專利名稱：用于在動(dòng)物乳腺內(nèi)表達(dá)sod的重組dna的構(gòu)建方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用分子生物學(xué)技術(shù)構(gòu)建重組DNA以在動(dòng)物乳汁中獲得SOD的方法。
SOD又稱過氧化物歧化酶，是體內(nèi)唯一的一種具有降解自由基作用的酶。
SOD目前被廣泛用于抗衰老，抗癌，消炎，調(diào)節(jié)免疫等，如在老年性癡呆，老年性白內(nèi)障，高血壓，冠心病，動(dòng)脈硬化，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，紅斑狼瘡，多種腫瘤等中都有一定預(yù)防和治療作用，并有很好的養(yǎng)顏、護(hù)膚、抗衰老功效。目前SOD產(chǎn)品主要來源于生物體細(xì)胞，從豬、牛等動(dòng)物的紅細(xì)胞、心、腦等組織細(xì)胞中提取，或者利用基因克隆技術(shù)在培養(yǎng)細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，然后再從上清中提取，以上技術(shù)都具有工藝復(fù)雜、成本高及產(chǎn)量低等不足之處。
本方法的目的在于克服上述現(xiàn)有技術(shù)之不足，提供一種有助于快速、簡(jiǎn)單、有效地從動(dòng)物乳汁中上獲得SOD的方法。
為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明之目的，首先按本發(fā)明所述的用于在動(dòng)物乳腺內(nèi)表達(dá)SOD的重組DNA的構(gòu)建方法，利用分子生物學(xué)的技術(shù)獲得包含有動(dòng)物乳蛋白基因啟動(dòng)子和/或增強(qiáng)子的DNA片段與SOD DNA的完整或不完整片段，通過兩者的直接或間接相連，經(jīng)過一些必要的修飾后裝入適當(dāng)?shù)腄NA載體，構(gòu)成一個(gè)或數(shù)個(gè)重組DNA，將重組DNA適當(dāng)處理并與一些化學(xué)物質(zhì)混合后注入動(dòng)物的乳腺導(dǎo)管內(nèi)，通過乳腺導(dǎo)管進(jìn)入乳腺分泌細(xì)胞。或通過其它建立生物反應(yīng)器的方法導(dǎo)入動(dòng)物生殖細(xì)胞以建立乳腺定位表達(dá)生物反應(yīng)器，在乳腺分泌細(xì)胞分泌乳汁的同時(shí)，也較大量地分泌SOD，因此可在動(dòng)物的乳汁中獲得SOD。
具體點(diǎn)說是首先通過分子生物學(xué)的方法獲得動(dòng)物或植物的SOD DNA完整或不完整片段和包含有動(dòng)物乳蛋白基因的啟動(dòng)子和/或增強(qiáng)子的DNA片段，將SOD DNA完整或不完整片段連接在包含有動(dòng)物乳蛋白基因啟動(dòng)子和/或增強(qiáng)子的DNA片段的下游，再做些必要的DNA修飾后，裝入適當(dāng)?shù)妮d體上，構(gòu)成重組DNA?；蛘邔袆?dòng)物乳蛋白基因的啟動(dòng)子和/或增強(qiáng)子的DNA片段與T7RNA聚合酶DNA相連，T7啟動(dòng)子與SOD DNA完整或不完整片段相連，將以上兩個(gè)連接片段做些必要的DNA修飾，裝入適當(dāng)?shù)囊粋€(gè)載體或一個(gè)以上的載體上，構(gòu)成重組DNA。再通過常規(guī)的分子克隆的方法，大量擴(kuò)增并純化此重組DNA，將此重組DNA做(或者不做)一定的酶切處理，與某些化學(xué)物質(zhì)(如脂質(zhì)體等)混合后，借助注射器等一類器具吸取此混合物，通過動(dòng)物乳頭管注入乳腺導(dǎo)管內(nèi)，使此重組DNA沿乳腺管進(jìn)入乳腺分泌細(xì)胞，當(dāng)動(dòng)物泌乳時(shí)用常規(guī)方法擠出乳汁，在乳汁中即可獲得較大量的SOD。或?qū)⒅亟MDNA通過其它建立生物反應(yīng)器的方法導(dǎo)入動(dòng)物生殖細(xì)胞以建立乳腺定位表達(dá)的生物反應(yīng)器。
