專利名稱：刺激促生長素抑制素和胰島素產(chǎn)生的化合物的篩選方法
背景技術(shù)：
發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及生物化學(xué)內(nèi)分泌學(xué)、分子生物學(xué)和蛋白質(zhì)化學(xué)。更具體地，本發(fā)明涉及測定刺激促生長素抑制素和胰島素產(chǎn)生的化合物的方法。
相關(guān)技術(shù)描述葡萄糖的體內(nèi)穩(wěn)態(tài)需要多種神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)的協(xié)同作用。然而，胰島被認(rèn)為是哺乳動物體內(nèi)主要的“葡萄糖感受器”。胰島包含四種細(xì)胞，它們被稱為前胰島素原(primansulin)、胰高血糖素、促生長素抑制素或胰多肽。其中產(chǎn)生胰島素的β細(xì)胞占主要地位。血清中葡萄糖的增加刺激了胰島素的分泌和產(chǎn)生，而該步驟可使某些組織隨后吸收葡萄糖。因此，β細(xì)胞的功能異?；蚱茐膶?dǎo)致血清葡萄糖含量的升高，最終導(dǎo)致糖尿病。
遺傳連鎖分析表明遺傳因子對獲得糖尿病的易感性有很大影響。例如，至少18個基因座與胰島素依賴型糖尿病(IDDM)有一定的關(guān)聯(lián)。一個稱為IDDM2的疾病感受型基因座包括人的胰島素基因，并與胰島素啟動子功能的改變的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)有關(guān)。因此，調(diào)節(jié)胰島素基因表達(dá)步驟的破壞將部分導(dǎo)致糖尿病原性疾病。與這種假設(shè)一致的是，β細(xì)胞功能的損失是糖尿病的一個非常普遍的特征。
非胰島素依賴型糖尿病(NIDDM)被認(rèn)為是外界影響和復(fù)雜的遺傳影響兩者共同的結(jié)果。令人感興趣的是，胰島素基因座本身的等位基因變異與糖尿病有關(guān)。這些變異表現(xiàn)出含有正常的胰島素基因，但是表現(xiàn)出改變了與轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)有關(guān)的性質(zhì)。
調(diào)查表明有多達(dá)2千萬的美國人患有II型糖尿病。疾病的發(fā)展需要環(huán)境因素和某些還未被充分鑒定的可能使II型糖尿病有外周胰島素抗性的糖尿病易感性基因(diabetes susceptibility gene)，在II型糖尿病中組織就不能響應(yīng)胰島素信號來適當(dāng)?shù)乩闷咸烟??；蛘?，在這些患者中，遺傳因子可能是造成產(chǎn)生胰島素的胰β細(xì)胞的葡萄糖易感性減少的原因。這兩種生理狀態(tài)的最終結(jié)果是顯著的高血糖，而高血糖是糖尿病的主要特征。
胰島素基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控是通過與細(xì)胞特異性的、對葡萄糖敏感的信號分子相互作用的短區(qū)域側(cè)翼DNA來實(shí)現(xiàn)的。盡管已經(jīng)普遍認(rèn)為含有堿性螺旋-環(huán)-螺旋(bHLH)和同源異型域的因子是控制β細(xì)胞特異性表達(dá)胰島素的轉(zhuǎn)錄機(jī)理的關(guān)鍵成分，但是該調(diào)節(jié)組織的確切特征仍然知之甚少。對胰島有特異性的堿性螺旋-環(huán)-螺旋復(fù)合體與近側(cè)的分別稱為Nir、IEB1或ICE的E-框(E-box)相互作用；該元件存在于鼠的胰島素I基因中，但在鼠胰島素II和人胰島素基因中只出現(xiàn)一次。
在產(chǎn)胰島素的細(xì)胞系中的瞬時測定(transient assay)表明，與E框結(jié)合的因子可與對β細(xì)胞有特異性的蛋白質(zhì)發(fā)生協(xié)同作用，該蛋白質(zhì)與鄰近的稱作FLAT的富含AT的序列結(jié)合，F(xiàn)LAT則具有與同源異型域識別序列的特征。與FLAT結(jié)合的因子包括Isl-1、lmx-1、cdx-3和STF-1。此外，其中的后者與稱作P元件的進(jìn)化上保守而富含AT的序列有首要的結(jié)合活性。Isl-1與FLAT元件的結(jié)合很弱，而且用產(chǎn)胰島素的細(xì)胞抽提物檢測時，似乎不存在于結(jié)合FLAT的復(fù)合體中。現(xiàn)有的數(shù)據(jù)支持了Isl-1在神經(jīng)生長中所起的更重要的作用。同源異型域因子lmx-3和cdx-3在異源細(xì)胞中有令人感興趣的胰島素啟動子功能的反式激活性質(zhì)，但是它們在β-細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞分布和與FLAT結(jié)合的活性仍是不清楚的。另外，直接表明這些因子在β細(xì)胞系中的功能的數(shù)據(jù)也很少。
