專利名稱：用于檢測基因多態(tài)性的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及遺傳多態(tài)性信息；用于檢測遺傳多態(tài)性信息的方法；使用遺傳多態(tài)性評估藥物的方法；和用于篩選藥物的方法。
背景技術(shù)：
與人類個體的身體外觀變化無窮一樣，在個體之間進(jìn)行比較后發(fā)現(xiàn)，由三十億(3,000,000,000)個堿基對組成的人類遺傳密碼在相當(dāng)多的位點處存在變化。遺傳密碼中的這些差異稱為遺傳多態(tài)性，而單核苷酸多態(tài)性是具有代表性的多態(tài)性。
單核苷酸多態(tài)性(SNP)指個體間一個DNA字母的差異。就像人類個體的相貌和體型變化無窮一樣，個體的核苷酸序列(即遺傳密碼)在相當(dāng)多的位點處存在變化。根據(jù)SNP的位置，它們分成cSNP(編碼SNP)和gSNP(基因組SNP)；cSNP進(jìn)一步分成sSNP(沉默SNP)、rSNP(調(diào)控SNP)、和iSNP(內(nèi)含子SNP)。
這些SNP可以作為多態(tài)標(biāo)記用于搜索那些與疾病的發(fā)展或惡化有關(guān)的基因；最后，在臨床領(lǐng)域，這些SNP直接涉及疾病的風(fēng)險診斷或者治療性藥物的選擇和使用。同樣，根據(jù)使用引發(fā)物作為靶分子獲得的證據(jù)來開發(fā)藥物已經(jīng)成為世界趨勢。在對患有相同疾病的患者施用藥物后，他們的響應(yīng)度是多樣性的。有些患者顯示顯著效果；有些患者顯示較低效果；而有些患者顯示沒有效果。因此，對藥物的響應(yīng)度隨患者存在極大變化。即使患者的狀況是相同的，而且診斷患有相同疾病，然而引起該疾病的路徑可能是不同的；或者，藥物結(jié)合其受體的能力、受體的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)能力、或受體自身的表達(dá)水平可能在患者間存在極大變化。因此，希望根據(jù)諸如SNP等遺傳多態(tài)性而針對目標(biāo)疾病選擇合適藥物并開發(fā)合適治療方法(即希望所謂的個性化醫(yī)學(xué))。
除了對藥物的響應(yīng)度以外，有時可能致命的強(qiáng)烈副作用也是醫(yī)務(wù)人員應(yīng)當(dāng)考慮的主要問題之一。即使沒有由藥方錯誤等引起的過量施用，仍然可能發(fā)生意外的致命副作用。因此，在對藥物的響應(yīng)方面，只考慮藥物的代謝和給藥是不夠的；還應(yīng)當(dāng)考慮到諸如SNP等遺傳多態(tài)性，在藥物受體的響應(yīng)度和那些與副作用有關(guān)的受體的敏感性方面測定個體差異。
發(fā)明描述本發(fā)明的目標(biāo)是提供用于檢測遺傳多態(tài)性信息的方法、根據(jù)該信息評估藥物的功效和安全性的方法、以及用于篩選藥物的方法。
作為解決上述問題的廣泛且深入研究的結(jié)果，本發(fā)明人成功建立了如下方法，包括檢測編碼受體的基因中的遺傳多態(tài)性，并根據(jù)由此得到的信息評估由受體介導(dǎo)的藥物的敏感性和副作用的發(fā)生，其中并不認(rèn)為該受體是藥物的作用靶。由此完成了本發(fā)明。
本發(fā)明描述如下。
(1)用于檢測遺傳多態(tài)性的方法，包括生成寡核苷酸探針和/或寡核苷酸引物，使得探針和/或引物包含在編碼受體的基因或與其互補(bǔ)的序列中存在的多態(tài)位點，或者，當(dāng)編碼受體的所述基因和與其互補(bǔ)的所述序列至少其中之一得到擴(kuò)增時，使得多態(tài)位點包含在擴(kuò)增片段中；并使用由此生成的寡核苷酸探針和/或寡核苷酸引物檢測編碼受體的受試者基因中的至少一種遺傳多態(tài)性。
(2)用于檢測遺傳多態(tài)性的方法，包括生成寡核苷酸探針和/或寡核苷酸引物，使得探針和/或引物包含在編碼受體的基因或與其互補(bǔ)的序列中存在的多態(tài)位點，或者，當(dāng)編碼受體的所述基因和與其互補(bǔ)的所述序列至少其中之一得到擴(kuò)增時，使得多態(tài)位點包含在擴(kuò)增片段中；并且使用由此生成的寡核苷酸探針和/或寡核苷酸引物檢測編碼受體的受試者基因中的至少一種遺傳多態(tài)性；其中所述多態(tài)位點是在SEQ ID NO1-1168所示核苷酸序列或與其互補(bǔ)的序列中存在的至少一種多態(tài)位點。
(3)用于檢測遺傳多態(tài)性的方法，包括生成寡核苷酸探針和/或寡核苷酸引物，使得探針和/或引物包含在編碼受體的基因或與其互補(bǔ)的序列中存在的多態(tài)位點，或者，當(dāng)編碼受體的所述基因和與其互補(bǔ)的所述序列至少其中之一得到擴(kuò)增時，使得多態(tài)位點包含在擴(kuò)增片段中；并且使用由此生成的寡核苷酸探針和/或寡核苷酸引物檢測編碼受體的受試者基因中的至少一種遺傳多態(tài)性；其中所述寡核苷酸探針和/或寡核苷酸引物至少其中之一是選自具有SEQ ID NO1-1168所示核苷酸序列中含多態(tài)位點的至少13個核苷酸的序列或與該含多態(tài)位點的至少13個核苷酸的序列互補(bǔ)的序列的探針和引物。
上文所述寡核苷酸探針和/或寡核苷酸引物的長度可以是13-60個核苷酸。
(4)在上文(1)-(3)所述方法中，表1所示信息(如表1所示SEQID NO1-1168序列信息)可以用作多態(tài)位點信息。作為上文所述含多態(tài)位點的寡核苷酸探針和/或寡核苷酸引物的具體實例，可以給出這樣生成的探針和/或引物，使得位于其5′或3′末端或其中心部分的核苷酸是多態(tài)位點。同樣包括在本發(fā)明中作為含多態(tài)位點的寡核苷酸探針的是由彼此相連的兩個片段組成的寡核苷酸探針，其中一個片段能夠與編碼受體的基因或與其互補(bǔ)的序列雜交，另一個片段不能與其雜交，而且多態(tài)位點位于可雜交片段的5′或3′末端。
在本發(fā)明中，對遺傳多態(tài)性的類型沒有特別的限制。例如，可以列舉單核苷酸多態(tài)性、由多個核苷酸的缺失、替代、或插入引起的多態(tài)性、或VNTR或微衛(wèi)星多態(tài)性。
(5)用于評估藥物的方法，包括根據(jù)通過上文(1)-(4)任一種方法獲得的檢測結(jié)果評估由受體介導(dǎo)的藥物的功效和安全性。
(6)用于評估藥物的方法，包括根據(jù)通過上文(1)-(4)任一種方法獲得的檢測結(jié)果評估由受體介導(dǎo)的藥物的敏感程度。
(7)用于選擇藥物的方法，包括使用通過上文(5)或(6)的方法獲得的評估結(jié)果來選擇將要使用的藥物。
(8)用于選擇藥物的方法，包括將編碼受體的基因或與其互補(bǔ)的序列中的多態(tài)性信息與由受試者獲得的編碼受體的基因或與其互補(bǔ)的序列中的多態(tài)性信息進(jìn)行比較；在由受體介導(dǎo)的藥物的功效和/或安全性方面分析個體差異；并根據(jù)獲得的分析結(jié)果選擇將要使用的藥物和/或藥物的劑量。
