專利名稱：帶有標(biāo)準(zhǔn)探針的dna微陣列以及包含該陣列的試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及到對(duì)檢體中含有對(duì)具有目的堿基序列的核酸量的定量分析有用的DNA微陣列。更具體講，涉及到使用在固相上固定了帶有與檢體中含有的具有目的堿基序列的核酸互補(bǔ)的堿基序列的核酸探針的DNA微陣列，進(jìn)行定量分析時(shí)，可使定量精度提高的DNA微陣列以及利用該DNA微陣列進(jìn)行檢出操作中利用的檢測(cè)用試劑盒。
背景技術(shù)：
作為基于雜交法的基因DNA的檢出、測(cè)定法的發(fā)展，有關(guān)在基板上固定多種核酸探針，用于對(duì)檢體樣品中所含有的基因DNA同時(shí)進(jìn)行多次檢出試驗(yàn)的基因芯片(DNA芯片、微陣列)的研究近年來(lái)進(jìn)步神速。利用這樣的基因芯片(DNA芯片、微陣列)對(duì)檢體樣品中含有的基因DNA進(jìn)行檢出、測(cè)定的方法預(yù)期可應(yīng)用在分子生物學(xué)研究、遺傳疾患、傳染病診斷等各個(gè)領(lǐng)域。
基因芯片的基本形態(tài)是依據(jù)雜交法，將用于檢出目的基因DNA的多種具有與目的基因堿基序列互補(bǔ)的堿基序列的單鏈核酸片段以陣列狀固定在玻璃等基板表面。作為雜交探針被利用的具有與目的基因互補(bǔ)的堿基序列的單鏈核酸片段一般利用稱為寡DNA的通過(guò)化學(xué)合成的DNA寡聚物，或利用稱為cDNA的以來(lái)自生物組織基因作為模板通過(guò)酶生物合成的互補(bǔ)鏈DNA片段等。關(guān)于單鏈核酸片段向基板表面的固定，如果使用寡DNA，例如象US5474796(或、特表平9-500568號(hào)公報(bào)、申請(qǐng)人ProtoGene Laboratories)所述方法那樣，大致有預(yù)先將末端固定在基板上，然后在基板上依次合成DNA分子本身，做成固定的核酸片段的方法，以及例如象特開(kāi)平11-187900號(hào)公報(bào)(申請(qǐng)人佳能株式會(huì)社)所述方法那樣，通過(guò)另一途經(jīng)合成寡DNA后、利用各種結(jié)合手段，將核酸片段固定在基板上的方法。
作為將另外途經(jīng)制備的核酸片段固定于基板上的手段，有各種各樣的方式，例如利用基板帶有的電荷和核酸片段的電荷的吸附固定法，以及將聚-L-賴氨酸、氨基硅烷偶聯(lián)劑等被覆基板表面，利用該被覆膜使固定效率提高的固定法等。
現(xiàn)在，一般使用的DNA微陣列不搭載用于含有目的堿基序列的核酸的定量分析的特別探針等。以往，無(wú)論是利用在固相表面的依次合成法制作的DNA微陣列，還是利用裂隙針?lè)ㄖ谱鞯腄NA微陣列，由于內(nèi)含起因于該制作方法的偏差，例如利用核酸配列的合成效率的偏差、由裂隙針點(diǎn)頭滴到基板的探針液量的偏差，以及固定率的偏差等，在定量精度、再現(xiàn)性中都存在問(wèn)題。而有人提出了可解決這些DNA微陣列制作時(shí)偏差使用噴墨的制作法(特開(kāi)平11-187900號(hào)公報(bào))等。
另一方面，對(duì)于供通過(guò)DNA微陣列進(jìn)行基因檢查的檢體，由于靈敏度的問(wèn)題，一般都對(duì)含有目的堿基序列的核酸實(shí)施擴(kuò)增操作，獲得摻入了同時(shí)可檢測(cè)的標(biāo)記物的擴(kuò)增產(chǎn)物。該擴(kuò)增操作的基本技術(shù)稱為PCR，在美國(guó)專利第4683195、第4683202、第4965188等有記載。然而，PCR在其擴(kuò)增反應(yīng)過(guò)程中含有很多控制困難的要素，例如，即使是對(duì)同一樣品同時(shí)進(jìn)行擴(kuò)增時(shí)，擴(kuò)增產(chǎn)物的收率也會(huì)出現(xiàn)從數(shù)倍至數(shù)十倍之間的偏差。為了解決這個(gè)擴(kuò)增產(chǎn)物產(chǎn)率不確定性，進(jìn)行很多研究，發(fā)明了競(jìng)爭(zhēng)(Competitive)PCR法等。競(jìng)爭(zhēng)PCR法在P.D.Siebert等人論文(Nature359；557-558(1992)，Bio Techniques 14；244-249(1993))等有詳細(xì)報(bào)道。而作為其它的方法，如向從患者等采取的檢體中添加已知量的作為內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)的核酸，在含有目的堿基序列的核酸擴(kuò)增反應(yīng)進(jìn)行的同時(shí)內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)核酸也進(jìn)行擴(kuò)增，由該內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)核酸的擴(kuò)增率推定含有目的堿基序列的核酸的擴(kuò)增率的手法等。

發(fā)明內(nèi)容
如上所述，使用DNA微陣列，在對(duì)含有目的堿基序列的核酸進(jìn)行定量分析時(shí)，存在著影響其定量的各種各樣的不穩(wěn)定因素。
首先在DNA微陣列制作時(shí)，存在著來(lái)自固定于基板上探針量的偏差的精度、再現(xiàn)性的低可靠性。另外，存在著起因于PCR法中的含有目的堿基序列的核酸擴(kuò)增效率的不確定性，檢體所含的具有目的堿基序列核酸的擴(kuò)增率中存在著偏差。以往，這些不同因素的偏差利用另外的各種方法對(duì)他們分別進(jìn)行檢定后，供使用DNA微陣列的定量分析，對(duì)分析結(jié)果根據(jù)各個(gè)檢定結(jié)果進(jìn)行修正后，得到實(shí)際的定量。
這些多種類的檢定操作都是非常繁雜的，另外由于需要長(zhǎng)時(shí)間操作，所以在處理多個(gè)檢體時(shí)，檢定操作成為阻礙其工作效率的要因。
本發(fā)明正是要解決上述課題，本發(fā)明的目的在于提供使這些檢定操作顯著簡(jiǎn)化，對(duì)檢體中含有目的堿基序列的核酸進(jìn)行定量，測(cè)定時(shí)可以獲得其修正數(shù)據(jù)的DNA微陣列，以及此時(shí)利用的檢定用試劑盒。
本發(fā)明人為了解決上述課題，進(jìn)行了銳意研究，發(fā)現(xiàn)了在制作DNA微陣列時(shí)，作為探針的固定法，通過(guò)采用利用噴墨將另外途經(jīng)制作的核酸探針涂布、固定在基板上的制作法(特開(kāi)平11-187900號(hào)公報(bào))，除了含有目的堿基序列的核酸的檢出用核酸探針之外，在同一DNA微陣列上還并用內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)用探針和/或外標(biāo)準(zhǔn)用探針，通過(guò)同樣手法固定的DNA微陣列，可以使這些檢定操作顯著簡(jiǎn)化。根據(jù)這些見(jiàn)解，本發(fā)明人在使用上述的DNA微陣列的檢測(cè)操作中也考察了用于使這些檢定操作精度更高、運(yùn)用簡(jiǎn)便的試劑盒，從而完成本發(fā)明。
即，本發(fā)明的DNA微陣列是在基板上固定了用于檢測(cè)檢體中所含的具有目的堿基序列的核酸分子的帶有與該目的核酸分子的堿基序列互補(bǔ)的堿基序列的核酸探針的DNA微陣列中，其特征在于含有選自用于對(duì)上述檢體中所含的上述含有目的堿基序列的核酸分子的含有濃度進(jìn)行定量的含有該目的堿基序列的核酸的擴(kuò)增反應(yīng)檢定用中添加的一種以上的內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)用探針、檢出操作以及探針量檢定用中添加的一種以上的外標(biāo)準(zhǔn)用探針、用于對(duì)通過(guò)與形成上述核酸探針同樣的手法形成的上述探針的存在量或密度進(jìn)行檢定的一種以上的探針中的一種以上的探針。此時(shí)固定在基板上的該內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)用探針和/或該外標(biāo)準(zhǔn)用探針最好是以4點(diǎn)以上的量或密度的一系列群固定在基板上。
另外，固定于DNA微陣列上的該內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)用探針優(yōu)選由與來(lái)自內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)核酸擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)物的不同鏈長(zhǎng)相對(duì)應(yīng)的二種以上的探針構(gòu)成。另外，該外標(biāo)準(zhǔn)用探針對(duì)于添加的外標(biāo)準(zhǔn)核酸，優(yōu)選由含有任意核酸堿基數(shù)的非互補(bǔ)堿基序列的二種以上探針構(gòu)成。
另外，該內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)用探針和外標(biāo)準(zhǔn)用探針如果是在基板上固定了合成核酸的探針更好。此時(shí)該合成核酸的鏈長(zhǎng)最好是15堿基～75堿基長(zhǎng)。