在有與胰島素啟動子結(jié)合活性的因子組中，STF-1可能是最有前途的胰島素啟動子功能的真正調(diào)控器。在小鼠中，于胚胎期8.5天在形成胰臟的原基細(xì)胞核中首先檢測到有STF-1，略早于該區(qū)域內(nèi)最早測到有胰島素表達(dá)之前。隨后通過內(nèi)分泌胰的生長，STF-1和胰島素大量共表達(dá)。另外，在產(chǎn)胰島素細(xì)胞系的抽提物中，STF-1是當(dāng)胰島素啟動子中同時有FLAT和P元件時有內(nèi)源DNA結(jié)合活性的成分。STF-1也與與E-框結(jié)合的因子Pan-1(估計可從與FLAT結(jié)合的因子中獲得)有強(qiáng)的協(xié)同作用。然而，DNA結(jié)合測定法表明，來自β細(xì)胞抽提物的其它未知因子也對檢測到的FLAT結(jié)合活性有較大的貢獻(xiàn)。FLAT介導(dǎo)的胰島素啟動活性是否需要全部這些檢測到的種類、或僅僅需要一個亞型(subset)仍是不清楚的。
成熟的胰臟包括內(nèi)分泌和外分泌兩種成分，它們被認(rèn)為是從生長的腸的普通前體細(xì)胞中產(chǎn)生的。該前體細(xì)胞表達(dá)出稱作STF-1(14，20)(或IPF-1(19)，IDX(17)或X1Hbox 8(22))的同源異型域蛋白，其重要性在“剔除”研究中有所描述，“剔除”研究是指尋靶破壞STF-1基因?qū)?dǎo)致胰的先天性缺失。盡管STF-1最初是由生長的胰的內(nèi)分泌細(xì)胞和外分泌細(xì)胞表達(dá)的，但是STF-1的產(chǎn)生逐漸局限于產(chǎn)生胰島素和促生長素抑制素的胰島細(xì)胞(7)。在這些細(xì)胞中，STF-1的作用對于維持促生長素抑制素和胰島素基因的高水平表達(dá)顯得很重要(14，17，19，20，22)。
STF-1可識別兩種確切的胰島素啟動子上的稱作FLAT和P的胰島特異性元件。當(dāng)與這些位點(diǎn)結(jié)合時，STF-1與E47協(xié)同刺激胰島素的轉(zhuǎn)錄，E47是可識別兩種稱作Far和Nir的E基因框元件的螺旋-環(huán)-螺旋蛋白質(zhì)。同樣的，STF-1通過兩個胰島特異性元件(稱為TSEI和TSEII)來調(diào)控胰島細(xì)胞中促生長素抑制素的表達(dá)(14，17)。
除了對某些基因有轉(zhuǎn)錄刺激作用，發(fā)現(xiàn)同源異型域蛋白質(zhì)如STF-1在確定細(xì)胞或節(jié)段身份(segmental identity)的研究中有重要作用。與它們在體內(nèi)的特異性和顯著的活性相反，許多同源異型域蛋白質(zhì)在體外表現(xiàn)出較低的與重疊DNA結(jié)合的特異性。然而，目前的研究暗示，某些蛋白質(zhì)輔因子可作為體內(nèi)同源異型域DNA結(jié)合特異性的決定簇(8，13)。例如在果蠅屬中，外小齒(extradenticle)(exd)可調(diào)節(jié)同源異型蛋白質(zhì)的活性而不改變它們的表達(dá)方式(21，24)。另外，外小齒表現(xiàn)出通過增強(qiáng)某些同源異型域蛋白質(zhì)的DNA結(jié)合特異性lai促進(jìn)靶基因的選擇(2，25)。實(shí)際上，外小齒在脊椎動物中是高度保守的，其與人原癌基因Pbxl有71％的延伸序列相同(23)。
已有技術(shù)缺少有效的增強(qiáng)同源異型域蛋白如STF-1的結(jié)合的方法。本發(fā)明滿足了該領(lǐng)域中這一長期存在的需要。