(9)在上文(1)-(4)的檢測方法、上文(5)和(6)的評估方法、或上文(7)和(8)的選擇方法中，選自下組的至少一種可以用作受體CD20，CD33，CSF3R，IL1R1，IL1R2，IL2R，HER2，IFNAR1，PGR，ACTH，ICAM1，VCAM1，ITGB2，PTGDR，PTGER1，PTGER2，PTGER3，PTGFR，GNA12，TBXA2R，BLTR2，CYSLT1，CYSLT2，PTAFR，BDKRB1，BDKRB2，ADRB1，ADRB2，HRH1，HRH2，HRH3，HTR3A，AGTR1，AGTRL1，AGTR2，AVPR1A，AVPR2，PTGIR，DRD1，ITGA2B，F(xiàn)OLR1，TNFR1，ADORA1，ADORA2A，ADORA2B，ADORA3，AVPR1B，ADRA1A，ADRA2A，ADRA2B，EDG1，EDG4，EDG5，GPR1，GPR2，GPR3，GPR4，GPR10，MC1R，MC2R，MC3R，MC4R，OXTR，SSTR1和SSTR3。
(10)這樣生成的寡核苷酸，使得它包含在編碼受體的基因或與其互補(bǔ)的序列中存在的多態(tài)位點。
(11)這樣生成的寡核苷酸，使得它包含在編碼選自下組的任何受體的基因或與其互補(bǔ)的序列中存在的多態(tài)位點CD20，CD33，CSF3R，IL1R1，IL1R2，IL2R，HER2，IFNAR1，PGR，ACTH，ICAM1，VCAM1，ITGB2，PTGDR，PTGER1，PTGER2，PTGER3，PTGFR，GNA12，TBXA2R，BLTR2，CYSLT1，CYSLT2，PTAFR，BDKRB1，BDKRB2，ADRB1，ADRB2，HRH1，HRH2，HRH3，HTR3A，AGTR1，AGTRL1，AGTR2，AVPR1A，AVPR2，PTGIR，DRD1，ITGA2B，F(xiàn)OLR1，TNFR1，ADORA1，ADORA2A，ADORA2B，ADORA3，AVPR1B，ADRA1A，ADRA2A，ADRA2B，EDG1，EDG4，EDG5，GPR1，GPR2，GPR3，GPR4，GPR10，MC1R，MC2R，MC3R，MC4R，OXTR，SSTR1和SSTR3。
(12)這樣生成上文(10)或(11)的寡核苷酸，例如，使得位于其5′或3′末端或其中心部分的核苷酸是多態(tài)位點?；蛘?，可以生成上文所述含多態(tài)位點的寡核苷酸，使得寡核苷酸是由彼此相連的兩個片段組成的，其中一個片段能夠與編碼受體的基因或與其互補(bǔ)的序列雜交，另一個片段不能與其雜交，而且多態(tài)位點位于可雜交片段的5′或3′末端。作為本發(fā)明寡核苷酸的更加具體的實例，可以給出包含至少一個在SEQ ID NO1-1168所示核苷酸序列或與其互補(bǔ)的序列中存在的多態(tài)位點的寡核苷酸。這些寡核苷酸可以是長度為13-35個核苷酸的寡核苷酸，或者是由包含SEQ ID NO1-1168所示任一核苷酸序列中第21個核苷酸的至少13個核苷酸的序列或與該至少13個核苷酸的序列互補(bǔ)的序列組成的寡核苷酸。選自SEQ ID NO1-1168所示核苷酸序列和與其互補(bǔ)的序列的寡核苷酸也包括在本發(fā)明內(nèi)。
(13)長度為13-60個核苷酸、在包含SEQ ID NO1-1168所示任何核苷酸序列或與其互補(bǔ)的序列中的多態(tài)位點的基因組DNA區(qū)域中設(shè)計的寡核苷酸，使得它位于該基因組DNA區(qū)域5′和/或3′末端的多態(tài)位點的1000bp距離內(nèi)。
(14)微陣列，其中上文(12)或(13)的寡核苷酸固定在支持物上。
(15)包含上文(12)或(13)的寡核苷酸和/或上文(14)的微陣列的遺傳多態(tài)性檢測試劑盒。
下面，將更加詳細(xì)的描述本發(fā)明。
本發(fā)明涉及使用受體的遺傳多態(tài)性信息來檢測受試者中的遺傳多態(tài)性的方法。本發(fā)明還表征為分析由受體介導(dǎo)的藥物的功效存在與否或強(qiáng)度和安全性；根據(jù)分析結(jié)果評估疾病與藥物之間的相關(guān)性。即使多名患者患有相同疾病，然而相當(dāng)普遍的是遺傳多態(tài)性信息在各個患者間仍然存在變化。因此，由患者間不同的遺傳多態(tài)性信息分析受體對藥物的敏感性的差異；然后評估藥物的功效和/或安全性(即當(dāng)患者具有這樣那樣的遺傳多態(tài)性信息時，認(rèn)可或不認(rèn)可特定藥物有功效；或者，當(dāng)患者具有這樣那樣的遺傳多態(tài)性信息時，常?；蚝苌侔l(fā)生副作用)。根據(jù)這些結(jié)果有可能確定哪種藥物應(yīng)當(dāng)用于特定疾病，并根據(jù)患者個人的遺傳多態(tài)性信息施用適合于他/她的藥物(定制藥物)。
1.遺傳多態(tài)性遺傳多態(tài)性包括單核苷酸多態(tài)性、插入/缺失多態(tài)性、以及由核苷酸序列重復(fù)次數(shù)差異引起的多態(tài)性。一般而言，單核苷酸多態(tài)性(SNP)指在基因或其互補(bǔ)鏈(互補(bǔ)序列)區(qū)域中用其它核苷酸替代一個特定核苷酸引起的多態(tài)性。然而，在本發(fā)明中，除了由上述替代引起的多態(tài)性以外，術(shù)語SNP還包括由核苷酸缺失引起的多態(tài)性和通過向核苷酸添加一個或多個核苷酸引起的多態(tài)性。
插入/缺失型多態(tài)性指由缺失或插入多個核苷酸(如兩個至幾十個核苷酸)引起的多態(tài)性。有時，可以缺失或插入幾百個至幾千個核苷酸。由核苷酸序列重復(fù)次數(shù)差異引起的多態(tài)性具有兩個至幾十個核苷酸的序列的重復(fù)，而且重復(fù)次數(shù)在個體間存在變化。重復(fù)單元由幾個至幾十個核苷酸組成的那些多態(tài)性稱為VNTR(重復(fù)片段串聯(lián)數(shù)目可變)多態(tài)性，而重復(fù)單元由大約兩個至四個核苷酸組成的那些多態(tài)性稱為微衛(wèi)星多態(tài)性。在VNTR或微衛(wèi)星多態(tài)性中，這些重復(fù)片段的數(shù)目在個體等位基因間存在差異，從而獲得變異。
此處應(yīng)當(dāng)注意的是，遺傳多態(tài)性信息包括基因中的多態(tài)性信息及其互補(bǔ)序列中的多態(tài)性信息二者。術(shù)語“互補(bǔ)鏈”或“互補(bǔ)序列”指在堿基配對關(guān)系的多核苷酸。例如，序列5′-A-G-T-3′與序列3′-T-C-A-5′互補(bǔ)?；パa(bǔ)可以是部分的(即多核苷酸中只有一定數(shù)目的核苷酸是依照堿基配對規(guī)則匹配的)，或者整個序列可以是完全互補(bǔ)的。這種互補(bǔ)程度顯著影響雜交的效力和強(qiáng)度。這在利用多核苷酸之間結(jié)合的擴(kuò)增反應(yīng)和檢測方法中是特別重要的。
核苷酸序列的互補(bǔ)指在將寡核苷酸的一種序列與其它序列進(jìn)行比對以使得前者的5′末端與后者的3′末端成對后，寡核苷酸序列彼此反向平行。互補(bǔ)不必是完全的；雙鏈螺旋體是穩(wěn)定的，即使它包含錯配堿基對或不匹配堿基?？紤]例如寡核苷酸的長度、核苷酸組成和寡核苷酸序列、離子強(qiáng)度、以及錯配堿基的存在等，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員能夠憑經(jīng)驗確定雙鏈螺旋體的穩(wěn)定性。