另外，本發(fā)明的DNA微陣列，當(dāng)具備內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)用探針時(shí)，在對(duì)含有目的堿基序列的核酸進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)時(shí)內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)核酸與含有該目的堿基序列的核酸同時(shí)擴(kuò)增，對(duì)擴(kuò)增反應(yīng)的擴(kuò)增效率進(jìn)行測(cè)定，但本發(fā)明也提供該內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)核酸的擴(kuò)增反應(yīng)用引物組的發(fā)明。即本發(fā)明涉及的引物組，是在作為進(jìn)行含有目的堿基序列核酸的擴(kuò)增反應(yīng)時(shí)，與含有該目的堿基序列的核酸同時(shí)進(jìn)行擴(kuò)增的內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)核酸的擴(kuò)增反應(yīng)用引物組，其特征在于，將來(lái)自含有目的堿基序列的核酸的擴(kuò)增產(chǎn)物的鏈長(zhǎng)與來(lái)自該引物組參與的內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)核酸的擴(kuò)增產(chǎn)物的鏈長(zhǎng)設(shè)計(jì)成相同。
另外，本發(fā)明也一并提供檢測(cè)用試劑盒，該試劑盒是含有上述內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)核酸的擴(kuò)增反應(yīng)用引物組，適合利用本發(fā)明的DNA微陣列對(duì)含有目的堿基序列的核酸進(jìn)行定量檢測(cè)用途的檢測(cè)用試劑盒。即本發(fā)明的目的堿基序列檢測(cè)用試劑盒是在作為利用DNA微陣列在對(duì)含有目的堿基序列的核酸進(jìn)行定量檢測(cè)時(shí)，在對(duì)具有該目的堿基序列的核酸進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)時(shí)，包含與含有該目的堿基序列的核酸同時(shí)擴(kuò)增的內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)核酸擴(kuò)增反應(yīng)用引物組的檢測(cè)用試劑盒，其特征在于，當(dāng)來(lái)自上述含有目的堿基序列的核酸的擴(kuò)增產(chǎn)物的鏈長(zhǎng)為二種以上時(shí)，包含二種以上對(duì)應(yīng)于這不同鏈長(zhǎng)的權(quán)利要求7所述的引物組。此時(shí)，可以做成例如特征如下的目的堿基序列檢測(cè)用試劑盒該多個(gè)引物組包含各1種以上擴(kuò)增產(chǎn)物鏈長(zhǎng)200bp以下用、200～500bp用、500～2000bp用、2000bp以上用的引物。
另外，在本發(fā)明的目的堿基序列檢測(cè)用試劑盒中，是在作為利用DNA微陣列在對(duì)含有目的堿基序列的核酸進(jìn)行定量檢出時(shí)，在對(duì)該含有目的堿基序列的核酸進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)時(shí)，包含與具有該目的堿基序列的核酸同時(shí)擴(kuò)增的內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)核酸的檢測(cè)用試劑盒，優(yōu)選是特征如下的試劑盒作為內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)核酸包含二種以上與檢測(cè)目的堿基序列沒(méi)有同源性的來(lái)自微生物的核酸或來(lái)自病毒的核酸。
另外，本發(fā)明的DNA微陣列當(dāng)備有外標(biāo)準(zhǔn)用探針時(shí)，本發(fā)明也一并提供檢測(cè)用試劑盒，該試劑盒是含有上述外標(biāo)準(zhǔn)核酸，適合利用本發(fā)明的DNA微陣列對(duì)含有目的堿基序列的核酸進(jìn)行定量檢測(cè)用途的檢測(cè)用試劑盒。即本發(fā)明的這個(gè)目的堿基序列檢測(cè)用試劑盒，是在利用DNA微陣列對(duì)含有目的堿基序列的核酸進(jìn)行定量檢測(cè)時(shí)，含有添加到檢體的外標(biāo)準(zhǔn)核酸的檢測(cè)用試劑盒，其特征在于，包含二種以上作為用可檢測(cè)標(biāo)記物標(biāo)記的合成核酸的外標(biāo)準(zhǔn)核酸。而此時(shí)該標(biāo)記物可以是熒光物質(zhì)、放射性物質(zhì)、發(fā)光物質(zhì)中的任一個(gè)。
另外，在本發(fā)明的DNA陣列中，核酸探針由單鏈核酸構(gòu)成，具體來(lái)說(shuō)，由單鏈核酸構(gòu)成的核酸探針可以由DNA、RNA、PNA(肽核酸)、cDNA(互補(bǔ)DNA)、cRNA(互補(bǔ)RNA)中的任一個(gè)構(gòu)成。另外，DNA微陣列也可以做成由作為核酸探針的單鏈核酸和通過(guò)對(duì)該核酸探針雜交而導(dǎo)入的靶核酸兩方構(gòu)成的形態(tài)的DNA微陣列。


圖1表示本發(fā)明實(shí)施方式的一例，是表示內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)用探針、外標(biāo)準(zhǔn)用探針、外標(biāo)準(zhǔn)核酸、以及內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)核酸的擴(kuò)增用引物組、該擴(kuò)增產(chǎn)物的圖。
圖2表示本發(fā)明的DNA微陣列的一實(shí)施方式模式，是表示DNA微陣列中具備的內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)用探針的配置圖。
圖3是表示在利用本發(fā)明的DNA微陣列的定量分析中，用于利用DNA微陣列中具備的外標(biāo)準(zhǔn)用探針?biāo)愠鎏结樄潭ɑ实臉?biāo)準(zhǔn)曲線的做成例子的圖。
圖4是表示在利用本發(fā)明的DNA微陣列的定量分析中，用于利用DNA微陣列中備有的內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)用探針?biāo)愠鯬CR擴(kuò)增倍率時(shí)的標(biāo)準(zhǔn)曲線以及因擴(kuò)增產(chǎn)物的核酸鏈長(zhǎng)不同造成的檢測(cè)靈敏度不同的圖。
圖5表示本發(fā)明的生物芯片的構(gòu)成的一個(gè)例子的平面配置和斷面形狀(AA中的斷面)模式圖。
圖6是表示對(duì)于生物芯片，測(cè)定的2次離子強(qiáng)度和DNA形成密度(每一探針點(diǎn)的DNA分子數(shù))的關(guān)系圖。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明的第一個(gè)方式是在DNA微陣列上搭載內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)用探針。
所謂內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)用探針從廣義上講是用于對(duì)為了輔助含有目的堿基序列的核酸的定量利用的內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)核酸進(jìn)行檢出的探針。指的是作為具有與檢體中存在量已判明的內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)核酸(基因)互補(bǔ)的堿基序列，可與內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)核酸(基因)結(jié)合的核酸探針，通過(guò)測(cè)定內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)核酸的存在量和含有目的堿基序列核酸存在量的相對(duì)比，可以對(duì)含有目的堿基序列的核酸進(jìn)行定量的探針。例如，在生物體細(xì)胞中，形成細(xì)胞骨架的基因(看家基因)的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物由于其表達(dá)量變動(dòng)很小，而表達(dá)量也比較多，所以常常作為內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)核酸使用。具體來(lái)說(shuō)，可例舉如GAPDH或β-肌動(dòng)蛋白的mRNA、核糖體RNA等。
另外，所謂狹義的內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)核酸指的是在利用以PCR為代表的核酸擴(kuò)增反應(yīng)，進(jìn)行核酸量的擴(kuò)增或?yàn)榱嗽诤心康膲A基序列的核酸中添加可檢測(cè)的標(biāo)記物進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)時(shí)向檢體中添加已知量的具有已知堿基序列的核酸。在檢體中添加的狹義內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)核酸選擇在進(jìn)行含有目的堿基序列的核酸的擴(kuò)增反應(yīng)或標(biāo)記反應(yīng)時(shí)，以與含有目的堿基序列的核酸同樣效率進(jìn)行擴(kuò)增或標(biāo)記的核酸。擴(kuò)增反應(yīng)或標(biāo)記反應(yīng)后，通過(guò)對(duì)添加的內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)核酸量進(jìn)行定量，可以算出擴(kuò)增倍率或標(biāo)記付加率，另外，作為相對(duì)于內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)核酸存在量的相對(duì)比可以求出含有目的堿基序列的核酸的存在量。