發(fā)明概述許多同源異型域蛋白表現(xiàn)出可通過刺激特異靶基因的轉(zhuǎn)錄來調(diào)節(jié)細(xì)胞生長。與它們在體內(nèi)的顯著活性相比，許多同源異型域蛋白在體外與蛋白質(zhì)靶部位的結(jié)合是無特異性的，這表明有識別靶部位選擇性的輔因子參與。一種輔因子稱為外小齒(exd)，它可通過與某些同源異型域蛋白協(xié)同結(jié)合到靶調(diào)節(jié)元件上來影響果蠅屬中的節(jié)段形態(tài)發(fā)生(segmental morphogensis)。本發(fā)明證明了STF-1(一種哺乳動物中胰生長所需要的孤獨(dú)同源異型域蛋白)通過與Pbx(哺乳動物中外小齒的同源物)協(xié)同結(jié)合到DNA上來刺激胰島激素基因促生長素抑制素的轉(zhuǎn)錄。與Pbx的協(xié)同結(jié)合需要五肽基序(pentapeptide motif)(FPWMK)，它在同源異型域蛋白的亞型中是高度保守的。FPMWK基序不足以使其它同源異型域蛋白具有Pbx協(xié)同性，然而，STF-1同源異型域的N末端臂也是必須的。當(dāng)與Pbx的協(xié)同結(jié)合發(fā)生在僅一個潛在STF-1靶部位亞型上時，本發(fā)明表現(xiàn)出Pbx可通過和STF-1形成異二聚復(fù)合體來選擇性識別胰生長中的靶基因。實(shí)際上，本發(fā)明證明了促生長素抑制素啟動子的TSEII元件可識別胰島細(xì)胞中的由STF-1和Pbx組成的異二聚復(fù)合體。因此，胰中STF-1作用的特異性部分受潛在靶啟動子部位識別STF-1 Pbx異二聚復(fù)合體的能力的支配。
因此，本發(fā)明的一個方面是提供了一種DNA結(jié)合測定法來測定對于促進(jìn)STF-1與STF-1接合部位的結(jié)合有效的化合物，其步驟包括使有末端標(biāo)記的、有STF-1結(jié)合位點(diǎn)的雙鏈DNA與STF-1一起混合，作為第一容器中的對照；使末端標(biāo)記的、有STF-1結(jié)合位點(diǎn)的雙鏈DNA與STF-1和測定化合物一起混合，作為第二容器中的樣品；培育所述第一和第二容器；將所述對照和所述樣品上樣于電泳凝膠；對所述電泳凝膠施加一定電流以使所述對照和所述樣品在所述凝膠中遷移；檢測所述對照和所述樣品；比較所述對照和所述樣品的遷移，其中如果所述樣品的遷移比所述對照慢，則所述測定的化合物是有效地促進(jìn)了STF-1與所述STF-1結(jié)合位點(diǎn)的結(jié)合。
本發(fā)明的另一方面是提供了一種DNA結(jié)合測定法來測定可有效促進(jìn)STF-1與STF-1接合部位的結(jié)合的化合物，步驟包括將組成型表達(dá)STF-1的第一表達(dá)質(zhì)粒和在STF-1結(jié)合位點(diǎn)控制下表達(dá)受體基因的第二表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入合適的細(xì)胞系中；將第三質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入所述轉(zhuǎn)染合適細(xì)胞系中，所述第三表達(dá)質(zhì)?？杀磉_(dá)測定(trest)化合物；測定所述受體基因的轉(zhuǎn)錄量，其中如果所述轉(zhuǎn)錄發(fā)生，則所述測定化合物可有效促進(jìn)STF-1與所述STF-1結(jié)合位點(diǎn)的結(jié)合。
本發(fā)明的其它方面、特征和優(yōu)點(diǎn)可從下面公開給出的本發(fā)明的較佳實(shí)施例的描述中明顯獲得。
附圖簡述為使上述的本發(fā)明的特征、優(yōu)點(diǎn)和目的被詳細(xì)了解，本發(fā)明以上概述的詳細(xì)描述可參照一些結(jié)合附圖來描述的實(shí)施例。這些附圖是說明書的一部分。然而，應(yīng)當(dāng)注意的是，附圖描述了本發(fā)明的較佳實(shí)施例，因此它不能被認(rèn)為是限制了它們的范圍。


圖1表示胰的同源異型框因子STF-1與遍在核因子一起協(xié)同結(jié)合到促生長素抑制素啟動子中的細(xì)胞特異性調(diào)節(jié)元件上。圖1A顯示了胰島Tu-6細(xì)胞的粗核抽提物用促生長素抑制素TSEII從-303延伸至-281的雙鏈寡核苷酸進(jìn)行的凝膠移位分析。其中指出了C1、C2和C3是蛋白質(zhì)DNA復(fù)合體。漸增的條帶表明核抽提物的量的增加。STF，只有重組STF-1蛋白質(zhì)；Tu-6 Ne和Hela NE分別指Tu-6和Hela細(xì)胞的核抽提物。PI指預(yù)免疫抗血清。STF-1 Ab指抗STF-1蛋白質(zhì)的C末端部分產(chǎn)生的抗血清。STF-1 Ab+Oct寡核苷酸指STF-1抗血清加上SV40的Oct1結(jié)合位點(diǎn)(Sph1基序)。