修飾的纖維素、聚丙烯酰胺、輝長巖和磁鐵礦。載體的性質(zhì)為了本發(fā)明的目的在一定程度上可溶或不溶。支持物事實上可以具有任何可能的結構構型，只要偶聯(lián)的分子可以結合到抗原和抗體上。這樣，支持物構型可為圓形(如珠粒)或圓柱形(如試管的內(nèi)表面或棒柱的外表面)。另外，表面可以是平面的，如片狀或測試帶等。優(yōu)選的支持物包括聚苯乙烯珠粒。本領域技術人員知道許多其它適合用于結合抗體或抗原的載體，或者可以通過使用常規(guī)試驗確定適合的載體。
給定的PKB激酶抗體或融合蛋白的結合活性可按照熟知的方法確定。本領域技術人員通過使用常規(guī)試驗可以確定每個測試的可操作的和優(yōu)選的測定條件。
對于抗體，方法之一(其中抗體可以被可檢測地標記)是通過將抗體連接到酶上并在酶免疫測定(EIA)中使用(Voller，“酶聯(lián)免疫吸附劑測定(ELISA)”(The Enzyme Linked Immunosorbent Assay)(ELISA)1978，診斷地平線(Diagnostic Horizons)21-7，微生物協(xié)會季刊，Walkersville，MD)；Voller等人，1978，臨床病理學雜志(J.Clin.Pathol.)31507-520；Butler，1981，酶學方法(Meth.Enzymol.)73482-523；Maggio(ed.)，1981，酶免疫測定(Enzyme Immunoassay)，CRC出版社，Boca Raton，F(xiàn)L，，Ishikawa等人，(eds.)，1981酶免疫測定，Kgaku Shoin，東京)。與抗體結合的酶可與適當?shù)牡孜?優(yōu)選的為顯色底物)在一定的方式下反應以產(chǎn)生可以檢測的化學部分，該化學部分可通過，例如，分光光度法、熒光測定法或可視方式檢測?？捎糜诳蓹z測地標記抗體的酶包括(但不限于)蘋果酸脫氫酶、葡萄球菌核酸酶、δ-5-類固醇異構酶、酵母乙醇脫氫酶、α-甘油磷酸脫氫酶、丙糖磷酸異構酶、辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶、天門冬酰胺酶、葡萄糖氧化酶、β-半乳糖苷酶、核糖核酸酶、脲酶、過氧化氫酶、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶、葡糖淀粉酶和乙酰膽堿酯酶。檢測可以通過比色方法完成，該方法使用酶的顯色底物。檢測也可以通過視覺將底物酶促反應的程度和相似的制備標準加以比較完成。
檢測也可以通過使用多種其它免疫測定方法之一完成。例如，通過放射性標記抗體或抗體片段，可以使用放射免疫測定(RIA)檢測PKB激酶(參見，例如，Weintraub，B.放射免疫測定原理(Principles ofRadioimmunoassays)，放射配體測定技術的第七次訓練課，內(nèi)分泌協(xié)會，1986年3月，此處引用作為參考)。放射性同位素可以通過如使用γ計數(shù)儀或閃爍計數(shù)儀或通過放射自顯影檢測。
也可以用熒光化合物標記抗體。當熒光標記的抗體暴露在適當波長的光下時，其存在可通過熒光檢測。最常使用的熒光標記化合物為異硫氰酸熒光素、羅丹明、藻紅蛋白、藻藍蛋白、別藻藍蛋白和熒光胺。
抗體也可以使用發(fā)射熒光的金屬(如152Eu或鑭系的其它金屬)可檢測地標記?？梢允褂媒饘衮匣鶊F(如二亞乙基三胺五乙酸(DTPA)或乙二胺四乙酸(EDTA))將這些金屬連接到抗體上。
也可以通過將抗體偶聯(lián)到化學發(fā)光化合物上可檢測地標記。然后通過檢測在化學反應過程中產(chǎn)生的發(fā)光的存在確定化學發(fā)光劑標記的抗體的存在。特別有用的化學發(fā)光標記化合物的例子為魯米諾、異魯米諾、theromatic吖啶鎓酯、咪唑、吖啶鎓鹽、草酸酯。