2.受體“受體”是一般術(shù)語，指應(yīng)答特定配體諸如激素、自身活性物質(zhì)(autacoid)、神經(jīng)遞質(zhì)等的接受者。作為代表性受體，已知有細(xì)胞膜受體和核受體。有些藥物抑制或拮抗特定配體與這種受體的結(jié)合，或者以與其配體相同的方式結(jié)合受體，由此刺激受體負(fù)責(zé)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。因此，當(dāng)配體結(jié)合受體的能力、受體的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)能力、或受體自身的表達(dá)水平受到遺傳多態(tài)性的影響時，藥物的功效或副作用發(fā)生個體差異。
在本發(fā)明中，由進(jìn)行遺傳多態(tài)性分析的靶基因表達(dá)的受體的實例包括下列受體。
CD20，CD33，CSF3R，IL1R1，IL1R2，IL2R，HER2，IFNAR1，PGR，ACTH，ICAM1，VCAM1，ITGB2，PTGDR，PTGER1，PTGER2，PTGER3，PTGFR，GNA12，TBXA2R，BLTR2，CYSLT1，CYSLT2，PTAFR，BDKRB1，BDKRB2，ADRB1，ADRB2，HRH1，HRH2，HRH3，HTR3A，AGTR1，AGTRL1，AGTR2，AVPR1A，AVPR2，PTGIR，DRD1，ITGA2B，F(xiàn)OLR1，TNFR1，ADORA1，ADORA2A，ADORA2B，ADORA3，AVPR1B，ADRA1A，ADRA2A，ADRA2B，EDG1，EDG4，EDG5，GPR1，GPR2，GPR3，GPR4，GPR10，MC1R，MC2R，MC3R，MC4R，OXTR，SSTR1和SSTR3。
受體指只是單獨地控制特定配體的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的接受者。
(1)CD20代表CD20抗原的受體。
(2)CD33代表CD33抗原的受體。
(3)CSF3R代表集落刺激因子3的受體。
(4)IL1R1代表白介素-1的受體。
(5)IL1R2代表白介素-1的受體。
(6)IL2R代表白介素-2的受體。
(7)HER2代表c-erb-B-2的受體。
(8)IFNAR1代表干擾素α、β、和ω的受體。
(9)PGR代表孕酮的受體。
(10)ACTH代表黑皮質(zhì)素2的受體。
(11)ICAM1代表人細(xì)胞間粘附分子1(CD54)的受體。
(12)VCAM1代表脈管細(xì)胞粘附分子1的受體。
(13)ITGB2代表整合蛋白β2[抗原CD18(p95)，淋巴細(xì)胞功能相關(guān)抗原1；巨噬細(xì)胞抗原1(mac-1)β亞基]的受體。
(14)PTGDR代表前列腺素D2的受體。
(15)PTGER1代表前列腺素E1的受體。
(16)PTGER2代表前列腺素E2的受體。
(17)PTGER3代表前列腺素E3的受體。
(18)PTGFR代表前列腺素F的受體。
(19)GNA12代表血栓烷A2的受體。
(20)TBXA2R代表血栓烷A2的受體。
(21)BLTR2代表白三烯B4的受體。
(22)CYSLT1代表半胱氨酰白三烯的受體。
(23)CYSLT2代表半胱氨酰白三烯的受體。
(24)PTAFR代表血小板激活因子的受體。
(25)BDKRB1代表緩激肽的受體。
(26)BDKRB2代表緩激肽的受體。
(27)ADRB1代表兒茶酚胺β-1的受體。
(28)ADRB2代表兒茶酚胺β-2的受體。
(29)HRH1代表組胺H1受體。
(30)HRH2代表組胺H2受體。
(31)HRH3代表組胺H3受體。
(32)HTR3A代表5-羥色胺(血清素)的受體。
(33)AGTR1代表血管緊張素受體1。
(34)AGTRL1代表血管緊張素樣受體。
(35)AGTR2代表血管緊張素的受體。
(36)AVPR1A代表精氨酸血管升壓素的受體。
(37)AVPR2代表精氨酸血管升壓素的受體。
(38)PTGIR代表前列腺素I2(前列環(huán)素)的受體。
(39)DRD1代表多巴胺的受體。
(40)ITGA2B代表整合蛋白α2b(IIb/IIIa復(fù)合物的血小板糖蛋白IIb，抗原CD41B)的受體。
(41)FOLR1代表葉酸受體1。
(42)TNFR1代表腫瘤壞死因子受體1(編號AC006057.5)。
(43)ADORA1代表腺苷A1受體。
(44)ADORA2A代表腺苷A2受體。
(45)ADORA2B代表腺苷A2B受體。
(46)ADORA3代表腺苷A3受體。
(47)AVPR1B代表精氨酸血管升壓素受體1B。
(48)ADRA1A代表腎上腺素能α-1A受體。
(49)ADRA2A代表腎上腺素能α-2A受體。
(50)ADRA2B代表腎上腺素能α-2B受體。
(51)EDG1代表內(nèi)皮分化、鞘脂G-蛋白偶聯(lián)受體1。
(52)EDG4代表內(nèi)皮分化、鞘脂G-蛋白偶聯(lián)受體4。
(53)EDG5代表內(nèi)皮分化、鞘脂G-蛋白偶聯(lián)受體5。
(54)GPR1代表G蛋白偶聯(lián)受體1。
(55)GPR2代表G蛋白偶聯(lián)受體2。
(56)GPR3代表G蛋白偶聯(lián)受體3。
(57)GPR4代表G蛋白偶聯(lián)受體4。
(58)GPR10代表G蛋白偶聯(lián)受體10。
(59)MC1R代表黑皮質(zhì)素1受體。
(60)MC2R代表黑皮質(zhì)素2受體。
(61)MC3R代表黑皮質(zhì)素3受體。
(62)MC4R代表黑皮質(zhì)素4受體。
(63)OXTR代表催產(chǎn)素受體。
(64)SSTR1代表抑生長素受體1。
(65)SSTR3代表抑生長素受體3。
3.遺傳多態(tài)性信息可以通過用于檢測遺傳多態(tài)性的常規(guī)方法來獲得遺傳多態(tài)性信息。例如，可以采用測序法、PCR法、片段長度多態(tài)性測定法、使用等位基因特異性寡核苷酸作為模板的雜交法(如TaqMan PCR法、侵入者法、DNA芯片法)、使用引物延伸反應(yīng)的方法、測序法、MALDI-TOF/MS法、DNA芯片法、等。PCR法和測序法可用于檢測任何類型的遺傳多態(tài)性。其它方法主要可用于檢測SNP。
TaqMan PCR法是使用熒光標(biāo)記的等位基因特異性寡核苷酸和TaqDNA聚合酶進(jìn)行PCR反應(yīng)的一種方法(Livak，K.J.，Genet.Anal.，14143，1999；Morris，T.等人，J.Clin.Microbiol.，342933，1996)。侵入者法是將對各自SNP等位基因特異的兩種報道者探針和一種侵入者探針與模板DNA的雜交與具有特異性內(nèi)切核酸酶活性(在識別DNA結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上進(jìn)行切割)的酶進(jìn)行的DNA切割相聯(lián)合的一種方法(例如參閱Livak，K.J.，Biomol.Eng.，14143-149，1999；Morris，T.等人，J.Clin.Microbiol.，342933，1996；Lyamichev，V.等人，Science260778-783，1993)。
