專利名稱：一種人工授精生產(chǎn)的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物及其制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種采用以精子作為外源基因載體，并采用人工授精的方法生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物及其制作方法。
目前，國內(nèi)外尚無以精子作載體通過人工授精生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，因?yàn)橛眠@種方法生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物存在著外源基因在動(dòng)物體內(nèi)整合率低，并且經(jīng)處理的精子很難達(dá)到人工授精對(duì)精子活力的要求，若用經(jīng)攜帶外源基因處理后的精子進(jìn)行人工授精，必將顯著降低懷孕率和產(chǎn)仔率。
本發(fā)明的目的在于提供一種生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的制作方法來提高外源基因在動(dòng)物體內(nèi)的整合率及被經(jīng)過攜帶外源基因處理的精子的活力，從而降低生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的成本，提高生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物成功率，適合在生產(chǎn)中生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。
本發(fā)明轉(zhuǎn)基因動(dòng)物是一種攜帶了外源基因的動(dòng)物。其制作方法為采集精液→鏡檢活力→高速離心→吸出精清→精子懸浮于組織細(xì)胞培養(yǎng)液中→再高速離心→重復(fù)洗滌→加入肝素→加入外源基因→37℃水浴30分鐘→加入復(fù)蘇劑→鏡檢活力→人工授精或制作凍精→生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。
本發(fā)明的特征之一在與外源基因作用后的精液中加入自制的復(fù)蘇劑，能明顯地提高精子的活力。目前，國內(nèi)外利用精子作載體通過人工授精生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，試驗(yàn)費(fèi)用很高，失敗率極大，其主要原因是經(jīng)過轉(zhuǎn)基因處理的精子復(fù)蘇后其活力只有0.2～0.5，精子活力也很難達(dá)到常規(guī)人工授精的要求，懷孕率、產(chǎn)仔率亦顯著下降，這就是目前尚無人用人工授精方法成功地生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的主要原因之一。復(fù)蘇劑由精清組成，亦可加組織細(xì)胞培養(yǎng)液共同組成。加入這種復(fù)蘇劑可使精子活力達(dá)到0.6～0.9。
本發(fā)明的特征之二加入肝素并控制加入量。加入肝素能使被處理的精子獲能，獲能精子才能受精。不加肝素或加入量過低，不能使被處理過的精子獲能，而肝素量加入過高，又可競爭性地抑制外源基因進(jìn)入精子內(nèi)。因此，加入肝素并控制加入量是提高轉(zhuǎn)基因成功率的重要手段之一。加入肝素的最佳范圍在5～15微克/毫升。
本發(fā)明的特征之三加大外源基因的量，可明顯提高外源基因在動(dòng)物體內(nèi)的整合率。由于加大外源基因的量，可降低精子活力導(dǎo)致生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物失敗，至今無人使用。本發(fā)明的制作方法中特地在用外源基因處理精子后加入了自制復(fù)蘇劑，解決了因加大外源基因量降低精子活力的問題。外源基因劑量的最佳范圍為10～30微克/毫升，為常用量的10倍以上。
本發(fā)明的特征之四加入大劑量的組織細(xì)胞營養(yǎng)液，反復(fù)充分地洗滌精子，以提高外源基因在動(dòng)物體內(nèi)的整合率。由于精清中含有抑制外源基因進(jìn)入精子的抑制因子及降解外源基因的酶，因此，充分洗去精子表面的精清成分是提高外源基因在動(dòng)物體內(nèi)整合率的重要方法之一。組織細(xì)胞營養(yǎng)液適宜劑量為原精液量的100倍以上。
本發(fā)明的特征之五控制乙二胺四乙酸(ED TA)的加入劑量來提高外源基因在動(dòng)物體內(nèi)的整合率。因?yàn)橐叶匪囊宜峥梢苑乐雇庠椿蛟趧?dòng)物體內(nèi)的降解，但是加入過量會(huì)對(duì)精子產(chǎn)生毒副作用。本發(fā)明提出其最佳劑量范圍是0.1～0.5毫摩爾濃度(PH7.5)。
本發(fā)明的特征之六在對(duì)精子處理的全過程中，始終遵守“等溫操作”的原則，最大程度地避免因操作過程中溫度差異對(duì)精子活力的影響，以最大程度地提高精子活力。
