專利名稱：制備o－乙酰絲氨酸和l－半胱氨酸以及l(fā)－半胱氨酸相關(guān)產(chǎn)物的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及制備O-乙酰絲氨酸、L-半胱氨酸以及來源于它們的含硫化合物的方法。
L-半胱氨酸及其衍生物可用于藥物領(lǐng)域(治療支氣管疾病)、化妝品工業(yè)(作為洗發(fā)香波和電燙波浪形洗劑的成分)以及食物領(lǐng)域(作為制作生面團(tuán)時(shí)的抗氧劑、風(fēng)味增強(qiáng)劑和佐劑)。L-半胱氨酸迄今為止通過從含角蛋白物質(zhì)(如頭發(fā)、鬃毛、角、蹄以及羽毛)抽提或前體的酶促轉(zhuǎn)化獲得。通過微生物過量產(chǎn)生L-半胱氨酸十分理想，因?yàn)長-半胱氨酸不僅是經(jīng)濟(jì)上有意義的化合物，而且，如由

圖1-3中可明顯看到，其構(gòu)成谷胱甘肽、甲硫氨酸和生物素合成中的重要中間產(chǎn)物。
在所有有機(jī)體中，L-半胱氨酸在硫代謝中具有重要位置并用于蛋白質(zhì)、谷胱甘肽、生物素、甲硫氨酸和其它含硫代謝物的合成。此外，L-半胱氨酸在輔酶A的生物合成中作為前體；除了這一點(diǎn)之外，L-半胱氨酸可以容易地氧化成胱氨酸。在L-半胱氨酸和其它氨基酸(如L-絲氨酸、甘氨酸和L-甲硫氨酸)的生物合成之間存在密切的聯(lián)系。
在原核生物中詳盡地研究了L-半胱氨酸的合成(圖4)，具體地說是在細(xì)菌中(Kredich，N.M.和G.M.Tomkins 1966，生物化學(xué)雜志，2414955-4965；Kredich，N.M.，1987，半胱氨酸的生物合成，在Neidhardt F.C.，Ingraham，J.L.，Magasanik，B.，Low，K.B.，Schaechter，M.，Umbarger，H.E.(編輯)，大腸桿菌和鼠傷寒沙門氏菌細(xì)胞和分子生物學(xué)，第1卷.美國微生物學(xué)會(huì)，華盛頓，419-428)。關(guān)鍵反應(yīng)由下列反應(yīng)組成把乙?；D(zhuǎn)移至絲氨酸以產(chǎn)生O-乙酰絲氨酸1)，其后為由SH基取代乙?；?，導(dǎo)致L-半胱氨酸的合成2)。
1)L-絲氨酸+乙酰輔酶A→O-乙酰絲氨酸+輔酶A2)O-乙酰絲氨酸+H2S→L-半胱氨酸+乙酸鹽在微生物和植物中，O-乙酰絲氨酸(不是絲氨酸)作為L-半胱氨酸的碳骨架的直接前體(Kredich，N.M.和G.M.Tomkins 1966，生物化學(xué)雜志，2414955-4965)。反應(yīng)通過絲氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶(EC 2.3.1.30)催化，其中轉(zhuǎn)移乙?；援a(chǎn)生L-絲氨酸的活化形式，絲氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶由cysE基因編碼，并通過末端產(chǎn)物L(fēng)-半胱氨酸進(jìn)行嚴(yán)格控制。已經(jīng)克隆了絲氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶基因并已知推導(dǎo)自DNA序列的氨基酸序列(Denk，D.和Bock，A.1987，微生物遺傳學(xué)雜志，133515-525)。
L-半胱氨酸自身的形成由兩個(gè)O-乙酰絲氨酸硫化氫解酶同工酶(EC 4.2.99.8)催化，該酶由基因cysK(O-乙酰絲氨酸硫化氫解酶A)和cysM(O-乙酰絲氨酸硫化氫解酶B)編碼，在該反應(yīng)中，O-乙酰絲氨酸作為β-丙氨酰供體，H2S作為β-丙氨酰受體(Kredich，N.M.和G.M.Tomkins 1966，生物化學(xué)雜志，2414955-4965)，O-乙酰絲氨酸硫化氫解酶A對半胱氨酸合成做出了主要貢獻(xiàn)。此外，O-乙酰絲氨酸硫化氫解酶B(cysM)能夠利用硫代硫酸鹽作為硫來源(Sirko，A.等，1987，微生物遺傳學(xué)雜志，1332719-2725)。O-乙酰絲氨酸硫化氫解酶B催化O-乙酰絲氨酸和硫代硫酸鹽之間的反應(yīng)以形成S-硫代半胱氨酸，然后S-硫代半胱氨酸可以轉(zhuǎn)化成半胱氨酸(Nakamura，T.等，1983，細(xì)菌學(xué)雜志，156，656-662)。
L-半胱氨酸的終產(chǎn)物對絲氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶的野生型的抑制是在半胱氨酸生物合成的動(dòng)力學(xué)調(diào)節(jié)中的生理學(xué)上重要因子(Kredich，N.M.1971，生物化學(xué)雜志，246，3474-3484；Kredich，N.M.和G.M.1966 Tomkins，生物化學(xué)雜志，241，4955-4965)。絲氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶的野生型形式的活性可被半胱氨酸抑制。已對這種抑制作用進(jìn)行動(dòng)力學(xué)研究并發(fā)現(xiàn)其具有競爭性特性。在0.1mM乙酰輔酶A和1mM L-絲氨酸存在下測得抑制劑常數(shù)Ki＝1.1×10-6M(Kredich，N.M.1971與Tomkins G.M.1966，生物化學(xué)雜志，241，4955-4965)。
例子可從分離半胱氨酸原養(yǎng)型回復(fù)體的文獻(xiàn)中找到，其絲氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶活性表現(xiàn)出被L-半胱氨酸的終產(chǎn)物抑制，由于在編碼區(qū)中的氨基酸取代(通過用甲磺酸乙酯化學(xué)突變半胱氨酸營養(yǎng)缺陷型菌株(Denk，D.，Bck，A.，1987，微生物遺傳學(xué)雜志，133515-525))，L-半胱氨酸僅微弱地存在。根據(jù)論及的參考文獻(xiàn)，這種突變體的反饋抗性提高10倍。因而，當(dāng)與野生型形式進(jìn)行比較時(shí)，該突變體的Ki大約是0.01mM。
本發(fā)明涉及表現(xiàn)出對抑制劑L-半胱氨酸的敏感性的絲氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶，與野生型酶比較該敏感性降低，當(dāng)與野生型序列相比較時(shí)其蛋白質(zhì)序列表現(xiàn)出至少一種突變或缺失，其中所說的突變位于從97位氨基酸到273位氨基酸并包括273位氨基酸的序列區(qū)，或所說的缺失在起自227位氨基酸的羧基末端序列區(qū)，1位是圖5(SEQ ID NO1)中的起始甲硫氨酸，并且256位上的Met突變?yōu)镮le除外。
已令人驚奇地發(fā)現(xiàn)，絲氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶的羧基末端的新的氨基酸取代和/或氨基酸缺失導(dǎo)致半胱氨酸敏感性的降低，同時(shí)可以保留適當(dāng)?shù)拿复倩钚浴?br> 新的絲氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶優(yōu)選地在1mM L-絲氨酸和0.1mM乙酰輔酶A存在下具有0.005-2.3mM的抑制劑常數(shù)Ki，其中至少一種突變的絲氨酸乙?；D(zhuǎn)移酶優(yōu)選地在1mM L-絲氨酸和0.1mM乙酰輔酶A存在下具有0.015-2.3mM的抑制劑常數(shù)Ki，同時(shí)至少一種羧基末端缺失的絲氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶優(yōu)選地在1mM L-絲氨酸和0.1mM乙酰輔酶A存在下表現(xiàn)出0.005-0.03的抑制劑常數(shù)Ki。
尤其優(yōu)選的酶突變體對L-半胱氨酸的抑制劑常數(shù)(Ki)在1mM L-絲氨酸和0.1mM乙酰輔酶A存在下在0.02至2.3mM之間。
新的絲氨酸乙?；D(zhuǎn)移酶表現(xiàn)出對含有它們的微生物的生長的適當(dāng)?shù)幕钚浴?br> 優(yōu)選地，新的絲氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶的蛋白質(zhì)序列含有在表1a或1b中指出的至少一種cysE突變體的氨基酸取代。
表1a在編碼區(qū)具有單個(gè)或多個(gè)氨基酸改變的反饋抗性cysE等位基因cysE突變體核苷酸取代(No.) 氨基酸取代(No.) Ki(μM) 比活性μmol/min×mgcysEIIGGC-＞AGC(934) Gly238-＞Ser238 10 0.068cysEIII GGT-＞GAT(716) Gly165-＞Asp165 10 0.030cysEIVGCT-＞GTT(932) Ala237-＞Val237 40 0.170GGC-＞AGC(934) Gly238-＞Ser238cysEV GCT-＞GTT(932) Ala237-＞Val237GGC-＞AGC(934) Gly238-＞Ser238 10 0.246ATG-＞ATA(990) Met256-＞Ile256cysEVIGGC-＞AGC(934) Gly238-＞Ser238 10 0.075ATG-＞ATA(990) Met256-＞Ile256cysEVII GCT-＞GTT(932) Ala237-＞Val237 10 0.253cysEVIII ATG-＞ATA(990) Met256-＞Ile256 30 0.160GCT-＞GTT(932) Ala237-＞Val237cysEX ACG-＞GCG(721) Thr167-＞Ala167 50 0.156cysEXIACG-＞GCG(721) Thr167-＞Ala167 700 0.117GGT-＞AGT(955) Gly245-＞Ser245cysE突變體 核苷酸取代(No.) 氨基酸取代(No.) Ki(μM)比活性μmol/min×mgcysEXII AAA-＞CAA(511)Lys97-＞Gln97 40 0.254GGC-＞AGC(934)Gly238-＞Ser238TTT-＞TTG(1023) Phe267-＞Leu267cysEXIII GTT-＞GCT(713)Val164-＞Ala164 30 0.213TTT-＞TTG(1023) Phe267-＞Leu267cysEXIV ACG-＞GCG(721)Thr167-＞Ala167 ＞1000 0.453ATG-＞TAG(988+989)Met256-＞Stop256cysEXVI GAT-＞GGT(971)Asp250-＞Gly250 50 0.554AAG-＞TAG(973)Lys251-＞Stop251cysEXVII GGT-＞GAT(716)Gly165-＞Asp165 1000.052ACG-＞GCG(721)Thr167-＞Ala167cysEXXIII ACG-＞GCG Thr167-＞Ala167 2300 0.085GCT-＞GTT Ala237-＞Val237GGC-＞AGC Gly238-＞Ser238