本發(fā)明的第二個(gè)方式，是在DNA微陣列上搭載針對(duì)外標(biāo)準(zhǔn)核酸的探針(外標(biāo)準(zhǔn)用探針)。
所謂外標(biāo)準(zhǔn)核酸主要是指是以修正DNA微陣列制作工序和/或檢測(cè)、測(cè)定工序中的偏差等目的添加到檢體中的含有已知堿基序列的核酸。具體來(lái)說(shuō)，可以使用向合成DNA、質(zhì)粒DNA等純度高的核酸中導(dǎo)入了可檢測(cè)、定量的標(biāo)記物后的核酸。而附加在這樣的外標(biāo)準(zhǔn)核酸的標(biāo)記是事先對(duì)其標(biāo)記效率等進(jìn)行了檢定的標(biāo)記。該外標(biāo)準(zhǔn)核酸只要是與DNA微陣列的種類(對(duì)象基因)無(wú)關(guān)的，具有與檢測(cè)目的的堿基序列沒(méi)有同源性的堿基序列，在整個(gè)DNA微陣列可以使用都相同的序列。外標(biāo)準(zhǔn)用探針是具有與上述外標(biāo)準(zhǔn)核酸互補(bǔ)的堿基序列，可有選擇結(jié)合的核酸探針。
外標(biāo)準(zhǔn)核酸、外標(biāo)準(zhǔn)用探針通過(guò)同時(shí)使用數(shù)種類的組，可以進(jìn)行DNA微陣列具有的性能、即定量性的檢定。具體來(lái)說(shuō)，例如，準(zhǔn)備搭載了3種以上、最好是5種以上的外標(biāo)準(zhǔn)用探針的DNA微陣列，將與此對(duì)應(yīng)的標(biāo)記過(guò)的外標(biāo)準(zhǔn)核酸各個(gè)種類的每一種改變濃度(已知量)后添加到含有目的堿基序列的核酸檢測(cè)操作中。通過(guò)畫出這些外標(biāo)準(zhǔn)核酸的檢出量的曲線，可以做成標(biāo)準(zhǔn)曲線。另外，使用一種外標(biāo)準(zhǔn)核酸和外標(biāo)準(zhǔn)用探針組時(shí)，也可以對(duì)固定在DNA微陣列的探針量進(jìn)行檢定。即使用一種類的組，也可以對(duì)DNA微陣列間(基板間)探針固定效率的偏差進(jìn)行修正。該方法首先是將外標(biāo)準(zhǔn)用探針以3階段以上、最好是5階段以上濃度固定于DNA微陣列上。通過(guò)使充足量的已標(biāo)記過(guò)的外標(biāo)準(zhǔn)核酸反應(yīng)，對(duì)與微陣列結(jié)合的外標(biāo)準(zhǔn)核酸的量進(jìn)行測(cè)定，可以測(cè)定實(shí)際固定在DNA微陣列上的探針?lè)肿訑?shù)比。
本發(fā)明的第三個(gè)方式是為了更有效、而且更簡(jiǎn)便利用上述的第一以及第二方式的DNA微陣列的檢出、定量法使用的檢測(cè)用試劑盒。
在利用具備內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)用探針的DNA微陣列的檢測(cè)試劑盒中，包含內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)核酸的擴(kuò)增用引物組。另外，在利用具備外標(biāo)準(zhǔn)用探針的DNA微陣列的檢測(cè)試劑盒中包含用可檢測(cè)和定量的標(biāo)記物標(biāo)記的、而且其標(biāo)記率已檢定的外標(biāo)準(zhǔn)核酸。這些核酸無(wú)論哪一個(gè)都要對(duì)應(yīng)于內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)用探針、外標(biāo)準(zhǔn)用探針，作為至少一種，根據(jù)需要也可以是數(shù)種～十幾種為一組，整合在檢定用試劑盒中。
內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)核酸的擴(kuò)增用引物組由于各種必要的條件不同，其內(nèi)容可變化。首先在以內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)核酸為模板的擴(kuò)增反應(yīng)中，為了生成含有與內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)用探針互補(bǔ)的堿基序列的擴(kuò)增產(chǎn)物，必須設(shè)定引物組的堿基序列(對(duì)應(yīng)位置)。另外，同時(shí)也必須留意在對(duì)核酸進(jìn)行擴(kuò)增時(shí)，以含有目的堿基序列的核酸作為模板，不要生成不優(yōu)選的擴(kuò)增產(chǎn)物。還有，作為內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)，為了使定量性的精度提高，在含有目的堿基序列的核酸的擴(kuò)增反應(yīng)中生成的擴(kuò)增產(chǎn)物的核酸鏈長(zhǎng)和使用本試劑盒含有的擴(kuò)增用引物對(duì)內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)核酸進(jìn)行擴(kuò)增時(shí)得到的擴(kuò)增產(chǎn)物的核酸鏈長(zhǎng)要避免差異過(guò)大。具體來(lái)說(shuō)，將來(lái)自內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)核酸的擴(kuò)增產(chǎn)物的核酸鏈長(zhǎng)設(shè)定數(shù)階段，優(yōu)選選擇使得來(lái)自內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)核酸的擴(kuò)增產(chǎn)物的鏈長(zhǎng)某一個(gè)與來(lái)自含有目的堿基序列的核酸的擴(kuò)增產(chǎn)物的鏈長(zhǎng)相同。例如，制備得到的擴(kuò)增產(chǎn)物鏈長(zhǎng)可為200bp以下、200～500bp、500～2000bp、2000bp以上4種的四種引物組，優(yōu)選選擇與來(lái)自含有目的堿基序列的核酸的擴(kuò)增產(chǎn)物的鏈長(zhǎng)相適合的引物組。不用說(shuō)，將該擴(kuò)增產(chǎn)物鏈長(zhǎng)的設(shè)定范圍進(jìn)一步細(xì)分，制備多個(gè)引物組也沒(méi)有任何問(wèn)題。
用作內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)核酸的核酸最好使用可以獲得的含有已知堿基序列、而且純度高的核酸，例如，在分子生物、醫(yī)療領(lǐng)域中一般市售的核酸，例如可以利用質(zhì)粒載體、噬菌體DNA、微生物基因組等。特別是由于質(zhì)粒載體、噬菌體DNA等純度高、可以比較簡(jiǎn)單地獲得單一種類的樣品，因此更適用。
另外，用可檢出、定量的標(biāo)記物標(biāo)記的、其標(biāo)記率已檢定的外標(biāo)準(zhǔn)核酸也適合利用可以獲得的含有已知堿基序列、而且純度高的核酸，例如，合成DNA、質(zhì)粒載體等更適用。合成DNA由于標(biāo)記效率穩(wěn)定，而且每分子量的標(biāo)記率高，因此特別優(yōu)選。
此外，在本發(fā)明的DNA微陣列中內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)用探針和外標(biāo)準(zhǔn)用探針雙方都具備的方式更好。此時(shí)檢定用試劑盒最好做成具備內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)核酸的擴(kuò)增用引物組和外標(biāo)準(zhǔn)核酸雙方的試劑盒。
還有，外標(biāo)準(zhǔn)探針、內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)探針在分別進(jìn)行處理時(shí)可以使用相同的探針(的序列)。但在同時(shí)使用時(shí)，由于競(jìng)爭(zhēng)需要使用不同的序列(不同種類)的探針。濃度標(biāo)準(zhǔn)探針可與外標(biāo)準(zhǔn)探針兼用。
本發(fā)明還提供DNA陣列本身的分析方法。以下用具體的實(shí)施方式進(jìn)行說(shuō)明。
在以往的利用TOF-SIMS法的定量分析中，存在以下的問(wèn)題。即、其測(cè)定條件、具體來(lái)說(shuō)存在著1次離子的照射條件(加速能、入射角、離子種類、照射量)、2次離子的檢出條件(能幅)、以及樣品為絕緣體時(shí)，存在著由于因帶電修正被脈沖照射的電子線引起的脫離，以及帶電中和的程度等不同，被檢測(cè)的2次離子強(qiáng)度也不同的問(wèn)題。
特別是樣品為絕緣體時(shí)，標(biāo)準(zhǔn)樣品和被測(cè)定樣品在照射1次離子時(shí)的帶電狀況不一定要相同。因此，為了達(dá)到高定量性，每改變一次樣品，都需要嚴(yán)格使測(cè)定條件最適化，最適化不充分時(shí)，就會(huì)喪失測(cè)定結(jié)果的精度。另外，標(biāo)準(zhǔn)曲線的做成需要與作為測(cè)定對(duì)象的濃度的水準(zhǔn)數(shù)相同數(shù)目的標(biāo)準(zhǔn)樣品，所以帶來(lái)繁瑣的操作。
另外，按照P.Lazzeri等報(bào)道的那樣旋涂法制作核酸芯片的標(biāo)準(zhǔn)樣品時(shí)，如果在很大面積平均，雖然可做到濃度再現(xiàn)性好的涂布形成，但在TOF-SIMS法的點(diǎn)大小的測(cè)定領(lǐng)域、具體來(lái)說(shuō)，在每一個(gè)從數(shù)10μm2到數(shù)100μm2的微小區(qū)域，不能說(shuō)涂布面內(nèi)的均一性充分，對(duì)測(cè)定結(jié)果的可靠性帶來(lái)很大的問(wèn)題。本發(fā)明為了解決上述課題，提供通過(guò)可達(dá)到高定量性的飛行時(shí)間型2次離子質(zhì)量分析(TOF-SIMS)法對(duì)在基板上以矩陣狀配置許多核酸相關(guān)物質(zhì)(探針)的所謂核酸芯片探針進(jìn)行分析的核酸芯片的分析方法，以及利用該分析方法簡(jiǎn)便決定存在于配置在核酸芯片上的核酸探針點(diǎn)的核酸量、即形成密度(每一探針點(diǎn)的核酸量)的可能的方式的DNA微陣列。