實(shí)施例1取全長(zhǎng)1Kb的人MnSODcDNA與含有啟動(dòng)子的、長(zhǎng)約800bp的牛β-caseincDNA連接，裝入pCDA3載體建成重組DNA，經(jīng)克隆篩選、擴(kuò)增、提取及純化后，與脂質(zhì)體相互作用，用生理鹽水配制成濃度為0.1mg/ml的液體，取200ml，注入空奶期的乳牛乳腺導(dǎo)管內(nèi)，經(jīng)適當(dāng)擠壓后，液體將通過乳腺導(dǎo)管進(jìn)入乳腺分泌細(xì)胞，當(dāng)乳牛產(chǎn)后泌乳，即可在乳汁中獲得較大量的SOD。
實(shí)施例2將含有啟動(dòng)子的、長(zhǎng)約800bp的牛β-casein cDNA與T7RNA聚合酶DNA連接，另將T7啟動(dòng)子與全長(zhǎng)1Kb的人MnSOD cDNA相連，經(jīng)過必要的DNA修飾后分別裝入兩個(gè)pCDNA3的載體，經(jīng)克隆篩選、擴(kuò)增、提取及純化后，與脂質(zhì)體相互作用，用生理鹽水配制成濃度為0.1mg/ml的液體，取200ml，注入空奶期的乳牛乳腺導(dǎo)管內(nèi)，經(jīng)適當(dāng)擠壓后，液體將通過乳腺導(dǎo)管進(jìn)入乳腺分泌細(xì)胞，當(dāng)動(dòng)物進(jìn)入泌乳期，含有啟動(dòng)子的、長(zhǎng)約800bp的牛β-casein cDNA將誘導(dǎo)T7RNA聚合酶的合成，后者將通過作用于T7啟動(dòng)子誘導(dǎo)SOD的合成，因此可從乳汁中獲得活性SOD。
使用本方法所述的用于在動(dòng)物乳腺內(nèi)表達(dá)SOD的重組DNA的構(gòu)建方法，并配合乳腺導(dǎo)管內(nèi)注射或其它的建立生物反應(yīng)器的方法，克服了以往生產(chǎn)SOD所存在的的設(shè)備條件要求高、技術(shù)難度大、成本高、產(chǎn)量低等缺點(diǎn)，使SOD的生產(chǎn)在純天然狀態(tài)下進(jìn)行，大批量生產(chǎn)，成本較低，因此具有一定的經(jīng)濟(jì)開發(fā)價(jià)值。
權(quán)利要求
1.一種用分子生物學(xué)技術(shù)構(gòu)建重組DNA以在動(dòng)物乳汁中獲得SOD的方法，其特征是將包含有動(dòng)物乳蛋白基因啟動(dòng)子和/或增強(qiáng)子的DNA片段與SOD DNA的完整或不完整片段直接或間接相連，經(jīng)過一些必要的修飾后裝入適當(dāng)?shù)腄NA載體，構(gòu)成重組DNA，以此重組DNA配合乳腺導(dǎo)管內(nèi)注射或其它建立生物反應(yīng)器的方法，在乳汁中獲得活性SOD。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用分子生物學(xué)技術(shù)構(gòu)建重組DNA以在動(dòng)物乳汁中獲得SOD的方法，其特征是將包含有動(dòng)物乳蛋白基因啟動(dòng)子和/或增強(qiáng)子的DNA片段與SODDNA的完整或不完整片段直接相連，經(jīng)過一些必要的修飾后裝入適當(dāng)?shù)腄NA載體，構(gòu)成重組DNA，以此重組DNA配合乳腺導(dǎo)管內(nèi)注射或其它建立生物反應(yīng)器的方法，在乳汁中獲得活性SOD。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用分子生物學(xué)技術(shù)構(gòu)建重組DNA以在動(dòng)物乳汁中獲得SOD的方法，其特征是將包含有動(dòng)物乳蛋白基因啟動(dòng)子和/或增強(qiáng)子的DNA片段與SODDNA的完整或不完整片段通過T7RNA聚合酶與T7啟動(dòng)子偶連系統(tǒng)間接相連，經(jīng)過一些必要的修飾后裝入適當(dāng)?shù)腄NA載體，構(gòu)成重組DNA，以此重組DNA配合乳腺導(dǎo)管內(nèi)注射或其它建立生物反應(yīng)器的方法，在乳汁中獲得活性SOD。