表1b具有羧基末端缺失的反饋抗性cysE等位基因cysE突變體 缺失的氨基酸 末端氨基酸 Ki(μM) 比活性μmol/min×mgcysE-Del259 14 His2597.5 0.328cysE-Del258 15 Gln2585 0.256cysE-Del257 16 Asp2577.5 0.394cysE-Del256 17 Met25612.50.366cysE-Del255 18 Asp25530 0.624cysE-Del250 23 Asp25020 0.405cysE-Del249 24 Ser24915 0.420cysE-Del248 25 Asp24812.50.270新的半胱氨酸不敏感性絲氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶可以通過，例如，表達(dá)編碼新的絲氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶的DNA序列獲得。
由這些DNA序列編碼的酶變體每一種對抑制劑L-半胱氨酸表現(xiàn)出不同的敏感性，然而，當(dāng)與野生型相比時(shí)，發(fā)現(xiàn)絲氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶在所有情況下對抑制劑L-半胱氨酸的抗性至少高五倍。
本發(fā)明還涉及編碼新的絲氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶的DNA序列。
這些DNA序列的特征在于下列事實(shí)它們在編碼DNA序列區(qū)(從各自的cysE基因的510bp至1040bp)表現(xiàn)出至少一種突變，1bp是在圖6(SHQ ID NO2)中的第一堿基，并且990位上的鳥嘌呤突變成腺嘌呤除外。
以下新的DNA序列也稱為反饋抗性的cysE等位基因。
這些DNA序列可以，例如，從下述起始物質(zhì)通過非特異性或定向誘變方法制備。
在所說的DNA區(qū)之內(nèi)的非特異突變可以，例如，通過化學(xué)試劑(例如亞硝基胍，乙基甲烷磺酸等)和/或通過物理方法(Miller，J.H.，1972，分子遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)，冷泉港實(shí)驗(yàn)室，USA113-185)和/或在特定條件下進(jìn)行的PCR反應(yīng)(Gibbs，R.A.1990，化學(xué)年評，621202-1214)產(chǎn)生。
用于在DNA片段之內(nèi)的特定位置引入突變的方法是已知的并在，例如，下列出版物中描述過Sarkar，G.，Sommer，S.S.，1990，生物技術(shù)8404-407描述了利用PCR的定點(diǎn)誘變；Ausubel，F(xiàn).M.等，1987，8.01-8.3.6分子生物學(xué)中的通用方案，Greene出版協(xié)會(huì)，描述了利用M13噬菌體的定點(diǎn)誘變方法。
另一個(gè)產(chǎn)生反饋抗性的cysE等位基因的方法包含結(jié)合導(dǎo)致反饋抗性的不同的點(diǎn)突變，由此產(chǎn)生具有新的性質(zhì)的多個(gè)突變體。
野生型cysE基因或通過突變滅活的cysE基因或突變的cysE基因以及已經(jīng)編碼反饋抗性的絲氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶的DNA優(yōu)選地用作誘變的起始材料。
將要突變的cysE基因可以是染色體或非染色體編碼的。
包括例如野生型cysE基因的起始DNA片段使用已知的制備重組DNA的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)在載體上重組。通過利用以前論及的誘變方法，改變在DNA序列中的一個(gè)或多個(gè)核苷酸以便現(xiàn)在由基因編碼的氨基酸序列顯示出在從97位氨基酸到273位氨基酸并包括273位氨基酸的序列區(qū)的至少一種突變，或在從227位氨基酸開始的羧基末端序列區(qū)的至少一種缺失，其中1位是圖5(SEQ ID NO1)中的起始甲硫氨酸，并且256位上的Met突變?yōu)镮le除外。
利用所描述的技術(shù)，可以將使編碼的絲氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶具有導(dǎo)致半胱氨酸不敏感的氨基酸序列的一個(gè)或多個(gè)突變引入任何cysE基因的所說的DNA區(qū)。
在例如，如描述的進(jìn)行誘變之后，選擇具有所需表型的突變體，例如，通過平板接種于無半胱氨酸的培養(yǎng)基并在其后確定突變的絲氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶對半胱氨酸敏感的程度。
本發(fā)明也涉及含有反饋抗性的cysE等位基因的微生物。
這樣的微生物菌株的特征是它們具有由至少一種反饋抗性的cysE等位基因去調(diào)節(jié)的半胱氨酸代謝。
因?yàn)?，原則上在所有微生物中半胱氨酸代謝均通過相同的代謝途徑進(jìn)行，該代謝途徑是以前已知的，用于制備新菌株的技術(shù)是已知的(例如可從標(biāo)準(zhǔn)的教科書中找到)并適用于所有微生物，新菌株可從任何微生物制備。
細(xì)菌優(yōu)選地適于制備新菌株。
革蘭氏陰性細(xì)菌，具體地說是大腸桿菌尤其適合。
本發(fā)明也涉及通過培養(yǎng)新的微生物制備L-半胱氨酸以及得自L-半胱氨酸的產(chǎn)物。
反饋抗性的cys-E等位基因使在重要的生物合成控制點(diǎn)消除控制由此擴(kuò)大位于該控制點(diǎn)下游的化合物大量產(chǎn)生成為可能。這些具體地說包括O-乙酰絲氨酸、L-半胱氨酸和L-半胱氨酸相關(guān)產(chǎn)物。L-半胱氨酸相關(guān)產(chǎn)物是所有源自L-半胱氨酸的產(chǎn)物，即其制備需要L-半胱氨酸的含硫化合物。這樣的產(chǎn)物的例子是2(R，S))-甲基-噻唑烷-2(R，S)，4(R)-乙二酸、高半胱氨酸、甲硫氨酸、生物素和谷胱甘肽。
為了表達(dá)改變的絲氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶，將反饋抗性的cys-E等位基因利用通常的方法轉(zhuǎn)化進(jìn)宿主菌株。例如，具有改變的絲氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶性質(zhì)的菌株的篩選可利用如下描述的方法實(shí)施。
為了確定改變的酶的半胱氨酸不敏感的程度，通過菌株分泌半胱氨酸首先在半定量的所謂的交叉飼養(yǎng)試驗(yàn)中測量。為了這一目的，將要試驗(yàn)的菌株接種于無半胱氨酸的基本培養(yǎng)基中，并向其中添加半胱氨酸營養(yǎng)缺陷指示菌株。在特定的接種線(暈輪)周圍的指示菌株作為半胱氨酸分泌的半定量測量手段。所有在交叉飼養(yǎng)試驗(yàn)中具有半徑大于2mm的暈輪的菌株指定為“交叉飼養(yǎng)試驗(yàn)中的陽性”。為了測定改變的絲氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶的半胱氨酸耐性程度，在選擇的菌株上進(jìn)行了酶活性試驗(yàn)。
任何在半胱氨酸存在時(shí)能夠測定絲氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶活性的方法都可以用于測定這種酶的半胱氨酸敏感性。例如，利用由Kredich和Tomkins，生物化學(xué)雜志，2414955-4965(1966)描述的方法可以測定絲氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶的活性。在這種試驗(yàn)中，酶試驗(yàn)混合物包含底物L(fēng)-絲氨酸和輔因子乙酰輔酶A。通過添加酶開始反應(yīng)，并在分光光度計(jì)上通過觀察在232nm吸收的減少監(jiān)測反應(yīng)，232nm吸收的減少由乙酰輔酶A中的硫酯鍵的裂解引起。
上述的酶試驗(yàn)適合于確定任何絲氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶活性的半胱氨酸敏感性(包括具有修飾的羧基末端的酶)。絲氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶活性的抑制在反應(yīng)混合物中于不同濃度的L-半胱氨酸存在下試驗(yàn)。不同的絲氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶的催化活性在L-半胱氨酸存在和缺乏下測定并從中確定抑制劑常數(shù)Ki(Kredich和Tomkins，生物化學(xué)雜志，241，4955-4965(1966))。
在大多數(shù)情況下，酶促活性的絲氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶是優(yōu)選的，該轉(zhuǎn)移酶具有降低的半胱氨酸敏感性。對于其它目的，在終產(chǎn)物敏感性和催化活性上的伴隨的減弱可以是合乎需要的。