Oct.Ab指抗Oct.1蛋白質(zhì)產(chǎn)生的單克隆Oct 1抗血清(W.Herr贈與)。圖1B顯示了用如下所述的促生長素抑制素TSEII和Tu6核抽提物制得的復(fù)合體(預(yù)先與未標(biāo)記的Oct1寡核苷酸培育，以只對C1和C2復(fù)合體分析)的解離速率(off-rate)分析。復(fù)合體C1和C2如圖所示。每條泳道均顯示了在加入1000倍過量的未標(biāo)記TSEII競爭劑DNA后的時間(分鐘表示)。PI指預(yù)免疫的血清；STF-1 Ab指加入凝膠移動測定中的STF-1抗血清。圖1C顯示了重組STF-1蛋白質(zhì)的凝膠移位分析，其中用促生長素抑制素TES II寡核苷酸作為探針。STF-1結(jié)合活性在沒有(-)或有(+)Jurkat細(xì)胞的異源核抽提物(用Western印跡法檢測，不含可檢測水平量的STF-1蛋白質(zhì))下測定。漸增條帶表明重組STF-1蛋白質(zhì)的量的增加。復(fù)合體C1和C2如圖所述。圖1D顯示了含有重組STF-1加上Jurkat核抽提物的重建抽提物中復(fù)合體C1和C2的解離速率。每條泳道均顯示了在加入未標(biāo)記TSE II競爭劑(1000倍過量)后的時間點(diǎn)(分鐘表示)。
圖2表示遍在同源異型框蛋白質(zhì)Pbx與STF-1在促生長素抑制素TSEII元件上形成異二聚復(fù)合體。圖2A顯示了用TSE II寡核苷酸作為探針對Tu6 NE的凝膠移位分析。復(fù)合體C1、C2和C3如圖所示。PBX Ab指反應(yīng)中包含的Pbx抗血清。PI指預(yù)免疫血清。STF-1 Ab指STF-1抗血清。圖2B顯示了體外翻譯的Pbx蛋白質(zhì)(PBX)對于STF-1結(jié)合活性的影響。如每條泳道中所示，凝膠移位分析采用TSE II寡核苷酸加上STF-1和/或Pbx。TNT指對照的裂解液。圖2C顯示了PBX使STF-1與TSEII復(fù)合體的結(jié)合穩(wěn)定。STF-1和STF-1 Pbx復(fù)合體的解離速率分析用促生長素抑制素TSE II寡核苷酸作為探針。加入過量未標(biāo)記TSE II寡核苷酸后的時間(分鐘表示)如圖所示。如圖所述，復(fù)合體C1和C2分別與STF-1單體和STF-1/PBX異二聚體對應(yīng)。圖2D顯示在促生長素抑制素和胰島素啟動子序列上STF-1/Pbx異二聚體的形成的分析結(jié)果。TSEII指野生型TSE II寡核苷酸。圖3D和3E顯示了M1、M2和M3以及突變型TSEII寡核苷酸(TAAT基序發(fā)生突變)。P和FLAT是可高度親和識別STF-1的胰島素I元件。TSEI是與STF-1結(jié)合的促生長素抑制素啟動子元件。PBX指加入結(jié)合反應(yīng)中的體外翻譯PBX蛋白；STF指全長重組STF-1蛋白質(zhì)。圖2E顯示了圖3B的凝膠移位分析中采用的野生型和突變型寡核苷酸。連括號表示誘變尋靶的共有序列TAAT基序。圖2F顯示了STF-1和Pbx協(xié)同作用在啟動子位點(diǎn)的亞型上。每條線條下指出了用STF-1和E2A-Pbx效應(yīng)質(zhì)粒進(jìn)行的GC細(xì)胞瞬時轉(zhuǎn)染測定法。線條框圖顯示了從受體構(gòu)建物獲得的螢光素酶活性，受體構(gòu)建物包括含有單個的最小生長激素(GH)的啟動子(Luc)，兩個拷貝的GH啟動子上游的促生長素抑制素TSEII元件(TSEII-Luc)、或兩個拷貝的胰島素P元件(P-Luc)。使活性標(biāo)準(zhǔn)化以共轉(zhuǎn)染入RSV-CAT對照質(zhì)粒中。
圖3表示STF-1中保守的五肽基序?qū)τ谂cPbx的協(xié)同結(jié)合是關(guān)鍵的。圖3A顯示了野生型和截短重組的STF-1多肽形成的STF-1單體(復(fù)合體C1)和STF-1/Pbx異二聚體(復(fù)合體C2)的分析結(jié)果。每條泳道中指出了突變的STF-1多肽中缺失端點(diǎn)。例如，D1-70指出STF-1多肽缺少殘基1-70。Hox140-215指STF-1的同源異型域多肽。圖3B顯示上述凝膠移位測定中所用的構(gòu)建物的示意圖。H.D.指STF-1同源異型域(氨基酸殘基140-215)。全長STF-1蛋白質(zhì)從氨基酸殘基1延伸至284。圖3C顯示保守的五肽基序的誘變破壞了與有所示氨基酸數(shù)目的野生型和突變型STF-1蛋白質(zhì)的Pbx序列協(xié)同性。圖3D顯示了單獨(dú)的以及與體外翻譯PBX或E.Jurkat核抽提物組合使用的野生型(WT)和突變型(MUT)STF蛋白的凝膠移位分析。