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2或3所述的用分子生物學(xué)技術(shù)構(gòu)建重組DNA以在動(dòng)物乳汁中獲得SOD的方法，其特征是將包含有牛β-casein DNA啟動(dòng)子和/或增強(qiáng)子的DNA片段與SOD DNA的完整或不完整片段間接或直接相連，經(jīng)過一些必要的修飾后裝入適當(dāng)?shù)腄NA載體，構(gòu)成重組DNA，以此重組DNA配合乳腺導(dǎo)管內(nèi)注射或其它建立生物反應(yīng)器的方法，在乳汁中獲得活性SOD。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或2或3所述的用分子生物學(xué)技術(shù)構(gòu)建重組DNA以在動(dòng)物乳汁中獲得SOD的方法，其特征是將包含有牛α-S1-casein DNA啟動(dòng)子和/或增強(qiáng)子的DNA片段與SODDNA的完整或不完整片段間接或直接相連，經(jīng)過一些必要的修飾后裝入適當(dāng)?shù)腄NA載體，構(gòu)成重組DNA，以此重組DNA配合乳腺導(dǎo)管內(nèi)注射或其它建立生物反應(yīng)器的方法，在乳汁中獲得活性SOD。
6.根據(jù)權(quán)利要求1或2或3所述的用分子生物學(xué)技術(shù)構(gòu)建重組DNA以在動(dòng)物乳汁中獲得SOD的方法，其特征是將包含有牛lactoglobulin DNA啟動(dòng)子和/或增強(qiáng)子的DNA片段與SODDNA的完整或不完整片段間接或直接相連，經(jīng)過一些必要的修飾后裝入適當(dāng)?shù)腄NA載體，構(gòu)成重組DNA，以此重組DNA配合乳腺導(dǎo)管內(nèi)注射或其它建立生物反應(yīng)器的方法，在乳汁中獲得活性SOD。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種用分子生物學(xué)技術(shù)在乳汁中獲得SOD的方法,克服了用現(xiàn)有技術(shù)提取或人工生產(chǎn)SOD之技術(shù)難度大、成本高、產(chǎn)量低等不足,將包含有動(dòng)物乳蛋白基因啟動(dòng)子和/或增強(qiáng)子的DNA片段與SOD DNA的完整或不完整片段直接或通過T7RNA聚合酶與T7啟動(dòng)子偶連系統(tǒng)等方法間接相連,經(jīng)過一些必要的修飾后裝入適當(dāng)?shù)腄NA載體,構(gòu)成重組DNA,經(jīng)過克隆篩選、擴(kuò)增、純化之后,與脂質(zhì)體等物質(zhì)混合,然后直接注入動(dòng)物的乳腺導(dǎo)管內(nèi),讓重組DNA進(jìn)入乳腺分泌細(xì)胞,或用常規(guī)的建立生物反應(yīng)器的方法建立乳腺定位表達(dá)生物反應(yīng)器,在分泌細(xì)胞分泌乳汁時(shí),重組DNA得以表達(dá),用常規(guī)的方法擠得乳汁,可從乳汁中獲重組DNA的表達(dá)產(chǎn)物一SOD,本方法具有方法簡(jiǎn)單、成本低、SOD活性高、產(chǎn)量高等優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號(hào)C12N9/02GK1247898SQ98113340
公開日2000年3月22日 申請(qǐng)日期1998年9月14日 優(yōu)先權(quán)日1998年9月14日
發(fā)明者黃偉民 申請(qǐng)人:黃偉民