通常，終產(chǎn)物抗性的絲氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶大大地過量產(chǎn)生不是合乎需要的，因?yàn)镺-乙酰絲氨酸或L-半胱氨酸或源自它們的代謝物(它們在這些環(huán)境之下形成至太大的程度)在細(xì)胞中積累并對細(xì)胞產(chǎn)生毒性，并能引出對具有降低的絲氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶活性的突變體的選擇。因?yàn)檫@一原因，反饋抗性的cysE等位基因優(yōu)選地利用通常的方法作為單拷貝整合進(jìn)基因組。
利用合適的載體在染色體中整合單基因的方法是現(xiàn)有技術(shù)中存在的(例如，Winans等，1985；細(xì)菌學(xué)雜志，1611219-1221；Shevell等，1988；細(xì)菌學(xué)雜志，1703294-3296；Kulakauskas等，1991，細(xì)菌學(xué)雜志，1732633-2638)。
同樣優(yōu)選地是以低拷貝數(shù)質(zhì)粒表達(dá)反饋抗性的絲氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶。
同樣熟知的是，表達(dá)載體除反饋抗性的cys-E等位基因之外優(yōu)選地具有其它的元件，該元件描述如下。
存在于載體中的編碼序列優(yōu)選地連接到調(diào)節(jié)元件上，該調(diào)節(jié)元件對于將編碼序列表達(dá)至合乎需要的程度是必需的。
這些調(diào)節(jié)元件的例子是啟動(dòng)子、核糖體結(jié)合位點(diǎn)和終止序列。在大多數(shù)情況下，天然調(diào)節(jié)的cysE序列用于表達(dá)新的突變體。然而，也可以使用任何其它調(diào)節(jié)序列。
除了調(diào)節(jié)元件外編碼選擇性標(biāo)記和/或報(bào)道基因的序列也優(yōu)選地存在于表達(dá)載體上。這樣的選擇標(biāo)記的表達(dá)有利于鑒定轉(zhuǎn)化體。合適的選擇標(biāo)記是編碼對，例如，氨芐青霉素、四環(huán)素、卡那霉素、氯霉素或其它抗生素抗性的基因。
如果新的突變體非染色體復(fù)制，質(zhì)粒載體優(yōu)選地含有復(fù)制起點(diǎn)。用以利用載體(其復(fù)制起點(diǎn)被除去)把基因整合進(jìn)染色體的策略是現(xiàn)有技術(shù)中存在的(Winans等，1985；細(xì)菌學(xué)雜志，1611219-1221；Shevell等，1988；細(xì)菌學(xué)雜志，1703294 3296；Kulakauskas等，1991，細(xì)菌學(xué)雜志，1732633-2638)。
能夠在大腸桿菌中自主復(fù)制的載體的例子在Pouwels，P.H.，Enger-Valk，B.E.，Brammer，W.J.1985，克隆載體，Elsevier，Amsterdam中給出。
這樣的載體的例子是-高拷貝數(shù)質(zhì)粒，如pBR322和pUC18-中到低拷貝數(shù)的質(zhì)粒，如pACYC184，pACYC177和pSC101-噬菌體載體，如M13載體。
合適的、優(yōu)選的載體是那些具有中至低拷貝數(shù)的載體；特別優(yōu)選的合適的載體是那些具有p15A復(fù)制子的載體如pACYC184(ATCC37033)或pACYC177(ATCC37031)。
在文獻(xiàn)中也描述了用于其它細(xì)菌的大量載體(Pouwels，P.H.，Enger-Valk，B.E.，Brammer，W.J.1985，克隆載體，Elsevier，Amsterdam)。當(dāng)利用這些載體時(shí)，可以在其它細(xì)菌中表達(dá)新的突變體。
可以利用用以制備重組DNA的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)產(chǎn)生合適的重組載體。這些技術(shù)在標(biāo)準(zhǔn)的教科書中詳盡地描述。
適合的宿主菌株用含有編碼半胱氨酸不敏感性絲氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶的轉(zhuǎn)錄單位的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化。
含有半胱氨酸敏感的蛋白質(zhì)的菌株(例如原核生物或酵母)用作宿主菌株。
優(yōu)選地，利用大腸桿菌野生型菌株或其中內(nèi)源性cysE基因被滅活并補(bǔ)充新的cysE基因的菌株。這樣的細(xì)胞系統(tǒng)適合于過量產(chǎn)生L-半胱氨酸和源自它的代謝物。
當(dāng)培養(yǎng)包含至少一種反饋抗性cysE等位基因的菌株時(shí)，發(fā)現(xiàn)在1mML-絲氨酸和0.1mM乙酰輔酶A存在時(shí)，攜帶具有0.015至2.3mM的Ki值的反饋抗性cysE等位基因的菌株明顯分泌更大量的半胱氨酸。
新的絲氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶也可以利用反義RNA產(chǎn)生。它是現(xiàn)有以特異性方式通過所謂的反向遺傳學(xué)利用反義RNA封閉或修飾基因活性技術(shù)的部分(Inouye，1988，基因7225-34)。反義RNA是互補(bǔ)于編碼蛋白質(zhì)的DNA鏈的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。可能的是通過以表達(dá)載體的方式在體內(nèi)產(chǎn)生反義RNA(互補(bǔ)于天然或轉(zhuǎn)化的cysE基因編碼鏈定義的區(qū))以降低絲氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶的半胱氨酸敏感性。在這種情況下，反義RNA特異性地退火形成在cysE-mRNA中的靶序列，由此引出新的絲氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶的合成，該酶在羧基末端是截短的；同時(shí)，與實(shí)施例3的缺失突變體相似，表現(xiàn)出對抑制劑L-半胱氨酸降低的敏感性。
另一個(gè)目的是通過新的微生物提供適合于確保半胱氨酸最優(yōu)過量產(chǎn)生的硫來源。
令人驚奇地發(fā)現(xiàn)，O-乙酰絲氨酸的胞內(nèi)過量產(chǎn)生(該過量產(chǎn)生通過利用適合的營養(yǎng)培養(yǎng)基及新的絲氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶突變體引起)導(dǎo)致半胱氨酸胞外濃度的顯著升高。因此，新的絲氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶突變體適合于過量產(chǎn)生半胱氨酸。
為了能夠做到這一點(diǎn)，必須提供一種新的微生物以及在生產(chǎn)培養(yǎng)基中充足量的硫供體。
所有有機(jī)硫化合物適用作達(dá)到半胱氨酸過量產(chǎn)生的硫供體。適合的和優(yōu)選的是硫酸鹽、亞硫酸鹽、硫化物、連二亞硫酸鹽、硫代硫酸鹽。硫代硫酸鹽是適合的并特別優(yōu)選地用于達(dá)到最佳半胱氨酸產(chǎn)生。
半胱氨酸產(chǎn)量的進(jìn)一步提高通過另外過量表達(dá)硫酸鹽誘導(dǎo)的酶(由基因cysD、C、H、G、I和J編碼)和硫化氫解酶(由基因cysK與cysM編碼)達(dá)到。
通過以下方法，半胱氨酸產(chǎn)量的進(jìn)一步提高是可能的a)通過在基因水平去調(diào)節(jié)蛋白cysB以達(dá)到組成型表達(dá)。cysB蛋白質(zhì)在大腸桿菌中的半胱氨酸生物合成的調(diào)節(jié)中起越過控制蛋白質(zhì)的作用(Kredich，N.M.，1987，半胱氨酸的生物合成。NeidhardtF.C.，Ingraham，J.L，Magasanik，B.，Low.K.B.，Schaechter，M.，Umbarger，H.E.(eds)大腸桿菌和Salmonella typhimurium細(xì)胞和分子生物學(xué)，第1卷，美國微生物學(xué)學(xué)會(huì)，華盛頓，419-428)。
b)通過使ser-A基因(選自serA野生型和編碼具有對絲氨酸降低的敏感性的磷酸甘油酸脫氫酶的serA基因)與新的cys-E基因結(jié)合。
c)通過外部供給絲氨酸。
優(yōu)選地，使天然的半胱氨酸敏感性的絲氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶的基因在宿主菌株中失活，由此保證它僅僅是半胱氨酸不敏感性絲氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶，將該酶通過轉(zhuǎn)化引入合成它的特定菌株。用于失活大腸桿菌中天然基因的方案很多(Hamilton等，1989，細(xì)菌學(xué)雜志，1714617-4622；Russel等，1989，細(xì)菌學(xué)雜志，1712609-2613；Shen和Huang，1986，遺傳學(xué)112441 457；Jasin和Schimmel，1984，細(xì)菌學(xué)雜志，159783-786)。
把編碼改變的絲氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶的單拷貝基因整合進(jìn)宿主基因組也是優(yōu)選的。
這些技術(shù)的描述以及參考文獻(xiàn)在下列出版物中可以找到Shevell等，1988，細(xì)菌學(xué)雜志，1703294 3296；Kulakauskas等，1991，細(xì)菌學(xué)雜志，1732633-2638。
優(yōu)選地，不同Ki的cysE等位基因克隆在低拷貝數(shù)的載體上并轉(zhuǎn)化進(jìn)適當(dāng)?shù)纳a(chǎn)菌株中。
圖1顯示了從高絲氨酸開始的L-甲硫氨酸的生物合成。
圖2顯示了從谷氨酸開始的谷胱甘肽的生物合成。
圖3顯示了從去硫代生物素開始的生物素的生物合成。
圖4顯示了在大腸桿菌中從葡萄糖開始的L-半胱氨酸的生物合成。
圖5顯示了大腸桿菌絲氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶的氨基酸序列。
