專(zhuān)利名稱(chēng)：Taar1轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明提供了包含編碼TAAR1的DNA的基因構(gòu)建體以及產(chǎn)生在其基因組中包含編碼TAAR1的轉(zhuǎn)基因DNA的非人轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的方法。另外，本發(fā)明提供了在其基因組中包含編碼TAAR1的轉(zhuǎn)基因DNA的非人轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。此外，還提供了過(guò)量表達(dá)TAAR1的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物以及產(chǎn)生它們的方法。本發(fā)明還涉及這些動(dòng)物作為工具的用途，用于評(píng)價(jià)TAAR1功能、用于已知的TAARI配體的進(jìn)一步的特征描述以及用于鑒別至今未知的TAAR1配體、用于分析TAAR1的信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制、用于分析TAAR1體內(nèi)的生理功能，并且用于描述TAAR1的激動(dòng)劑、拮抗物或調(diào)節(jié)劑的特征。另外，本發(fā)明涉及所述的TAAR1轉(zhuǎn)基因動(dòng)物用于研究TAAR1功能的用途以及它們作為模型鑒定和測(cè)試化合物關(guān)于神經(jīng)、精神和代謝疾病的治療效果的用途。
微量胺(TA)是與在哺乳動(dòng)物神經(jīng)系統(tǒng)中微量存在的生物胺神經(jīng)遞質(zhì)有關(guān)的內(nèi)源性化合物。在過(guò)去的數(shù)十年間，由于微量胺與多種高發(fā)病緊密相關(guān)，引發(fā)了對(duì)微量胺的藥理學(xué)和新陳代謝深入研究的努力，其中所述高發(fā)病如抑郁癥、精神分裂癥、焦慮癥、雙相性精神障礙、注意力缺陷多動(dòng)癥、神經(jīng)疾病如帕金森病、癲癇、偏頭痛、高血壓、精神活性物質(zhì)濫用以及代謝紊亂如進(jìn)食障礙、糖尿病、肥胖癥和血脂異常(綜述在Lindemann& Hner，2005；Branchek，T.A.和Blackburn，T.P.(2003)Curr.Opin.Pharmacol.3，90-97；Premont，R.T.，Gainetdinov，R.R.，Caron，M.G.(2001)Proc.Natl.Acad.Sci.98，9474-9475.；Davenport，A.P.(2003)Curr.Opin.Pharmacol.3，127-134中)。然而，僅僅因最近G蛋白偶聯(lián)受體新家族一稱(chēng)作微量胺相關(guān)受體(TAAR)的鑒定，才有可能在分子水平更詳細(xì)地理解微量胺的生理學(xué)(Lindemann，L.，Ebeling，M.，Kratochwil，N.A.，Bunzow J.R.，Grandy，D.K.，Hoener，M.C.(2005)Genomics 85，372-385；Bunzow，等(2001)Mol.Pharmacol.60，1181-1188；Borowsky，B.，等，(2001)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.98，8966-8971)。這類(lèi)受體中的某一些受體顯示對(duì)微量胺的敏感性，并且它們獨(dú)特的藥理學(xué)和表達(dá)模式使這些受體成為以往已與微量胺相聯(lián)系的數(shù)種疾病的藥物開(kāi)發(fā)中靶的主要候選者。對(duì)系統(tǒng)水平上微量胺相關(guān)受體與其配體的生理學(xué)意義理解的進(jìn)展關(guān)鍵取決于詳細(xì)地了解微量胺相關(guān)受體的表達(dá)模式、它們的藥理學(xué)及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)模式。在本文中，作為激動(dòng)劑、拮抗劑或者正向調(diào)節(jié)劑或負(fù)向調(diào)節(jié)劑作用于TAAR的化合物以及過(guò)量表達(dá)TAAR1受體的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型是剖析該受體家族的分子功能及充分理解它們作為藥物開(kāi)發(fā)靶標(biāo)的潛在相關(guān)的重要工具。
因此本發(fā)明提供了包含有效連接到啟動(dòng)子的編碼TAAR1的DNA序列的基因構(gòu)建體。
TAAR1基因的序列可以來(lái)自任何動(dòng)物。優(yōu)選地，taar1的序列來(lái)自哺乳動(dòng)物，更優(yōu)選地，taar1的序列是人序列(NM_138327，SEQ.ID NO1)或小鼠序列(NM_053205，SEQ.ID NO2)。
啟動(dòng)子可以是神經(jīng)元啟動(dòng)子(neuronal promoter)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，啟動(dòng)子是組織特異性的啟動(dòng)子。組織特異性的啟動(dòng)子可以是以組織特異性方式調(diào)控和指揮基因表達(dá)的任何啟動(dòng)子，如在腦組織中(腦特異性)、在肌肉組織中、在肝組織中、在腎組織中等等。優(yōu)選的，啟動(dòng)子提供在中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)中的特異性表達(dá)。最優(yōu)選的，啟動(dòng)子是小鼠Thy1啟動(dòng)子(Ingraham，H.A.，Lawless，G.M.，Evans，G.A.(1986)The mouseThy-1.2 glycoprotein genecomplete sequence and identification of anunusual promoter.J Immunol.136，1482-1489)。
啟動(dòng)子還可以是可調(diào)控的啟動(dòng)子?？烧{(diào)控的啟動(dòng)子可以是以可調(diào)節(jié)的和/或可誘導(dǎo)的方式調(diào)控轉(zhuǎn)基因表達(dá)的任何啟動(dòng)子，如通過(guò)添加特定的誘導(dǎo)物質(zhì)或阻抑物質(zhì)。在本領(lǐng)域中已知一些可誘導(dǎo)的細(xì)菌啟動(dòng)子(Schultze N，Burki Y，Lang Y，Certa U，Bluethmann H；Nat Biotechnol 1996；14(4)499-503；van der Neut R；Targeted gene disruptionapplications inneurobiology；J Neurosci Methods 1997；71(1)19-27；Liu HS，Lee CH，Lee CF，Su IJ，Chang TY；Lac/Tet dual-inducible system functions inmammalian cell lines.Biotechniques。1998；24(4)624-8，630-2)。
本文用到的術(shù)語(yǔ)“啟動(dòng)子”指的是調(diào)控編碼序列表達(dá)的DNA區(qū)域。
本文用到的術(shù)語(yǔ)“轉(zhuǎn)基因DNA”描述了人工引入和摻入到生物中的DNA。
本文用到的術(shù)語(yǔ)“taar1基因的序列”描述了編碼TAAR1的DNA序列。
基因構(gòu)建體可以額外包含Kozak序列。優(yōu)選的，基因構(gòu)建體包含優(yōu)化的Kozak序列如序列tccacc。Kozak序列是圍繞ATG起始信號(hào)的用于mRNA翻譯的DNA序列(Kozak，M.，An ahalysis of 5′-noncodingsequences from 699 vertebrate messenger RNAs.Nucleic Acids Res.15(1989)8125-8148)。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，基因構(gòu)建體額外包括N端流感血凝素病毒前導(dǎo)序列。在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，基因構(gòu)建體額外包括表位標(biāo)志如M1-FLAG表位。在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，基因構(gòu)建體額外包括Met-Gly接頭。在更加優(yōu)選的實(shí)施方案中，基因構(gòu)建體包括N端流感血凝素病毒前導(dǎo)序列、M1-FLAG表位和Met-Gly接頭(Bunzow等人，(2001)Mol.Pharmacol.60，1181-1188；X.M.Guan，T.S.Kobilka，B.K.Kobilka(1992)Enhancement of membrane insertion and function in a type IIIbmembrane protein following introduction of a cleavable signal peptide.J.Biol.Chem.267，21995-21998)。
優(yōu)選的，基因構(gòu)建體如在


圖1或圖2中所描述的。
更優(yōu)選的，基因構(gòu)建體是摻入到質(zhì)粒pThy1-hsTARR1中的Thy1-hsTAAR1，其中所述質(zhì)粒pThy1-hsTARR1的保藏號(hào)為DSM 17761(根據(jù)布達(dá)佩斯條約保藏于德意志微生物保藏中心(Deutsche Sammlungvon Microorganismen und Zellkulturen GmbH(DSMZ)，具有2005年11月30日的有效保藏日期)，或者基因構(gòu)建體是摻入到質(zhì)粒pThy1-mmTaar1中的Thy1-mmTAAR1，其中所述質(zhì)粒pThy1-mmTaar1的保藏號(hào)為DSM 17760(根據(jù)布達(dá)佩斯條約保藏于德意志微生物保藏中心(Deutsche Sammlung von Microorganismen und Zellkulturen GmbH(DSMZ)，具有2005年11月30日的有效保藏日期)。
本發(fā)明還提供了產(chǎn)生其基因組包含編碼TAAR1的轉(zhuǎn)基因DNA的轉(zhuǎn)基因非人動(dòng)物的方法，包括a)將上述基因構(gòu)建體引入非人合子或非人胚胎干細(xì)胞，b)從所述合子或胚胎干細(xì)胞生成轉(zhuǎn)基因非人動(dòng)物，并且從而c)產(chǎn)生其基因組包含編碼TAAR1的轉(zhuǎn)基因DNA的轉(zhuǎn)基因非人動(dòng)物。
本發(fā)明另外的實(shí)施方案提供了產(chǎn)生表達(dá)轉(zhuǎn)基因TAAR1的非人轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的方法，包括a)將上述基因構(gòu)建體引入非人合子或非人胚胎干細(xì)胞，b)從所述合子或胚胎干細(xì)胞生成轉(zhuǎn)基因非人動(dòng)物，并且從而c)產(chǎn)生表達(dá)轉(zhuǎn)基因TAAR1的轉(zhuǎn)基因非人動(dòng)物。