另外，也可以使用生物發(fā)光化合物標記本發(fā)明的抗體。生物發(fā)光是在生物系統(tǒng)內(nèi)發(fā)現(xiàn)的一類化學發(fā)光，催化蛋白質(zhì)可增加化學發(fā)光反應的效率。生物發(fā)光蛋白質(zhì)的存在通過檢測發(fā)光的存在確定。用于標記的重要的生物發(fā)光化合物為熒光素、熒光素酶和水母發(fā)光蛋白。
藥物制劑可以將已確定影響PKB激酶基因表達或PKB激酶活性或PKB激酶與其任一結合伴侶相互作用的化合物(包括但不限于PIP3或PKB)以治療有效劑量施用于患者，來治療或改善造血細胞生長紊亂(包括癌癥)。治療有效劑量是指足以引起這樣的紊亂癥狀改善的化合物的量。
有效劑量這樣的化合物在細胞培養(yǎng)物或?qū)嶒瀯游镏械亩拘曰蛑委熜Ч赏ㄟ^標準藥物方法確定，例如用于確定LD50(50％群體致死的劑量)和ED50(在50％群體中治療有效的劑量)。毒性和治療效果間的劑量比就是治療指數(shù)，可以表示為LD50/ED50。治療指數(shù)大的化合物是優(yōu)選的。在可以使用表現(xiàn)出毒性副作用的化合物的同時，應該仔細設計將這樣的化合物朝向有效組織位點的遞送系統(tǒng)以使對未感染的細胞的潛在破壞最小化，從而降低副作用。
從細胞培養(yǎng)物測定和動物研究獲得的數(shù)據(jù)可用于制定在人中使用的劑量范圍。這樣的化合物的劑量優(yōu)選地處于循環(huán)濃度的范圍內(nèi)，該濃度包括毒性很小或無毒性的ED50。依賴于所使用的劑量形式和所用的施用路線劑量可在此范圍內(nèi)變化。對于任何在本發(fā)明的方法中使用的化合物，治療有效劑量最初可從細胞培養(yǎng)物測定中估計。在動物模型中制定劑量以達到循環(huán)血漿濃度范圍，該范圍包括在細胞培養(yǎng)物中確定的IC50(即達到癥狀最大抑制率一半的測試化合物的濃度)。這樣的信息可用于更精確地確定在人中有用的劑量。在血漿中的水平可以通過，例如，高效液相色譜測定。
制劑與用途按照本發(fā)明使用的藥物組合物可以用常規(guī)的方法使用一個或多個生理可接受的載體或賦形劑制成制劑。
這樣，可以將化合物及其生理可接受的鹽和溶劑合物制成制劑以通過吸入或吹入(通過口或鼻)施用或口、頰、腸胃外、直腸施用。
對于口服施用，藥物組合物可以采取，例如，片劑或膠囊的形式，這些形式通過常規(guī)方法與藥學上可接受的賦形劑一起制備其中的賦形劑如粘合劑(例如預先凝膠化的玉米淀粉、聚乙烯吡咯烷酮、羥丙基甲基纖維素)；填充物(例如乳糖、微晶纖維素或磷酸氫鈣)；潤滑劑(例如硬脂酸鎂、滑石或硅石)；崩解劑(例如馬鈴薯淀粉或淀粉羥乙酸鈉)；濕潤劑(例如月桂基硫酸鈉)。片劑可以通過本領域熟知的方法包衣?？诜囊后w制劑可采取，例如，溶液、糖漿或懸浮液的形式。它們也可以以在使用前與水或其它適當?shù)妮d體組合的干燥產(chǎn)物存在。這樣的液體制劑可以通過常規(guī)方法與藥學上可接受的添加劑一起制備這些添加劑如懸浮劑(例如山梨醇糖漿、纖維素衍生物或氫化食用脂肪)；乳化劑(例如卵磷脂或阿拉伯膠)；非液相載體(例如杏仁油、油性酯、乙醇或分餾的植物油)；防腐劑(例如對羥基苯甲酸甲酯或?qū)αu基苯甲酸丙酯或山梨酸)。
也可以將口服的制劑制成適當?shù)闹苿┮孕纬苫钚曰衔锏木忈屝问健?br> 可以將化合物制成用于通過注射(例如大劑量注射或連續(xù)注入)的腸胃外施用的制劑。用于注射的制劑可以以單位劑量形式(例如，安瓿或多劑量容器)與添加的防腐劑存在。