圖6顯示了大腸桿菌cysE基因的DNA序列和從這一序列推定的絲氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶的氨基酸序列。
圖7顯示了得自實(shí)施例1的質(zhì)粒pP1的限制性酶切圖，該質(zhì)粒含有反饋抗性的cysE等位基因，該基因作為2.25kb的PvuII片段克隆進(jìn)pUC19。
圖8顯示了得自實(shí)施例2的質(zhì)粒pPC43，該質(zhì)粒在pBluescript中含有作為1.15kb大小的EcoRI/BamHI片段的cysE野生型基因。
圖9顯示了得自實(shí)施例3(該質(zhì)粒含有具有羧基末端缺失的反饋抗性的cysE等位基因)與實(shí)施例4(該質(zhì)粒含有包含各種堿基取代的反饋抗性的cysE等位基因)的pACYC184-LH的質(zhì)粒圖。
下列實(shí)施例用于進(jìn)一步說明本發(fā)明實(shí)施例1包含半胱氨酸不敏感性絲氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶的大腸桿菌突變體的分離可能的是通過回復(fù)營養(yǎng)缺陷的大腸桿菌菌株產(chǎn)生調(diào)節(jié)突變體。具有所需性質(zhì)的突變體(絲氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶對半胱氨酸的不敏感性)在半胱氨酸營養(yǎng)缺陷的cysE大腸桿菌菌株的回復(fù)體中尋找。
為了分離回復(fù)體，使用半胱氨酸營養(yǎng)缺陷的大腸桿菌菌株JM15(CGSC#5042cysE50，tfr-8)以及JM39(CGSC#5043cysE51，tfr-8)，該菌株保藏于在Braunschweig的Deutsche Sarmnlung frMikroorganismen(德意志微生物保藏中心)，保藏號為DSM 10173。為了產(chǎn)生半胱氨酸原養(yǎng)的回復(fù)體，如Miller，J.H.(1972)，分子遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)，冷泉港出版社125-129，冷泉港實(shí)驗(yàn)室描述用誘變劑亞硝基胍處理這些菌株。半胱氨酸原養(yǎng)的回復(fù)體在無半胱氨酸的基本培養(yǎng)基上尋找。獲得的大約1000個(gè)回復(fù)體最初在交叉飼養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中試驗(yàn)半胱氨酸分泌。為了這一目的，將要試驗(yàn)的回復(fù)體平板接種于無半胱氨酸的補(bǔ)加1％葡萄糖的基本培養(yǎng)基上(12g/L K2HPO4，3g/L KH2PO4，5g/L(NH4)2SO4，0.3g/L MgSO4×7H2O，0.015g/L CaCl2×2H2O，0.002g/LFeSO4×7H2O，1g/L檸檬酸鈉×2H2O，0.1g/L NaCl，15g/L Bacto-agar和1ml/L痕量元素溶液(由0.15g/L Na2MoO4×2H2O，2.5g/L H3BO3，0.7g/LCoCl2×6H2O，0.25g/L CuSO4×5H2O，1.6g/L MnCl2×4H2O和0.3g/LZnSO4×7H2O組成)并用半胱氨酸-營養(yǎng)缺陷的指示菌株JM39以每ml5×106個(gè)細(xì)胞接種，在37℃下培養(yǎng)48小時(shí)。試驗(yàn)菌落(暈輪)周圍的暈輪的半徑采取通過試驗(yàn)菌株的半胱氨酸分泌的半定量測量。所有表現(xiàn)出生長區(qū)大于2mm的回復(fù)體分類為陽性，并在用于純化目的幾次劃出后將其分離和保存。
為了研究回復(fù)體的半胱氨酸分泌的生化基礎(chǔ)，在體外測定絲氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶的活性同時(shí)測定半胱氨酸抑制酶的能力。對于該測定，使用選擇的回復(fù)體的S30提取物(細(xì)胞勻漿在30,000g和4℃下離心20分鐘)、開始菌株以及比較菌株大腸桿菌W3110(ATTC 27325)。發(fā)現(xiàn)了許多回復(fù)體，其絲氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶活性在抑制劑L-半胱氨酸的不同濃度下仍然表現(xiàn)出明顯的剩余活性(5至50μM的Ki值)。
為了在液體培養(yǎng)基中通過定量測定半胱氨酸確定分泌半胱氨酸的能力，將50個(gè)選擇的cysE回復(fù)體于30℃下在20ml標(biāo)準(zhǔn)的生產(chǎn)培養(yǎng)基中以170rpm培養(yǎng)48小時(shí)。標(biāo)準(zhǔn)的生產(chǎn)培養(yǎng)基由下列物質(zhì)組成15g/L葡萄糖、0.08g/L細(xì)菌胰胨、0.04g/L酵母提取物、5mg/L維生素B1、3g/L KH2PO4，12g/L K2HPO4，0.3g/L MgSO4×7H2O，0.1g/LNaCl，5g/L (NH4)2SO4，14.7g/L CaCl2×2H2O，1g/L檸檬酸鈉×2H2O，5g/L Na2S2O3×5H2O和1ml/L痕量元素溶液(見上)。每種情況下在24和48小時(shí)后取下樣品(10μl)并稀釋，在適當(dāng)?shù)臅r(shí)候利用Gaitonde，M.K.(1967)，生物化學(xué)雜志，104627-633的方法比色確定無細(xì)胞上清液中半胱氨酸濃度。通過這些突變體分泌的半胱氨酸的程度在培養(yǎng)上清液中在5-60mg/L半胱氨酸之間。另一方面，作為比較，在大腸桿菌野生型菌株中未檢到任何半胱氨酸分泌。從該篩選中選出8個(gè)回復(fù)體，其半胱氨酸分泌在40和60mg/L之間。
為了精確分析這8個(gè)突變體的絲氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶的終產(chǎn)物抗性的遺傳基礎(chǔ)，克隆了它們的cysE結(jié)構(gòu)基因并測定了這些基因的DNA序列。
因?yàn)閏ysE野生型基因的DNA序列以及在大腸桿菌中cysE基因側(cè)翼區(qū)的染色體限制性酶切圖已經(jīng)公開(Denk和Bock，1987，微生物遺傳學(xué)雜志，133515-525)，已知cysE結(jié)構(gòu)基因位于2.25kb大小的PvuII DNA片段上。
為了克隆編碼半胱氨酸不敏感性絲氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶的cysE基因，用PvuII完全水解選擇的回復(fù)體的染色體DNA，將DNA水解產(chǎn)物在制備瓊脂糖凝膠上分級分離，分離了大小范圍為在2-3kb的DNA。將分離的PvuII水解產(chǎn)物利用T4 DNA連接酶連接到SmaI-線性化的并用堿性磷酸酶去磷酸化的質(zhì)粒載體pUC19中(由BoehringerMannheim獲得)。
用各自的連接混合物轉(zhuǎn)化半胱氨酸營養(yǎng)缺陷性的cysE菌株JM15(CGSC#5042)，在無半胱氨酸、含氨芐西林(50mg/L)的基本培養(yǎng)基上進(jìn)行選擇。在它們的限制圖譜中，所選擇的補(bǔ)充宿主菌株的半胱氨酸營養(yǎng)缺陷的質(zhì)粒(參見圖7)表現(xiàn)出cysE基因所需的裂解圖譜(Denk和Bock，1987，微生物遺傳學(xué)雜志，133515-525)。所選擇的轉(zhuǎn)化體在交叉飼養(yǎng)試驗(yàn)中也產(chǎn)生指示菌株JM35(暈輪＞4mm)的有活力的生長。在這些cysE突變體的細(xì)胞提取物中的絲氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶的活性的確定(該提取物在30,000g和4℃下離心20分鐘獲得)表明對L-半胱氨酸的降低的敏感性。為了確切地確定在個(gè)體cysE*等位基因的結(jié)構(gòu)基因的變化(該變化導(dǎo)致末端產(chǎn)物抗性)，利用cysE基因特異性寡核苷酸測定這些等位基因的DNA序列，將發(fā)現(xiàn)的核苷酸序列與cysE野生型基因的核苷酸序列相比較。核苷酸序列的比較給出如與野生型DNA序列與氨基酸序列相比較的差別，該差別在下列表2中總結(jié)(參見圖5和6)。
表2化學(xué)誘變劑導(dǎo)致的反饋抗性cysE等位基因cysE突變體 核苷酸取代(No.)氨基酸取代(No.)Ki(μM)cysEII GGC-＞AGC(934) Gly238-＞Ser238 10cysEIIIGGT-＞GAT(716) Gly165-＞Asp165 10cysEVIIGCT-＞GTT(932) Ala237-＞Val237 10cysEX ACG-＞GCG(721) Thr167-＞Ala167 50cysEXI GGT-＞AGT(955) Gly245-＞Ser245 700ACG-＞GCG(721) Thr167-＞Ala167cysEXIIAAA-＞CAA(511) Lys97-＞Gln97 40GGC-＞AGC(934) Gly238-＞Ser238TTT-＞TTG(1023)Phe267-＞Leu267cysEXIII GTT-＞GCT(713) Val164-＞Ala164 30TTT-TTG(1023) Phe267-＞Leu267cysEXVIGAT-＞GGT(971) Asp250-＞Gly250 50AAG-＞TAG(973) Lys251-＞Stop251實(shí)施例2通過在cysE結(jié)構(gòu)基因中特異性的堿基取代產(chǎn)生終產(chǎn)物不敏感性絲氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶在實(shí)施例1中描述了總共8個(gè)不同的cysE等位基因，它們由于堿基取代和伴隨的氨基酸改變表現(xiàn)出絲氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶對L-半胱氨酸抑制劑的實(shí)質(zhì)上脫敏作用。這些改變的酶不僅在導(dǎo)致抗性的氨基酸取代的位置不同，而且，在某些情況下，對L-半胱氨酸抑制劑的敏感性的程度不同。具有新的性質(zhì)以及其中在實(shí)施例1中所描述的氨基酸取代相互結(jié)合的終產(chǎn)物抗性的絲氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶由定點(diǎn)誘變構(gòu)建。這一目的所需要的誘變使用由Kunkel等，(1987)，酶學(xué)方法，154367-382描述的方法的現(xiàn)有技術(shù)進(jìn)行。