合子或胚胎干細(xì)胞可以來(lái)自任何非人動(dòng)物。優(yōu)選的，合子或胚胎干細(xì)胞來(lái)自嚙齒類(lèi)動(dòng)物。更優(yōu)選的，合子或胚胎干細(xì)胞來(lái)自小鼠。
優(yōu)選的，上述方法中所用的合子是C57BL/6J合子。還可以在本發(fā)明的方法中用到的本領(lǐng)域中所用的合子包括，但不限于，CBA/合子、BALB/c合子、DBA/2合子和SV129合子。
還可以在本發(fā)明的方法中用到的本領(lǐng)域中所用的胚胎干細(xì)胞包括但不限于來(lái)自小鼠品系如C57BL/6、CBA/、BALB/c、DBA/2和SV129的胚胎干細(xì)胞。優(yōu)選的，使用來(lái)自C57BL/6小鼠的胚胎干細(xì)胞(Seong，E等人(2004)Trends Genet.20，59-62；Wolfer，D.P.等人，Trends Neurosci.25(2002)336-340)。
本發(fā)明另外提供了通過(guò)任何上述方法產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因非人動(dòng)物。
本文用到的術(shù)語(yǔ)“轉(zhuǎn)基因TAAR1”描述了源自人工引入和摻入到生物中的DNA的TAAR1蛋白質(zhì)。
本文用到的術(shù)語(yǔ)“轉(zhuǎn)基因動(dòng)物”描述了在其基因組中包含轉(zhuǎn)基因DNA的動(dòng)物?？梢詫⑦@一轉(zhuǎn)基因DNA摻入到基因組的某處。
例如，轉(zhuǎn)基因動(dòng)物可以如下生成通過(guò)向合子的前核中注射上述DNA構(gòu)建體，將這些注射后的合子轉(zhuǎn)移到假孕的代孕母親中，繁殖由卵母細(xì)胞產(chǎn)生的建立者動(dòng)物到野生型動(dòng)物，測(cè)試由這些繁殖產(chǎn)生的后代中合成的DNA轉(zhuǎn)基因構(gòu)建體的存在，繁殖半合子動(dòng)物，任選地生成純合轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。
備選地，轉(zhuǎn)基因動(dòng)物可以如下生成通過(guò)向胚胎干細(xì)胞中引入上述基因構(gòu)建體并且隨后選擇在基因組中存在轉(zhuǎn)基因的胚胎干細(xì)胞克隆，證明在轉(zhuǎn)化的胚胎干細(xì)胞克隆中存在轉(zhuǎn)基因，將經(jīng)證實(shí)的重組胚胎干細(xì)胞注射到野生型動(dòng)物的胚泡中，轉(zhuǎn)移這些注射的胚泡到假孕的代孕母親中，繁殖由胚泡產(chǎn)生的嵌合體到野生型動(dòng)物，測(cè)試這些繁殖產(chǎn)生的后代中轉(zhuǎn)基因的存在，繁殖半合子動(dòng)物，任選地生成純合轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，提供了其基因組包含編碼TAAR1的轉(zhuǎn)基因DNA的轉(zhuǎn)基因非人動(dòng)物。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)基因非人動(dòng)物包含在
圖1中所描述的基因構(gòu)建體或在圖2中所描述的基因構(gòu)建體。
在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)基因非人動(dòng)物包含摻入到質(zhì)粒pThy1-hsTARR1中的基因構(gòu)建體Thy1-hsTAAR1，其中所述質(zhì)粒pThy1-hsTARR1的保藏號(hào)為DSM 17761(根據(jù)布達(dá)佩斯條約保藏于德意志微生物保藏中心(Deutsche Sammlung von Microorganismen undZellkulturen GmbH(DSMZ)，具有2005年11月30日的有效保藏日期)，或者包含摻入到質(zhì)粒pThy1-mmTaar1中的基因構(gòu)建體Thy1-mmTAAR1，其中所述質(zhì)粒pThy1-mmTaar1的保藏號(hào)為DSM 17760(根據(jù)布達(dá)佩斯條約保藏于德意志微生物保藏中心(Deutsche Sammlung vonMicroorganismen und Zellkulturen GmbH(DSMZ)，具有2005年11月30日的有效保藏日期)。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了表達(dá)轉(zhuǎn)基因TAAR1的轉(zhuǎn)基因非人動(dòng)物。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)基因TAAR1以組織特異性的方式表達(dá)，即在腦中。在另一實(shí)施方案中，可以時(shí)間性調(diào)控轉(zhuǎn)基因TAAR1的表達(dá)，例如通過(guò)添加特定的誘導(dǎo)物質(zhì)或阻抑物質(zhì)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)基因非人動(dòng)物過(guò)量表達(dá)轉(zhuǎn)基因TAAR1蛋白質(zhì)。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)基因TAAR1以組織特異性方式過(guò)量表達(dá)。
轉(zhuǎn)基因非人動(dòng)物可以是本領(lǐng)域已知的任何非人動(dòng)物，它們可以用于本發(fā)明的方法。優(yōu)選的，轉(zhuǎn)基因非人動(dòng)物是哺乳動(dòng)物，更優(yōu)選的，轉(zhuǎn)基因非人動(dòng)物是嚙齒類(lèi)動(dòng)物。最優(yōu)選的，本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物是小鼠。
上述轉(zhuǎn)基因非人動(dòng)物可以用基因分析、分子分析和行為分析。
本發(fā)明還涉及本發(fā)明所提供的轉(zhuǎn)基因非人動(dòng)物的后代，其通過(guò)與相同的或與另一基因型繁殖得到。后代在本文中用作子代的同義詞。
轉(zhuǎn)基因動(dòng)物可以用于制備原代細(xì)胞培養(yǎng)物，以及用于制備來(lái)自這些動(dòng)物或其后代的原代細(xì)胞制品的次級(jí)細(xì)胞系。另外，轉(zhuǎn)基因動(dòng)物可以用于制備組織或器官型腦切片培養(yǎng)物。此外，轉(zhuǎn)基因動(dòng)物可以用于制備組織外植體或器官外植體或其培養(yǎng)物。另外，轉(zhuǎn)基因動(dòng)物可以用于制備組織提取物或細(xì)胞提取物如膜或突觸小體制品。
本發(fā)明另外提供了來(lái)自本發(fā)明提供的轉(zhuǎn)基因非人動(dòng)物或其后代的細(xì)胞系或原代細(xì)胞培養(yǎng)物。
另外，本發(fā)明提供了來(lái)自本發(fā)明提供的轉(zhuǎn)基因非人動(dòng)物或其后代的組織或器官型腦切片培養(yǎng)物。
另外，本發(fā)明提供了來(lái)自本發(fā)明提供的轉(zhuǎn)基因非人動(dòng)物或其后代的組織外植體或器官外植體或其培養(yǎng)物。
此外，本發(fā)明提供了來(lái)自本發(fā)明提供的轉(zhuǎn)基因非人動(dòng)物或其后代的組織提取物或細(xì)胞提取物。
基于細(xì)胞培養(yǎng)物的模型可以通過(guò)兩種方法制備。細(xì)胞培養(yǎng)物可以從非人轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中分離或按照標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞轉(zhuǎn)染技術(shù)應(yīng)用上述同樣的基因構(gòu)建體從確立的細(xì)胞培養(yǎng)物制備。
包含編碼TAAR1的轉(zhuǎn)基因DNA的基因構(gòu)建體的整合可以通過(guò)多種方法檢測(cè)，方法包括基因組的Sounthern印跡和用自動(dòng)物的組織活組織檢查中分離的DNA進(jìn)行PCR分析。
很顯然對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，有大量的分析方法可以用于檢測(cè)轉(zhuǎn)基因DNA的表達(dá)，包括在RNA水平的方法和在蛋白質(zhì)水平的方法，其中所述RNA水平的方法包括通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄酶聚合酶鏈反應(yīng)或通過(guò)Northern印跡的mRNA定量、原位雜交；其中所述蛋白質(zhì)水平的方法包括組織化學(xué)、免疫印跡分析和結(jié)合研究。此外，轉(zhuǎn)基因表達(dá)水平的定量可以進(jìn)一步通過(guò)對(duì)本領(lǐng)域這些熟知的人員來(lái)說(shuō)常規(guī)的ELISA技術(shù)測(cè)定。
定量測(cè)量可以用多種標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定法實(shí)現(xiàn)。例如，轉(zhuǎn)錄水平可以用RT-PCR和雜交方法測(cè)定，包括RNA酶保護(hù)、Northern印跡分析和RNA點(diǎn)漬法分析。蛋白質(zhì)水平可以通過(guò)ELISA、Western印跡分析以及通過(guò)對(duì)比免疫組織化學(xué)或組織化學(xué)染色的組織切片測(cè)定。免疫組織化學(xué)染色、酶促組織化學(xué)染色以及免疫電鏡術(shù)也可用于評(píng)定內(nèi)源的以及過(guò)量表達(dá)的TAAR1蛋白質(zhì)的組織分布。
本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物可以另外通過(guò)本領(lǐng)域已知的方法描述特征，方法包括免疫組織化學(xué)、電鏡術(shù)、磁共振成像(MRI)、正電子發(fā)射斷層照相術(shù)(PET)以及通過(guò)描述神經(jīng)功能、感覺(jué)功能和認(rèn)知功能以及生理(如代謝)參數(shù)的行為研究和生理研究。行為測(cè)試和生理檢查的實(shí)例是自發(fā)性行為、涉及認(rèn)知功能的行為、經(jīng)藥物損害所致的行為、握力試驗(yàn)、水平金屬線(xiàn)試驗(yàn)、強(qiáng)迫游泳試驗(yàn)、旋轉(zhuǎn)棒試驗(yàn)、活動(dòng)能力試驗(yàn)、前脈沖抑制試驗(yàn)、莫瑞斯水迷宮試驗(yàn)、Y-迷宮試驗(yàn)、光暗偏好試驗(yàn)、被動(dòng)和主動(dòng)躲避試驗(yàn)、埋石試驗(yàn)、十字迷宮試驗(yàn)、習(xí)得性無(wú)助試驗(yàn)、應(yīng)激誘導(dǎo)性體溫過(guò)高、測(cè)量經(jīng)過(guò)一段時(shí)間的食物消耗和體重發(fā)育、測(cè)量休息和基礎(chǔ)條件下以及在熱暴露和冷暴露期間的體溫和能量消耗、測(cè)定中性溫度帶、測(cè)定食物的同化系數(shù)(例如通過(guò)彈式熱量測(cè)量法)、測(cè)定能量消耗以及糞便中的能量含量、測(cè)定呼吸系數(shù)例如對(duì)于糖和脂代謝的分析、測(cè)定食物受限期間底物利用和能量消耗，例如通過(guò)間接測(cè)熱法測(cè)定氧耗、CO2和熱產(chǎn)生；測(cè)量靜息條件、基礎(chǔ)條件和應(yīng)激條件下的心率和血壓(例如通過(guò)遠(yuǎn)程遙測(cè))、測(cè)定身體成分(例如關(guān)于水含量、脂肪量和游離脂肪量)。