作為使用引物延伸反應(yīng)的方法，可以采用例如SniPer法。SniPer法的基本原理是稱為RCA(滾動環(huán)狀擴(kuò)增)法的技術(shù)，其中聚合酶在作為模板的環(huán)狀單鏈DNA上移動，從而連續(xù)合成它的互補(bǔ)鏈。根據(jù)這種方法，可以通過檢測DNA擴(kuò)增進(jìn)行時發(fā)生的顯色反應(yīng)的存在與否來判斷SNP(Lizardi，P.M.等人，Nature Genet.，19225-232，1998；Piated，A.S.等人，Nature Biotech.，16359-363，1998)。
測序法指通過PCR擴(kuò)增含多態(tài)性的區(qū)域并使用Dye Terminator等對擴(kuò)增產(chǎn)物的DNA序列測序從而分析遺傳多態(tài)性(尤其是SNP)的頻率的一種方法。
MALDI-TOF/MS法是使用質(zhì)譜儀的一種方法?；旧?，這是利用不同核苷酸的質(zhì)量差異來進(jìn)行SNP基因定型的方法。還有使用PCR擴(kuò)增的方法和使用多鏈體(multiplex)的方法(Haff，L.A.、Smirnov，I.P.，Genome Res.，7378-，1997；Little，D.P.等人，Eur.J.Clinica.Chem.Clin.Biochem.，35545-，1997；Ross，P.等人，Nat.Biotechnol.，161347-，1998)。
DNA芯片法是將很多種DNA探針排列并固定在基片諸如玻璃片上；然后在它上面進(jìn)行標(biāo)記DNA的雜交；并且通過檢測探針上標(biāo)記信號(諸如熒光)的方法可區(qū)分地檢測完全匹配和單核苷酸錯配的一種方法。
可用于本發(fā)明方法的遺傳多態(tài)性信息，特別是SNP信息，如下文表1所示。
表1

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在表1中，“基因名稱”欄顯示編碼受體的基因的名稱?！靶蛄小睓谥幸源髮懽帜副硎龅暮塑账?即“序列”欄中第21位核苷酸)即多態(tài)性信息。該表中的序列基本上顯示了SNP之前和之后各20個核苷酸。然而，有些序列在第21位多態(tài)位點之前或之后20個核苷酸中具有額外的多態(tài)性。例如，CD20的No.9(SEQ ID NO9)中第16位的“T/C”或IL1R的No.10(SEQ ID NO57)中第5位的“T/C”也是多態(tài)性。記號“/”兩側(cè)的兩個核苷酸表示核苷酸的純合或雜合SNP。例如，“A/G”表示等位基因是A/A或G/G純合子或A/G雜合子。然而，括號中的核苷酸[如CSF3R的No.12(SEQ ID NO46)中的(A)]表示由插入引起的多態(tài)性。記號“Δ”[如參見IL1R2的No.37(SEQ ID NO133)]表示由缺失一個或多個核苷酸引起的多態(tài)性。括號中的核苷酸連同數(shù)字指括號中的核苷酸重復(fù)了該數(shù)字的次數(shù)。例如，SEQ ID NO43(表1，CSF3R的No.9)中出現(xiàn)的“(C)8-10”指序列中C重復(fù)8-10次。應(yīng)當(dāng)注意的是，表1“序列”欄中所述核苷酸序列中解釋位置關(guān)系的所用術(shù)語“第21位”指遺傳多態(tài)性位點的位置。因此，在缺失SNP(Δ)的情況中，缺失的假想核苷酸是“第21位”。在多個核苷酸位于多態(tài)位點的情況中，那些核苷酸作為一組是“第21位”。例如，在VCAM1的No.18(SEQ ID NO249)的情況中，多態(tài)位點“GCAG”或缺失位點是第21位；在IL1R的No.41(SEQ ID NO89)的情況中，多態(tài)位點“(A)9-12”是第21位。
“位置”顯示SNP在基因組中的位置。SNP在5′側(cè)翼區(qū)、內(nèi)含子區(qū)、和3′側(cè)翼區(qū)中的位置的表述以位于外顯子1的5′最末端核苷酸上游1bp的核苷酸為-1位置。然后，朝著基因的5′端，核苷酸的編號是-2、-3、-4、...。內(nèi)含子區(qū)指跨越位于外顯子3′末端下游1bp的核苷酸至下一個外顯子的區(qū)域。內(nèi)含子的編號與位于該內(nèi)含子5′端的外顯子的編號相同。例如，位于外顯子3與外顯子4之間的內(nèi)含子(即位于外顯子3的3′端的內(nèi)含子)稱為內(nèi)含子3。內(nèi)含子區(qū)中SNP的位置的計數(shù)以緊挨著位于該內(nèi)含子5′端的外顯子/內(nèi)含子相接處3′的第一個核苷酸為內(nèi)含子核苷酸序列的位置1。帶有“+”記號或無任何記號的數(shù)字指它們是朝著基因的3′端計數(shù)的；帶有“-”記號的數(shù)字指它們是朝著基因的5′端計數(shù)的。例如，若由外顯子3/內(nèi)含子3相接處朝著基因3′端計數(shù)的第三個核苷酸是多態(tài)的，則該位置表述為“內(nèi)含子3，+3”。相似的，若由內(nèi)含子3/外顯子4相接處朝著基因的5′端計數(shù)的第五個核苷酸是多態(tài)的，則該位置表述為“內(nèi)含子3，-5”。位于最后一個外顯子的3′端的區(qū)域稱為3′側(cè)翼區(qū)。此區(qū)中SNP的位置的計數(shù)以位于最后一個外顯子的3′最末端核苷酸下游1bp的核苷酸為位置1。應(yīng)當(dāng)注意的是，在表1“位置”欄中關(guān)于MC2R17-MC2R20(SEQID NO967-970)出現(xiàn)的數(shù)字是數(shù)據(jù)庫中指出的數(shù)字；通過本發(fā)明的分析獲得的數(shù)字顯示在括號中。在“編號”欄中出現(xiàn)的數(shù)字對應(yīng)于顯示SNP位置的相應(yīng)基因圖譜(圖9-73)中出現(xiàn)的數(shù)字。在圖9-73中，還提供了多態(tài)性在公開的基因組數(shù)據(jù)庫中的編號。通過使用表1、附圖、和數(shù)據(jù)庫中給出的信息，可以說明與多態(tài)性相鄰的序列。這些信息是有用的，例如可用于制備與多態(tài)性相鄰的PCR引物。
上述基因組數(shù)據(jù)庫的實例包括但不限于由NCBI(國家生物技術(shù)信息中心，美國)和IMS-JST JSNP數(shù)據(jù)庫網(wǎng)站(基因定型實驗室，SNP研究中心，日本理化研究所，日本)提供的服務(wù)列表。
4.寡核苷酸探針或寡核苷酸引物的制備可以根據(jù)表1所述核苷酸序列(SEQ ID NO1-1168)來制備作為引物和/或探針用于本發(fā)明檢測方法的寡核苷酸，例如在需要檢測SNP時，而且可以合成這些序列本身，或者可以設(shè)計并合成引物和/或探針，使得它們編碼這些序列的一部分。然而，此處應(yīng)當(dāng)注意的是，這些引物或探針的核苷酸序列必須包含SNP(表1“序列”欄中以大寫字母指示的部分)。本發(fā)明還包括這些序列的互補(bǔ)鏈。