cysE質(zhì)粒pPC43(保藏在德意志微生物保藏中心，Braunschweig，保藏號為DSM 10171)(在圖8中對其進(jìn)行了描述，它含有在噬粒載體pBluescriptII SK+(得自Stratagene，Heidelberg)的EcoRI-BamHI位點(diǎn)的1.15kb-大小的cysE野生型基因)用作誘變酶的起始質(zhì)粒。cysE WT基因從大腸桿菌野生型菌株W3110(ATTC 27325)的基因組DNA通過聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)方法(Saiki等，1988，科學(xué)，239487-491)利用寡核苷酸cysE-fwl(SEQ ID NO3)(有義引物)和cysE-revl(SEQ ID NO4)(反義引物)擴(kuò)增。引物的核苷酸序列組成如下cysE-fwl(SEQ ID NO3)5’-GCCTGGATCCTGCAGTCGACCTGGCGCATCGCTTCGGCGTTG-3’黑體部分代表圖6中的cysE DNA序列的堿基9-30；摻入的BamHI位點(diǎn)有下劃線。
cysE-revl(SEQ ID NO4)5’-GTAGGAGCTCTGCAGAATTCGGGTATCCGGGAGCGGTATTG-3’黑體部分代表圖6中的cysE DNA序列的堿基1106-1126；摻入的EcoRI位點(diǎn)有下劃線。
PCR實(shí)驗(yàn)在熱循環(huán)器中進(jìn)行30個(gè)循環(huán)(基因ATAQ控制器，得自Pharmacia)，實(shí)驗(yàn)在200μM脫氧核苷三磷酸(dATP、dCTP、dGTP、dTTP)存在下，每種情況下1μM相應(yīng)的寡核苷酸、100ngW3110 DNA、反應(yīng)緩沖液(10mM Tris-HCl pH8.3、50mM KCl、1.5mM MgCl2、0.01％明膠)以及5單位熱穩(wěn)定的DNA聚合酶(得自Biolabs)和下列條件下進(jìn)行96℃，1.5min；62℃，1min；72℃，3min。擴(kuò)增產(chǎn)物利用BamHI和EcoRI限制性消化，用瓊脂糖凝膠純化并作為1.15kb大小的DNA片段克隆進(jìn)以BamHI和EcoRI線性化的噬粒載體BluescriptII SK+中，由此形成了cysE質(zhì)粒pPC43(圖8)。
所需要的多個(gè)突變體利用下列方法制備1)cysE IV等位基因的制備雙突變體Val237+Ser238以cysE野生型質(zhì)粒pPC43起始并使用定點(diǎn)誘變，最初利用突變寡核苷酸cysE-Mut-1(SEQ ID NO5)(表3)在238位取代甘氨酸引入絲氨酸，利用突變寡核苷酸cysE-Mut-3(SEQ ID NO6)(表3)在237位取代丙氨酸將纈氨酸引入形成的cysE突變體pPC34中，由此形成cysEIV等位基因。
2)cysE VIII等位基因的制備雙突變體Val237+Ile256以cysE野生型質(zhì)粒pPC43起始并使用定點(diǎn)誘變，利用突變寡核苷酸cysE-Mut-6(SEQ ID NO7)(表3)在256位引入異亮氨酸取代甲硫氨酸，形成cysE I等位基因。利用突變寡核苷酸cysE-Mut-3(SEQ IDNO6)(表3)在237位取代丙氨酸將纈氨酸引入cysEI等位基因。這提供了cysE VIII等位基因。
3)CysE VI等位基因的制備雙突變體Ser238+Ile256利用突變寡核苷酸cysE-Mut-1(SEQ ID NO5)(表3)在238位取代甘氨酸將絲氨酸引入cysE I等位基因(突變體Ile256)，由此形成cysE VI等位基因。
4)cysE V等位基因的制備三突變體Val237+Ser238+Ile256將在cysE IV等位基因(雙突變體Val237+Ser238)的256位的甲硫氨酸利用突變寡核苷酸cysE-Mut-6(SEQ ID NO7)(表3)由異亮氨酸取代。這提供了cysE V等位基因。
5)cysE XIV等位基因的制備雙突變體Ala167+終止251以cysE-Del255等位基因起始(參見實(shí)施例3)利用突變寡核苷酸cysE-Mut-10(SEQ ID NO8)(表3)在167位取代蘇氨酸引入丙氨酸，由此形成了cysE XIV等位基因。
6)cysE XVII等位基因的制備雙突變體ASP165+Ala167從cysE III等位基因(突變體Asp165，參見實(shí)施例1)起始，利用寡核苷酸cysE-Mut-10(SEQ ID NO8)(表3)在167位用丙氨酸取代氨基酸蘇氨酸。這提供了cysE XVII等位基因。
7)cysE XXIII等位基因的制備三突變體Ala167+Val237+Ser238使用突變寡核苷酸cysE-Mut-10(SEQ ID NO8)(表3)將丙氨酸取代cysE IV等位基因(雙突變體Val237+Ser238)167位的蘇氨酸，由此形成cysE XXIII等位基因。
特定突變體的整個(gè)結(jié)構(gòu)基因的DNA序列分析用于檢查正確地引入了突變。cysE*多突變體的概況在表4中提出。
生化參數(shù)(如酶活性與抑制劑常數(shù)Ki)以與實(shí)施例1中所描述的方法類似的方法確定。
表3用于定點(diǎn)誘變以產(chǎn)生新反饋抗性的cysE等位基因的寡核苷酸SEQ ID NO突變寡核苷酸 核苷酸序列 在圖6中的位置 氨基酸取代5 cysE-Mut-1 5′-GCCGCTAGCGTTCCGGCT-3′ 928-945Gly238-＞Ser2386 cysE-Mut-3 5′-CCGCCGCATACCACCGCCGTT-3′ 913-933Ala237-＞Val2377 cysE-Mut-6 5′-CCATCAATGGATATAGACCAGCAT-3 976-999Met256-＞Ile2568 cysE-Mut-105′-GTCGTTGGTGAAGCGGCGGTGATT-3′709-732Thr167-＞Ala167
表4由定點(diǎn)誘變產(chǎn)生的反饋抗性的cysE等位基因cysE突變體核苷酸取代(No.) 氨基酸取代(No.)Ki(μM)cysEIVGCT-＞CTT(932)Ala237-＞Val23740GGC-＞AGC(934)Gly238-＞Ser238cysEV GCT-＞GTT(932)Ala237-＞Val23710GGC-＞AGC(934)Gly238-＞Ser238ATG-＞ATA(990)Met256-＞Ile256cysEVIGGC-＞AGC(934)Gly238-＞Ser23810ATG-＞ATA(990)Met256-＞Ile256cysEVIII GCT-＞GTT(932)Ala237-＞Val23730ATG-＞ATA(990)Met256-＞Ile256cysEXIV ACG-＞GCG(721)Thr167-＞Ala167＞1000ATG-＞TAG(988+989)Met256-＞stop256cysEXVII GGT-＞GAT(716)Gly165-＞Asp165100ACG-＞GCG(721)Thr167-＞Ala167cysEXXIII ACG-＞GCG(721)Thr167-＞Ala1672300GCT-＞GTT(932)Ala237-＞Val237GGC-＞AGC(934)Gly238-＞Ser238實(shí)施例3通過利用PCR以受控方式截短酶的羧基末端產(chǎn)生終產(chǎn)物不敏感性絲氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶在蛋白質(zhì)之內(nèi)的一個(gè)或多個(gè)氨基酸的特定變化是現(xiàn)有技術(shù)中存在的，可以利用適合的突變引物通過PCR技術(shù)在DNA水平容易地進(jìn)行(Saiki等，1988，科學(xué)，239487-491。將形成的PCR產(chǎn)物克隆進(jìn)適合的質(zhì)粒/宿主系統(tǒng)中以使改變的蛋白質(zhì)可以表達(dá)。
具有不同長度的羧基末端缺失的cysE突變體(該突變體編入表6中)利用在表5中描述的寡核苷酸引物從大腸桿菌野生型菌株W3110(ATTC 27325)的基因組DNA制備。
PCR實(shí)驗(yàn)在熱循環(huán)器中進(jìn)行30個(gè)循環(huán)(基因ATAQ控制器，得自Pharmacia)，實(shí)驗(yàn)在200μM脫氧核苷三磷酸(dATP、dCTP、dGTP、dTTP)存在下，每種情況下1μm有義引物cysE-LHfwl(SEQID NO9)與相應(yīng)的反義引物(SEQ ID NO10-23)(表5)、100ng W3110DNA、反應(yīng)緩沖液(10mM Tris-HCl pH8.3、50mM KCl、1.5mMMgCl2、0.01％明膠)以及5單位熱穩(wěn)定的DNA聚合酶(得自Biolabs)和下列條件下進(jìn)行96℃，1.5min；62℃，1min；72℃，3min。
cysE-LHfwl(SEQ ID NO9)5’-TGGACCAGAGCTCTGGCTGGCGCATCGCTTCGGCGTTG-3’黑體部分代表圖6中的cysE DNA序列的堿基9-30；摻入的BstXI/SacI位點(diǎn)有下劃線。
擴(kuò)增后形成的產(chǎn)物利用酶SacI和NsiI限制性消化并用瓊脂糖凝膠純化，將在每種情況下分離的cysE DNA片段連接進(jìn)以SacI和NsiI線性化的載體pACYC184-LH/DSM 10172)(參見圖9)。將每種連接混合物轉(zhuǎn)化進(jìn)半胱氨酸營養(yǎng)缺陷的cysE菌株JM15(CGSC#5042)，在無半胱氨酸的含四環(huán)素(20mg/l)的基本培養(yǎng)基進(jìn)行選擇。
從該克隆形成的質(zhì)粒按照其缺失的程度(參見關(guān)于質(zhì)粒圖的圖9)命名為pACYC184/cysE-Del。酶活性和抑制劑常數(shù)Ki以及交叉飼養(yǎng)試驗(yàn)的確定以與在實(shí)施例1中的描述的方法類似的方法進(jìn)行。DNA序列分析用于確認(rèn)正確地引入了缺失。