本發(fā)明另外的目標(biāo)是非人轉(zhuǎn)基因動(dòng)物、來(lái)自本發(fā)明所提供的轉(zhuǎn)基因非人動(dòng)物或其后代的細(xì)胞系或原代細(xì)胞培養(yǎng)物、組織或器官型腦切片培養(yǎng)物、組織外植體或器官外植體或其培養(yǎng)物、組織提取物或細(xì)胞提取物作為模型的用途，用于鑒定和檢驗(yàn)化合物在如下疾病中的治療效果抑郁癥、焦慮癥、雙目性精神障礙、注意力缺陷多動(dòng)癥、應(yīng)激相關(guān)性疾病如創(chuàng)傷后精神緊張性精神障礙、精神障礙例如精神分裂癥、神經(jīng)疾病例如帕金森病、神經(jīng)變性疾病如阿爾茨海默病、癲癇、偏頭痛、高血壓、精神活性物濫用和代謝障礙如進(jìn)食障礙、糖尿病、糖尿病并發(fā)癥、肥胖癥、血脂異常、能量消耗和同化作用的障礙和體溫穩(wěn)態(tài)障礙和機(jī)能不良、睡眠和晝夜節(jié)律障礙和心血管病癥。
此外，本發(fā)明提供了非人轉(zhuǎn)基因動(dòng)物、來(lái)自本發(fā)明所提供的轉(zhuǎn)基因非人動(dòng)物或其后代的細(xì)胞系或原代細(xì)胞培養(yǎng)物、組織或器官型腦切片培養(yǎng)物、組織外植體或器官外植體或其培養(yǎng)物、組織提取物或細(xì)胞提取物作為模型的用途，用來(lái)研究對(duì)誘發(fā)下述疾病的化合物的易感性，所述疾病包括抑郁癥、焦慮癥、雙相性精神障礙、注意力缺陷多動(dòng)癥、應(yīng)激相關(guān)性疾病如創(chuàng)傷后精神緊張性精神障礙、精神障礙例如精神分裂癥、神經(jīng)疾病例如帕金森病、癲癇、偏頭痛、高血壓、精神活性物濫用和代謝障礙如進(jìn)食障礙、糖尿病、糖尿病并發(fā)癥、肥胖癥、血脂異常、能量消耗和同化作用的障礙和體溫穩(wěn)態(tài)障礙和機(jī)能不良、睡眠和晝夜節(jié)律障礙和心血管病癥。
本發(fā)明另外的目標(biāo)是非人轉(zhuǎn)基因動(dòng)物、來(lái)自本發(fā)明所提供的轉(zhuǎn)基因非人動(dòng)物或其后代的細(xì)胞系或原代細(xì)胞培養(yǎng)物、組織或器官型腦切片培養(yǎng)物、組織外植體或器官外植體或其培養(yǎng)物、組織提取物或細(xì)胞提取物的用途，作為工具評(píng)定TAAR1功能。
另外，本發(fā)明提供了非人轉(zhuǎn)基因動(dòng)物、來(lái)自本發(fā)明所提供的轉(zhuǎn)基因非人動(dòng)物或其后代的細(xì)胞系或原代細(xì)胞培養(yǎng)物、組織或器官型腦切片培養(yǎng)物、組織外植體或器官外植體或其培養(yǎng)物、組織提取物或細(xì)胞提取物的用途，作為工具鑒定TAAR1的未知配體和它們的特征描述。
此外，本發(fā)明提供了非人轉(zhuǎn)基因動(dòng)物、來(lái)自本發(fā)明所提供的轉(zhuǎn)基因非人動(dòng)物或其后代的細(xì)胞系或原代細(xì)胞培養(yǎng)物、組織或器官型腦切片培養(yǎng)物、組織外植體或器官外植體或其培養(yǎng)物、組織提取物或細(xì)胞提取物的用途，作為工具確定作用于TAAR1的化合物的特異性。
本發(fā)明另外的目標(biāo)是非人轉(zhuǎn)基因動(dòng)物、來(lái)自本發(fā)明所提供的轉(zhuǎn)基因非人動(dòng)物或其后代的細(xì)胞系或原代細(xì)胞培養(yǎng)物、組織或器官型腦切片培養(yǎng)物、組織外植體或器官外植體或其培養(yǎng)物、組織提取物或細(xì)胞提取物的用途，用來(lái)研究TAARs或其他與TAARs相關(guān)聯(lián)的細(xì)胞成分的胞內(nèi)運(yùn)輸。
本發(fā)明還提供了基本如前描述的尤其是參照后述實(shí)施例的基因構(gòu)建體、方法、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物、測(cè)試系統(tǒng)以及用途。
已經(jīng)總體上描述了本發(fā)明，將通過(guò)參考特定的實(shí)施例更好的理解上述內(nèi)容，除非另外明確說(shuō)明，在此引入的實(shí)施例及隨后的圖僅用于解釋說(shuō)明的目的，并不旨在限制本發(fā)明。
附圖簡(jiǎn)述
圖1顯示了摻入到質(zhì)粒pThy1-hsTAAR1(未顯示)中的基因構(gòu)建體huTAAR-TG的圖示。Thy1基因的調(diào)控區(qū)用來(lái)調(diào)控人TAAR1 cDNA在腦中的表達(dá)。
AThy1基因的6.8kb調(diào)控區(qū)，其中用XhoI克隆位點(diǎn)替換了位于外顯子2和4上的1.5kbp BanI-XhoI片段從而刪除了外顯子3。Thy1基因的現(xiàn)在的外顯子(外顯子1、外顯子2、外顯子4)用黑色標(biāo)示。
B應(yīng)用Thy1基因中的XhoI位點(diǎn)插入包含人TAAR1 cDNA的XhoI片段(hsTAAR1，白色)。人TAAR1 cDNA與N端標(biāo)記(FLAG，陰影線(xiàn))融合。
C將N端標(biāo)記顯示為核苷酸序列并且顯示為它們到單字母氨基酸碼的翻譯。Kozak序列(小寫(xiě)字母)隨后接著流感血凝素病毒的信號(hào)序列(大寫(xiě)字母)、FLAG表位標(biāo)記(大寫(xiě)字母，加下劃線(xiàn))和Met-Gly接頭(大寫(xiě)字母，斜體)。
圖2顯示了摻入到質(zhì)粒pThy1-mmTaar1(未顯示)中的mmTAAR-TG構(gòu)建體的圖示。Thy1基因的調(diào)控區(qū)用于調(diào)控人Taar1 cDNA在腦中的表達(dá)。
AThy1基因的6.8kb調(diào)控區(qū)，其中用XhoI克隆位點(diǎn)替換了位于外顯子2和4上的1.5kbp BanI-XhoI片段從而刪除了外顯子3。Thy1基因現(xiàn)在的外顯子(外顯子1、外顯子2、外顯子4)用黑色標(biāo)示。
BThy1基因的XhoI位點(diǎn)用來(lái)插入包含人Taar1 cDNA的XhoI片段(hsTaar1，白色)。人Taar1 cDNA與N端標(biāo)記(FLAG，陰影線(xiàn))融合。
CN端標(biāo)記顯示為核苷酸序列并且顯示為它們到單字母氨基酸碼的翻譯。Kozak序列(小寫(xiě)字母)隨后接著流感血凝素病毒的信號(hào)序列(大寫(xiě)字母)、FLAG表位標(biāo)記(大寫(xiě)字母，加下劃線(xiàn))和Met-Gly接頭(大寫(xiě)字母，斜體)。
圖3顯示了通過(guò)PCR方法對(duì)轉(zhuǎn)基因品系和B6-Tg(TAAR1)1和B6-Tg(Taar1)2的基因型分型。對(duì)DNA分析了轉(zhuǎn)基因的存在，表明動(dòng)物的各自基因型。標(biāo)記物XIV(Roche)用作分子量標(biāo)準(zhǔn)。
AB6-Tg(Taar1)2PCR反應(yīng)的溴化乙啶染色瓊脂糖凝膠以檢測(cè)小鼠的尾部活組織檢查中Thy1-mmTaar1序列的存在。
M標(biāo)記物XIV，1小鼠活組織檢查9；2小鼠活組織檢查10；3陽(yáng)性對(duì)照；4陰性對(duì)照。
BB6-Tg(TAAR1)1PCR反應(yīng)的溴化乙啶染色瓊脂糖凝膠以檢測(cè)小鼠的尾部活組織檢查中Thy1-hsTaar1序列的存在。
M標(biāo)記物XIV，1小鼠活組織檢查34；2小鼠活組織檢查35；3陽(yáng)性對(duì)照；4陰性對(duì)照。
實(shí)施例除非另外明確說(shuō)明，在實(shí)施例中涉及的可商購(gòu)的試劑按照制造商的說(shuō)明書(shū)應(yīng)用。
實(shí)施例1pThy1-hsTAAR1和pThy1-mmTaar1質(zhì)粒構(gòu)建體的構(gòu)建cDNA序列的PCR擴(kuò)增基于公開(kāi)的小鼠TAAR1編碼序列(Genbank登錄號(hào)NM_053205，SEQ.ID NO2)或人TAAR1編碼序列(Genbank登錄號(hào)NM_138327，SEQ.ID NO1)或基于p Thy1-hsTAAR1和pThy1-mmTaar1質(zhì)粒的其他元件來(lái)設(shè)計(jì)寡核苷酸并且從Microsynth AG(Balgach，瑞士)得到它們。所有的分子克隆技術(shù)基本根據(jù)Sambrook等人(分子克隆A laboratorymanual.1989，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold SpringHarbor.)以及試劑盒和酶的供應(yīng)商的說(shuō)明書(shū)來(lái)實(shí)施。
人(hsTAAR1)和小鼠(mmTaar1)的編碼序列通過(guò)PCR從基因組C57BL/6 DNA(mmTaar1)或克隆的編碼序列pcDNA3.1-humTar01(hsTAAR1)擴(kuò)增。
將5’-寡核苷酸hTar1-tg-3c(SEQ.ID NO21)和mTar1-tg-1c(SEQ.ID NO27)設(shè)計(jì)以包含XhoI位點(diǎn)、Kozak序列、編碼流感血凝素病毒的信號(hào)序列的序列、FLAG表位標(biāo)記和Met-Gly接頭(
圖1C，圖2C)。3’-寡核苷酸hTar1-tg-4nc(SEQ.ID NO22)和mTar1-tg-2nc(SEQ.IDNO28)緊接著中止密碼子的下游引入了XhoI位點(diǎn)。
·hsTAAR1-PCR擴(kuò)增0.5ng/μl模板DNA(pcDNA3.1-humTar01)，300μM dNTPs(PCR核苷酸混合物，Roche Diagnostics，Mannheim，德國(guó))，1μM寡核苷酸huTar1-tg-3c，1μM寡核苷酸huTar1-tg-4nc，1x PCR緩沖液3(Expand高保真PCR系統(tǒng)(Expand High Fidelity PCR System)的部分；RocheDiagnostics，Mannheim，德國(guó))，0.075U/μl Expand聚合酶混合物(Expand高保真PCR系統(tǒng)的部分；Roche Diagnostics，Mannheim，德國(guó))在總體積20μl中，按照下列方法進(jìn)行溫育94℃2分鐘，10×(94℃10秒，60℃30秒，68℃2分鐘)，20×(94℃10秒，60℃30秒68℃2分鐘+15秒/循環(huán))68℃7分鐘，∞12℃，反應(yīng)在PCR循環(huán)變溫器MJ Research PTC-200(MJResearch Inc.，Watertown，美國(guó))中進(jìn)行。
