專利名稱：培育快速生長轉(zhuǎn)基因動物的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及動物育種，特別涉及應(yīng)用基因工程技術(shù)研制快速生長動物養(yǎng)殖品種的方法。
魚類育種是漁業(yè)生產(chǎn)中的重要環(huán)節(jié)，高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、抗逆養(yǎng)殖品種的研制和培養(yǎng)是加速漁業(yè)發(fā)展的有力保障。傳統(tǒng)的魚類品種選育是一個漫長的過程，加之物種遺傳壁壘和育種資源的限制，已不能滿足日益增長的社會需求。1982年，應(yīng)用基因轉(zhuǎn)移技術(shù)，將生長激素基因?qū)胄∈笫芫?，獲得快速生長的轉(zhuǎn)基因小鼠，該研究成果預(yù)示了基因工程育種的巨大潛力(Palmiter,R.et al,1982,Nature 300,611615)。但在豬、牛、羊等畜牧養(yǎng)殖品種轉(zhuǎn)移外源生長激素基因，未能得到預(yù)期的生長性狀改善(Westhusin,M.1997,NatureGenetics 17.4-5)。我們將人生長激素基因?qū)膈庺~受精卵，研制出世界首例快速生長的轉(zhuǎn)基因魚(Zhu,Z.et al,1985,Z.angew.Ichthyol.1,31-34)。除了個別的轉(zhuǎn)生長激素基因鮭魚實驗外(Delvin,R.H.et al,1994,Nature,371,209-210)，其它各種轉(zhuǎn)生長激素基因魚的快速生長效應(yīng)均沒有預(yù)期的顯著。這一出乎預(yù)想的結(jié)果有多方面的原因。一方面，生物的生長是一個復(fù)雜的過程，受到多種基因產(chǎn)物影響，生長激素只是其中之一；另一方面，生長的調(diào)節(jié)要求相關(guān)基因表達和在時空上的協(xié)同作用。通過轉(zhuǎn)移單一生長激素基因的方法，以求改良動物生長性狀的目的是難以實現(xiàn)的。
生長激素(GH)和胰島素樣生長因子(IGF)是調(diào)節(jié)脊椎動物生長的兩個重要因子。已有的研究證實，生長激素刺激動物肝臟等靶器官細胞產(chǎn)生胰島素樣生長因子，后者促進蛋白質(zhì)合成及骨骼肌生長；體內(nèi)生長激素或胰島素樣生長因子的含量對生長激素基因的表達均起調(diào)控作用。因此，生長激素和胰島素樣生長因子是調(diào)節(jié)生長的兩個協(xié)同因子。
本發(fā)明采用外源生長激素基因和胰島素樣生長因子基因同步轉(zhuǎn)移方法，將兩個基因?qū)媵~受精卵中，通過兩者表達產(chǎn)物的協(xié)同作用，大大促進轉(zhuǎn)基因魚個體的生長，由此篩選和培育快速生長的魚類養(yǎng)殖新品系，以達到應(yīng)用于漁業(yè)生產(chǎn)的目的。
為實現(xiàn)本發(fā)明的目的，其技術(shù)方案是基于魚類生長的多因子調(diào)節(jié)特點，以及生長激素和胰島素樣生長因子在魚類生長調(diào)節(jié)中的協(xié)同作用。采用DNA體外重組技術(shù)，將魚類的生長激素基因和胰島素樣生長因子基因分別與魚類的基因表達強啟動子拼接，構(gòu)建“全魚”重組基因轉(zhuǎn)移載體。將兩種“全魚”重組基因轉(zhuǎn)移載體同步導(dǎo)入魚受精卵，使之整合到由此發(fā)育而成的受體魚染色體基因組中。在強啟動子的驅(qū)動下，外源生長激素基因和胰島素樣生長因子基因得以有效表達，并協(xié)同發(fā)揮作用。應(yīng)用多聚酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù)和逆轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)技術(shù)，鑒定外源基因穩(wěn)定整合并有效表達的陽性轉(zhuǎn)基因魚群體。在此基礎(chǔ)上，篩選具顯著快速生長性狀的轉(zhuǎn)基因魚，培育繁殖，建立快速生長的轉(zhuǎn)基因魚新品系。