這些研究結(jié)果編入表6中。
表5用于制備具有羧基末端缺失的cysE等位基因的反義寡核苷酸SEQ ID.NO. 突變寡核苷酸核苷酸序列 在圖6中的位置10 cysE-Del270 5′-CTCGATGCATTACGTATTACCCATACTCAAATCTATGGTTAATACC-3′ 1006-103211 cysE-Del268 5′-CTCGATGCATTACGTATTACTCAAATGTATGGTTAATACCGTTGAA-3′ 1000-102612 cysE-Del263 5′-CTCGATGCATTACGTATTAAATACCGTTGAAATGCTGGTCCATATC-3′ 985-101113 cysE-Del259 5′-CTCGATGCATTACGTATTAATGCTGGTCCATATCCATTGATGGCTT-3′ 973-99914 cysE-Del258 5′-CTCGATGCATTACGTATTACTGGTCCATATCCATTGATGGCTTATC-3′ 970-99615 cysE-Del257 5′-CTCGATGCATTACGTATTAGTCCATATCCATTGATGGCTTATCGCTG-3′ 966-99316 cysE-Del256 5′-CTCGATGCATTACGTATTACATATCCATTGATGGCTTATCGCTGTC-3′ 964-99017 cysE-Del255 5′-CTCGATGCATTACGTATTAATCCATTGATGGCTTATCGCTGTCTGG-3′ 961-98718 cysE-Del250 5′-CTCGATGCATTACGTATTAATCGCTGTCTGGTTTACCGACAATACG-3′ 946-97219 cysE-Del249 5′-CTCGATGCATTACGTATTAGCTGTCTGGTTTACCGACAATACGAGC-3′ 943-96920 cysE-Del248 5′-CTCGATGCATTACGTATTAGTCTGGTTTACCGACAATACGAGCCGG-3′ 940-96621 cysE-Del245 5′-CTCGATGCATTACGTATTAACCGACAATACGAGCCGGAACGCCAGC-3′ 931-95722 cysE-Del239 5′-CTCGATGCATTACGTATTAAACGCCAGCGGCGGTGGTATCCGGCGG-3′ 913-93923 cysE-Del227 5′-CTCGATGCATTACGTATTACAGCACCACGGAACCTGCGCCAATCTT-3′ 877-903黑體部分相應(yīng)于圖6中的序列的各自的堿基；NsiI位點(diǎn)有下劃線。
表6通過羧基末端缺失產(chǎn)生的反饋抗性的cysE等位基因cysE突變體缺失的氨基酸數(shù)目末端氨基酸Ki(μM)cysE-Del271 2 Asp2710cysE-Del270 3 Gly2700cysE-Del268 5 Glu2680cysE-Del263 10 Ile2630cysE-Del259 14 His2597.5cysE-Del258 15 Gln2585cysE-Del257 16 Asp2577.5cysE-Del256 17 Met25612.5cysE-Del255 18 Asp25530cysE-Del250 23 Asp25020cysE-Del249 24 Ser24915cysE-Del248 25 Asp24812.5cysE-Del245 28 Gly2450cysE-Del239 34 Val2390cysE-Del227 46 Leu2270實(shí)施例4為了在搖瓶中過量產(chǎn)生L-半胱氨酸或L-半胱氨酸相關(guān)產(chǎn)物用改變的絲氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶轉(zhuǎn)化大腸桿菌宿主菌株以低拷貝數(shù)為特征的載體pACYC184-LH用于生產(chǎn)。為了這一目的，得自實(shí)施例1和2的質(zhì)粒中的cysE基因通過PCR擴(kuò)增。
PCR實(shí)驗(yàn)在熱循環(huán)器中進(jìn)行30個(gè)循環(huán)(基因ATAQ控制器，得自Pharmacia)，實(shí)驗(yàn)在200μM脫氧核苷三磷酸(dATP、dCTP、dGTP、dTTP)存在下，每種情況下1μM有義引物cysE-LHfwl(SEQID NO9)與相應(yīng)的反義引物cysE-LHrevl(SEQ ID NO24)、10ng各自的質(zhì)粒DNA、反應(yīng)緩沖液(10mM Tris-HCl pH8.3、50mM KCl、1.5mM MgCl2、0.01％明膠)以及5單位熱穩(wěn)定的Vent DNA聚合酶(得自Biolabs)和下列條件下進(jìn)行96℃，1.5min；62℃，1min；72℃，3min。
cysE-LHfwl(SEQ ID NO9)5’-TGGACCAGAGCTCTGGCTGGCGCATCGCTTCGGCGTTG-3’具有下劃線的堿基代表摻入的BstXI和SacI限制切割位點(diǎn)；余下的堿基(黑體)代表在圖6中的cysE序列的9-30位。
cysE-LHrevl(SEQ ID NO24)5’-CTCGATGCATTACGTAGGGGTATCCGGGAGCGGTATTG-3’具有下劃線的堿基代表摻入的NsiI限制切割位點(diǎn)；余下的堿基(黑體)代表在圖6中的cysE序列的1106-1127位。
擴(kuò)增后獲得的產(chǎn)物利用酶SacI和NsiI限制性消化并用瓊脂糖凝膠純化，將在每種情況下分離的cysE DNA片段連接進(jìn)以SacI和NsiI線性化的載體pACYC184-LH(DSM 10172)中。
將每種連接混合轉(zhuǎn)化進(jìn)半胱氨酸營養(yǎng)缺陷的cysE菌株JM15(CGSC#5042)中，在無半胱氨酸的含四環(huán)素(20mg/l)的基本培養(yǎng)基進(jìn)行選擇。從該克隆獲得的反饋抗性的cysE質(zhì)粒系列命名為pACYC184/cysE(參見圖9)，每一克隆代號為對應(yīng)的cysE等位基因代號。
酶促活性和抑制劑常數(shù)Ki以及交叉飼養(yǎng)試驗(yàn)確定以與在實(shí)施例1中描述的方法相同的方法進(jìn)行。
為了確定液體培養(yǎng)基的生產(chǎn)能力，用單個(gè)菌落接種20ml的標(biāo)準(zhǔn)生產(chǎn)培養(yǎng)基并在30℃和170rpm下培養(yǎng)48小時(shí)。生產(chǎn)培養(yǎng)基由下列物質(zhì)組成15g/L葡萄糖、0.08g/L細(xì)菌胰胨、0.04g/L酵母提取物、5mg/L維生素B1、3g/L KH2PO4，12g/L K2HPO4，0.3g/L MgSO4×7H2O，0.1g/L NaCl，5g/L (NH4)2SO4，14.7g/L CaCl2×2H2O，2mg/LFeSO4×2H2O、1g/L檸檬酸鈉×2H2O，5g/L Na2S2O3×5H2O和1ml/L痕量元素溶液和0.025mg/L四環(huán)素。痕量元素溶液由0.15g/LNa2MoO4×2H2O、2.5g/L H3BO3、0.7g/L CoCl2×6H2O、0.25g/LCuSO4×5H2O、1.6g/L MnCl2×4H2O和0.3g/L ZnSO4×7H2O組成。每種情況下在24和48小時(shí)后取下樣品(10μl)并適當(dāng)稀釋，利用Gaitonde，M.K.(1967)，生物化學(xué)雜志，104627-633的方法比色確定無細(xì)胞上清液中半胱氨酸濃度。在本文中，當(dāng)以不同的cysE突變體轉(zhuǎn)化時(shí)，測得生產(chǎn)菌株JM15的濃度為50至300mg半胱氨酸/L。實(shí)施例5利用重組λ噬菌體構(gòu)建染色體編碼的、反饋抗性的cysE等位基因以及在1L發(fā)酵罐中生產(chǎn)L-半胱氨酸與源自L-半胱氨酸的產(chǎn)物為了整合進(jìn)染色體附著位點(diǎn)(attλ)，將cysE等位基因cysEIV、cysEX和cysEXI克隆進(jìn)質(zhì)粒pRS551(Simons等，1987，基因，5385-96)。為了這一目的，通過PCR從相應(yīng)的cysE質(zhì)粒擴(kuò)增每種cysE等位基因，所用的寡核苷酸，即cysE-fwl和cysE-revl在實(shí)施例1中描述。擴(kuò)增如在實(shí)施例3中所描述的進(jìn)行。形成的片段以EcoRI/BamHI裂解并通過瓊脂糖凝膠純化，連接進(jìn)以EcoRI和BamHI切割的載體pRS551。這提供了基于載體pRSS51的重組質(zhì)粒pRScysEIV、X和XI。
除了包含λRS45噬菌體之外還包含攜帶重組cysE等位基因的λRS45衍生物的異源λ裂解物在體內(nèi)通過同源重組產(chǎn)生，其方式為利用λRS45噬菌體(Simons等，1987，基因，5385-96)制備在攜帶pRScysE的recA+菌株(例如YMC9、ATCC 3397)上的平板裂解物。
將用異源λ裂解物感染并隨后平板接種于含卡那霉素(25mg/L)的LB平板上的cysE菌株JM15用于選擇重組RS45衍生物。然后試驗(yàn)獲得的溶源性、卡那霉素抗性的克隆在沒有半胱氨酸的基本培養(yǎng)基平板上生長的能力。選擇在每種情況下是半胱氨酸原養(yǎng)的克隆并用于制備同源cysEλ裂解物(通過UV誘導(dǎo)，Simons等，1987，基因5385-96)。
用這些在每種情況下獲得的同源cysEλ裂解物感染JM15菌株。形成的JM15attλ∷cysE菌株如實(shí)施例6中所描述的培養(yǎng)。在每種情況下各自的培養(yǎng)基包含每升25mg的卡那霉素(取代四環(huán)素)作為選擇劑。
半胱氨酸的產(chǎn)量是在cysEIV的情況下為0.5，在cysEX的情況下為1.8，在cysEXI的情況下為2.1g/L(參見表7)。實(shí)施例6不同的、質(zhì)粒編碼的cysE等位基因?qū)盟拗骶闖M15在1L發(fā)酵罐中生產(chǎn)L-半胱氨酸或源自L-半胱氨酸的產(chǎn)物的影響將以各個(gè)cysE質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的生產(chǎn)菌株JM15(CGSC#5042)的單個(gè)菌落接種在100mL錐形瓶中的20mL LB培養(yǎng)基(1％胰化蛋白胨、0.5％酵母提取物、0.5％NaCl)中。