圖4表示STF-1內(nèi)的五肽基序(其對于STF-1與Pbx在促生長素抑制素TSEII位點(diǎn)上形成異二聚體是必須的)在多個同源異型框蛋白中是保守的。不同的同源異型框蛋白根據(jù)種類來分類并根據(jù)名字排列。對于每種蛋白質(zhì)，與STF-1中基序?qū)?yīng)的序列以單字母氨基酸碼表示，右側(cè)顯示了N端至同源異型域的距離。
圖5表示與PBX相互作用的保守基序(Pim)對于促進(jìn)PBX和同源異型框蛋白質(zhì)間的協(xié)同結(jié)合是必須的，但量不足。圖5A顯示了下面凝膠移位測定中所用的重組GST-融合蛋白質(zhì)的示意圖。Isl1 H.D.指Isl1因子lim域的同源異型域。PBX相互作用基序-Isl1 H.D.指含有融合入Isl1同源異型域的STF-1 PBX相互作用基序區(qū)(氨基酸殘基110-138)的STF-1-Isl1融合蛋白。cdx3 H.D.指胰同源異型框蛋白cdx3的同源異型域(氨基酸殘基143-253)。PBX相互作用基序-cdx3指含有與cdx3同源異型域(氨基酸176-253)融合的STF-1 PBX相互作用基序區(qū)(氨基酸110-138)的融合蛋白。PBX相互作用基序-STF-1指含有與STF-1同源異型域(氨基酸殘基140-215)融合的PBX相互作用基序區(qū)(110-138)的STF-1多肽。STF-1 H.D.指單獨(dú)STF-1同源異型域而沒有PBX相互作用基序區(qū)。圖5B顯示了用促生長素抑制素TSEII位點(diǎn)作為32P標(biāo)記的探針進(jìn)行的凝膠移位測定。-和+表示沒有或含有用PBX RNA控制的網(wǎng)織紅細(xì)胞裂解液。每條泳道顯示了用同源異型域融合蛋白測得的PBX協(xié)同性。單體和異二聚復(fù)合體如標(biāo)記所示。
圖6表示STF-1同源異型域的N末端臂是與Pbx協(xié)同性所必需的。其顯示了PBX相互作用基序-cdx3融合構(gòu)建物的凝膠移位分析結(jié)果，該構(gòu)建物含有STF-1PBX相互作用基序(氨基酸殘基110-138)以及STF-1同源異型域的各個被cdx3的同源異型域取代的區(qū)域。圖6A顯示了STF-1/cdx3融合構(gòu)建物的結(jié)構(gòu)和活性。cdx3的序列為陰影部分，而STF-1的序列為白色部分。并指出了N末端臂(N)和Helices 1，2和3(H1，H2，H3)的相對位置。凝膠移位測定中與Pbx的協(xié)同結(jié)合在右側(cè)表示成(+，-)。圖6B顯示了STF-1和cdx3(顯示在下面)同源異型域的氨基酸排列，右側(cè)顯示了C端殘基的氨基酸數(shù)。破折號表示STF-1和cdx3間的氨基酸身份。箭頭所指地方是用于融合構(gòu)建物的氨基酸端點(diǎn)(I，II，III)。圖6C顯示了重組的STF-1/cdx3融合蛋白的凝膠移位測定結(jié)果。構(gòu)建物數(shù)字指上面示意圖中所述的構(gòu)建物。如圖所示，體外翻譯的Pbx(PBX)或未控制的網(wǎng)織紅細(xì)胞裂解液(TNT)存在于結(jié)合反應(yīng)中。C1、C2復(fù)合體分別與STF-1單體和Pbx/STF-1異二聚體對應(yīng)。
發(fā)明詳述人的基因組含有四簇稱為Hox基因的同源異型選擇者基因，它們是胚胎發(fā)育中軸體模式形成(axial body pattern formation)的關(guān)鍵決定簇(Krumlauf，1994，Cell78191-201)。四個簇各含有多達(dá)13個基因，而一個簇中的一個給定基因通常與其它三個家族中的一個有高度的同源性。這種對應(yīng)的基因稱為共生同源基因(paralog)；因此HoxA1，HoxB1，HoxC1和HoxD1均是緊密對應(yīng)的共生同源基因，而每個在不同的簇的不同的染色體上。例如，HoxB復(fù)合體位于染色體17的長臂上，且HoxB1至HoxB9已被鑒定。
胰島素基因的葡萄糖依賴性調(diào)控隨著胰島素分泌中葡萄糖介導(dǎo)的增加而產(chǎn)生。這可以部分地源于胞間鈣的增加。另外，響應(yīng)葡萄糖的胰島素啟動子功能可至少部分地通過調(diào)節(jié)FLAT結(jié)合蛋白的活性來產(chǎn)生。HoxB13與胰島素啟動子的有重要功能的FLAT元件高親和性地結(jié)合。此外，HoxB13和胰島素ICE/Nir元件-結(jié)合因子Pan-1在組合加入時大大地激活了胰島素啟動子。這與FLAT和Nir元件協(xié)同作用于產(chǎn)生胰島素的細(xì)胞的結(jié)果是一致的。這些收集數(shù)據(jù)表明，鈣依賴性信號途徑可調(diào)節(jié)HoxB13的功能。