有益效果1、“全魚”生長激素重組基因和“全魚”胰島素樣生長因子重組基因整合到魚染色體基因組中，并有效表達。在兩種魚類生長調(diào)節(jié)重要因子的協(xié)同作用下，轉(zhuǎn)基因魚可獲得顯著的快速生長效應(yīng)。我們對黃河鯉受精卵同步轉(zhuǎn)移“全魚”生長激素重組基因和“全魚”胰島素樣生長因子重組基因，轉(zhuǎn)基因黃河鯉最大個體體重是對照魚平均體重的3.4倍(魚苗生長118天，最大實驗魚2750g，最大對照魚1414g)。
2、在同等條件下，轉(zhuǎn)生長激素基因魚更有效地利用餌料，特別是更有效地利用低蛋白質(zhì)餌料，具有更高的蛋白質(zhì)合成能力。魚體干物質(zhì)和蛋白質(zhì)含量分別提高1.6％和3.3％，而脂肪含量降低8.5％。
3、穩(wěn)定整合在魚染色體中的外源基因可通過生殖腺系細胞傳遞給后代。
附圖
“全魚”生長激素重組基因轉(zhuǎn)移載體pCAgcGH和“全魚”胰島素樣生長因子重組基因轉(zhuǎn)移載體pCAsIGFc示意圖，CA為鯉魚肌動蛋白基因啟動子調(diào)控順序，gcGH為草魚生長激素結(jié)構(gòu)基因部分，sIGF-Ic為鮭魚胰島素樣生長因子-I的cDNA。
實施例即本發(fā)明的方法與步驟1、基因轉(zhuǎn)移載體構(gòu)建轉(zhuǎn)移載體基因元件包括本實驗室克隆的鯉魚6-肌動蛋白基因啟動子(CA)和草魚生長激素基因(gcGH)，以及引進的鮭魚胰島素樣生長因子基因-I的cDNA,(sIGF-Ic)。質(zhì)粒載體為pUC118。采用PCR技術(shù)將gcGH和sIGF-Ic分別與CA精確連接，構(gòu)建“全魚”重組基因轉(zhuǎn)移載體pCAgcGH和pCAsIGFc。見附圖。
2、外源基因轉(zhuǎn)移用限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ將重組基因轉(zhuǎn)移載體線性化，用胰蛋白酶消化去除黃河鯉魚受精卵卵膜，采用顯微注射方法，在第一次卵裂前將混合外源基因同時導(dǎo)入受精卵動物極，導(dǎo)入基因劑量5×105拷貝/卵，導(dǎo)入基因的受精卵及去卵膜的受精卵在實驗室無菌環(huán)境中孵化。
3、轉(zhuǎn)基因魚鑒定篩選轉(zhuǎn)基因魚經(jīng)室外魚池飼養(yǎng)，進行個體標記。取尾鰭DNA，采用PCR技術(shù)檢測外源基因gcGH和sIGF-I的整合；制備肝臟RNA，采用RT-PCR技術(shù)檢測外源基因gcGH和sIGF-I的表達，鑒定轉(zhuǎn)基因陽性魚，篩選快速生長轉(zhuǎn)基因陽性魚，培育繁殖，進而建立快速生長轉(zhuǎn)基因魚品系。
4、轉(zhuǎn)基因魚營養(yǎng)及代謝測定用三種等能的合成鯉魚餌料(分別含40％、30％和20％的蛋白質(zhì)及相應(yīng)的30％、40％和50％的碳水化合物)飽和投喂魚8周，測定魚的體重、餌料吸收、消化率和軀體組成的變化。
權(quán)利要求
應(yīng)用基因轉(zhuǎn)移技術(shù)的一種培育快速生長轉(zhuǎn)基因動物的方法，其特征是將外源生長激素基因和胰島素樣生長因子基因分別與基因表達強啟動子拼接，構(gòu)建重組基因轉(zhuǎn)移載體，以此兩種重組基因轉(zhuǎn)移載體同步導(dǎo)入受體動物受清卵，使之整合到由此發(fā)育而成的受體動物染色體基因組中，經(jīng)鑒定篩選培育出快速生長的轉(zhuǎn)基因動物群體。
全文摘要
生物的生長是一個復(fù)雜的過程,受到多種基因產(chǎn)物影響,因此,通過轉(zhuǎn)移單一生長激素基因的方法,難以實現(xiàn)動物生長性狀的改良目的。本發(fā)明采用協(xié)同基因同步轉(zhuǎn)移方法,將脊椎動物生長調(diào)節(jié)中的兩個重要因子－生長激素和胰島素樣生長因子的重組基因同時導(dǎo)入受體動物受精卵中,外源基因在染色體中的整合、表達,在其產(chǎn)物的協(xié)同作用下,促進轉(zhuǎn)基因動物個體的生長。
文檔編號C12N15/63GK1217384SQ9710930
公開日1999年5月26日 申請日期1997年11月17日 優(yōu)先權(quán)日1997年11月17日
發(fā)明者朱作言, 汪亞平, 崔宗斌, 張甫英, 陳尚萍 申請人:中國科學(xué)院水生生物研究所