本發(fā)明人為了解決上述課題進(jìn)行銳意研究，發(fā)現(xiàn)除了配置在核酸芯片上的形成密度未知的核酸探針點(diǎn)之外，如果與上述核酸探針點(diǎn)形成同樣的手法在基板表面的一部分設(shè)置每一點(diǎn)的平均核酸密度已判明的濃度基準(zhǔn)用核酸探針點(diǎn)，對(duì)于該濃度基準(zhǔn)用核酸探針點(diǎn)進(jìn)行2次離子質(zhì)量分析檢出的2次離子信號(hào)強(qiáng)度作為基準(zhǔn)，可以通過(guò)2次離子質(zhì)量分析法決定配置在基板上的未知濃度的核酸探針點(diǎn)的核酸濃度，還有，該定量性表現(xiàn)出很好的再現(xiàn)性。
另外，在本實(shí)施方式的DNA微陣列中，由單鏈核酸構(gòu)成的核酸探針和通過(guò)對(duì)該核酸探針雜交導(dǎo)入的靶核酸兩方也可以存在于該基板上。
還有，本實(shí)施方式作為在基板上以矩陣狀配置了由許多核酸相關(guān)物質(zhì)構(gòu)成的核酸探針的DNA微陣列的制造方法，其特征是在DNA微陣列，在上述核酸探針點(diǎn)形成的基板表面的一部分設(shè)置每一點(diǎn)的平均核酸密度已確定的濃度基準(zhǔn)用的核酸探針點(diǎn)，至少包括在上述基板上形成矩陣狀核酸探針的工序，和在上述核酸探針點(diǎn)形成的基板表面的一部分中，通過(guò)與上述核酸探針點(diǎn)形成相同手法，形成每一點(diǎn)的平均核酸密度已確定的濃度基準(zhǔn)用核酸探針點(diǎn)的工序。本實(shí)施方式的DNA微陣列，其特征是在DNA微陣列基板上的一部分形成已經(jīng)形成的探針點(diǎn)的核酸濃度已知的區(qū)域，由在該區(qū)域通過(guò)TOF-SIMS法檢測(cè)的2次離子強(qiáng)度做成標(biāo)準(zhǔn)曲線，使用該標(biāo)準(zhǔn)曲線，由在DNA微陣列基板上的其它區(qū)域檢測(cè)的2次離子強(qiáng)度決定固定在該探針點(diǎn)的核酸探針的核酸量(形成密度)。
即、在本實(shí)施方式的DNA微陣列中，在許多核酸相關(guān)物質(zhì)以矩陣狀配置在基板上的所謂DNA微陣列形成的基板上的一部分設(shè)置每一點(diǎn)核酸濃度已知的核酸探針點(diǎn)，通過(guò)TOF-SIMS法進(jìn)行定量測(cè)定時(shí)，用作濃度基準(zhǔn)。另外，作為每一點(diǎn)的核酸濃度已知的核酸探針點(diǎn)，在DNA微陣列基板上通過(guò)形成階段式改變了核酸濃度的核酸探針點(diǎn)，此時(shí)可以做成標(biāo)準(zhǔn)曲線，可以進(jìn)行具有更高定量性的測(cè)定。對(duì)于一般在濃度基準(zhǔn)中利用的每一點(diǎn)核酸濃度已知的核酸探針點(diǎn)，使用用通過(guò)另外途經(jīng)在同一制作條件制作的核酸探針點(diǎn)，預(yù)先通過(guò)化學(xué)分析每一點(diǎn)含有的核酸濃度已決定的核酸探針點(diǎn)。
本發(fā)明中的DNA微陣列一般來(lái)說(shuō)使用外形尺寸為1cm×1cm、1英寸×1英寸(25.4mm×25.4mm)、或玻片尺寸(例如、26mm×76mm)的基板制作，探針點(diǎn)矩陣被做成配置在內(nèi)部的平面形態(tài)。本發(fā)明就象已敘述的那樣，采用利用TOF-SIMS法分析的手段，利用設(shè)置在同一基板內(nèi)的上述濃度基準(zhǔn)，可以高精確度地對(duì)固定于DNA微陣列表面的各矩陣點(diǎn)的核酸探針的濃度進(jìn)行檢定。
在本實(shí)施方式的DNA微陣列中，配置在基板上的核酸探針就象下面所述的那樣，最好是通過(guò)共價(jià)鍵固定于基板上。為了在共價(jià)鍵的固定中利用，例如在基板表面處理過(guò)程中，對(duì)該基板表面用結(jié)合了氨基的硅烷偶聯(lián)劑(N-β-(氨乙基)-γ-氨丙基三甲氧硅烷)和交聯(lián)劑N-馬來(lái)酰亞胺己酰氧琥珀酰亞胺(EMCS)處理，做成形成被膜的形態(tài)也是有效的。
在決定每點(diǎn)含有的核酸濃度時(shí)利用的化學(xué)分析中，通過(guò)對(duì)形成許多核酸濃度分別被階段式改變的核酸探針的多個(gè)DNA微陣列，例如進(jìn)行酸處理，將核酸探針從基板分離，對(duì)該溶液中含有的核酸探針量、該核酸中的磷的量利用微量分析手段進(jìn)行分析，通過(guò)另外方法進(jìn)行定量。核酸中磷量的定量中利用的微量分析手段沒(méi)有特別限定，最好是高靈敏度、而且高精度的手段，例如ICP-MS法等。ICP-MS法中的磷檢測(cè)限度為10ppb程度，為了進(jìn)行定量，至少需要該值的2～3倍、即20～30ppb程度。另外作為樣品量(溶液量)最低限度需要1ml。
而另一方面，利用下面的噴墨法形成核酸探針時(shí)，即使在1英寸×3英寸面積上形成例如200行×300列程度的矩陣大小的核酸探針也并不那么困難。另外，噴墨法中的1次吐出量表現(xiàn)出高再現(xiàn)性，可以高準(zhǔn)確度地推定其平均值(pl級(jí))。另外，在上述濃度基準(zhǔn)用點(diǎn)的制作利用的吐出溶液中的探針DNA濃度(μM級(jí))不用說(shuō)要預(yù)先設(shè)定。
除了這些值以外，使用吐出量中的探針DNA的固定量(減去經(jīng)水洗等沒(méi)有固定的部分的量、數(shù)10％的水平)，為了獲得上述ICP-MS分析所必需的樣品量應(yīng)當(dāng)從基板上洗脫的核酸探針點(diǎn)總數(shù)可以進(jìn)行一定程度推定。具體來(lái)說(shuō)，在上述標(biāo)準(zhǔn)條件下制作核酸芯片時(shí)，每一類的濃度(μM級(jí))，在平均200行×300列程度的矩陣大小·點(diǎn)的吐出量(pl級(jí))的DNA微陣列，需要使用數(shù)10枚。
另外，關(guān)于附設(shè)在DNA微陣列上的濃度基準(zhǔn)用點(diǎn)，每一濃度的核酸濃度已知的探針點(diǎn)數(shù)雖然沒(méi)有特別限定，但形成多個(gè)最好。
本實(shí)施方式使用根據(jù)在階段式改變核酸濃度的濃度基準(zhǔn)用核酸探針點(diǎn)多個(gè)間進(jìn)行檢測(cè)的2次離子信號(hào)強(qiáng)度做成的標(biāo)準(zhǔn)曲線，可以決定未知濃度的核酸探針點(diǎn)的核酸濃度。此時(shí)，通過(guò)本發(fā)明的分析方法，使用在飛行時(shí)間型2次離子質(zhì)量分析中檢測(cè)的2次離子強(qiáng)度在達(dá)到更高定量性方面是有效的。
而上述所謂2次離子強(qiáng)度不是計(jì)數(shù)率，最好是在一定條件下，一定時(shí)間計(jì)數(shù)的積分強(qiáng)度。正確作法是將1次離子劑量作為所謂的static條件的1×1012/cm2以下的一定值，作為由一定面積放出的下面2次離子的計(jì)數(shù)值(計(jì)數(shù)的數(shù))。而1次離子的劑量至少需要1×1014/cm2以下。
在利用TOF-SIMS法的測(cè)定中，作為利用的1次離子可以使用Cs+離子、Ga+離子或Ar+離子。作為2次離子種類，如來(lái)自探針核酸、以及通過(guò)雜交導(dǎo)入的靶核酸為單鏈核酸、更具體講為DNA、RNA、cDNA(互補(bǔ)DNA)、cRNA(互補(bǔ)RNA)時(shí)構(gòu)成核酸的骨架的磷酸的P-、PO-、PO2-、PO3-等。另外，由堿基類脫去質(zhì)子后的產(chǎn)物，即堿基類為腺嘌呤時(shí)C5H4N5-(134a.m.u.)、為鳥嘌呤時(shí)C5H4N5O-(150a.m.u.)、為胞嘧啶時(shí)C4H4N3O-(110a.m.u.)、為胸腺嘧啶時(shí)C5H5N2O2-(125a.m.u)也可作為2次離子種類檢測(cè)。另外，對(duì)于核酸探針為RNA探針時(shí)，除了取代胸腺嘧啶，對(duì)來(lái)自尿嘧啶的C4H3N2O2-(111a.m.u)進(jìn)行檢測(cè)以外，可以對(duì)與DNA探針同樣的2次離子進(jìn)行檢測(cè)。以作為構(gòu)成DNA微陣列的基板，例如使用玻璃等絕緣物基板時(shí)，與1次離子照射合并，并用的電子線照射需要考慮到1次離子脈沖幅度、頻率以及樣品的電容率、以及玻璃基板的厚度后，決定合適的照射條件。
在本發(fā)明的DNA微陣列分析方法中，其特征是將起因于核酸的2次離子強(qiáng)度相應(yīng)于1次離子照射的掃描，作為二維圖像，進(jìn)行定量表示。
實(shí)施例以下舉出實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行更具體說(shuō)明。這里給出的實(shí)施例雖然是本發(fā)明最好實(shí)施方式的例子，但本發(fā)明并不限定于這樣的實(shí)施例所示的方式。
(實(shí)施例1)作為內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)用核酸的制備作為內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)用核酸選擇含有已知堿基序列的質(zhì)粒DNApUC118(3，162bp、寶酒造株式會(huì)社制)。為了做成PCR的模板，按照常規(guī)方法，用限制酶EcoR I切斷上述質(zhì)粒pUC118，做成直鏈DNA。然后經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳確認(rèn)切斷狀況后，對(duì)限制酶切斷反應(yīng)液通過(guò)酚處理、乙醇沉淀，回收目的直鏈DNA。將回收的直鏈DNA按照終濃度為10ng/μl(2.4pmol/ml)溶解于TE緩沖液(10mM Tris-HCl(pH7.5)、1mM EDTA)中，作為內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)用核酸溶液。