根據(jù)本發(fā)明，可采用常規(guī)的分子生物學(xué)、微生物學(xué)和重組DNA技術(shù)領(lǐng)域中的已有技術(shù)。這些技術(shù)在文獻(xiàn)中有充分描述。例如見Maniatis，F(xiàn)ritsh&Sambrook，“分子克隆實(shí)驗手冊(Molecular CloningA Laboratory Manual(1982)；“DNA克隆實(shí)踐方法(DNA CloningA Practical approach)，”第I和II卷(D.N.Glover ed.1985)；“寡核苷酸合成(Oligonucleotide Synthesis)”(M.J.Gait ed.1984)；“核酸雜交(Nucleic Acid Hybridiation)”[B.D.Hames&S.J.Higgins eds.(1985)]；“轉(zhuǎn)錄和翻譯(Transcription and Translation)”[B.D.Hames&S.J.Higgins eds.(1984)]；“動物細(xì)胞培養(yǎng)(Animal Cell Culture)”[R.I.Freshney，ed.(1986)]；“固定化細(xì)胞和酶(Immobilized Cells And Enzymes)”[IRL Press，(1986)]；B.Perbal，“分子克隆指導(dǎo)(A Practical Guide To Molecular Cloning)”(1984)。
因此，如果在這里出現(xiàn)，下述術(shù)語應(yīng)有下列定義。
這里所述的氨基酸最好是“L”異構(gòu)型的。然而，“D”異構(gòu)型的殘基可代替任何L-氨基酸殘基，只要多肽保留有與免疫球蛋白結(jié)合的所需功能性質(zhì)。NH2指多肽的氨基末端存在的游離氨基基團(tuán)。COOH指存在于多肽的羧基末端的游離的羧基基團(tuán)。為與標(biāo)準(zhǔn)的多肽術(shù)語(J Biol.Chem.，2433552-59(1969))保持一致，下面的對應(yīng)表顯示了氨基酸殘基的縮寫對應(yīng)表符號 氨基酸1個字母 3個字母Y Tyr 酪氨酸G Gly 甘氨酸F Phe 苯丙氨酸M Met 甲硫氨酸A Ala 丙氨酸S Ser 絲氨酸I Ile 異亮氨酸L Leu 亮氨酸T Thr 蘇氨酸V Val 纈氨酸P Pro 脯氨酸K Lys 賴氨酸H His 組氨酸Q Gln 谷氨酰胺E Glu 谷氨酸W Trp 色氨酸R Arg 精氨酸D Asp 天冬氨酸N Asn 天冬酰胺C Cys 半胱氨酸應(yīng)當(dāng)注意，所有的氨基酸殘基序列在這里以式子表示，其從左到右是按常規(guī)的氨基端到羧基端的方向排列的。而且，應(yīng)當(dāng)注意，氨基酸殘基序列的開始或結(jié)尾處的破折號表示與另一有一個或多個氨基酸殘基的序列相連的肽鍵。上述表格與這里出現(xiàn)的三個字母和一個字母的記號對應(yīng)。
“復(fù)制子”是任何在體內(nèi)有自動復(fù)制DNA功能的遺傳元件(如質(zhì)粒、染色體、病毒)，即在其控制下能夠進(jìn)行復(fù)制。
“載體”是一種復(fù)制子，如質(zhì)粒、噬菌體或粘粒，另一個DNA片段可與其連接從而來復(fù)制所連著的片段。
“DNA分子”指單鏈或雙鏈螺旋型的脫氧核苷(腺嘌呤、鳥嘌呤、胸腺嘧啶或胞嘧啶)的聚合體形式。該術(shù)語僅僅指分子的一級和二級結(jié)構(gòu)，不局限于任何特定的三級結(jié)構(gòu)。因此，該術(shù)語包括所發(fā)現(xiàn)的雙鏈DNA、inter alia、線性DNA分子(如限制片段)、病毒、質(zhì)粒和染色體。在討論這里的結(jié)構(gòu)時，根據(jù)常規(guī)只給出了沿DNA非轉(zhuǎn)錄鏈(即有與mRNA相同序列的鏈)的5′到3′的序列。
“復(fù)制起點(diǎn)”指參與DNA合成的DNA序列。