在細(xì)菌搖床(30℃、150rpm)中培養(yǎng)7小時(shí)之后，將各個(gè)初步培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移到100mL的SM1培養(yǎng)基中。SM1培養(yǎng)基包含5g/L葡萄糖、5mg/L維生素B1、3g/L KH2PO4、12g/L K2HPO4、0.3g/LMgSO4×7H2O、0.1g/L NaCl、5g/L (NH4)2SO4、14.7g/LCaCl2×2H2O、2mg/L FeSO4×2H2O、1g/L檸檬酸鈉×2H2O、5g/LNa2S2O3×5H2O和1ml/L痕量元素溶液和0.025mg/L四環(huán)素。痕量元素溶液由0.15g/L Na2MoO4×2H2O、2.5g/L H3BO3、0.7g/LCoCl2×6H2O、0.25g/L CuSO4×5H2O、1.6g/L MnCl2×4H2O和0.3g/LZnSO4×7H2O組成。將培養(yǎng)物于30℃和150rpm下在1L培養(yǎng)瓶中搖動(dòng)培養(yǎng)17小時(shí)。在此培養(yǎng)之后，OD600在4和5之間。爾后的發(fā)酵在Braun-Melsungen BIOSTAT M研究發(fā)酵罐中進(jìn)行。使用總?cè)萘繛?L的培養(yǎng)容器。
發(fā)酵培養(yǎng)基包含15g/L葡萄糖、5g/L NaCl、1g/L檸檬酸鈉×2H2O、0.3g/L MgSO4×7H2O、15mg/L CaCl2×2H2O、75mg/LFeSO4×7H2O、1.5g/L KH2PO4、1ml/L痕量元素溶液(見上)、5mg/L維生素B1、2.5g/L酵母提取物(Difco)、2.5g/L胰化蛋白胨(Difco)和25mg/L四環(huán)素。
在發(fā)酵罐中的葡萄糖濃度最初通過泵入700g/L(w/v)(滅菌的)葡萄糖溶液調(diào)整至15g/L的值，pH通過泵入25％NH4OH溶液調(diào)整至7.0。在OD600達(dá)到10之后，每小時(shí)供給300mg無菌的100g/L(w/v)硫代硫酸鹽母液。將100ml的初步培養(yǎng)物泵入發(fā)酵罐容器接種。起始體積大約是1L。培養(yǎng)物最初在400rpm下攪拌并以1.5vvm的通過無菌過濾器滅菌的壓縮空氣充氣。發(fā)酵在30℃的溫度下進(jìn)行。
通過用25％NH4OH自動(dòng)校正將pH保持在7.0。在發(fā)酵期間，發(fā)酵肉湯中的氧飽和度決不能低于20％；攪拌速度用來于確保這一點(diǎn)。營養(yǎng)溶液中的葡萄糖含量、光密度和半胱氨酸含量以2-3小時(shí)的間隔測定。葡萄糖含量利用YSI的葡萄糖分析儀酶促測定。通過連續(xù)輸送葡萄糖將這一化合物的濃度調(diào)整至10到20g/L。
在培養(yǎng)基中的半胱氨酸的含量利用Gaitonde，M.K.(1967)，生物化學(xué)雜志，104，627-633的方法從樣品的無細(xì)胞上清液比色測定。
發(fā)酵在44-50小時(shí)之后終止。在48小時(shí)后產(chǎn)生的半胱氨酸的量(以g/L表示)在表7中總結(jié)。表7以不同的cysE等位基因轉(zhuǎn)化的生產(chǎn)菌株JM15的半胱氨酸產(chǎn)量(1L發(fā)酵罐)cysE等位基因 半胱氨酸產(chǎn)量[g/L][48小時(shí)]pACYC184/cysEIV 1.6pACYC184/cysEV 1.3pACYC184/cysEVI 1.4pACYC184/cysEX 3.4pACYC184/cysEXI 3.4pACYC184/cysEXII1.2pACYC184/cysEXIV2.3pACYC184/cysEXV 3.0pACYC184/cysEXVI2.2pACYC184/cysEXXIII 2.7pACYC184/cysEDel255 3.9實(shí)施例7利用棒桿菌生產(chǎn)L-半胱氨酸或源自L-半胱氨酸的產(chǎn)物將反饋抗性的cysE等位基因cysEIV、cysEX、cysEXI以及cysEXIV(參見在實(shí)施例1中的表2)利用限制酶BamHI和EcoRI(得自Boehringer Mannheim)裂解出它們對應(yīng)的質(zhì)粒，通過瓊脂糖凝膠純化并分離每種1.15kb大小的DNA片段。利用大腸桿菌DNA聚合酶I(得自Boehringer Mannheim)的Klenow片段使各自的DNA片段成為平端。用限制酶SmaI水解載體pWST1(得自Boehringer Mannheim)并利用T4 DNA連接酶連接到平端的DNA片段上。載體pWST1是大腸桿菌/棒桿菌穿梭載體并可以在大腸桿菌和棒桿菌中復(fù)制。該載體的棒桿菌復(fù)制子起源于谷氨酸棒桿菌菌株ATCC 19223。載體pWST1的制備在US-A-4,965,197中描述。連接混合物用于轉(zhuǎn)化對半胱氨酸是營養(yǎng)缺陷的突變體JM15?；パa(bǔ)質(zhì)粒按照它們所插入的cysE等位基因命名為pWST1-cysEIV、pWST1-cysEX、pWST1-cysEXI和pWST1-cysEXIV。
將pWST1-cysE質(zhì)粒用于轉(zhuǎn)化谷氨酸棒桿菌菌株ATCC21851。轉(zhuǎn)化利用在Liebl，W.等，1989，F(xiàn)EMS微生物通信，65，299-304中詳盡描述的技術(shù)通過電穿孔法進(jìn)行。重組克隆在包含25mg/L卡那霉素的瓊脂平板上基于其質(zhì)粒編碼的卡那霉素抗性選擇。
發(fā)酵以類似于實(shí)施例6中所描述的條件進(jìn)行(除了濃度為50mg/L的卡那霉素用作選擇抗生素以代替四環(huán)素外)。
結(jié)果發(fā)現(xiàn)攜帶質(zhì)粒上的cysEXI等位基因的菌株的發(fā)酵達(dá)到了最高的半胱氨酸產(chǎn)量。
序列表(1)一般信息(i)申請人(A)名稱電化學(xué)工業(yè)有限公司(國際)(B)街道Zielstattstr.20(C)城市慕尼黑(D)聯(lián)邦州巴伐利亞(E)國家德國(F)郵區(qū)代碼81379(G)電話089/748440(H)傳真089/74844350(I)電傳5215553 cons d(ii)發(fā)明名稱制備O-乙酰絲氨酸和L-半胱氨酸以及L-半胱氨酸相關(guān)產(chǎn)物的方法(iii)序列數(shù)25(iv)計(jì)算機(jī)可讀形式(A)介質(zhì)類型軟盤(B)計(jì)算機(jī)IBM PC兼容機(jī)(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件PatentIn Release#1.0，#1.30版(EPA)(2)SEQ ID NO1的信息(i)序列特征(A)長度42個(gè)堿基對(B)類型核苷酸(C)鏈型單鏈
(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(ii)分子類型混雜核酸(A)描述/desc＝“寡核苷酸”(vii)直接來源(A)文庫合成(B)克隆cysE-fw1(xi)序列描述SEQ ID NO1GCCTGGATCC TGCAGTCGAC CTGGCGCATC GCTTCGGCGT GG 42(2)SEQ ID NO2的信息(i)序列特征(A)長度41個(gè)堿基對(B)類型核苷酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(ii)分子類型混雜核酸(A)描述/desc＝“寡核苷酸”(vii)直接來源(A)文庫合成(B)克隆cysE-revl(xi)序列描述SEQ ID NO2GTAGGAGCTC TGCAGAATTC GGGTATCCGG GAGCGGTATT G 41(2)SEQ ID NO3的信息(i)序列特征(A)長度18個(gè)堿基對(B)類型核苷酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(ii)分子類型混雜核酸(A)描述/desc＝“寡核苷酸”
(vii)直接來源(A)文庫合成(B)克隆cysE-Mut-1(xi)序列描述SEQ ID NO3GCCGCTAGCG TTCCGGCT 18(2)SEQ ID NO4的信息(i)序列特征(A)長度18個(gè)堿基對(B)類型核苷酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(ii)分子類型混雜核酸(A)描述/desc＝“寡核苷酸”(vii)直接來源(A)文庫合成(B)克隆cysE-Mut-2(xi)序列描述SEQ ID NO4CGTCGTTGAT GAACGGCG 18(2)SEQ ID NO5的信息(i)序列特征(A)長度21個(gè)堿基對(B)類型核苷酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(ii)分子類型混雜核酸(A)描述/desc＝“寡核苷酸”(vii)直接來源(A)文庫合成(B)克隆cysE-Mut-3
(xi)序列描述SEQ ID NO5CCGCCGCATA CCACCGCCGTT21(2)SEQ ID NO6的信息(i)序列特征(A)長度24個(gè)堿基對(B)類型核苷酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(ii)分子類型混雜核酸(A)描述/desc＝“寡核苷酸”(vii)直接來源(A)文庫合成(B)克隆cysE-Mut-6(xi)序列描述SEQ ID NO6CCATCAATGG ATATAGACCA GCAT24(2)SEQ ID NO7的信息(i)序列特征(A)長度24個(gè)堿基對(B)類型核苷酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(ii)分子類型混雜核酸(A)描述/desc＝“寡核苷酸”(vii)直接來源(A)文庫合成(B)克隆cysE-Mut-10(xi)序列描述SEQ ID NO7GTCGTTGGTG AAGCGGCGGT GATT24(2)SEQ ID NO8的信息(i)序列特征(A)長度38個(gè)堿基對(B)類型核苷酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(ii)分子類型混雜核酸(A)描述/desc＝“寡核苷酸”(vii)直接來源(A)文庫合成(B)克隆cysE-LHfwl(xi)序列描述SEQ ID NO8TGGACCAGAG CTCTGGCTGG CGCATCGCTT CGGCGTTG 38(2)SEQ ID NO9的信息(i)序列特征(A)長度46個(gè)堿基對(B)類型核苷酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(ii)分子類型混雜核酸(A)描述/desc＝“寡核苷酸”(vii)直接來源(A)文庫合成(B)克隆cysE-Del270(xi)序列描述SEQ ID NO9CTCGATGCAT TACGTATTAC CCATACTCAA ATCTATGGTT AATACC46(2)SEQ ID NO10的信息(i)序列特征(A)長度46個(gè)堿基對