(實(shí)施例2)內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)用核酸的擴(kuò)增用引物的制備根據(jù)實(shí)施例1制備的直鏈狀DNApUC118 EcoR I Digest的堿基序列信息，作為PCR用引物選擇如下面表1所示的正向引物5種P1～P5、反向引物4種RP1～RP4。

(P1-PR4序列編號(hào)10-18)表1中所示位置表示以限制酶EcoR I的切斷部位的最前頭作為位置1進(jìn)行編號(hào)時(shí)，該引物堿基序列的位置。表1中反向引物，RP1～RP4表示互補(bǔ)鏈上堿基序列的位置。
表1所示的堿基序列的各引物合成后，通過(guò)高效液相層析(HPLC)進(jìn)行純化，分別按照終濃度為10pmol/μl溶解于TE緩沖液，作為引物溶液。
圖1示出了以實(shí)施例1制備的內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)用核酸pUC118 EcoR I Digest作為模板，使用表1所示引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)得到的擴(kuò)增產(chǎn)物的鏈長(zhǎng)，以及被利用的正向引物和反向引物的組合。而在反向引物中，通過(guò)另一種途經(jīng)準(zhǔn)備在5’末端進(jìn)行了熒光標(biāo)記(羅丹明)的引物，進(jìn)行與上記未標(biāo)記引物同樣處理后作為熒光標(biāo)記引物溶液。
(實(shí)施例3)內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)用探針的制備根據(jù)實(shí)施例1制備的直鏈狀質(zhì)粒DNApUC118 EcoR I Digest的堿基序列信息，設(shè)定以下內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)用探針。
表2

(B-H序列編號(hào)1-4)表2中所示位置表示以限制酶EcoR I的切斷部位的最前頭作為位置1進(jìn)行編號(hào)時(shí)，該探針堿基序列的位置。
表2所示堿基序列的4種內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)用探針合成后，作為用于固定在DNA微陣列上的官能團(tuán)，按照常規(guī)方法分別向各核酸的5’末端導(dǎo)入巰基。官能團(tuán)導(dǎo)入后進(jìn)行純化、冷凍干燥。冷凍干燥的內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)用探針于冷庫(kù)中在-30℃下保存。
圖1表示內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)用探針4種進(jìn)行雜交的靶堿基序列的位置。另外，對(duì)于各PCR擴(kuò)增產(chǎn)物也一并示出了靶堿基序列的位置。
(實(shí)施例4)外標(biāo)準(zhǔn)核酸的制備由實(shí)施例1準(zhǔn)備的直鏈狀質(zhì)粒pUC118 EcoR I Digest的序列信息設(shè)定以下的外標(biāo)準(zhǔn)核酸。
表3

(A-G序列編號(hào)5-8)表3中所示位置是表示以限制酶EcoR I的切斷部位的最前頭作為位置1進(jìn)行編號(hào)時(shí)，該外標(biāo)準(zhǔn)核酸的堿基序列位置。該4種外標(biāo)準(zhǔn)核酸具有與表2所示4種內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)用探針互補(bǔ)的堿基序列。
表3所示堿基序列的外標(biāo)準(zhǔn)核酸4種分別作為檢測(cè)、定量用標(biāo)記，合成后按照常規(guī)方法在各核酸的5’末端導(dǎo)入熒光色素(羅丹明)。熒光標(biāo)記導(dǎo)入后進(jìn)行純化，將其溶解于TE緩沖液(終濃度為5μM)，作為外標(biāo)準(zhǔn)核酸溶液。該外標(biāo)準(zhǔn)核酸溶液加入到實(shí)施遮光處理的容器上，于冷庫(kù)中在-30℃下保存。
圖1對(duì)于4種外標(biāo)準(zhǔn)核酸也示出了具有與他互補(bǔ)的堿基序列的上記4種內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)用探針進(jìn)行雜交的靶堿基序列的位置，以及其堿基序列位置。
(實(shí)施例5)DNA微陣列的制作[1]玻璃基板的清洗將合成石英玻璃基板(尺寸25mm×75mm×1mm、飯山特殊玻璃公司制)放入到耐熱性、耐堿性的槽中，浸入到制備到所定濃度的超音清洗用的清洗液中。于清洗液中浸泡過(guò)夜后，進(jìn)行20分鐘超聲清洗。然后，將基板從清洗液中取出，用純水輕輕洗涮后，于超純水中進(jìn)行20分超聲清洗。然后將基板于加熱到80℃的1N氫氧化鈉水溶液中浸泡10分鐘。再進(jìn)行純水清洗和超純水清洗，準(zhǔn)備DNA芯片用的清洗好的石英玻璃基板。
表面處理將硅烷偶聯(lián)劑；KBM-603(信越硅公司生產(chǎn))按照終濃度1wt％溶解于純水中，于室溫?cái)嚢?小時(shí)。然后將清洗好的玻璃基板浸入到硅烷偶聯(lián)劑水溶液，于室溫放置20分鐘。取出玻璃基板，用純水輕輕清洗基板表面后，向基板兩面吹氮?dú)?，使其干燥。然后將干燥的基板于加熱?20℃烘箱中烘烤1小時(shí)，完成表面的偶聯(lián)劑處理。隨著該氨基硅烷偶聯(lián)劑處理的完成，在基板表面導(dǎo)入了氨基。
另外，準(zhǔn)備按照終濃度0.3mg/ml將同仁化學(xué)研究所公司生產(chǎn)的N-馬來(lái)酰亞胺己酰氧琥珀酰亞胺(N-(6-Maleimidocaproyloxy)succinimido、以下、略為EMCS)溶解于二甲基亞砜與乙醇的1∶1(體積比)混合溶劑中的EMCS溶液。烘烤結(jié)束后，將玻璃基板放冷，然后于室溫在制備的EMCS溶液中浸泡2小時(shí)。通過(guò)這樣處理，經(jīng)硅烷偶聯(lián)劑處理導(dǎo)入表面的氨基與EMCS的琥珀酰亞胺基反應(yīng)，將來(lái)自EMCS的馬來(lái)酰亞胺基導(dǎo)入基板表面。將從BMCS溶液取出的玻璃基板用先前提到的二甲基亞砜和乙醇的混合溶劑清洗。再用乙醇清洗后，將實(shí)施了表面處理的玻璃基板在氮?dú)夥諊赂稍铩?br> 探針DNA利用實(shí)施例3制備的4種內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)用探針，按照下述表4所示組成表，配制溶解于純水，具有各種濃度的溶液、混合溶液。各內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)用探針溶液在制備后按照一定量分成小份，進(jìn)行冷凍干燥，除去水分。
表4
通過(guò)B J打印機(jī)吐出DNA、制備含有與基板結(jié)合的甘油7.5wt％、硫二甘醇7.5wt％、尿素7.5wt％、Acetylenol EH(川研フアインケミカル公司制)1.0wt％的水溶液。然后將如表4所示的預(yù)先制備為小份的27種探針溶液冷凍干燥物加到所定量的上述混合溶劑，溶解至規(guī)定濃度。將得到的DNA探針溶液填充到泡沫噴墨打印機(jī)(商品名BJF-850佳能公司制)用墨盒，裝到印字頭上。
另外，這里使用的泡沫噴墨打印機(jī)是可改造成為能進(jìn)行平板印刷的打印機(jī)。另外該泡沫噴墨打印機(jī)根據(jù)所定的文件作成方法，通過(guò)輸入印字圖樣，向?qū)?yīng)的圖樣吐出點(diǎn)，在約120微米孔距，可以點(diǎn)印約5微微升的DNA溶液。
然后，使用該改造泡沫噴墨打印機(jī)，對(duì)于1枚表面處理后玻璃基板，按照?qǐng)D2所示配列順序，分別點(diǎn)印27種探針溶液。確認(rèn)進(jìn)行了目的點(diǎn)印字后，于加濕盒內(nèi)靜置30分鐘，使玻璃基板表面的馬來(lái)酰亞胺基和DNA探針5’末端的巰基反應(yīng)。
清洗反應(yīng)30分鐘后，通過(guò)含有100mM的NaCl的10mM磷酸緩沖液(pH7.0)將殘留在表面的DNA溶液沖洗掉，得到在玻璃基板表面固定了點(diǎn)印成矩陣狀的單鏈DNA基因芯片(DNA探針·陣列基板)。
(實(shí)施例6)通過(guò)外標(biāo)準(zhǔn)核酸對(duì)基板進(jìn)行檢定制備8枚實(shí)施例5制作的DNA微陣列。對(duì)于這8枚DNA微陣列，浸入到以下所示組成的封閉液，于室溫放置3小時(shí)，實(shí)施封閉處理。
表5封閉溶液組成

另外，制作8種含有下面表6所示組成的外標(biāo)準(zhǔn)核酸的雜交溶液。而雜交溶液的基本溶劑是100mM NaCl、10mM磷酸緩沖液(pH7.0)(以下、稱為基本緩沖液)，將表6所示的外標(biāo)準(zhǔn)核酸單獨(dú)或混合物溶解于該基本緩沖液中，無(wú)論是單獨(dú)，還是混合，合計(jì)的終濃度為30nM。
表6

記入表6中外標(biāo)準(zhǔn)核酸欄的省略號(hào)是表3所示的外標(biāo)準(zhǔn)核酸名稱第一個(gè)文字，表示含有該外標(biāo)準(zhǔn)核酸。
封閉處理結(jié)束后，用基本緩沖液淋洗DNA微陣列。將封閉處理后的DNA微陣列各1枚浸入到準(zhǔn)備的8種雜交溶液中，用乙烯薄膜密封。于45℃進(jìn)行3小時(shí)雜交反應(yīng)。
反應(yīng)結(jié)束后，將DNA微陣列從乙烯薄膜中取出，進(jìn)行以下清洗。