·mm Taar1-PCR擴(kuò)增0.5ng/μl模板DNA(基因組C57BL/6 DNA)，300μM dNTP(PCR核苷酸混合物，Roche Diagnostics，Mannheim，德國(guó))，1μM寡核苷酸mTar1-tg-1c，1μM寡核苷酸mTar1-tg-2nc，1x PCR緩沖液3(Expand高保真PCR系統(tǒng)的部分；Roche Diagnostics，Mannheim，德國(guó))，0.075U/μl Expand聚合酶混合物(Expand高保真PCR系統(tǒng)的部分；Roche Diagnostics，Mannheim，德國(guó))在總體積20μl中按照下列方法進(jìn)行溫育94℃2分鐘，10×(94℃10秒，60℃30秒，68℃2分鐘)，20×(94℃10秒，60℃30秒，68℃2分鐘+15秒/循環(huán))68℃7分鐘，∞12℃。反應(yīng)在PCR循環(huán)變溫器MJ ResearchPTC-200(MJ Research Inc.，Watertown，美國(guó))中進(jìn)行。
克隆到克隆載體pCMV中得到的1.1kb PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳分離后用Strata PrepPCR純化試劑盒(Stratagene，La Jolla，CA，美國(guó))純化。之后根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)將純化的PCR產(chǎn)物亞克隆到pCMV PCR克隆試劑盒(Invitrogen-Gibco，Carlsbad，CA，美國(guó))的pCMVScript載體的SrfI位點(diǎn)中。得到的載體是pCMV-mmTaar1和pCMV-hsTAAR1。
應(yīng)用BigDye Termiuator v1.1循環(huán)測(cè)序試劑盒(Applied Biosystems)和ABIPrism 310基因分析器，用在表1中描述的寡核苷酸測(cè)序確定方向和序列
表1pCMV-mmTaar1和pCMV-hsTAAR1的測(cè)序反應(yīng)。
手工編輯了SEQ.ID.NO5-10的序列并且省略了pCMV的載體序列?？梢詫⑺鼈儏R編起來(lái)以證實(shí)pCMV-hsTAAR1載體(SEQ.ID NO3)的正確序列。
手工編輯了SEQ.ID.NO11-16的序列并且省略了pCMV的載體序列。可以將它們匯編起來(lái)以證實(shí)pCMV-mmTaar1載體(SEQ.ID NO4)的正確序列。
克隆到pThy載體中載體pCMV-mmTaar1和pCMV-hsTAAR1分別用于生成pThy1-mmTaar1和pThy1-hsTAAR1載體。為此目的，將pCMV-mmTaar1和pCMV-hsTAAR1用XhoI消化并且將得到的包含Taar1編碼序列的1.1kb片段從瓊脂糖凝膠中純化。隨后將其連接進(jìn)用限制性酶XhoI打開(kāi)的載體pThy1中(
圖1A；圖2A；Richards，J.G.，Higgins，G.A.，Ouagazzal，A.M.，Ozmen，L.，Kew，J.N.，Bohrmann，B.，Malherbe，P.，Brockhaus，M.，Loetscher，H.，Czech，C.，Huber，G.，Bluethmann，H.，Jacobsen，H.和Kemp，J.A.(2003)J.Neurosci.23(26)，8989-9003)。
用Thy1-2c(SEQ.ID NO31)和限制性消化物通過(guò)測(cè)序來(lái)證實(shí)得到的載體pThy1-mmTaar1和pThy1-hsTAAR1。
保藏?cái)?shù)據(jù)包含基因構(gòu)建體pThy1-mmTaar1的質(zhì)粒根據(jù)布達(dá)佩斯條約保藏于德意志微生物保藏中心(Deutsche Sammlung vonMicroorganismen und Zellkulturen GmbH(DSMZ)，Mascheroder Weg 1b，D-38124 Braunschweig，德國(guó)，有效保藏日期為2005年11月30日，保藏號(hào)為DSM 17760。
包含基因構(gòu)建體pThy1-hsTAAR1的質(zhì)粒根據(jù)布達(dá)佩斯條約保藏于德意志微生物保藏中心(Deutsche Sammlung von Microorganismen undZellkulturen GmbH(DSMZ)，Mascheroder Weg 1 b，D-38124Braunschweig，德國(guó)，有效保藏日期為2005年11月30日，保藏號(hào)為DSM17761。
實(shí)施例2生成轉(zhuǎn)基因小鼠品系B6-Tg(TAAR1)1和B6-Tg(Taar1)2所有動(dòng)物的處理遵從瑞士聯(lián)邦和州的有關(guān)動(dòng)物研究的法律實(shí)施。由Kantonale Veterinramt of Basel City以Tierversuchgenehmigung No.192特別授予了生成和處理突變小鼠品系的許可。
質(zhì)粒pThy1-mmTaar1和pThy1-hsTAAR1用NotI和PvuI消化，隨后凝膠純化包含Thy1啟動(dòng)子和Taar1序列的7.6kb片段。將pThy1-mmTaar1和pThy1-hsTAAR1的這些片段注射入受精的C57BL/6卵母細(xì)胞的前核中，隨后將卵母細(xì)胞轉(zhuǎn)移到假孕的代孕母鼠的輸卵管中，上述操作基本按照在(Gene Targeting.1999，Second Edition，The PracticalApproach Series，Oxford University Press，New York)和Hogan，B.，Beddington，R.，Costantini，F(xiàn).，und Lacy，E.(Manipulating the mouseembryo.1994，Second Edition，Cold Spring Harbor Press，Cold SpringHarbor)中所描述的。將代孕母鼠提供的后代作為建立者動(dòng)物并且分析其基因組中各自的轉(zhuǎn)基因的存在。
為此目的，將基因組DNA使用用于核酸純化的MagNAPure LC系統(tǒng)(Roche Applied Science，Rotkreuz，瑞士)根據(jù)制造商的說(shuō)明書(shū)從成年動(dòng)物的尾部活組織檢查中分離出來(lái)并且用PCR分析TAAR1轉(zhuǎn)基因的存在。
將在其基因組中包含基因構(gòu)建體“Thy1-hsTAAR1”的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物稱(chēng)為B6-Tg(TAAR1)1，并且將在其基因組中包含基因構(gòu)建體“Thy1-mmTaar1”的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物稱(chēng)為B6-Tg(Taar1)2。
·B6-Tg(TAAR1)1的基因型分型0.5ng/μl尾部活組織檢查DNA，200μM dNTP(PCR核苷酸混合物，Roche Diagnostics，Mannheim，德國(guó))，1μM寡核苷酸Thy1-2c(SEQ.ID.NO31)，1μM寡核苷酸huTar1-757-n(SEQ.ID NO20)c，1x PCR反應(yīng)緩沖液(Roche Diagnostics，Mannheim，德國(guó))，0.05U/μl Taq DNA聚合酶(Roche Diagnostics，Mannheim，德國(guó))在總體積20μl中按照下列方法進(jìn)行溫育94℃2分鐘，30x(94℃20秒，60℃30秒，72℃50秒)72℃7分鐘，∞12℃。反應(yīng)在PCR循環(huán)變溫器MJ Research PTC-200(MJ Research Inc.，Watertown，美國(guó))中進(jìn)行。
·B6-Tg(Taar1)2的基因型分型0.5ng/μl尾部活組織檢查DNA，200μM dNTP(PCR核苷酸混合物，Roche Diagnostics，Mannheim，德國(guó))，1μM寡核苷酸maTar1-293-c，1μM寡核苷酸Thy1-5-nc(SEQ.ID NO32)，1x PCR反應(yīng)緩沖液(RocheDiagnostics，Mannheim，德國(guó))，0.05U/μl Taq DNA聚合酶(RocheDiagnostics，Mannheim，德國(guó))在總體積20μl中按照下列方法進(jìn)行溫育94℃2分鐘，30x(94℃20秒，64℃30秒，72℃50秒)72℃7分鐘，∞12℃，反應(yīng)在PCR循環(huán)變溫器MJ Research PTC-200(MJ Research Inc.，Watertown，美國(guó))中進(jìn)行。
PCR產(chǎn)物按照在Sambrook等人(1989)中所描述的標(biāo)準(zhǔn)瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分析。見(jiàn)基因型分型的實(shí)例圖3。
鑒別了三個(gè)具有人TAAR1構(gòu)建體插入的建立者，將其表示為B6-Tg(TAAR1)1.6、B6-Tg(TAAR1)1.7和B6-Tg(TAAR1)1.29。
鑒別了三個(gè)具有鼠的Taar1構(gòu)建體插入的建立者，將其表示為B6-Tg(Taar1)2.15、B6-Tg(Taar1)2.19和B6-Tg(Taar1)2.27。
在轉(zhuǎn)基因小鼠品系B6-Tg(TAAR1)1和B6-Tg(Taar1)2的腦區(qū)域中分別對(duì)人TAAR1和小鼠TAAR1表達(dá)的半定量分析。
測(cè)試經(jīng)鑒定的建立者B6-Tg(TAAR1)1.6、B6-Tg(TAAR1)1.7和B6-Tg(TAAR1)1.29的后代中由構(gòu)建體Thy1-hsTAAR1編碼的mRNA的表達(dá)。測(cè)試經(jīng)鑒定的建立者B6-Tg(Taar1)2.15、B6-Tg(Taar1)2.19和B6-Tg(Taar1)2.27的后代中由構(gòu)建體Thy1-mm(Taar1)編碼的mRNA的表達(dá)。
應(yīng)用實(shí)時(shí)PCR測(cè)定法來(lái)測(cè)試構(gòu)建體Thy1-mm(Taar1)和Thy1-hsTAAR1的表達(dá)。為此目的，分離小鼠腦的總RNA，轉(zhuǎn)錄成cDNA并且用實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)，實(shí)時(shí)PCR用對(duì)兩種構(gòu)建體共同的合成N端標(biāo)記特異的引物和探針的組合物(
圖1C，圖2C)。