DNA“編碼序列”指在合適的調(diào)節(jié)序列控制下在體內(nèi)轉(zhuǎn)錄并翻譯成多肽的雙鏈DNA。編碼序列的界限是5′端(相當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)的氨基端)的起始密碼子和3′端(相當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)的羧基端)的翻譯終止密碼子。編碼序列包括(但不局限于)原核細(xì)胞序列、來自真核細(xì)胞mRNA的cDNA甚至是合成的DNA序列。聚腺苷酸信號和轉(zhuǎn)錄終止序列通常位于編碼序列的3′端。
控制轉(zhuǎn)錄和翻譯的序列是DNA調(diào)控序列，如啟動子、增強(qiáng)子、聚腺苷酸信號、終止子等，它們可提供宿主細(xì)胞中的編碼序列的表達(dá)。
“啟動子序列”是可以與細(xì)胞中RNA聚合酶結(jié)合并引發(fā)下游(3′方向)編碼序列轉(zhuǎn)錄的DNA調(diào)控區(qū)。為詳細(xì)說明本發(fā)明，啟動子序列的3′端與轉(zhuǎn)錄起始部位連接，其上游(5′方向)延伸包括在上述背景下引發(fā)可檢測水平的轉(zhuǎn)錄所需的最小數(shù)量的堿基或元件。在啟動子序列中會發(fā)現(xiàn)有轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)(常規(guī)情況下用核酸酶S1作圖來確定)，還有與RNA聚合酶結(jié)合的蛋白質(zhì)結(jié)合區(qū)域(共有序列)。真核生物啟動子通常(但不總是)含有“TATA”框和“CAT”框。原核生物啟動子除-10和-35共有序列外還含有SD序列。
“表達(dá)控制序列”是控制并調(diào)節(jié)另一DNA序列轉(zhuǎn)錄和翻譯的DNA序列。當(dāng)RNA聚合酶將編碼序列轉(zhuǎn)錄成mRNA時，編碼序列是處于轉(zhuǎn)錄和翻譯控制序列的“控制”下，然后mRNA被翻譯成由編碼序列編碼的蛋白質(zhì)。
“信號序列”可以包括編碼序列之前的部分。該序列編碼信號肽，即多肽的N末端，其與宿主細(xì)胞聯(lián)系并使多肽到達(dá)細(xì)胞表面或分泌入基質(zhì)，該信號肽在蛋白質(zhì)離開細(xì)胞前被宿主細(xì)胞切下。信號序列可與多種原核和真核生物天然蛋白質(zhì)關(guān)聯(lián)。
術(shù)語“寡核苷酸”在這里指本發(fā)明的探針，其被定義為包括兩個或多個核糖核苷酸的分子，最好超過三個。其確切大小與許多因素有關(guān)，而這些因素反過來與寡核苷酸的最終功能和用途有關(guān)。
術(shù)語“引物”在這里指一種寡核苷酸，無論其是天然存在于純化的限制性消化物中或是合成的，當(dāng)在誘導(dǎo)引物延伸產(chǎn)物的合成(與核酸鏈互補(bǔ))的條件下，即在有核苷酸、誘導(dǎo)劑如DNA聚合酶和合適的溫度pH下，它可作為合成的引發(fā)點(diǎn)。引物可以是單鏈或雙鏈的，且必須有足夠的長度，以在誘導(dǎo)劑存在時引發(fā)合成所需的延伸產(chǎn)物。引物的確切長度依賴于許多因素，其包括溫度、引物來源及其使用方法。例如，對于診斷應(yīng)用，根據(jù)靶序列的復(fù)雜性，寡核苷酸引物通常含有15-25或更多的核苷酸，盡管它可含有較少的核苷酸。
這里的引物的選擇應(yīng)“基本上”與特定靶DNA序列的不同鏈互補(bǔ)。這意味著引物必須足夠互補(bǔ)來與它們各自的鏈雜交。因此，引物序列不需要反映模板的確切序列。例如，非互補(bǔ)的核苷酸片段可與引物的5′端連接，而引物序列的其余部分與鏈互補(bǔ)?；蛘?，非互補(bǔ)的堿基或更長的序列可散布在引物中，只要引物序列與序列有足夠的互補(bǔ)性或與其雜交，從而制成延伸產(chǎn)物的合成模板。
如這里所用的，術(shù)語“限制性內(nèi)切核酸酶”和“限制性酶”均指在特異性核苷酸序列處或附近切開雙鏈DNA的細(xì)菌酶。
當(dāng)這種DNA被引入細(xì)胞內(nèi)，細(xì)胞就被外源或異源DNA“轉(zhuǎn)化”。轉(zhuǎn)化的DNA可以或不必整合(共價連接)入細(xì)胞的基因組。例如在原核生物、酵母和哺乳動物細(xì)胞中，轉(zhuǎn)化DNA可以維持在如質(zhì)粒那樣的附加型元件中。對于真核細(xì)胞，穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的細(xì)胞中轉(zhuǎn)化的DNA已整合入染色體中，這樣就能通過染色體的復(fù)制遺傳給子代細(xì)胞。這一穩(wěn)定性是由真核細(xì)胞建立的由一群含有轉(zhuǎn)化DNA的子代細(xì)胞組成的細(xì)胞系或克隆系的能力來證明?！翱寺∠怠笔且蝗簭膯蝹€細(xì)胞或單一祖細(xì)胞(monnon ancestor)通過有絲分裂獲得?！凹?xì)胞系”是可以在體外穩(wěn)定生長許多代的原始細(xì)胞的克隆系。