2×SSC+0.1％十二烷基硫酸鈉(SDS) 55℃ 5分鐘×3次0.1×SSC.室溫1分鐘×1次，其中，2×SSC的組成為NaCl 17.5g/l、檸檬酸三鈉2水合物8.8g/l，用氫氧化鈉溶液調(diào)整到pH7.0。
清洗結(jié)束后，用氣流除去液體，進(jìn)行干燥。干燥后用DNA陣列掃描儀(GenePix 4000B、Axon公司制)，測(cè)定各個(gè)點(diǎn)的熒光量。測(cè)定數(shù)據(jù)用DNA陣列掃描附帶的解析軟件(GenePix Pro 3.0)進(jìn)行解析。
(實(shí)施例7)固定探針的密度檢定由測(cè)定的熒光量求各探針的密度比。如表7所示。
表7

密度比是以Ink No.5的DNA探針固定密度作為100％時(shí)，作為對(duì)他的相對(duì)比求出的。另外各外標(biāo)準(zhǔn)核酸的標(biāo)記率表示通過(guò)另一方法測(cè)定，用其標(biāo)記率進(jìn)行修正的密度比。
表7中Ink No.1～4的密度比(熒光量)不到理論值的200％的是由于探針核酸的固定量達(dá)到了基板容許量(飽和量)。
另外，表4中所示的Ink No.17～27混合探針的各探針密度比分別表示依據(jù)對(duì)應(yīng)的各探針濃度的單獨(dú)探針密度比的值。
(實(shí)施例8)使用外標(biāo)準(zhǔn)核酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線的做成由實(shí)施例7結(jié)果，檢定各探針固定量，使用該修正數(shù)據(jù)做成標(biāo)準(zhǔn)曲線。
具體來(lái)說(shuō)，使用實(shí)施例5制作的DNA微陣列，與實(shí)施例6同樣進(jìn)行雜交實(shí)驗(yàn)。但外標(biāo)準(zhǔn)核酸的添加量為如下所述的混合量。外標(biāo)準(zhǔn)核酸的混合比為A-Rho66.7％(20nM)C-Rho25.0％(7.5nM)E-Rho6.7％(2.0nM)G-Rho1.7％(0.5nM)按照與實(shí)施例6同樣步驟進(jìn)行測(cè)定和解析。
使用測(cè)定結(jié)果和實(shí)施例7求出的探針密度的修正值，做成標(biāo)準(zhǔn)曲線。圖3表示做成的標(biāo)準(zhǔn)曲線。
(實(shí)施例9)使用PCR產(chǎn)物做成標(biāo)準(zhǔn)曲線使用實(shí)施例1制備的內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)用核酸、以及實(shí)施例2制備的內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)用引物，做成PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的標(biāo)準(zhǔn)曲線。
首先使用表8的內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)用引物的組合，按照常規(guī)方法進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。PCR反應(yīng)液組成如下所示。另外，在本實(shí)施例使用的反向引物中，使用了在實(shí)施例3中準(zhǔn)備的5’末端進(jìn)行了熒光標(biāo)記的引物。
PCR反應(yīng)液PCR預(yù)混合反應(yīng)液(2×) 25μlpUC118 EcoR I Digest 1μl混合引物(表8) 6μl純水 18μl/總計(jì) 50μl溫度循環(huán)(92℃10秒 62℃15秒 72℃30秒24循環(huán))表8

*表示帶有熒光標(biāo)記反應(yīng)后進(jìn)行凝膠過(guò)濾，對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行純化。用TE緩沖液調(diào)整容量后，測(cè)定240nm的吸光度和熒光量，對(duì)核酸量和熒光標(biāo)記量進(jìn)行定量，求出標(biāo)記率。
使用求出標(biāo)記率的內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)擴(kuò)增產(chǎn)物，與實(shí)施例8同樣進(jìn)行雜交反應(yīng)，測(cè)定起因于與探針結(jié)合的內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光量。
使用內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)擴(kuò)增產(chǎn)物標(biāo)記率和實(shí)施例7求出的探針密度的修正值，由測(cè)定結(jié)果做成標(biāo)準(zhǔn)曲線。圖4表示做成的標(biāo)準(zhǔn)曲線。
研究圖4所示的標(biāo)準(zhǔn)曲線，可以看出，標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率存在的差異與擴(kuò)增產(chǎn)物分子量(鏈長(zhǎng))有關(guān)。即，為了更準(zhǔn)確地對(duì)含有目的堿基序列的核酸進(jìn)行定量，判斷需要具有目的堿基序列核酸的擴(kuò)增產(chǎn)物和采用可給出具有同等鏈長(zhǎng)的內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)擴(kuò)增產(chǎn)物的引物組合。
以下實(shí)施例表示使用通過(guò)與核酸探針形成相同手法形成的在上述探針的存在量或密度檢定用添加的濃度標(biāo)準(zhǔn)用探針的例子。
(實(shí)施例10)圖5是表示在基板上結(jié)合許多點(diǎn)狀探針的探針陣列的平面配置和斷面構(gòu)造的模式圖。501為在任意條件下制作的探針群，502為核酸濃度已知的探針群。在斷面圖中，503為基板、504為由有機(jī)物質(zhì)構(gòu)成的表面處理層、500為核酸探針。以下就圖5例舉的構(gòu)成的探針陣列，對(duì)于應(yīng)用眾所周知的方法(特開(kāi)平11-187900號(hào)公報(bào)記載的方法9)進(jìn)行制作的工序進(jìn)行說(shuō)明。
〔1〕玻璃基板的清洗和〔2〕表面處理與實(shí)施例5同樣進(jìn)行。
〔3〕探針DNA的合成委托DNA合成業(yè)者(ベツクス)，合成序列編號(hào)9的單鏈核酸(dT的40聚體)。另外，對(duì)于序列編號(hào)1的單鏈DNA的5’末端在合成時(shí)使用巰基修飾劑(グレンリサ一チ)，導(dǎo)入巰基(SH)。DNA合成后，通過(guò)常規(guī)方法進(jìn)行脫保護(hù)、DNA的回收，另外，在純化中使用HPLC。從合成到純化為止的一系列工序都委托合成業(yè)者。
序列編號(hào)95’-HS-(CH2)6-O-PO2-O-TTTTTTTTTT TTTTT
TTTTT TTTTTTTTTT TTTTTTTTTT 3’〔4〕通過(guò)熱噴墨打印機(jī)吐出DNA、和與基板的結(jié)合將〔3〕所述的序列編號(hào)1的單鏈DNA按照終濃度8μM溶解于含有甘油7.5wt％、尿素7.5wt％、硫二甘醇7.5wt％、乙炔醇(商品名Acetylenol EH；川研フアインケミカル公司制)1wt％的溶液。
另外，將使用作為熱噴墨法一種的泡沫噴墨法的泡沫噴墨打印機(jī)BJF-850(佳能)用的打印機(jī)頭BC-50(佳能)改造成可以吐出數(shù)100μl溶液。將實(shí)施了這樣改造的噴頭搭載到改造成可向作為平板的石英基板上吐出墨水的吐出描圖機(jī)上。向該噴頭的改造槽部注入數(shù)100μl上述DNA溶液，將EMCS處理基板裝到吐出描圖機(jī)上，向EMCS處理表面點(diǎn)印。另外，點(diǎn)印時(shí)的吐出量為4pl/Droplet，點(diǎn)印的范圍向基板上20mm×30mm范圍吐出200dpi、即以127μm的孔距吐出。在該條件下，點(diǎn)成矩陣(157行236列)狀的點(diǎn)的直徑約為50μm。
點(diǎn)印結(jié)束后、將基板于加濕盒內(nèi)靜置30分鐘，使基板表面的馬來(lái)酰亞胺基和核酸探針5’末端的巰基(-SH)反應(yīng)，固定DNA探針。然后，用純水清洗基板，保存在純水中。DNA結(jié)合基板(DNA芯片)在通過(guò)TOF-SIMS分析之前吹氮?dú)猓M(jìn)行干燥，于真空干燥器中進(jìn)一步干燥。通過(guò)這樣的條件，制作共計(jì)15枚DNA芯片。
另外，點(diǎn)印中使用的DNA溶液中的序列編號(hào)1的單鏈DNA濃度選擇5μM、2.5μM，通過(guò)同樣操作制作各25枚、35枚DNA芯片。將以上3種作為標(biāo)準(zhǔn)DNA芯片。
然后，在與上述同樣條件下制作使用單鏈DNA的一般溶液濃度(約8μM)的DNA芯片。但在該DNA芯片中，從端部的第1行到第3行使用在標(biāo)準(zhǔn)DNA芯片制作中使用的同樣單鏈DNA溶液三種。即，在基板最端部的第1行，配置以濃度10μM的DNA溶液形成的探針點(diǎn)，在第2行，以濃度5μM的DNA溶液形成的探針點(diǎn)，在第3行以濃度2.5μM的DNA溶液形成的探針點(diǎn)。另外，使用其它組的DNA濃度8μM溶液制作從端部的第1行至第3行以外的行(第4行至第157行)。而探針陣列的數(shù)目可以任意設(shè)定。
(實(shí)施例11)核酸芯片上的核酸的定量將用3種DNA濃度制作的標(biāo)準(zhǔn)DNA芯片分別用酸清洗之后，使DNA探針溶解后，在該酸溶液不飛散的條件濃縮至1ml以下。然后向該濃縮溶液中加超純水1ml進(jìn)行定容。將該溶液導(dǎo)入ICP-MS裝置后測(cè)定P(磷)的重量。以該值為基礎(chǔ)，考慮測(cè)定的點(diǎn)數(shù)(點(diǎn)印的數(shù))，決定用各濃度制作的DNA探針的(每1點(diǎn)的)DNA分子數(shù)的平均值。另外，在各DNA濃度下制作的基板的枚數(shù)在考慮ICP-MS裝置中的P的檢出限界濃度(約10ppb)和各基板上的DNA分子數(shù)之后決定，并不限定于實(shí)施例10給出的枚數(shù)。