基本根據(jù)Chomczynski和Sacchi(Single-step method of RNA isolationby acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction，Anal.Biochem.162(1987)156-159)所述從組織樣品中制備RNA。簡(jiǎn)而言之，處死6-8周齡小鼠，移取全部的腦并且將其用設(shè)置為6次20秒的Fast PrepFP120組織勻漿器(Savant Instruments，Inc.，Holbrook，N.Y.)在LysingMatrix D管中在10×體積的Trizol試劑(Invitrogen，Paisley，英國(guó))中勻漿。勻漿物用1/5體積的氯仿提取并且隨后用2體積的異丙醇沉淀。用80％的乙醇清洗沉淀的總RNA并且將其溶解在DEPC-H2O中。100μg總RNA進(jìn)一步用RNeasy Mini試劑盒(Qiagen，Hilden，德國(guó))的用于RNA純化的RNeasy Mini方法純化，方法包括用無(wú)RNA酶的DNase組(Qiagen，Hilden，德國(guó))在柱上的DNA酶消化。
根據(jù)制造商的說(shuō)明書(shū)應(yīng)用Omniscript Reverse Transkription試劑盒(Qiagen，Hilden，德國(guó))用于cDNA合成。簡(jiǎn)而言之，2μg總RNA與1μMoligo(dT)15(Roche Diagnostics，Mannheim，德國(guó))混合，0.5mM每種dNTP(PCR核苷酸混合物，Roche Diagnostics，Mannheim，Germany)，1x緩沖液RT(Qiagen，Hilden，德國(guó))，10U RNA酶抑制劑(RocheDiagnostics，Mannheim，德國(guó))，1μl Omniscript Reverse Transcriptase(Qiagen，Hilden，Germany)在總體積20μl中。反應(yīng)混合物在37℃溫育1小時(shí)。
根據(jù)Quantitect Gene Expression Assay Handbook(Qiagen，Hilden，德國(guó))，應(yīng)用用戶(hù)設(shè)計(jì)的Quantitect基因表達(dá)測(cè)定實(shí)施實(shí)時(shí)PCR。設(shè)計(jì)了轉(zhuǎn)基因特異性的Quantitect用戶(hù)測(cè)定來(lái)檢測(cè)合成的N端標(biāo)記，它由正向引物(SEQ.ID NO33)、反向引物(SEQ.ID NO34)和FAM標(biāo)記的探針(SEQ.ID NO35)組成。應(yīng)用了針對(duì)管家基因鼠Arbp(酸性核糖體磷蛋白PO)的Yakima Yellow標(biāo)記的Quanti Tect內(nèi)源對(duì)照測(cè)定(Mm Arbp 1YY Quantitect Gene Expression Assay，Qiagen，Hilden，德國(guó))作為對(duì)照。10μl Quanti Tect Probe PCR Master混合物，2μl Quantitect測(cè)定混合物和2μl cDNA在DNA Engine Opticon 2(MJ Research Inc.，Watertown，USA)上裝配在白色反應(yīng)板中(MJ Research Inc.，Watertown，美國(guó))，并且進(jìn)行具有下述溫度步驟的實(shí)時(shí)PCR95℃15分鐘，45x(94℃15秒，56℃30秒，76℃30秒)。用Opticon monitor軟件(MJ Research Inc.，Watertown，美國(guó))計(jì)算C(T)值。
在表2中總結(jié)了一個(gè)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。在此實(shí)驗(yàn)中，處死每種品系B6-Tg(TAAR1)1.6、B6-Tg(TAAR1)1.7、B6-Tg(TAAR1)1.29、B6-Tg(Taar1)2.15、B6-Tg(Taar1)2.19和B6-Tg(Taar1)2.27中的兩只小鼠和兩只野生型小鼠，按照上述產(chǎn)生cDNA并且對(duì)每只小鼠用轉(zhuǎn)基因特異性的Quantitect測(cè)定(Qiagen，Hilden，德國(guó))運(yùn)行2個(gè)PCR反應(yīng)，以及作為對(duì)照用Arbp特異性的Quantitect測(cè)定對(duì)每只小鼠運(yùn)行一個(gè)PCR反應(yīng)(見(jiàn)表2)。
對(duì)于來(lái)自野生型的未加入逆轉(zhuǎn)錄酶的對(duì)照反應(yīng)以及水對(duì)照，得到的C(T)接近或低于檢測(cè)的閾值(表2)。另一方面，因?yàn)槠銫(T)值在質(zhì)粒陽(yáng)性對(duì)照的范圍內(nèi)，所以品系B6-Tg(TAAR1)1.7、B6-Tg(TAAR1)1.29、B6-Tg(Taar1)2.19和B6-Tg(Taar1)2.27表達(dá)轉(zhuǎn)基因構(gòu)建體(表2)。
表2來(lái)自B6-Tg(TAAR1)1和B6-Tg(Taar1)2小鼠腦的cDNA的實(shí)時(shí)PCR分析的結(jié)果，用于檢測(cè)mRNA轉(zhuǎn)錄本的存在。(C(T)PCR循環(huán)數(shù)；nd未確定)。
序列表<110>弗·哈夫曼-拉羅切有限公司<120>TAAR1轉(zhuǎn)基因動(dòng)物<130>23400 EP<150>EP 05111699.4<151>2005-12-05<160>35<170>PatentIn版本3.3<210>1<211>1020<212>DNA<213>人(Homo sapiens)<400>1atgatgccct tttgccacaa tataattaat atttcctgtg tgaaaaacaa ctggtcaaat 60gatgtccgtg cttccctgta cagtttaatg gtgctcataa ttctgaccac actcgttggc 120aatctgatag ttattgtttc tatatcacac ttcaaacaac ttcatacccc aacaaattgg 180ctcattcatt ccatggccac tgtggacttt cttctggggt gtctggtcat gccttacagt 240atggtgagat ctgctgagca ctgttggtat tttggagaag tcttctgtaa aattcacaca 300agcaccgaca ttatgctgag ctcagcctcc attttccatt tgtctttcat ctccattgac 360cgctactatg ctgtgtgtga tccactgaga tataaagcca agatgaatat cttggttatt 420tgtgtgatga tcttcattag ttggagtgtc cctgctgttt ttgcatttgg aatgatcttt 480ctggagctaa acttcaaagg cgctgaagag atatattaca aacatgttca ctgcagagga 540ggttgctctg tcttctttag caaaatatct ggggtactga cctttatgac ttctttttat 600atacctggat ctattatgtt atgtgtctat tacagaatat atcttatcgc taaagaacag 660gcaagattaa ttagtgatgc caatcagaag ctccaaattg gattggaaat gaaaaatgga 720atttcacaaa gcaaagaaag gaaagctgtg aagacattgg ggattgtgat gggagttttc 780ctaatatgct ggtgcccttt ctttatctgt acagtcatgg acccttttct tcactacatt 840attccaccta ctttgaatga tgtattgatt tggtttggct acttgaactc tacatttaat 900ccaatggttt atgcattttt ctatccttgg tttagaaaag cactgaagat gatgctgttt 960ggtaaaattt tccaaaaaga ttcatccagg tgtaaattat ttttggaatt gagttcatag 1020<210>2<211>999<212>DNA<213>小家鼠(Mus musculus)<400>2atgcatcttt gccacgctat cacaaacatt tcccacagaa acagcgactg gtcaagagaa 60gtccaagctt ccctgtacag cttaatgtca ctcataatcc tggccactct ggttggcaac 120
ttaatagtaa taatttccat atcccatttc aagcaacttc atacacccac caactggctc 180cttcactcca tggccattgt cgactttctg ctgggctgtc tgataatgcc ctgcagcatg 240gtgagaactg ttgagcgctg ttggtatttt ggggaaatcc tctgtaaagt tcacaccagc 300accgatatca tgctgagctc cgcctccatt ttccacttag ctttcatttc cattgaccgc 360tactgtgctg tgtgtgaccc tttgagatac aaagccaaga tcaatatctc cactattctt 420gtgatgatcc tcgttagttg gagccttcct gctgtttatg catttgggat gatcttcctg 480gaactgaact taaaaggagt ggaagagctg tatcgcagtc aggtcagcga cctgggcggc 540tgttctccct tctttagtaa agtatctggg gtactggcgt tcatgacttc cttctatata 600cctggatctg ttatgttatt tgtttactat aggatatatt tcatagctaa aggacaagca 660aggtcaatca atcgtacgaa tgttcaagtt ggattggaag ggaaaagcca agcaccacaa 720agcaaggaaa caaaagccgc gaagacctta gggatcatgg tgggcgtttt cctcgtatgc 780tggtgcccgt tctttctctg cacggtcctg gaccctttcc tgggctatgt tatcccaccc 840tctctgaatg acgcactgta ttggtttggg tacttgaatt ctgccctcaa tccgatggtt 900tatgcctttt tctatccctg gttcagaaga gccttgaaga tggttctcct tggtaaaatt 960ttccaaaaag attcatctag gtctaagcta tttttgtaa 999<210>3<211>1116<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述包含與N端FLAG標(biāo)記融合的hsTAAR1 CDNA的基因構(gòu)建體Thy1-hsTAAR1的xhoI片段<400>3ctcgagtcca ccatgaagac gatcatcgcc ctgagctaca tcttctgcct ggtgttcgcc 60gactacaagg acgatgatga cgccatgggc atgatgccct tttgccacaa tataattaat 120atttcctgtg tgaaaaacaa ctggtcaaat gatgtccgtg cttccctgta cagtttaatg 180gtgctcataa ttctgaccac actcgttggc aatctgatag ttattgtttc tatatcacac 240ttcaaacaac ttcatacccc aacaaattgg ctcattcatt ccatggccac tgtggacttt 300cttctggggt gtctggtcat gccttacagt atggtgagat ctgctgagca ctgttggtat 360tttggagaag tcttctgtaa aattcacaca agcaccgaca ttatgctgag ctcagcctcc 420attttccatt tgtctttcat ctccattgac cgctactatg ctgtgtgtga tccactgaga 480tataaagcca agatgaatat cttggttatt tgtgtgatga tcttcattag ttggagtgtc 540cctgctgttt ttgcatttgg aatgatcttt ctggagctaa acttcaaagg cgctgaagag 600atatattaca aacatgttca ctgcagagga ggttgctctg tcttctttag caaaatatct 660ggggtactga cctttatgac ttctttttat atacctggat ctattatgtt atgtgtctat 720