下列實施例的提出是為了說明本發(fā)明并幫助本領域普通技術人員制造或使用本發(fā)明。實施例并不意在以任何其它方式限制說明書的范圍或由在此的文件授予的保護范圍。
實施例1PKB激酶的純化用于純化PKB激酶的測定包含與5μl的混合物混合的1μl的柱級分(使用前5分鐘混合，在冰上保存)，該混合物包含1)3μl[γ32P]-ATP 5μCi(在測定物中最終濃度為1μM)；2)1μl測定緩沖液(0.1M KCl，5mMMgCl2，1mM EGTA，30mM HEPES，pH 7.4，30℃，在6μl測定物中的最終濃度)；3)0.5μl(EE)-PKB(最終濃度為2.5μM；母液為包含1mMDTT、1mM EGTA，然后與甘油1∶1(v/v)混合的PBS；激酶從用克隆重組的桿狀病毒感染的SF9細胞純化，蛋白質(zhì)通過其(EE)標記純化，洗脫的肽通過凝膠過濾分離)；4)0.5μl脂囊泡制劑，該制劑包含磷脂酰絲氨酸、磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺，有或無D-D-S/A-PtdIns(3，4，5)P3(在測定物中的最終濃度分別為100、100、20和15μM，囊泡的制備通過將干燥脂膜超聲波處理進25mM HEPES(pH 7.4，30℃)并在4℃下貯存3天以上)。測定將在30℃下進行12分鐘，通過添加下列物質(zhì)終止先添加400μl冰冷1％tritonX100、0.3M NaCl、10mM EDTA、1mM焦磷酸鈉、10mMβ-甘油磷酸、50mM氟化鈉、1mM EGTA、0.01％疊氮化物、25mM HEPESpH 7.4，4℃，然后添加30μlα(EE)珠粒(每次測定4μl壓緊的珠粒；將蛋白質(zhì)G-sepharose共價交聯(lián)到飽和數(shù)量的α(EE)單克隆抗體上)。將試管在4℃下混合25分鐘，用上述終止緩沖液洗滌一次，用蓋革計數(shù)儀測定每個試管的[32P]含量。稀釋柱級分以使在任何測定中最大消耗總[γ32P]-ATP的40-45％。用Biosilect柱進行HPLC-SEC(VT 11.6ml，BioRad)。裝載35-45μl樣品，流量為40μl/分鐘，收集到80μl級分。SEC緩沖液包含0.15MNaCl、20mM HEPES pH 7.4 4℃，0.5mM EGTA、0.1mM EDTA、1％甜菜堿、0.03％Tween 20、0.01％疊氮化物、2mM β-甘油磷酸、1mM DTT和胃蛋白酶抑制劑A、亮抑蛋白酶肽、抑肽酶、抗蛋白酶(均為2μg/ml)。
圖1顯示了磷脂酰肌醇(3，4，5)-三磷酸[32P]-PtdIns(3，4，5)P3結合蛋白質(zhì)與PKB激酶活性共純化，最終可從相似的部分純化的制劑的更大規(guī)模制劑解析出四個不同形式的PKB激酶。所有四個活性都磷酸化并在PtdIns(3，4，5)P3或PtdIns(3，4)P2(例如(1-硬脂?；?-花生四烯?；?sn-磷脂?；鵇-肌醇(3，4，5)-三磷酸‘D-D-S/A-PtdIns(3，4，5)P3’的生物立體異構體存在下活化PKB(通過髓磷脂堿性蛋白質(zhì)(MBP)磷酸化判斷)；參見圖2A。
結果表明純化的激酶就如部分純化的活性一樣(a)在這些脂或PtdIns(4，5)P2的對映異構體存在下對PKB無活性；(b)在這些脂的硬脂酰基花生四烯?；衔锒嵌貦坝王；衔锏牡蜐舛认掠谢钚?；(c)可通過D-D-S/A-PtdIns(3，4，5)P3及其非對映異構體同樣有效地活化，該非對映異構體僅在甘油主鏈的手性中心排列上有不同(即D-L-S/A-PtdIns(3，4，5)P3)，這說明盡管識別/相互作用依賴于脂肪酸的性質(zhì)，對于水溶性的頭部基因卻并不受其立體化學的限制；圖2B。