(實(shí)施例12)TOF-SIMS測(cè)定將圖5所示的DNA芯片移到飛行時(shí)間型二次離子質(zhì)量分析裝置(TOFSIMS IVION TOF社)的分析室，在表1的條件下照射直至1次離子的注入劑量達(dá)到1×1012atoms/cm2為止，對(duì)其間檢出的2次離子PO3-(質(zhì)荷比78.958amu(アトムマスユニツト))進(jìn)行累計(jì)，求累積強(qiáng)度。圖6表示在從第1行至第3行的各DNA濃度的點(diǎn)位置測(cè)定的2次離子強(qiáng)度的平均值和DNA的形成密度(每1點(diǎn)的DNA分子數(shù))的對(duì)應(yīng)關(guān)系。其中，在對(duì)探針DNA進(jìn)行固定之前，將在表面處理后基板測(cè)定PO3-的強(qiáng)度作為背景值。
確認(rèn)各行的點(diǎn)中的DNA形成密度與2次離子強(qiáng)度成比例。在相同測(cè)定條件下，對(duì)于將噴墨打印機(jī)吐出的DNA溶液中的核酸濃度定為8μM形成的核酸探針，進(jìn)行TOF-SIMS測(cè)定時(shí)，由PO3-的計(jì)數(shù)的數(shù)求出的各點(diǎn)中的DNA形成密度(每1點(diǎn)的DNA分子數(shù))大約為2.0×107，在任意選擇的10個(gè)點(diǎn)內(nèi)的偏差在20％以下。
表9 TOF-SIMS的測(cè)定條件

(實(shí)施例13)形成密度分布的圖像表示對(duì)實(shí)施例12使用的相同樣品的多個(gè)核酸探針進(jìn)行設(shè)定后，在樣品面進(jìn)行1次離子掃描，使發(fā)生的2次離子對(duì)應(yīng)于各掃描點(diǎn)來(lái)表示，將在各掃描點(diǎn)得到的P-的強(qiáng)度分為多個(gè)階段，設(shè)定類似色彩，對(duì)P-的強(qiáng)度分布，即核酸的面密度(每一探針點(diǎn)的核酸分子數(shù))形成密度的分布進(jìn)行定量比較。
產(chǎn)業(yè)上利用的可能性就象以上說(shuō)明的那樣，通過(guò)本發(fā)明可以提供簡(jiǎn)便、且詳細(xì)的分析的DNA微陣列。具體來(lái)說(shuō)，在進(jìn)行實(shí)際目的的核酸檢測(cè)操作的同時(shí)，可以簡(jiǎn)便實(shí)施檢定操作。另外，在同時(shí)進(jìn)行該檢定操作本身時(shí)，結(jié)果可以得到高精度的檢定結(jié)果。因此，通過(guò)利用本發(fā)明的DNA微陣列，在目的核酸分子的定量分析中的定量性精度顯著提高。另外，在該定量分析操作中，對(duì)應(yīng)于本發(fā)明的DNA微陣列，作為檢測(cè)用試劑盒通過(guò)使用內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)擴(kuò)增用引物、外標(biāo)準(zhǔn)核酸，利用者可以非常簡(jiǎn)便地利用本發(fā)明。另外，通過(guò)在芯片基板上備有通過(guò)與上述核酸探針點(diǎn)形成相同的手法形成的、每點(diǎn)的平均核酸密度的濃度已經(jīng)決定的基準(zhǔn)用核酸探針點(diǎn)，配置在基板上的未知濃度的核酸探針點(diǎn)的核酸濃度可以通過(guò)2次離子質(zhì)量分析法決定，與以往方法比較，再現(xiàn)性、定量性提高。
通過(guò)使用本發(fā)明的手法，可以提高DNA微陣列制品的可靠性。另外，也可以將以矩陣狀配置在DNA微陣列內(nèi)的核酸探針點(diǎn)的形成密度分布作為圖像表示。
序列表<110> 佳能株式會(huì)社<120> 帶有標(biāo)準(zhǔn)探針的DNA微陣列以及包含該陣列的試劑盒<130> CF017338<160> 18<170> PatentIn version 3.1<210> 1<211> 18<212> DNA<213> 人工<220>
<223> 探針<400> 1actggccgtc gttttaca 18<210> 2<211> 20<212> DNA<213> 人工<220>
<223> 探針<400> 2gtgagctatg agaaagcgcc 20<210> 3<211> 20<212> DNA<213> 人工<220>
<223> 探針
<400> 3ggtatcttta tagtcctgtc 20<210> 4<211> 20<212> DNA<213> 人工<220>
<223> 探針<400> 4ggccttttgc tcacatgttc 20<210> 5<211> 18<212> DNA<213> 人工<220>
<223> 外標(biāo)準(zhǔn)<400> 5tgtaaaacga cggccagt 18<210> 6<211> 20<212> DNA<213> 人工<220>
<223> 外標(biāo)準(zhǔn)<400> 6ggcgctttct catagctcac 20<210> 7<211> 20<212> DNA<213> 人工
<220>
<223> 外標(biāo)準(zhǔn)<400> 7gacaggacta taaagatacc 20<210> 8<211> 20<212> DNA<213> 人工<220>
<223> 外標(biāo)準(zhǔn)<400> 8gaacatgtga gcaaaaggcc 20<210> 9<211> 40<212> DNA<213> 人工<220>
<223> 探針<400> 9tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 40<210> 10<211> 18<212> DNA<213> 人工<220>
<223> 引物<400> 10gagacaataa ccctgata 18
<210> 11<211> 18<212> DNA<213> 人工<220>
<223> 引物<400> 11ccttaacgtg agttttcg 18<210> 12<211> 18<212> DNA<213> 人工<220>
<223> 引物<400> 12gcttggagcg aacgacct 18<210> 13<211> 18<212> DNA<213> 人工<220>
<223> 引物<400> 13gagtcgacct gcaggcat 18<210> 14<211> 20<212> DNA<213> 人工<220>
<223> 引物
<400> 14ggttggactc aagacgatag 20<210> 15<211> 18<212> DNA<213> 人工<220>
<223> 引物<400> 15taagttgggt aacgccag 18<210> 16<211> 18<212> DNA<213> 人工<220>
<223> 引物<400> 16agggcgctgg caagtgta 18<210> 17<211> 18<212> DNA<213> 人工<220>
<223> 引物<400> 17cgtttcggtg atgacggt 18<210> 18<211> 20<212> DNA<213> 人工
<220>
<223> 引物<400> 18gcggtaatac ggttatccac 20
權(quán)利要求
1.DNA微陣列，是在基板上固定了為了檢測(cè)檢體中所含的具有目的堿基序列的核酸分子使用的帶有實(shí)質(zhì)上與該目的核酸分子的堿基序列互補(bǔ)的堿基序列的核酸探針的DNA微陣列中，其特征在于，含有選自在含有該目的堿基序列的核酸的擴(kuò)增反應(yīng)檢定用而添加的一種以上的內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)用探針、檢出操作以及探針量檢定用中添加的一種以上的外標(biāo)準(zhǔn)用探針、通過(guò)與形成上述核酸探針同樣的手法形成的上述探針的存在量或密度進(jìn)行檢定用探針中的一種以上的探針。
2.DNA微陣列，是在基板上固定了為了檢測(cè)檢體中所含的具有目的堿基序列的核酸分子使用的帶有實(shí)質(zhì)上與該目的核酸分子的堿基序列互補(bǔ)的堿基序列的核酸探針的DNA微陣列中，其特征在于，從為了對(duì)上述檢體中所含的具有上述目的堿基序列的核酸分子的含有濃度進(jìn)行定量，含有向含有的一種以上的該目的堿基序列的核酸的擴(kuò)增反應(yīng)檢定用中添加的內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)用探針、一種以上的檢出操作以及探針量檢定用中添加的外標(biāo)準(zhǔn)用探針選擇出的一種以上的探針。
3.權(quán)利要求2所述的DNA微陣列，其特征是固定在基板上的該內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)用探針和/或該外標(biāo)準(zhǔn)用探針按照4點(diǎn)以上的量或密度以一系列的組固定在基板上。
4.權(quán)利要求2所述的DNA微陣列，其特征是該內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)用探針由相對(duì)于與來(lái)自內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)核酸的擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)物的不同鏈長(zhǎng)的二種以上的探針構(gòu)成。
5.權(quán)利要求2所述的DNA微陣列，其特征是該外標(biāo)準(zhǔn)用探針由相對(duì)于添加的外標(biāo)準(zhǔn)核酸的含有任意核酸堿基數(shù)的互補(bǔ)堿基序列的二種以上的探針構(gòu)成。