出于例示目的以SNP作為范例，設(shè)計引物或探針，使得SNP位點位于引物或探針的核苷酸序列的3′或5′端；或者，設(shè)計引物或探針，使得SNP位點位于與其核苷酸序列互補(bǔ)的序列的3′或5′端。或者，設(shè)計引物或探針，使得SNP位點位于其核苷酸序列或與其互補(bǔ)的序列的3′或5′端四個核苷酸、優(yōu)選兩個核苷酸以內(nèi)?；蛘?，設(shè)計引物或探針，使得SNP位點位于寡核苷酸全長核苷酸序列的中央?！爸醒搿敝钢醒?yún)^(qū)，其中由此朝著5′端計數(shù)的核苷酸數(shù)目與由此朝著3′端計數(shù)的核苷酸數(shù)目幾乎相等。若寡核苷酸的核苷酸數(shù)目是奇數(shù)，“中央”指中央五個核苷酸，優(yōu)選中央三個核苷酸，最優(yōu)選真正中央的一個核苷酸。例如，若寡核苷酸由41個核苷酸組成，則“中央”指第19位至第23位核苷酸，優(yōu)選第20位至第22位核苷酸，最優(yōu)選第21位核苷酸。若寡核苷酸的核苷酸數(shù)目是偶數(shù)，則“中央”指中央四個核苷酸，優(yōu)選中央兩個核苷酸。例如，若寡核苷酸由40個核苷酸組成，則“中央”指第19位至第22位核苷酸，優(yōu)選第20位核苷酸。在表1“序列”欄所示核苷酸序列中，若多態(tài)性是缺失多態(tài)性，則這些序列的實際長度是40，一個偶數(shù)。因此，若根據(jù)這些序列來設(shè)計由40個核苷酸組成的寡核苷酸，則“中央”指第19位至第22位核苷酸，優(yōu)選第20位核苷酸。
當(dāng)多態(tài)位點由多個核苷酸組成時，將探針或引物設(shè)計并制備成使得多態(tài)位點的核苷酸序列或與其互補(bǔ)的序列的整個或部分包含在探針或引物的核苷酸序列中。當(dāng)由此制備的寡核苷酸用作探針時，有可能通過雜交或差異雜交的存在與否來測定等位基因。在下文中，將探針或引物DNA中那些與多態(tài)位點或其外圍位點形成互補(bǔ)鏈的核苷酸稱為“相應(yīng)核苷酸”?？梢栽O(shè)計探針或引物，使得相應(yīng)核苷酸位于構(gòu)成多態(tài)性的序列上的任何核苷酸處?！巴鈬稽c”指構(gòu)成多態(tài)性的序列5′最末端外側(cè)(5′側(cè))1-3個核苷酸的區(qū)域或構(gòu)成多態(tài)性的序列3′最末端外側(cè)(3′側(cè))1-3個核苷酸的區(qū)域。具體而言，可以設(shè)計探針或引物中的相應(yīng)核苷酸，使得5′或3′端核苷酸在形成互補(bǔ)鏈時位于構(gòu)成多態(tài)性的序列的5′末端側(cè)、3′末端側(cè)、或中央。在本發(fā)明中，優(yōu)選的是，上文所述5′或3′端核苷酸位于構(gòu)成多態(tài)性的序列的中央。還有可能設(shè)計相應(yīng)核苷酸，使得它們位于構(gòu)成多態(tài)性的序列的外圍區(qū)。
例如，在制備侵入者探針和等位基因探針并通過稍后所述侵入者法來檢測表1中PTGDR的No.13(SEQ ID NO313)中的遺傳多態(tài)性(TCC)時，可將等位基因探針設(shè)計成與多態(tài)位點TCC互補(bǔ)的核苷酸(即5′至3′方向的G、G、或A)是等位基因探針的相應(yīng)核苷酸并雜交(見圖4B的小圖a-c)。例如，在圖4B的小圖(a)中，形成互補(bǔ)鏈的5′最末端相應(yīng)核苷酸“G”位于構(gòu)成多態(tài)性的核苷酸(TCC)的中央；在圖4B的小圖(b)中，形成互補(bǔ)鏈的5′最末端相應(yīng)核苷酸“A”位于構(gòu)成多態(tài)性的核苷酸(TCC)的“T”處。在圖4B的小圖(d)中，顯示了等位基因探針，它被設(shè)計成它的相應(yīng)核苷酸位于多態(tài)位點(下劃線部分)的外圍區(qū)(三個核苷酸)。
設(shè)計侵入者探針，使得它的3′端核苷酸“N”(A、T、C、或G之任一)的位置在雜交時對應(yīng)于多態(tài)位點(TCC)任一核苷酸的位置。然而，最有效的是將侵入者探針設(shè)計成侵入者探針與等位基因探針之間存在一個核苷酸的重疊(圖4C)。另一方面，為了檢測另一種多態(tài)性(即TCC的缺失)，可以設(shè)計侵入者探針和等位基因探針，使得在考慮TCC缺失(即由序列進(jìn)行缺失)后位于缺失位點5′側(cè)或3′側(cè)1-3個核苷酸處的核苷酸將是重疊核苷酸。圖4B的小圖(e)顯示了等位基因探針，它被設(shè)計成使得缺失位點兩側(cè)的兩個核苷酸與其雜交。至于TaqMan探針，它們被設(shè)計成使得任何這些核苷酸TCC或缺失位點位于探針的中央。
設(shè)計核苷酸序列的長度，使得探針包含至少13個核苷酸，優(yōu)選13-60個核苷酸，更優(yōu)選15-40個核苷酸，最優(yōu)選18-30個核苷酸。此寡核苷酸序列可以作為探針用于檢測靶基因，而且它可以用作正向(有義)引物或反向(反義)引物。
本發(fā)明中所使用的寡核苷酸可以是由串聯(lián)的兩個區(qū)域組成的寡核苷酸，一個區(qū)域能夠與基因組DNA雜交，而另一個區(qū)域不能與其雜交。連接的次序沒有特別的限制；任何一個區(qū)域都可以位于上游或下游。根據(jù)表1所述含SNP序列的信息來設(shè)計此寡核苷酸的可雜交區(qū)。制備寡核苷酸，使得位于能夠與基因組DNA雜交的區(qū)域的5′或3′最末端的核苷酸對應(yīng)于目的SNP。隨意設(shè)計上述寡核苷酸中不能與基因組DNA雜交的區(qū)域，使得它不與表1所述含SNP的序列雜交。此寡核苷酸可以作為探針主要用于在侵入者法中檢測SNP。
另外，設(shè)計本發(fā)明中所使用的引物，使得出于檢查由SNP導(dǎo)致的功能變化、判斷有效或無效、以及檢查副作用的發(fā)生的目的而通過PCR進(jìn)行擴(kuò)增時表1給出的核苷酸序列包含SNP。設(shè)計引物的長度，使得引物包含至少15個核苷酸，優(yōu)選15-30個核苷酸，更優(yōu)選18-24個核苷酸。由模板DNA適當(dāng)選擇引物序列，使得擴(kuò)增片段的長度為1000bp或更少，優(yōu)選500bp以內(nèi)(如120-500bp)，更優(yōu)選200bp以內(nèi)(如120-200bp)。
例如，設(shè)計引物，使得有義或反義引物至少其中之一包含在由緊挨著SNP的5′或3′端的核苷酸分別朝著基因的5′或3′末端計數(shù)的1000bp、優(yōu)選200bp、更優(yōu)選100bp以內(nèi)的區(qū)域中。
可以依照已知技術(shù)化學(xué)合成由此設(shè)計的寡核苷酸引物或探針。通常，用商品化化學(xué)合成儀來合成這些引物或探針。
還有可能預(yù)先用熒光物質(zhì)(如FAM、VIC、雷德蒙染料、等)標(biāo)記探針，從而使檢測流程自動化。