當(dāng)DNA序列確定長度內(nèi)至少約75％(較佳至少約80％，最佳至少約90或95％)的核苷酸相同時，兩個DNA序列是“基本上同源的”?；旧贤吹男蛄锌赏ㄟ^用標(biāo)準(zhǔn)軟件比較序列來鑒定，其中序列從序列數(shù)據(jù)庫或Southern雜交實(shí)驗在例如該特定系統(tǒng)確定的嚴(yán)格條件下獲得。確定的合適雜交條件是該領(lǐng)域已知的。例如見Maniatis等人，同上；DNA Cloning，Vols.I&II，同上；Nucleic AcidHybridization，同上。
DNA構(gòu)建物的“異源”區(qū)是在較大DNA分子中可鑒別的DNA片段，其在自然界中沒有發(fā)現(xiàn)與較大分子連接。因此，當(dāng)異源區(qū)編碼哺乳動物基因時，基因通常被DNA側(cè)接(flank)，而該DNA不與源有機(jī)物基因組中的哺乳動物基因組DNA側(cè)接。在另一個例子中，編碼序列是一個構(gòu)建物，其中的編碼序列在自然界中沒有發(fā)現(xiàn)(如含有內(nèi)含子的基因組編碼序列cDNA，或含有與天然基因不同的密碼子的合成序列)。等位變異或天然發(fā)生的突變不會產(chǎn)生這里定義的DNA異源區(qū)。
這些研究中最常用的標(biāo)記是放射性元素、酶、暴露在紫外光下時產(chǎn)生熒光的化學(xué)物質(zhì)等。許多熒光性物質(zhì)是已知的，并可用作標(biāo)記。它們包括例如熒光素、若丹明、金胺、得克薩斯紅(Texas Red)、AMCA藍(lán)和Lucifer黃。特別的檢測物是在山羊中制備的與熒光素通過異硫氰酸酯共軛的抗兔抗體。
蛋白質(zhì)也可用放射性元素或酶來作標(biāo)記。放射性標(biāo)記可用任何現(xiàn)有的計量方法來檢測。較佳的同位素可選自3H、14C、32P、35S、36Cl、51Cr、31Co、58Co、59Fe、90Y、125I、131I和186Re。
同樣可使用酶標(biāo)記，其可用任何現(xiàn)在采用的比色法、分光法、熒光分光光度法、電流分析法或氣體計量法技術(shù)來檢測。酶通過與橋接分子如碳化二亞胺、二異氰酸酯、戊二醛等反應(yīng)來共軛連接到選擇的顆粒上?？捎糜谶@些步驟的許多酶是已知的并可被采用。較佳的是過氧化物酶、β-葡糖醛酸酶、β-D-葡糖苷酶、β-D-半乳糖苷酶、脲酶、葡萄糖氧化酶加上過氧化物酶和堿性磷酸酶。美國專利No.3,654,090，3,850,752和4,016,043公開了不同標(biāo)記物和方法的實(shí)施例。
該領(lǐng)域研究出并采用的特別測定系統(tǒng)是受體測定法。在受體測定法中，對待測物作適當(dāng)?shù)臉?biāo)記，然后對某種細(xì)胞測試菌落用一定量的標(biāo)記接種，然后進(jìn)行結(jié)合研究以測定標(biāo)記物與細(xì)胞受體的結(jié)合情況。通過這種方法就可確定物體間的親和性差別。
該領(lǐng)域已知的有用的測定方法是“順/反”測定法。簡單的說，該測定法采用了兩種基因構(gòu)建物，一種通常是在轉(zhuǎn)染入合適細(xì)胞系后可連續(xù)表達(dá)感興趣的特定受體的質(zhì)粒，第二種是在受體/配體復(fù)合體的控制下表達(dá)報道分子如螢光素酶的質(zhì)粒。因此，例如，如果要評價一種作為特定受體的配體的化合物，一種質(zhì)粒應(yīng)是一種導(dǎo)致受體在所選細(xì)胞系中表達(dá)的構(gòu)建物，而第二種質(zhì)粒應(yīng)有與螢光素酶基因連接的啟動子，而螢光素酶基因中插入有特定受體的效應(yīng)元件。如果待測化合物是受體的刺激物時，配體將與受體復(fù)合，得到的復(fù)合體與效應(yīng)元件結(jié)合并啟動螢光素酶基因的轉(zhuǎn)錄。然后光計量測定得到的化學(xué)發(fā)光值，獲得劑量效應(yīng)曲線并與已知的配體比較。前述的過程在美國專利No.4,981,784和PCT國際
發(fā)明者M·R·蒙特米尼, B·皮爾斯 申請人:研究發(fā)展基金會