在用于PKB磷酸化研究的相同檢測條件下，我們研究了PKB激酶((圖2D)和PKB自身(圖2C)與這些測定中的脂囊泡的結合。為了測定PKB和PKB激酶與脂囊泡的結合以及不同脂類對PKB磷酸化的影響，通過將干燥脂膜超聲處理進下列物質(zhì)制備脂囊泡0.2M蔗糖、20mM KCl、20mMHEPES，pH 7.4 30℃、0.01％疊氮化物(在測定中最終濃度為200μM磷脂酰膽堿、150μM磷脂酰絲氨酸、20μM磷脂酰乙醇胺、10μM spingomylin加指定濃度的肌醇脂。將這些物質(zhì)與相關激酶在包含下列物質(zhì)的測定緩沖液中混合1mgml-1BSA、0.12 M NaCl、1mM EGTA、0.2mM鈣、1.5mMMgCl2、1mM DTT、0.01％疊氮化物、5mM KCl、20mM HEPES，pH 7.4，30℃(大約50nM游離鈣，均為在測定中的最終濃度)、有或無[γ32P]-ATP(1μM最終濃度)和(EE)-PKB(2.5μM最終濃度)。如果該測定為了估計激酶與脂囊泡的結合，在30℃下保持4分鐘后離心測定物(airfuge(Beckman)最大速率離心30分鐘)。取出上清液的等分試樣以用于測定和免疫印跡。用測定緩沖液快速漂洗沉淀物，再次離心并溶解在SDS-樣品緩沖液中。如本文所述定量PKB的磷酸化。
PKB激酶與包含低摩爾百分比的PtdIns(3，4，5)P3立體異構體(對于D-D-S/A PtdIns(3，4，5)P3為0.003％)和D-D-P/P-PtdIns(3，4)P2的脂囊泡結合但不與包含PtdIns(4，5)P2或L-L-P/PtdIns(3，4)P2)的脂囊泡結合。這與下述觀察一致PKB激酶可以結合[32P]-PtdIns(3，4，5)P3，水溶性的30mer肽(基于Thr308周圍的PKB的序列)的磷酸化受PtdIns(3，4，5)P3或PtdIns(3，4)P2的明顯抑制(未顯示)。
在相同的測定條件下，PKB也可以表現(xiàn)為與脂囊泡結合(圖2C)。然而，需要大大提高濃度的3-磷酸化的脂類以檢測易位，而且在結合3-磷酸化的脂類上和PKB激酶表現(xiàn)出了不同的特異性。但是，與PKB的磷酸化非常相似(比較圖2B和C)。這說明了幾點1)兩個激酶的脂結合性質(zhì)相當不同，2)磷酸化的特異性主要受PKB的募集反應的影響(即PKB的PH結構域的親合性與特異性)，3)僅相當小部分的PKB與活性脂濃度的脂囊泡可能結合，這引起了大多數(shù)PKB激酶結合，由此導致了4)PKB激酶的易位對PKB磷酸化的相對最大影響可在非常低濃度的PtdIns(3，4，5)P3下出現(xiàn)，在更高水平時，PKB的易位變成了主要因素。
將PKB激酶A制劑Western印跡到硝酸纖維素上，并在原位受胰蛋白酶作用。使釋放的肽通過N-端測序和質(zhì)譜法進行分析。參見，L.R.Stephens等人，細胞89，105-1 14(1997)。確定了四個肽并用于數(shù)據(jù)庫檢索，鑒定到了一族人EST序列(TIGRTHC193570)。肽序列(以確定讀框)以及獲自EST克隆測序和從人U937細胞cDNA文庫分離的cDNA的測序的信息的結合，確定了具有最小可能的開放讀框的cDNA，該cDNA包含所有四個肽(允許種間差異)并編碼具有55kd預期分子量的蛋白質(zhì)。該預期的蛋白質(zhì)包含NH2端蛋白質(zhì)激酶結構域和COOH-端PH結構域(圖3)。