5.試劑盒上文所述寡核苷酸可以包括在遺傳多態(tài)性檢測試劑盒中。本發(fā)明的遺傳多態(tài)性檢測試劑盒包含實踐本發(fā)明所必需的一種或多種成分。例如，本發(fā)明的檢測試劑盒包含用于保存或供應(yīng)進(jìn)行切割測定法(如侵入者測定法)所必需的酶和/或反應(yīng)成分的成分。本發(fā)明的試劑盒包含預(yù)定測定法所必需(合適)的任何和所有成分酶或成分。這些成分的實例包括但不限于寡核苷酸、聚合酶(如Taq聚合酶)、緩沖液(如Tris緩沖液)、dNTP、對照試劑(如組織樣品、用作陽性和陰性對照的靶寡核苷酸、等)、標(biāo)記和/或檢測試劑(熒光染料諸如VIC、FAM)、固體支持物、指南、例示性圖表和/或產(chǎn)品信息、抑制劑、和包裝環(huán)境調(diào)節(jié)劑(如冰、干燥劑)。本發(fā)明的試劑盒可以是只包含部分必需成分的部分試劑盒。在這種情況中，使用者可以提供其余成分。本發(fā)明的試劑盒可以包含兩個或多個分開的容器，每個都包含將要使用的部分成分。例如，在試劑盒中，第一個容器包含酶，而第二個容器包含寡核苷酸。酶的具體實例包括在適當(dāng)保存緩沖液或容器中的結(jié)構(gòu)特異性切割酶。寡核苷酸的具體實例包括侵入者寡核苷酸、探針寡核苷酸、用作對照的靶寡核苷酸、等?；蛘?，可以以這樣的方式提供一種或多種反應(yīng)成分，使得它們預(yù)先分成特數(shù)量的部分。既然這些試劑盒包含早就定量確定用于本發(fā)明方法一個步驟的成分，那么不必再次測量或再次分裝。還可以混合選定的反應(yīng)成分并分成幾份特定量。優(yōu)選的是，反應(yīng)成分應(yīng)當(dāng)預(yù)先分成幾份并裝在反應(yīng)器中。反應(yīng)器的具體實例包括但不限于反應(yīng)管或孔或微量滴定板。尤其優(yōu)選的是，預(yù)先分裝的反應(yīng)成分應(yīng)當(dāng)在反應(yīng)器中通過例如脫水或凍干等手段保持干燥。
6.檢測使用如上所述制備的寡核苷酸作為引物，用DNA聚合酶擴(kuò)增編碼受體的基因(模板DNA)?；蛘?，將如上所述制備的探針與模板DNA雜交，從而檢測那些具有目的遺傳多態(tài)性的DNA?？梢砸勒粘Ｒ?guī)方法來制備模板DNA，如氯化銫梯度離心、SDS裂解法、或酚/氯仿抽提。
(1)通過PCR進(jìn)行的檢測可以通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)來進(jìn)行擴(kuò)增。有用的DNA聚合酶的具體實例包括LA Taq DNA聚合酶(Takara)、Ex Taq聚合酶(Takara)、Gold Taq聚合酶(Perkin Elmer)、AmpliTaq(Perkin Elmer)、PfuDNA聚合酶(Stratagene)等。
擴(kuò)增條件如下。變性步驟是于85-105℃保溫10-40秒鐘，優(yōu)選于94℃保溫20-30秒鐘；退火步驟是于50-72℃保溫20秒鐘至1分鐘，優(yōu)選于60℃保溫20秒鐘至1分鐘；而延伸步驟是于65-75℃保溫1-4分鐘，優(yōu)選于72℃保溫2-3分鐘，以上構(gòu)成一個循環(huán)，進(jìn)行30-40個循環(huán)。然而，為了使模板DNA和引物充分變性，可以在開始上文所述擴(kuò)增循環(huán)之前添加預(yù)變性步驟，即于95℃保溫1-5分鐘[若使用Gold Taq聚合酶(Perkin Elmer)，則至少保溫8-15分鐘，優(yōu)選10-12分鐘]。同樣，為了完全延伸擴(kuò)增的DNA，可以在上述擴(kuò)增循環(huán)之后添加延伸步驟，即于72℃保溫1-10分鐘。此外，如果不是立即對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測，那么需要添加保存步驟，即將擴(kuò)增產(chǎn)物保存于4℃以避免非特異擴(kuò)增。由此，可以擴(kuò)增編碼受體的基因。
隨后，將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，隨后用溴化乙錠、SYBR綠色溶液等染色，從而以一、二或三條條帶(DNA片段)的形式檢測擴(kuò)增產(chǎn)物。由此，可以以DNA片段的形式檢測編碼受體的基因中包含遺傳多態(tài)性的一部分。除了瓊脂糖凝膠電泳以外，也可以進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳或毛細(xì)管電泳。還有可能使用預(yù)先經(jīng)諸如熒光染料等物質(zhì)標(biāo)記的引物進(jìn)行PCR，并檢測擴(kuò)增產(chǎn)物。還可以采用不需要電泳的檢測方法；在這種方法中，將擴(kuò)增產(chǎn)物結(jié)合到固體支持物諸如微型板上，并通過熒光、酶反應(yīng)、等等手段來檢測目的DNA片段。
(2)通過TaqMan PCR進(jìn)行的檢測TaqMan PCR指使用熒光標(biāo)記的等位基因特異性寡聚物和Taq DNA聚合酶進(jìn)行PCR反應(yīng)的方法?？梢愿鶕?jù)上文所述SNP信息來設(shè)計TaqMan PCR中所使用的等位基因特異性寡聚物(稱為“TaqMan探針”)。用熒光報道染料R(如FAM或VIC)標(biāo)記TaqMan探針的5′末端，同時用淬滅劑Q(淬滅物質(zhì))標(biāo)記它的3′末端(

圖1)。因此，在這些條件下無法檢測到熒光，因為淬滅劑吸收了熒光能量。由于TaqMan探針的3′末端是磷酸化的，因此TaqMan探針在PCR反應(yīng)過程中不發(fā)生延伸反應(yīng)(圖1)。然而，在使用這種TaqMan探針連同Taq DNA聚合酶和設(shè)計用于擴(kuò)增含SNP區(qū)域的引物一起進(jìn)行PCR反應(yīng)時，發(fā)生了下文所述反應(yīng)。
首先，TaqMan探針與模板DNA中的特定序列發(fā)生雜交(圖2a)，同時由PCR引物發(fā)生延伸反應(yīng)(圖2b)。此時，具有5′核酸酶活性的Taq DNA聚合酶在PCR引物進(jìn)行延伸反應(yīng)時切割發(fā)生雜交的TaqMan探針。在切除TaqMan探針后，熒光染料脫離了淬滅劑的影響。然后，能夠檢測到熒光(圖2c)。
例如，如圖3所示，假設(shè)有兩個等位基因一個等位基因在SNP位點具有A(等位基因1)，而另一個等位基因在SNP位點具有G(等位基因2)。用FAM標(biāo)記對等位基因1特異的一種TaqMan探針，并用VIC標(biāo)記對等位基因2特異的另一種TaqMan探針(圖3)。將這兩種等位基因特異性寡聚物加到PCR試劑中，然后對需要檢測SNP的模板DNA進(jìn)行TaqMan PCR。隨后，用熒光檢測儀測定FAM和VIC的熒光強(qiáng)度。當(dāng)?shù)任换虻腟NP位點與TaqMan探針內(nèi)與SNP對應(yīng)的位點互補(bǔ)時，探針與等位基因發(fā)生雜交；并且Taq聚合酶切割探針的熒光染料，使其脫離淬滅劑的影響。結(jié)果是，檢測到熒光強(qiáng)度。