tacagaatat atcttatcgc taaagaacag gcaagattaa ttagtgatgc caatcagaag780ctccaaattg gattggaaat gaaaaatgga atttcacaaa gcaaagaaag gaaagctgtg840aagacattgg ggattgtgat gggagttttc ctaatatgct ggtgcccttt ctttatctgt900acagtcatgg acccttttct tcactacatt attccaccta ctttgaatga tgtattgatt960tggtttggct acttgaactc tacatttaat ccaatggttt atgcattttt ctatccttgg 1020tttagaaaag cactgaagat gatgctgttt ggtaaaattt tccaaaaaga ttcatccagg 1080tgtaaattat ttttggaatt gagttcatag ctcgag 1116<210>4<211>1095<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述包含與N端FLAG標(biāo)記融合的mmTaar1 CDNA的基因構(gòu)建體Thy1-mmTaar1的XhoT片段<400>4ctcgagtcca ccatgaagac gatcatcgcc ctgagctaca tcttctgcct ggtgttcgcc 60gactacaagg acgatgatga cgccatgggc atgcatcttt gccacgctat cacaaacatt 120tcccacagaa acagcgactg gtcaagagaa gtccaagctt ccctgtacag cttaatgtca 180ctcataatcc tggccactct ggttggcaac ttaatagtaa taatttccat atcccatttc 240aagcaacttc atacacccac caactggctc cttcactcca tggccattgt cgactttctg 300ctgggctgtc tgataatgcc ctgcagcatg gtgagaactg ttgagcgctg ttggtatttt 360ggggaaatcc tctgtaaagt tcacaccagc accgatatca tgctgagctc cgcctccatt 420ttccacttag ctttcatttc cattgaccgc tactgtgctg tgtgtgaccc tttgagatac 480aaagccaaga tcaatatctc cactattctt gtgatgatcc tcgttagttg gagccttcct 540gctgtttatg catttgggat gatcttcctg gaactgaact taaaaggagt ggaagagctg 600tatcgcagtc aggtcagcga cctgggcggc tgttctccct tctttagtaa agtatctggg 660gtactggcgt tcatgacttc cttctatata cctggatctg ttatgttatt tgtttactat 720aggatatatt tcatagctaa aggacaagca aggtcaatca atcgtacgaa tgttcaagtt 780ggattggaag ggaaaagcca agcaccacaa agcaaggaaa caaaagccgc gaagacctta 840gggatcatgg tgggcgtttt cctcgtatgc tggtgcccgt tctttctctg cacggtcctg 900gaccctttcc tgggctatgt tatcccaccc tctctgaatg acgcactgta ttggtttggg 960tacttgaatt ctgccctcaa tccgatggtt tatgcctttt tctatccctg gttcagaaga1020gccttgaaga tggttctcct tggtaaaatt ttccaaaaag attcatctag gtctaagcta1080tttttgtaac tcgag 1095<210>5<211>410
<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述用T3測(cè)序載體構(gòu)建體pCMV-hsTAAR1得到的序列<400>5ctcgagtcca ccatgaagac gatcatcgcc ctgagctaca tcttctgcct ggtgttcgcc 60gactacaagg acgatgatga cgccatgggc atgatgccct tttgccacaa tataattaat120atttcctgtg tgaaaaacaa ctggtcaaat gatgtccgtg cttccctgta cagtttaatg180gtgctcataa ttctgaccac actcgttggc aatctgatag ttattgtttc tatatcacac240ttcaaacaac ttcatacccc aacaaattgg ctcattcatt ccatggccac tgtggacttt300cttctggggt gtctggtcat gccttacagt atggtgagat ctgctgagca ctgttggtat360tttggagaag tcttctgtaa aattcacaca agcaccgaca ttatgctgag 410<210>6<211>345<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述用T7測(cè)序載體構(gòu)建體pCMV-hsTAAR1得到的序列<400>6aatcagaagc tccaaattgg attggaaatg aaaaatggaa tttcacaaag caaagaaagg 60aaagctgtga agacattggg gattgtgatg ggagttttcc taatatgctg gtgccctttc120tttatctgta cagtcatgga cccttttctt cactacatta ttccacctac tttgaatgat180gtattgattt ggtttggcta cttgaactct acatttaatc caatggttta tgcatttttc240tatccttggt ttagaaaagc actgaagatg atgctgtttg gtaaaatttt ccaaaaagat300tcatccaggt gtaaattatt tttggaattg agttcatagc tcgag345<210>7<211>490<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述用hu-Tar 303c測(cè)序pCMV-hsTAAR1得到的序列<400>7ctgttggtat tttggagaag tcttctgtaa aattcacaca agcaccgaca ttatgctgag 60ctcagcctcc attttccatt tgtctttcat ctccattgac cgctactatg ctgtgtgtga120tccactgaga tataaagcca agatgaatat cttggttatt tgtgtgatga tcttcattag180ttggagtgtc cctgctgttt ttgcatttgg aatgatcttt ctggagctaa acttcaaagg240cgctgaagag atatattaca aacatgttca ctgcagagga ggttgctctg tcttctttag300
caaaatatct ggggtactga cctttatgac ttctttttat atacctggat ctattatgtt 360atgtgtctat tacagaatat atcttatcgc taaagaacag gcaagattaa ttagtgatgc 420caatcagaag ctccaaattg gattggaaat gaaaaatgga atttcacaaa gcaaagaaag 480gaaagctgtg 490<210>8<211>358<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述由用hu-Tar 408nc測(cè)序pCMV-hsTAAR1得到的序列<400>8ctcgagtcca ccatgaagac gatcatcgcc ctgagctaca tcttctgcct ggtgttcgcc 60gactacaagg acgatgatga cgccatgggc atgatgccct tttgccacaa tataattaat120atttcctgtg tgaaaaacaa ctggtcaaat gatgtccgtg cttccctgta cagtttaatg180gtgctcataa ttctgaccac actcgttggc aatctgatag ttattgtttc tatatcacac240ttcaaacaac ttcatacccc aacaaattgg ctcattcatt ccatggccac tgtggacttt300cttctggggt gtctggtcat gccttacagt atggtgagat ctgctgagca ctgttggt 358<210>9<211>370<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述用hu-Tar 695c測(cè)序pCMV-hsTAAR1得到的序列<400>9acaggcaaga ttaattagtg atgccaatca gaagctccaa attggattgg aaatgaaaaa 60tggaatttca caaagcaaag aaaggaaagc tgtgaagaca ttggggattg tgatgggagt120tttcctaata tgctggtgcc ctttctttat ctgtacagtc atggaccctt ttcttcacta180cattattcca cctactttga atgatgtatt gatttggttt ggctacttga actctacatt240taatccaatg gtttatgcat ttttctatcc ttggtttaga aaagcactga agatgatgct300gtttggtaaa attttccaaa aagattcatc caggtgtaaa ttatttttgg aattgagttc360atagctcgag 370<210>10<211>386<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述用hu-Tar 757nc測(cè)序pCMV-hsTAAR1得到的序列