與PKB激酶基因相關的人和小鼠EST序列可以在TIGR數(shù)據(jù)庫(THC193570)中找到。通過篩選人U937細胞Oligo dT-引物的文庫(在λZAPI1，Stratagene中)和大鼠腦Oligo dT/隨機引物的文庫(在UniZAPXR，Stratagene中)用源自IMAGE克隆526583的[32P]標記的0.3kb EcoRI-HindIII片段鑒別cDNA編碼的PKB激酶。鑒定并純化陽性斑，cDNA作為基于pBluescript的質(zhì)粒被切割。DNA測序在ABI自動測序儀上通過Babraham研究所微量化學設備(Babraham Institute MicrochemicalFacility)進行。
實施例2PKB激酶cDNA的鑒定使用數(shù)據(jù)庫中的基因組序列信息，我們可以確定精確的染色體位置(人染色體16p13.3；(參見，T.C.Bunn等人，基因組研究(Genome Research)6，525-537(1996)。))以及PKB激酶的某些(但不是全部)內(nèi)含子/外顯子邊界。從該信息以及許多cDNA的測序可以清楚地看到這種定位產(chǎn)生了替代的剪接轉(zhuǎn)錄物的復雜模式。從我們的U937細胞文庫鑒定的一個轉(zhuǎn)錄物精確地相當于圖3定義的ORF，除了其無編碼蛋白質(zhì)激酶結構域的底物識別基元的外顯子(殘基188-213；我們的肽序列數(shù)據(jù)一致表明我們純化的酶包含該基元，圖3)之外。我們使用該cDNA產(chǎn)生了PKB激酶被折衷的激酶(見下)。
我們還鑒定了得自大鼠腦cDNA文庫的cDNA克隆，該克隆清楚地得自相當?shù)幕蛭稽c，但是其擴大了圖3的潛在的ORF以編碼大約65kd的蛋白質(zhì)?？雌饋砗孟筇娲募艚踊蚱鹗济艽a子使用造成產(chǎn)生超過一個得自該基因位點的PKB激酶異構體(注在圖3顯示的大多數(shù)PKB激酶A肽的N端不同于所顯示的預期ORF，這也許表明該酶的截短形式可通過替代剪接產(chǎn)生)。進一步的數(shù)據(jù)庫檢索也鑒定到了在果蠅屬(Drosophila)(EmblY07908)中的未知功能的相近同系物。參見，K.Salim等人，EMBO雜志(EMBO J.)15，6241-6250(1996)。
實施例3PKB激酶的表達我們構建了編碼55kd PKB激酶的N-端EE標記形式的哺乳動物表達載體及其‘激酶被折衷的’剪接變體。通過使用標準的基于PCR的克隆策略將圖3中定義的ORF符合讀框地置于pCMV3瞬時表達載體中的N-端標記(參見，L.R.Stephens等人，細胞89，105-114(1997))。使用缺失編碼殘基188-213的核苷酸的cDNA也可以構建一種載體(這通過使用IMAGE克隆510982和526583建成本文中作為‘激酶被折衷的剪接變體’)。通過測序校驗所有的構建體。
這些蛋白質(zhì)在cos-7細胞中表達，并純化自該細胞(參見，L.R.Stephens等人，細胞89，105-114(1997)，參見，圖4)。具有完整的蛋白質(zhì)激酶結構域的蛋白質(zhì)以PtdIns(3，4，5)P3敏感的方式使PKB磷酸化，表明該活性存在于圖3定義的ORF中。
簡而言之，通過蛋白質(zhì)的(EE)標記純化蛋白質(zhì)(使用myc抗體作為對照)，將等分試樣進行Western印跡。然后將用α(EE)單克隆抗體探查的PVDF濾膜(由ECL檢測；右上圖)用考馬斯藍染色(左上圖；所顯示的數(shù)據(jù)僅適用于(EE)-II；用(EE)-I可獲得相似的結果)。在脂囊泡的存在下(有或無D-D-S/A-PtdIns(3，4，5)P3和[γ32P]ATP(300nM；分別為3μM和1μM的最終濃度)測定等分試樣中的PKB激酶活性。放射自顯影圖顯示了在PKB中的[32P]。