若模板是等位基因1的純合子，則辨認(rèn)出FAM的強(qiáng)烈熒光強(qiáng)度，但是VIC的熒光幾乎辨認(rèn)不出。若模板是等位基因1與等位基因2的雜合子，則可以檢測到FAM和VIC二者的熒光。
(3)通過侵入者法進(jìn)行的SNP檢測侵入者法指通過等位基因特異性寡聚物與模板雜交來檢測SNP的方法。在侵入者法中，使用兩種未標(biāo)記的寡聚物和一種熒光標(biāo)記的寡聚物。兩種未標(biāo)記寡聚物之一稱為“等位基因探針”。等位基因探針由兩個區(qū)域組成，一個區(qū)域與基因組DNA(模板DNA)雜交而形成互補(bǔ)雙鏈，另一個區(qū)域(稱為“flap”)的序列與模板DNA的序列完全無關(guān)因，因而不與基因組DNA雜交。位于可雜交區(qū)域5′或3′最末端的核苷酸對應(yīng)于SNP(圖4A的小圖(a))。上文所述flap序列是序列與稍后所述FRET探針互補(bǔ)的寡核苷酸。另一種寡聚物稱為“侵入者探針”。此寡聚物被設(shè)計成與由SNP位點朝著基因組DNA的3′端互補(bǔ)雜交(圖4A的小圖(b))。然而，與SNP對應(yīng)的核苷酸(圖4A的小圖(b)中的“N”)可以是任何核苷酸。由此，當(dāng)基因組DNA(模板)與上文所述兩種探針雜交時，侵入者探針的一個核苷酸(N)侵入SNP位點(圖4A的小圖(c))。結(jié)果是，在SNP位點形成三鏈。
另一方面，熒光標(biāo)記的寡聚物的序列與等位基因完全無關(guān)。不管SNP的類型，該序列是共同的。該探針稱為“FRET”探針(熒光共振能量轉(zhuǎn)移探針)(圖5)。用熒光染料R標(biāo)記位于FRET探針(報道劑)5′端的核苷酸，同時將淬滅劑Q連接在報道劑的上游。因此，在這些條件下，淬滅劑吸收熒光染料，因而檢測不到熒光。同樣設(shè)計FRET探針中由5′端報道劑核苷酸起始的某個區(qū)域(稱為“區(qū)域1”)，使得它與探針中位于區(qū)域1的3′端的某個區(qū)域(稱為“區(qū)域2”)在彼此面對時互補(bǔ)。因此，區(qū)域1和區(qū)域2在FRET探針內(nèi)形成互補(bǔ)鏈(圖5)。同樣，設(shè)計位于此互補(bǔ)鏈形成區(qū)的3′端的區(qū)域，使得它與等位基因探針的flap雜交而形成互補(bǔ)鏈(圖5)。
在侵入者法中，使用稱為切割酶的一種酶，它是具有獨特的內(nèi)切核酸酶活性(在識別特定DNA結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上進(jìn)行切割)的酶之一(5′核苷酸酶)。切割酶是在基因組DNA、等位基因探針、和侵入者探針在SNP位點形成三鏈時在緊挨著SNP位點3′端的點切割等位基因探針的酶。因此，如圖4A的小圖(c)所示，當(dāng)三種核苷酸形成三鏈時，切割酶識別5′flap并切除此flap。結(jié)果是，此SNP位點的結(jié)構(gòu)得到切割酶的識別(圖6的小圖(a))，而且等位基因探針在其flap位點得到切割而釋放flap(圖6的小圖(b))。隨后，由等位基因探針釋放的flap互補(bǔ)結(jié)合FRET探針，因為它具有與FRET探針互補(bǔ)的序列(圖6的小圖(c))。此時，fla 的SNP位點侵入FRET探針中早就形成了互補(bǔ)結(jié)合區(qū)的部分。切割酶再次識別此結(jié)構(gòu)，并切除被熒光染料標(biāo)記的核苷酸。由此切除的熒光染料不再受淬滅劑的影響，并發(fā)出熒光(圖6的小圖(d))。當(dāng)SNP與等位基因探針中與SNP對應(yīng)的核苷酸不匹配時，不形成切割酶能夠識別的特定DNA結(jié)構(gòu)，如圖7所示。因此，探針不受切割，也檢測不到熒光。
例如，當(dāng)SNP是T/C時，制備T的侵入者探針和等位基因探針，以及具有與SNP對應(yīng)的FAM相連報道劑的FRET探針。另外，同樣制備C的侵入者探針和等位基因探針，以及具有與SNP對應(yīng)的VIC相連報道劑的FRET探針。然后，將它們混合以進(jìn)行SNP檢測。結(jié)果是，若SNP是T/T純合子，則發(fā)出FAM的熒光；若SNP是C/C純合子，則發(fā)出VIC的熒光；而若SNP是T/C雜合子，則發(fā)出FAM和VIC二者的熒光。因為FAM和VIC具有不同的熒光波長，所以可以將它們區(qū)分開來?？梢杂脽晒庾x板儀或用于收集反應(yīng)過程中生成的熒光數(shù)據(jù)的裝置(實時熒光檢測儀)來檢測被熒光染料標(biāo)記的產(chǎn)物。實時熒光檢測儀的具體實例包括ABI 7700序列檢測系統(tǒng)(Applied Biosystems)。
(4)通過SniPer法進(jìn)行的檢測為了通過SniPer法檢測SNP，有可能通過檢查RCA擴(kuò)增的存在與否來區(qū)分等位基因。簡而言之，將將要用作模板的基因組DNA線性化。然后，將探針與此基因組DNA雜交。當(dāng)探針序列和作為模板的基因組DNA的序列彼此互補(bǔ)并形成互補(bǔ)鏈時，基因組DNA可以通過連接反應(yīng)而轉(zhuǎn)變成環(huán)狀DNA。結(jié)果是，環(huán)狀DNA進(jìn)行RCA。另一方面，當(dāng)探針的末端與基因組DNA不匹配時，DNA不連接成為環(huán)狀DNA。因此，不進(jìn)行RCA反應(yīng)。由此，在Sniper法中，設(shè)計與基因組DNA退火且能夠環(huán)化的單鏈探針。此單鏈探針稱為掛鎖探針(padlock probe)。設(shè)計此掛鎖探針兩個末端的序列，使得它們對應(yīng)于將要檢測的SNP。然后，將此掛鎖探針與基因組DNA混合以進(jìn)行連接。若掛鎖探針的兩個末端與基因組DNA的SNP位點彼此互補(bǔ)，則掛鎖探針的兩個末端通過連接相連，生成環(huán)狀探針。若掛鎖探針的兩個末端與基因組DNA的SNP位點彼此不互補(bǔ)，則探針不變成環(huán)狀。因此，只有那些與待檢測SNP互補(bǔ)的掛鎖探針變成環(huán)狀，并通過DNA聚合酶得到擴(kuò)增。通過檢測這種擴(kuò)增的存在與否，可以檢測SNP。為了檢測，使用在它們的相應(yīng)末端分別具有熒光染料和淬滅劑且還具有發(fā)夾結(jié)構(gòu)的合成寡核苷酸。
(5)通過MALDI-TOF/MS法進(jìn)行的檢測MALDI-TOF/MS(Matrix Assisted Laser Disorption-Time ofFlight/Mass Spectrometry)是一種在SNP定型中使用質(zhì)譜儀的方法。
此方法由下列步驟組成。
(i)含SNP的DNA片段的PCR擴(kuò)增和純化設(shè)計PCR引物，使得它們與SNP位點的核苷酸之間沒有重疊。然后擴(kuò)增DNA片段。通過外切核酸酶、堿性磷酸酶等處理除去引物、dNTP等，從而由擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)物純化擴(kuò)增片段。