本發(fā)明中所用的組織細(xì)胞營養(yǎng)液為SIGMA公司生產(chǎn)的F10實(shí)施例4號(hào)公羊(新疆細(xì)毛羊)采精量為1.8毫升，活力為0.9，密度為密，放入離心機(jī)，以800個(gè)離心力離心6分鐘后，吸出精清凍于-20℃?zhèn)溆?。將去掉精清的精子懸浮?0毫升的組織細(xì)胞培養(yǎng)液中(F10+5％BSA)進(jìn)行洗滌，再次以1600個(gè)離心力離心5分鐘。重復(fù)洗滌、離心，加入15微克/毫升的肝素，作用10分鐘后，再加入40微克/毫升的外源基因(該實(shí)施例所用外源基因?yàn)槿丝挂鹊鞍酌富?，進(jìn)行37℃水浴25分鐘，加入復(fù)蘇劑后鏡檢活力為0.8，密度為中，精液量為2.1毫升人工授精配種21只母羊生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因羔羊。以同樣方法共人工授精新疆細(xì)毛羊母羊313只，產(chǎn)羔257只，產(chǎn)羔率82.1％，隨機(jī)抽樣檢測152只羔羊，經(jīng)斑點(diǎn)、Southern雜交檢測得到陽性羔羊15只，陽性率為9.87％。
權(quán)利要求
1.一種人工授精生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，其特征是這種轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的外源基因的載體是精子，并且是采用人工授精的方法生產(chǎn)的。
2.一種人工授精生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物制作方法，其特征是制作方法為采集精液→鏡檢活力→高速離心→吸出精清→精子懸浮于組織細(xì)胞培養(yǎng)液中→再高速離心→重復(fù)洗滌→加入肝素→加入外源基因→37℃水浴30分鐘→加入復(fù)蘇劑→鏡檢活力→人工授精或制作凍精→生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的人工授精生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物制作方法，其特征是在與外源基因作用后的精液中加入了復(fù)蘇劑。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的人工授精生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物制作方法，其特征是在重復(fù)洗滌后的精液中加入肝素并控制肝素劑量在5～15微克/毫升。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的人工授精生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物制作方法，其特征是大幅度提高外源基因的劑量至10～30微克/毫升。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的人工授精生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物制作方法，其特征是加入大劑量的組織培養(yǎng)液反復(fù)洗滌精子。
7.根據(jù)權(quán)利要求2所述的人工授精生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物制作方法，其特征是乙二胺四乙酸的劑量是0.1～0.5毫摩爾濃度。
8.根據(jù)權(quán)利要求2所述的人工授精生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物制作方法，其特征是在對(duì)精子處理的全過程中，實(shí)行等溫操作。
9.根據(jù)權(quán)利要求2所述的人工授精生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物制作方法，其特征是復(fù)蘇劑由精清組成，或者由精清和組織細(xì)胞培養(yǎng)液共同組成。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種采用以精子作為外源基因載體，并采用人工授精的方法生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物及其制作方法。其制作方法為采集精液→鏡檢活力→高速離心→吸出精清→精子懸浮于組織細(xì)胞培養(yǎng)液中→再高速離心→重復(fù)洗滌→加入肝素→加入外源基因→37℃水浴30分鐘→加入復(fù)蘇劑→鏡檢活力→人工授精或制作凍精→生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。本發(fā)明提高了外源基因在動(dòng)物體內(nèi)整合率和被經(jīng)過攜帶外源基因處理的精子的活力，降低了成本，提高了生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的成功率。
文檔編號(hào)A61D19/02GK1164384SQ9710412
公開日1997年11月12日 申請(qǐng)日期1997年4月21日 優(yōu)先權(quán)日1997年4月21日
發(fā)明者郭志勤, 陳東, 劉明君, 黃俊成, 孫永新, 陳永福, 武堅(jiān), 李文蓉, 顧文藝, 孫拓 申請(qǐng)人:新疆畜牧科學(xué)院畜牧獸醫(yī)生物技術(shù)農(nóng)業(yè)部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室