<400>10acagtatggt gagatctgct gagcactgtt ggtattttgg agaagtcttc tgtaaaattc 60acacaagcac cgacattatg ctgagctcag cctccatttt ccatttgtct ttcatctcca120ttgaccgcta ctatgctgtg tgtgatccac tgagatataa agccaagatg aatatcttgg180ttatttgtgt gatgatcttc attagttgga gtgtccctgc tgtttttgca tttggaatga240tctttctgga gctaaacttc aaaggcgctg aagagatata ttacaaacat gttcactgca300gaggaggttg ctctgtcttc tttagcaaaa tatctggggt actgaccttt atgacttctt360tttatatacc tggatctatt atgtta 386<210>11<211>411<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述用T3測(cè)序pcMv-mmTaar1得到的序列<400>11ctcgagtcca ccatgaagac gatcatcgcc ctgagctaca tcttctgcct ggtgttcgcc 60gactacaagg acgatgatga cgccatgggc atgcatcttt gccacgctat cacaaacatt120tcccacagaa acagcgactg gtcaagagaa gtccaagctt ccctgtacag cttaatgtca180ctcataatcc tggccactct ggttggcaac ttaatagtaa taatttccat atcccatttc240aagcaacttc atacacccac caactggctc cttcactcca tggccattgt cgactttctg300ctgggctgtc tgataatgcc ctgcagcatg gtgagaactg ttgagcgctg ttggtatttt360ggggaaatcc tctgtaaagt tcacaccagc accgatatca tgctgagctc c 411<210>12<211>378<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述用T7測(cè)序pcMv-mmTaar1得到的序列<400>12tataggatat atttcatagc taaaggacaa gcaaggtcaa tcaatcgtac gaatgttcaa 60gttggattgg aagggaaaag ccaagcacca caaagcaagg aaacaaaagc cgcgaagacc120ttagggatca tggtgggcgt tttcctcgta tgctggtgcc cgttctttct ctgcacggtc180ctggaccctt tcctgggcta tgttatccca ccctctctga atgacgcact gtattggttt240gggtacttga attctgccct caatccgatg gtttatgcct ttttctatcc ctggttcaga300agagccttga agatggttct ccttggtaaa attttccaaa aagattcatc taggtctaag360ctatttttgt aactcgag 378<210>13<211>371
<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述用mTar-293c測(cè)序pCMV-mmTaar1得到的序列<400>13gtgagaactg ttgagcgctg ttggtatttt ggggaaatcc tctgtaaagt tcacaccagc60accgatatca tgctgagctc cgcctccatt ttccacttag ctttcatttc cattgaccgc 120tactgtgctg tgtgtgaccc tttgagatac aaagccaaga tcaatatctc cactattctt 180gtgatgatcc tcgttagttg gagccttcct gctgtttatg catttgggat gatcttcctg 240gaactgaact taaaaggagt ggaagagctg tatcgcagtc aggtcagcga cctgggcggc 300tgttctccct tctttagtaa agtatctggg gtactggcgt tcatgacttc cttctatata 360cctggatctg t371<210>14<211>292<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述用mTar-345nc測(cè)序pCMV-mmTaar1得到的序列<400>14ctcgagtcca ccatgaagac gatcatcgcc ctgagctaca tcttctgcct ggtgttcgcc60gactacaagg acgatgatga cgccatgggc atgcatcttt gccacgctat cacaaacatt 120tcccacagaa acagcgactg gtcaagagaa gtccaagctt ccctgtacag cttaatgtca 180ctcataatcc tggccactct ggttggcaac ttaatagtaa taatttccat atcccatttc 240aagcaacttc atacacccac caactggctc cttcactcca tggccattgt cg 292<210>15<211>391<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述用T7測(cè)序pCMV-mmTaar1得到的序列<400>15gttatttgtt tactatagga tatatttcat agctaaagga caagcaaggt caatcaatcg60tacgaatgtt caagttggat tggaagggaa aagccaagca ccacaaagca aggaaacaaa 120agccgcgaag accttaggga tcatggtggg cgttttcctc gtatgctggt gcccgttctt 180tctctgcacg gtcctggacc ctttcctggg ctatgttatc ccaccctctc tgaatgacgc 240actgtattgg tttgggtact tgaattctgc cctcaatccg atggtttatg cctttttcta 300tccctggttc agaagagcct tgaagatggt tctccttggt aaaattttcc aaaaagattc 360atctaggtct aagctatttt tgtaactcga g 391
<210>16<211>451<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述由用mTar-755nc測(cè)序pCMV-mmTaar1得到的序列<400>16cccaccaact ggctccttca ctccatggcc attgtcgact ttctgctggg ctgtctgata60atgccctgca gcatggtgag aactgttgag cgctgttggt attttgggga aatcctctgt 120aaagttcaca ccagcaccga tatcatgctg agctccgcct ccattttcca cttagctttc 180atttccattg accgctactg tgctgtgtgt gaccctttga gatacaaagc caagatcaat 240atctccacta ttcttgtgat gatcctcgtt agttggagcc ttcctgctgt ttatgcattt 300gggatgatct tcctggaact gaacttaaaa ggagtggaag agctgtatcg cagtcaggtc 360agcgacctgg gcggctgttc tcccttcttt agtaaagtat ctggggtact ggcgttcatg 420acttccttct atatacctgg atctgttatg t 451<210>17<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述寡核苷酸<400>17cttctggggt gtctggtcat g 21<210>18<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述寡核苷酸<400>18gcataatgtc ggtgcttgtg tg22<210>19<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述寡核苷酸<400>19cctggatcta ttatgttatg tgtc 24<210>20<211>23