(ii)引物延伸(熱循環(huán))和純化向靶區(qū)(即PCR產(chǎn)物)的模板中加入十倍或更多的引物，并通過熱循環(huán)進(jìn)行引物延伸。設(shè)計此處所用引物，使得它們的3′末端與SNP位點的核苷酸毗鄰。引物的長度為15-30個核苷酸，優(yōu)選20-25個核苷酸。在進(jìn)行多聚體(multiplex)反應(yīng)時，向5′末端添加與模板不互補(bǔ)的序列。在85-105℃(優(yōu)選94℃)與35-40℃(優(yōu)選37℃)這兩個溫度之間進(jìn)行20-30個循環(huán)(優(yōu)選25個循環(huán))的熱循環(huán)。用純化試劑盒等純化由此得到的反應(yīng)產(chǎn)物，使之適于質(zhì)譜儀。
(iii)用質(zhì)譜儀對DNA進(jìn)行質(zhì)譜術(shù)將純化后的延伸反應(yīng)產(chǎn)物施加到質(zhì)譜儀上以測定目標(biāo)產(chǎn)物的質(zhì)量。簡而言之，將純化產(chǎn)物與基質(zhì)混勻，并將0.5-1.0μl混合液點到MALDI板上。將板干燥后，將激光施加到樣品上以制備光譜圖。
(6)通過DNA測序法進(jìn)行檢測在本發(fā)明中，可以通過單核苷酸延伸反應(yīng)來檢測多態(tài)性。簡而言之，向含有目的基因的反應(yīng)系統(tǒng)中加入用不同熒光化合物標(biāo)記的四種雙脫氧核苷酸。然后，進(jìn)行單核苷酸延伸反應(yīng)。在這種情況中，待延伸的核苷酸即多態(tài)位點。同樣，進(jìn)行終止DNA合成和用熒光標(biāo)記DNA分子的3′末端這兩種反應(yīng)。將四種反應(yīng)液在測序膠的相同泳道或毛細(xì)管上進(jìn)行電泳。用熒光檢測儀檢測用于標(biāo)記的熒光染料的差異，從而將DNA條帶測序。或者，用熒光檢測系統(tǒng)或質(zhì)譜系統(tǒng)等等檢查經(jīng)過單核苷酸延伸的寡核苷酸，從而根據(jù)熒光染料的差異確定哪種核苷酸得到延伸。除了熒光標(biāo)記的雙脫氧核苷酸以外，引物也可以是熒光標(biāo)記的，并且與未標(biāo)記的雙脫氧核苷酸一起使用。
(7)DNA微陣中的檢測DNA微陣指上面固定了核苷酸探針的固體支持物，包括DNA芯片、基因芯片、微型芯片、珠陣等。
作為DNA微陣(如DNA芯片)測定法的具體實例，可以給出GeneChip測定法(Affymetrix；美國專利號6,045,996、5,925,525、和5,858,659)。GeneChip技術(shù)使用固定在芯片上的寡核苷酸探針的小型、高密度微陣。例如，通過光照化學(xué)合成法(Affymetrix)(這是固相化學(xué)合成法和半導(dǎo)體工業(yè)中使用的光刻生產(chǎn)技術(shù)的聯(lián)合應(yīng)用)來制造探針陣列。通過使用光刻掩模使得芯片化學(xué)反應(yīng)位點的邊界清楚，并進(jìn)行特定化學(xué)合成步驟，由此可以構(gòu)建將寡核苷酸探針固定在設(shè)計位置的高密度陣列。在大型玻璃基板上同時合成多探針陣列。隨后，將此基板干燥，并將單個探針陣列包裝在注射塑造的塑料盒中。此盒保護(hù)陣列免于外界環(huán)境的影響，還擔(dān)當(dāng)雜交室。
首先，將待分析的多核苷酸進(jìn)行分離、通過PCR擴(kuò)增、并用熒光報道基團(tuán)標(biāo)記。然后，使用流體站將經(jīng)標(biāo)記DNA與陣列一起保溫。將此陣列插入掃描儀中以檢測雜交模式。以結(jié)合在探針陣列上(即摻入靶序列)的熒光報道基團(tuán)的發(fā)光的形式收集雜交數(shù)據(jù)。通常，與靶序列完全匹配的探針產(chǎn)生的信號比有些部分與靶序列不匹配的那些探針要強(qiáng)。由于陣列上各個探針的序列和位置是已知的，因此有可能根據(jù)互補(bǔ)來確定與探針陣列反應(yīng)的靶多核苷酸的序列。
在本發(fā)明中，還有可能使用具有電子方式捕獲的探針的DNA微型芯片(Nanogen；參閱例如美國專利號6,017,696、6,068,818、和6,051,380)。通過使用微電子學(xué)，Nanogen的技術(shù)能夠向/由半導(dǎo)體微型芯片上的特定測試位點轉(zhuǎn)移帶電分子，并將它們濃縮。將對某些SNP或變異特異的DNA捕獲型探針以電子方式排列在微型芯片的特定位點上或分派地址。由于DNA帶強(qiáng)烈負(fù)電，因此它能夠以電方式移動至帶正電區(qū)域。
首先，用正電荷以電子手段激活微型芯片上的測試位點或一排測試位點。然后，將含DNA探針的溶液加到微型芯片上。由于帶負(fù)電荷的探針快速移動至帶正電區(qū)域，因此探針在微型芯片的該位點上濃縮并與其化學(xué)結(jié)合。清洗此微型芯片，并將另一種DNA探針溶液加到微型芯片上，使得DNA探針特異結(jié)合芯片。
隨后，分析測試樣品中是否存在靶DNA分子。通過判斷與測試樣品中互補(bǔ)DNA雜交的DNA捕獲探針的類型來進(jìn)行這種分析。測試樣品可以有例如通過PCR擴(kuò)增的目的基因。通過使用電荷，靶分子可以移動至微型芯片上的一個或多個測試位點并濃縮。由于樣品DNA在各個測試位點處的電子濃縮，樣品DNA和與其互補(bǔ)的捕獲探針之間的雜交快速進(jìn)行。例如，由于這些操作，雜交在幾分鐘內(nèi)發(fā)生。為了由各個測試位點清除未結(jié)合的DNA或非特異結(jié)合的DNA，將該位點的極性或電荷轉(zhuǎn)變成負(fù)電荷，從而使未結(jié)合的DNA或非特異結(jié)合的DNA返回溶液。在這種方法中，可以使用例如利用激光的熒光掃描儀來檢測特異結(jié)合。
另外，在本發(fā)明中，還有可能使用利用因表面張力差異而在平面(芯片)上的流體分離現(xiàn)象的陣列技術(shù)(ProtoGene；參閱例如美國專利號6,001,311、5,985,551、和5,474,796)。ProtoGene技術(shù)基于流體因化學(xué)涂層造成的表面張力差異而在平面上彼此分離的事實。由于可以根據(jù)上文所述原理來分離寡核苷酸探針，因此有可能通過含探針試劑的噴墨印刷而直接在芯片上合成探針。將具有由表面張力限定的反應(yīng)位點的陣列安置在位于一組(4個)壓電噴管下面的X/Y移動臺上。每個壓電噴管分別含有四種標(biāo)準(zhǔn)DNA核苷酸。此移動臺沿陣列的每行移動，從而向每個反應(yīng)位點供應(yīng)適當(dāng)試劑(如amidite)。將陣列的整個表面浸泡在對陣列中的測試位點共同的試劑中，然后是清洗液。隨后，旋轉(zhuǎn)陣列以除去這些溶液。
使用Protogene技術(shù)將對待檢測的SNP或變異特異的DNA探針固定在芯片上。然后，使芯片接觸通過PCR擴(kuò)增的目的基因。雜交后，清除未結(jié)合的DNA，隨后通過適當(dāng)方法來檢測雜交。
另外，有可能使用“珠陣”(Illumina公司；參閱例如PCT國際
發(fā)明者中村祐輔, 關(guān)根章博, 飯?zhí)镉锌? 齋藤督 申請人:獨立行政法人理化學(xué)研究所, 中村祐輔, 關(guān)根章博, 飯?zhí)镉锌? 齋藤督