實施例4PKB激酶抑制劑的鑒定與用途PKB是PIP3途徑的關鍵酶，參與調(diào)節(jié)細胞生長。該酶可能在某些人類癌癥中起作用；例如，已知其在部分卵巢癌、乳腺癌和胰癌中可被擴增。參見，Bellacosa，A.等人(1995)國際癌癥雜志64，280-285頁以及Cheng，J.Q.等人(1996)美國國家科學院院報93卷，3636-3641。該酶的擴增給予腫瘤細胞防止編程性細胞死亡的機制。這樣，可以明顯地看到抑制PKB活性的藥物對于治療具有不需要的細胞生長的疾病(包括癌癥)有益。達到這種目的的一種方法是開發(fā)鑒定這種藥物的測定方法。
PKB激酶抑制劑的鑒定可以通過測定抑制PKB激酶活性的PIP3活化的化合物實現(xiàn)。這可以通過在化合物存在或不存在時測定PKB的磷酸化進行?？梢匀缟纤鲞M行測定，或通過Stokoe，D.等人(1997)科學，277卷，567-570頁的方法進行。例如，使用實施例3中描述的測定，55kd PKB激酶的末端EE標記形式可以與PIP3、ATP再生系統(tǒng)一起溫育，其中優(yōu)選地包含5mM MgCl2、2mM ATP、10mM磷酸肌酸、肌酸激酶(50μg/ml)、1％NP-40以及PKB或另一個適合的底物。在適當?shù)臅r期后，可以免疫沉淀PKB并測定磷酸化的量。
本發(fā)明并不限于本文描述的特定實施方案的范圍，所述的實施方案意在作為本發(fā)明某一方面的單個說明，功能相當?shù)姆椒ê徒M分屬于本發(fā)明的范圍。事實上，結合前面的的說明和所附的插圖，本發(fā)明的各種改良(除了本文所顯示的和描述的之外)對本領域技術人員都會變得顯而易見。這樣的改良屬于本發(fā)明的范圍。
權利要求
1.一種分離的核酸分子，該分子包含編碼PKB激酶活性的核苷酸序列。
2.一種分離的核苷酸序列，該序列編碼一種嵌合蛋白質(zhì)，其包含融合到編碼異源多肽的第二種核苷酸序列上的權利要求1的核苷酸序列。
3.一種核苷酸載體，包含權利要求1的核苷酸序列。
4.一種表達載體，包含權利要求1的核苷酸序列，該序列與控制核苷酸序列在宿主細胞中表達的核苷酸調(diào)節(jié)序列有效地連接。
5.一種宿主細胞，該細胞經(jīng)遺傳工程化以包含權利要求1的核苷酸序列。
6.一種宿主細胞，該細胞經(jīng)遺傳工程化以包含權利要求1的核苷酸序列，該序列與控制核苷酸序列在宿主細胞中表達的核苷酸調(diào)節(jié)序列有效地連接。
7.一種可以免疫特異性地與PKB激酶結合的抗體。
8.一種用于診斷哺乳動物疾病的方法，該方法包括檢測包含在哺乳動物基因組中的PKB激酶突變。
9.一種用于篩選用來治療細胞生長紊亂的化合物的方法，包括以下步驟在溶液中混合化合物、活化的PKB激酶、PKB激酶的底物、ATP再生系統(tǒng)、PKB活化劑；且在所述的化合物存在或不存在時鑒定磷酸從ATP到PKB激酶底物的轉(zhuǎn)移。
10.權利要求9的方法，其中所述的PKB活化劑是PIP3。
11.一種用于治療哺乳動物中細胞生長紊亂的方法，該方法包括將在權利要求11中鑒定的化合物以足以抑制PKB活性的量施用于哺乳動物。
12.一種用于活化PKB激酶的方法，該方法包括在溶液中溫育所述的PKB激酶與PIP3。
13.通過權利要求10的方法鑒定的化合物。
14.一種分離的PKB激酶。
15.一種分離的PKB激酶，該激酶包含SEQ.ID.No.1。
全文摘要
描述了用于鑒定影響PKB活性的化合物的組合物及方法,所述化合物具有診斷和治療疾病的醫(yī)藥用途。
文檔編號C12N5/10GK1276832SQ98809120
公開日2000年12月13日 申請日期1998年9月17日 優(yōu)先權日1997年9月26日
發(fā)明者L·司戴芬斯, P·豪金斯, D·斯多克 申請人:昂尼克斯藥物公司