<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述寡核苷酸<400>20cttgcctgtt ctttagcgat aag23<210>21<211>112<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述寡核苷酸<400>21gcctcgagtc caccatgaag acgatcatcg ccctgagcta catcttctgc ctggtgttcg 60ccgactacaa ggacgatgat gacgccatgg gcatgatgcc cttttgccac aa 112<210>22<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述寡核苷酸<400>22gcctcgagct atgaactcaa ttccaaaa 28<210>23<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述寡核苷酸<400>23cgactttctg ctgggctgtc 20<210>24<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述寡核苷酸<400>24caacagttct caccatgctg c 21<210>25<211>21<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述寡核苷酸<400>25gtactggcgt tcatgacttc c 21<210>26<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述寡核苷酸<400>26ccttgcttgt cctttagcta tg 22<210>27<211>115<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述寡核苷酸<400>27gcctcgagtc caccatgaag acgatcatcg ccctgagcta catcttctgc ctggtgttcg 60ccgactacaa ggacgatgat gacgccatgg gcatgcatct ttgccacgct atcac 115<210>28<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述寡核苷酸<400>28gcctcgagtt acaaaaatag cttagacc 28<210>29<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述寡核苷酸<400>29aattaaccct cactaaaggg20<210>30<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述寡核苷酸<400>30taatacgact cactataggg20<210>31<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述寡核苷酸<400>31gtgctccgtg gatctcaagc 20<210>32<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述寡核苷酸<400>32ggatgatggc atgcagcact g 21<210>33<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述正向引物<400>33gatcatcgcc ctgagcta18<210>34<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述反向引物<400>34gcgtcatcat cgtccttgta 20<210>35<211>16<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述FAM標(biāo)記的探針<400>35tcttctgcct ggtgtt 1權(quán)利要求
1.基因構(gòu)建體，其包含有效連接到啟動(dòng)子的編碼TAAR1的DNA序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的基因構(gòu)建體，其中編碼序列是人序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的基因構(gòu)建體，其中啟動(dòng)子是組織特異性的啟動(dòng)子。
4.根據(jù)權(quán)利要求1到3中任意一項(xiàng)所述的基因構(gòu)建體，其中啟動(dòng)子是腦特異性的啟動(dòng)子。
5.根據(jù)權(quán)利要求1到3中任意一項(xiàng)所述的基因構(gòu)建體，其中啟動(dòng)子是可調(diào)控的啟動(dòng)子。
6.產(chǎn)生其基因組包含編碼TAAR1的轉(zhuǎn)基因DNA的轉(zhuǎn)基因非人動(dòng)物的方法，其包括a)將根據(jù)權(quán)利要求1到5中任意一項(xiàng)所述的基因構(gòu)建體導(dǎo)入非人合子或非人胚胎干細(xì)胞，b)從所述合子或胚胎干細(xì)胞生成轉(zhuǎn)基因非人動(dòng)物，并且從而c)產(chǎn)生其基因組包含編碼TAAR1的轉(zhuǎn)基因DNA的轉(zhuǎn)基因非人動(dòng)物。
7.產(chǎn)生表達(dá)轉(zhuǎn)基因TAAR1的非人轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的方法，其包括a)將根據(jù)權(quán)利要求1到5中任意一項(xiàng)所述的基因構(gòu)建體導(dǎo)入非人合子或非人胚胎干細(xì)胞，b)從所述合子或胚胎干細(xì)胞生成轉(zhuǎn)基因非人動(dòng)物，并且從而c)產(chǎn)生表達(dá)轉(zhuǎn)基因TAAR1的轉(zhuǎn)基因非人動(dòng)物。
8通過(guò)根據(jù)權(quán)利要求6或7的方法產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因非人動(dòng)物。
9轉(zhuǎn)基因非人動(dòng)物，其基因組包含根據(jù)權(quán)利要求1到5中任意一項(xiàng)所述的基因構(gòu)建體。
10根據(jù)權(quán)利要求8或9的轉(zhuǎn)基因非人動(dòng)物，其中轉(zhuǎn)基因動(dòng)物是嚙齒類(lèi)動(dòng)物。
11根據(jù)權(quán)利要求8或9的轉(zhuǎn)基因非人動(dòng)物，其中轉(zhuǎn)基因動(dòng)物是小鼠。
12根據(jù)權(quán)利要求8或9的轉(zhuǎn)基因非人動(dòng)物，其中轉(zhuǎn)基因動(dòng)物是C57BL/6。
13根據(jù)權(quán)利要求8到12中任意一項(xiàng)所述的轉(zhuǎn)基因非人動(dòng)物，其過(guò)量表達(dá)TAAR1蛋白質(zhì)。
14根據(jù)權(quán)利要求8到12中任意一項(xiàng)所述的轉(zhuǎn)基因非人動(dòng)物，其以組織特異性方式過(guò)量表達(dá)TAAR1蛋白質(zhì)。
15根據(jù)權(quán)利要求8到14中任意一項(xiàng)所述的轉(zhuǎn)基因非人動(dòng)物的后代。
16來(lái)自根據(jù)權(quán)利要求8到15中任意一項(xiàng)所述的轉(zhuǎn)基因非人動(dòng)物或其后代的細(xì)胞系或原代細(xì)胞培養(yǎng)物。
17來(lái)自根據(jù)權(quán)利要求8到15中任意一項(xiàng)所述的轉(zhuǎn)基因非人動(dòng)物或其后代的組織或器官型腦切片培養(yǎng)物。
18來(lái)自根據(jù)權(quán)利要求8到15中任意一項(xiàng)所述的轉(zhuǎn)基因非人動(dòng)物或其后代的組織外植體或器官外植體或其培養(yǎng)物。
19來(lái)自根據(jù)權(quán)利要求8到15中任意一項(xiàng)所述的轉(zhuǎn)基因非人動(dòng)物或其后代的組織提取物或細(xì)胞提取物。
20根據(jù)權(quán)利要求8到15的非人轉(zhuǎn)基因動(dòng)物、或根據(jù)權(quán)利要求16的細(xì)胞系或原代細(xì)胞培養(yǎng)物、或根據(jù)權(quán)利要求17的組織或器官型腦切片培養(yǎng)物或根據(jù)權(quán)利要求18的組織或器官外植體或其培養(yǎng)物、或根據(jù)權(quán)利要求19的組織提取物或細(xì)胞提取物作為模型的用途，用于鑒定和檢驗(yàn)化合物在如下疾病中的治療效果抑郁癥、焦慮癥、雙相性精神障礙、注意力缺陷多動(dòng)癥、應(yīng)激相關(guān)性疾病、精神障礙例如精神分裂癥、神經(jīng)疾病例如帕金森病、神經(jīng)變性疾病如阿爾茨海默病、癲癇、偏頭痛、高血壓、精神活性物濫用和代謝障礙如進(jìn)食障礙、糖尿病、糖尿病并發(fā)癥、肥胖癥、血脂異常、能量消耗和同化作用的障礙、體溫穩(wěn)態(tài)障礙和機(jī)能不良、睡眠和晝夜節(jié)律障礙和心血管病癥。
21根據(jù)權(quán)利要求8到15的非人轉(zhuǎn)基因動(dòng)物、或根據(jù)權(quán)利要求16的細(xì)胞系或原代細(xì)胞培養(yǎng)物、或根據(jù)權(quán)利要求17的組織或器官型腦切片培養(yǎng)物或根據(jù)權(quán)利要求18的組織或器官外植體或其培養(yǎng)物、或根據(jù)權(quán)利要求19的組織提取物或細(xì)胞提取物作為工具的用途，用于評(píng)定TAAR1功能。
22根據(jù)權(quán)利要求8到15的非人轉(zhuǎn)基因動(dòng)物、或根據(jù)權(quán)利要求16的細(xì)胞系或原代細(xì)胞培養(yǎng)物、或根據(jù)權(quán)利要求17的組織或器官型腦切片培養(yǎng)物或根據(jù)權(quán)利要求18的組織或器官外植體或其培養(yǎng)物、或根據(jù)權(quán)利要求19的組織提取物或細(xì)胞提取物作為工具的用途，用于鑒定TAAR1的未知配體。
23根據(jù)權(quán)利要求8到15的非人轉(zhuǎn)基因動(dòng)物、或根據(jù)權(quán)利要求16的細(xì)胞系或原代細(xì)胞培養(yǎng)物、或根據(jù)權(quán)利要求17的組織或器官型腦切片培養(yǎng)物或根據(jù)權(quán)利要求18的組織或器官外植體或其培養(yǎng)物、或根據(jù)權(quán)利要求19的組織提取物或細(xì)胞提取物作為工具的用途，用于確定作用于TAAR1的化合物的特異性。
24根據(jù)權(quán)利要求8到15的非人轉(zhuǎn)基因動(dòng)物、或根據(jù)權(quán)利要求16的細(xì)胞系或原代細(xì)胞培養(yǎng)物、或根據(jù)權(quán)利要求17的組織或器官型腦切片培養(yǎng)物或根據(jù)權(quán)利要求18的組織或器官外植體或其培養(yǎng)物、或根據(jù)權(quán)利要求19的組織提取物或細(xì)胞提取物的用途，用于研究TAARs或與TAARs相關(guān)聯(lián)的其他細(xì)胞成分的胞內(nèi)運(yùn)輸。
25基本如前描述的尤其是參照前述實(shí)施例的基因構(gòu)建體、方法、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物、測(cè)試系統(tǒng)以及用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及包含編碼TAAR1的DNA的基因構(gòu)建體和它們用于生成TAAR1轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的用途，涉及在其基因組中包含編碼TAAR1的轉(zhuǎn)基因DNA的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物、它們的用途以及生成這些動(dòng)物的方法。
文檔編號(hào)A01K67/027GK1978654SQ20061016455
公開(kāi)日2007年6月13日 申請(qǐng)日期2006年12月5日 優(yōu)先權(quán)日2005年12月5日
發(fā)明者M·赫納, L·林德曼, C·A·邁爾 申請(qǐng)人:弗·哈夫曼-拉羅切有限公司