6.權(quán)利要求2所述的DNA微陣列，其特征是該內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)用探針和外標(biāo)準(zhǔn)用探針是將合成核酸固定在基板上。
7.權(quán)利要求6所述的DNA微陣列，其特征是該合成核酸的鏈長(zhǎng)為15堿基～75堿基長(zhǎng)。
8.引物組，是在作為利用DNA微陣列對(duì)含有目的堿基序列的核酸進(jìn)行定量檢測(cè)時(shí)，在對(duì)具有該目的堿基序列進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)時(shí)，與含有該目的堿基序列的核酸同時(shí)擴(kuò)增的內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)核酸的擴(kuò)增反應(yīng)用引物組，其特征是來(lái)自含有目的堿基序列的核酸的擴(kuò)增產(chǎn)物的鏈長(zhǎng)與來(lái)自該引物組參與的內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)核酸的擴(kuò)增產(chǎn)物的鏈長(zhǎng)被設(shè)計(jì)成相同。
9.目的堿基序列檢測(cè)用試劑盒，是在利用DNA微陣列對(duì)含有目的堿基序列的核酸進(jìn)行定量檢測(cè)時(shí)，作為在對(duì)含有該目的堿基序列的核酸進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)時(shí)，包含與含有目的堿基序列的核酸同時(shí)擴(kuò)增的內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)核酸的擴(kuò)增反應(yīng)用引物組的檢測(cè)用試劑盒，其特征是當(dāng)來(lái)自上述含有目的堿基序列的核酸的擴(kuò)增產(chǎn)物的鏈長(zhǎng)為二種以上時(shí)，包含二種以上對(duì)應(yīng)于不同鏈長(zhǎng)的權(quán)利要求8所述的引物組。
10.權(quán)利要求8所述的目的堿基序列檢測(cè)用試劑盒，其特征是多個(gè)該引物組包含各1種以上的擴(kuò)增產(chǎn)物鏈長(zhǎng)200bp以下用、200～500bp用、500～2000bp用、2000bp以上用的引物。
11.目的堿基序列檢測(cè)用試劑盒，是在作為利用DNA微陣列對(duì)含有目的堿基序列的核酸進(jìn)行定量檢測(cè)時(shí)，作為含有添加到檢體中的外標(biāo)準(zhǔn)核酸的檢測(cè)用試劑盒，其特征是包含二種以上的用可檢測(cè)的標(biāo)記物標(biāo)記的合成核酸的外標(biāo)準(zhǔn)核酸。
12.權(quán)利要求9所述的目的堿基序列檢測(cè)用試劑盒，其特征是該標(biāo)記物是熒光物質(zhì)、放射性物質(zhì)、發(fā)光物質(zhì)中的任一種。
13.目的堿基序列檢測(cè)用試劑盒，是在利用DNA微陣列對(duì)含有目的堿基序列的核酸進(jìn)行定量檢測(cè)時(shí)，在含有該目的堿基序列的核酸的擴(kuò)增反應(yīng)時(shí)作為包含與含有目的堿基序列的核酸同時(shí)擴(kuò)增的內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)核酸的檢測(cè)用試劑盒，其特征是作為內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)核酸包含二種以上的與檢測(cè)目的堿基序列沒(méi)有同源性的來(lái)自微生物的核酸或來(lái)自病毒的核酸。
14.DNA微陣列，是由許多核酸相關(guān)物質(zhì)構(gòu)成的探針點(diǎn)以矩陣狀配置在基板上的DNA微陣列，其特征是在上述核酸探針點(diǎn)形成的基板表面的一部分具備通過(guò)與上述核酸探針點(diǎn)形成相同手法形成的每一點(diǎn)平均核酸密度已確定的存在量或密度檢定用的核酸探針點(diǎn)。
15.權(quán)利要求14所述的DNA微陣列，其特征是作為上述濃度基準(zhǔn)用的核酸探針點(diǎn)具備具有多個(gè)階段的平均核酸密度的每一點(diǎn)核酸密度已決定的多種核酸探針點(diǎn)。
16.權(quán)利要求14所述的DNA微陣列，其特征是每一點(diǎn)的平均核酸密度已決定的核酸探針點(diǎn)另外通過(guò)化學(xué)分析決定該每點(diǎn)的平均核酸密度。
17.權(quán)利要求16所述的DNA微陣列，其特征是作為上述化學(xué)分析手段，使用通過(guò)誘導(dǎo)偶合等離子體質(zhì)量分析法(Inductively CoupledPlasma Mass Spectrometry、以下略為ICP-MS)，決定該每點(diǎn)的平均核酸密度。
18.權(quán)利要求14所述的DNA微陣列，其特征是上述核酸探針由單鏈核酸構(gòu)成。
19.權(quán)利要求14所述的DNA微陣列，其特征是在該基板上配置由單鏈核酸構(gòu)成的核酸探針和通過(guò)對(duì)該核酸探針雜交導(dǎo)入的靶核酸的兩方。
20.DNA微陣列的分析方法，是在基板上以矩陣狀配置了由許多核酸相關(guān)物質(zhì)構(gòu)成的核酸探針點(diǎn)的DNA微陣列的分析方法，其特征是在上述核酸探針點(diǎn)形成的基板表面的一部分設(shè)置通過(guò)與上述核酸探針點(diǎn)的形成相同的手法形成的每點(diǎn)平均核酸密度已經(jīng)決定的濃度基準(zhǔn)用的核酸探針點(diǎn)，作為上述濃度基準(zhǔn)用核酸探針點(diǎn)，具備具有多個(gè)階段的平均核酸密度的每點(diǎn)平均核酸密度已經(jīng)決定的多種核酸探針點(diǎn)，相對(duì)于具有上述多個(gè)階段的平均核酸密度的多種核酸探針點(diǎn)，使用根據(jù)進(jìn)行2次離子質(zhì)量分析時(shí)檢出的2次離子的信號(hào)強(qiáng)度做成的標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過(guò)2次離子質(zhì)量分析法決定配置在基板上的未知濃度的核酸探針點(diǎn)核酸濃度。
21.權(quán)利要求20所述的方法，其特征是作為上述2次離子質(zhì)量分析使用飛行時(shí)間型2次離子質(zhì)量分析法。
22.權(quán)利要求21所述的方法，其特征是在上述2次離子質(zhì)量分析檢測(cè)的2次離子強(qiáng)度以1次離子的劑量作為選擇在1×1014/cm2以下的一定值時(shí)，是由1次離子照射的一定面積放出的來(lái)自上述核酸探針的特定的2次離子的積分強(qiáng)度(計(jì)數(shù)的數(shù))。
23.權(quán)利要求21所述的方法，其特征是在上述2次離子質(zhì)量分析中檢測(cè)的2次離子強(qiáng)度，在將1次離子的劑量作為選擇在1×1012/cm2以下的一定值時(shí)，是由1次離子照射的一定面積放出的來(lái)自上述核酸探針的特定的2次離子的積分強(qiáng)度(計(jì)數(shù)的數(shù))。
24.權(quán)利要求21～23中任一項(xiàng)所述的方法，其特征是作為在上述2次離子質(zhì)量分析中檢測(cè)的2次離子，可以利用由從腺嘌呤、胸腺嘧啶、鳥嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶的各堿基脫去一個(gè)氫原子的陰離子、或P-、PO-、PO2-、PO3-構(gòu)成的來(lái)自核酸探針的2次離子種類選擇的陰離子。
25.權(quán)利要求21～24中任一項(xiàng)所述的方法，其特征是設(shè)置根據(jù)在上述2次離子質(zhì)量分析中檢測(cè)的2次離子的強(qiáng)度，對(duì)應(yīng)于1次離子的照射位置以二維表示的2次離子強(qiáng)度的圖像表示檢測(cè)結(jié)果的工序。
26.DNA微陣列的制造方法，是由許多核酸相關(guān)物質(zhì)構(gòu)成的核酸探針以矩陣狀配置在基板上的DNA微陣列的制造方法，其特征是在DNA微陣列中，在形成上述核酸探針點(diǎn)的基板表面的一部分設(shè)置每一點(diǎn)的平均核酸密度已確定的濃度基準(zhǔn)用的核酸探針點(diǎn)時(shí)，至少具有在上述基板上形成矩陣狀核酸探針的工序，在上述核酸探針點(diǎn)形成的基板表面的一部分中，通過(guò)與上述核酸探針點(diǎn)形成相同手法，形成每一點(diǎn)的平均核酸密度已確定的濃度基準(zhǔn)用核酸探針點(diǎn)的工序。
全文摘要
本發(fā)明提供在基板上固定了為了檢測(cè)檢體中所含的具有目的堿基序列的核酸分子使用的帶有實(shí)質(zhì)上與該目的核酸分子的堿基序列互補(bǔ)的堿基序列的核酸探針的DNA微陣列，是特征如下的DNA微陣列含有從用于檢定靶核酸的一種以上的內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)用探針、用于檢出操作以及探針量檢定的一種以上的外標(biāo)準(zhǔn)用探針、用于對(duì)通過(guò)與上述核酸探針形成同樣的手法形成的上述探針的存在量或密度進(jìn)行檢定的探針選擇出的一種以上的探針。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK1668923SQ0381681
公開(kāi)日2005年9月14日 申請(qǐng)日期2003年6月23日 優(yōu)先權(quán)日2002年6月24日
發(fā)明者川口正浩, 岡本尚志, 高瀨博光, 橋本浩行 申請(qǐng)人:佳能株式會(huì)社