(B)類型核苷酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(ii)分子類型混雜核酸(A)描述/desc＝“寡核苷酸”(vii)直接來源(A)文庫合成(B)克隆cysE-Del268(xi)序列描述SEQ ID NO10CTCGATGCAT TACGTATTAC TCAAATGTAT GGTTAATACC GTTGAA46(2)SEQ ID NO11的信息(i)序列特征(A)長度46個(gè)堿基對(B)類型核苷酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(ii)分子類型混雜核酸(A)描述/desc＝“寡核苷酸”(vii)直接來源(A)文庫合成(B)克隆cysE-Del263(xi)序列描述SEQ ID NO11CTCGATGCAT TACGTATAAA ATACCGTTGA AATGCTGGTC CATATC46(2)SEQ ID NO12的信息(i)序列特征(A)長度46個(gè)堿基對(B)類型核苷酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型
(ii)分子類型混雜核酸(A)描述/desc＝“寡核苷酸”(vii)直接來源(A)文庫合成(B)克隆cysE-Del259(xi)序列描述SEQ ID NO12CTCGATGCAT TACGTATTAA TGCTGGTCCA TATCCATTGA TGGCTT46(2)SEQ ID NO13的信息(i)序列特征(A)長度46個(gè)堿基對(B)類型核苷酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(ii)分子類型混雜核酸(A)描述/desc＝“寡核苷酸”(vii)直接來源(A)文庫合成(B)克隆cysE-Del258(xi)序列描述SEQ ID NO13CTCGATGCAT TACGTATTAC TGGTCCATAT CCATTGATGG CTTATC46(2)SEQ ID NO14的信息(i)序列特征(A)長度47個(gè)堿基對(B)類型核苷酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(ii)分子類型混雜核酸(A)描述/desc＝“寡核苷酸”(vii)直接來源
(A)文庫合成(B)克隆cysE-Del257(xi)序列描述SEQ ID NO14CTCGATGCAT TACGTATTAG TCCATATCCA TTGATGGCTT ATCGCTG 47(2)SEQ ID NO15的信息(i)序列特征(A)長度46個(gè)堿基對(B)類型核苷酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(ii)分子類型混雜核酸(A)描述/desc＝“寡核苷酸”(vii)直接來源(A)文庫合成(B)克隆cysE-Del256(xi)序列描述SEQ ID NO15CTCGATGCAT TACGTATTAC ATATCCATTG ATGGCTTATC GCTGTC46(2)SEQ ID NO16的信息(i)序列特征(A)長度46個(gè)堿基對(B)類型核苷酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(ii)分子類型混雜核酸(A)描述/desc＝“寡核苷酸”(vii)直接來源(A)文庫合成(B)克隆cysE-Del255(xi)序列描述SEQ ID NO16CTCGATGCAT TACGTATTAA TCCATTGATG GCTTATCGCT GTCTGG46(2)SEQ ID NO17的信息(i)序列特征(A)長度46個(gè)堿基對(B)類型核苷酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(ii)分子類型混雜核酸(A)描述/desc＝“寡核苷酸”(vii)直接來源(A)文庫合成(B)克隆cysE-Del250(xi)序列描述SEQ ID NO17CTCGATGCAT TACGTATTAA TCGCTGTCTG GTTTACCGAC AATACG46(2)SEQ ID NO18的信息(i)序列特征(A)長度46個(gè)堿基對(B)類型核苷酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(ii)分子類型混雜核酸(A)描述/desc＝“寡核苷酸”(vii)直接來源(A)文庫合成(B)克隆cysE-Del249(xi)序列描述SEQ ID NO18CTCGATGCAT TACGTATTAG CTGTCTGGTT TACCGACAAT ACGAGC46(2)SEQ ID NO19的信息
(i)序列特征(A)長度46個(gè)堿基對(B)類型核苷酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(ii)分子類型混雜核酸(A)描述/desc＝“寡核苷酸”(vii)直接來源(A)文庫合成(B)克隆cysE-Del248(xi)序列描述SEQ ID NO19CTCGATGCAT TACGTATTAG TCTGGTTTAC CGACAATACG AGCCGG46(2)SEQ ID NO20的信息(i)序列特征(A)長度46個(gè)堿基對(B)類型核苷酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(ii)分子類型混雜核酸(A)描述/desc＝“寡核苷酸”(vii)直接來源(A)文庫合成(B)克隆cysE-Del245(xi)序列描述SEQ ID NO20CTCGATGCAT TACGTATTAA CCGACAATAC GAGCCGGAAC GCCAGC46(2)SEQ ID NO21的信息(i)序列特征(A)長度46個(gè)堿基對(B)類型核苷酸
(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(ii)分子類型混雜核酸(A)描述/desc＝“寡核苷酸”(vii)直接來源(A)文庫合成(B)克隆cysE-Del239(xi)序列描述SEQ ID NO21CTCGATGCAT TACGTATTAA ACGCCAGCGG CGGTGGTATC CGGCGG46(2)SEQ ID NO22的信息(i)序列特征(A)長度46個(gè)堿基對(B)類型核苷酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(ii)分子類型混雜核酸(A)描述/desc＝“寡核苷酸”(vii)直接來源(A)文庫合成(B)克隆cysE-Del227(xi)序列描述SEQ ID NO22CTCGATGCAT TACGTATTAC AGCACCACGG AACCTGCGCC AATCTT46(2)SEQ ID NO23的信息(i)序列特征(A)長度38個(gè)堿基對(B)類型核苷酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(ii)分子類型混雜核酸
(A)描述/desc＝“寡核苷酸”(vii)直接來源(A)文庫合成(B)克隆cysE-LHrevl(xi)序列描述SEQ ID NO23CTCGATGCAT TACGTAGGGG TATCCGGGAG CGGTATTG 38(2)SEQ ID NO24的信息(i)序列特征(A)長度273個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(ii)分子類型蛋白質(zhì)(vii)直接來源(A)有機(jī)體大腸桿菌(B)菌株W3110(xi)序列描述SEQ ID NO24Met Ser Cys Glu Glu Leu Glu Ile Val Trp Asn Asn Ile Lys Ala Glu1 5 10 15Ala Arg Thr Leu Ala Asp Cys Glu Pro Met Leu Ala Ser Phe Tyr His20 25 30Ala Thr Leu Leu Lys His Glu Asn Leu Gly Ser Ala Leu Ser Tyr Met35 40 45Leu Ala Asn Lys Leu Ser Ser Pro Ile Met Pro Ala Ile Ala Ile Arg50 55 60Glu Val Val Glu Glu Ala Tyr Ala Ala Asp Pro Glu Met Ile Ala Ser65 70 75 80Ala Ala Cys Asp Ile Gln Ala Val Arg Thr Arg Asp Pro Ala Val Asp85 90 95Lys Tyr Ser Thr Pro Leu Leu Tyr Leu Lys Gly Phe His Ala Leu Gln100 105 110Ala Tyr Arg Ile Gly His Trp Leu Trp Asn Gln Gly Arg Arg Ala Leu115 120 125Ala Ile Phe Leu Gln Asn Gln Val Ser Val Thr Phe Gln Val Asp Ile130 135 140His Pro Ala Ala Lys Ile Gly Arg Gly Ile Met Leu Asp His Ala Thr145 150 155 160Gly Ile Val Val Gly Glu Thr Ala Val Ile Glu Asn Asp Val Ser Ile165 170 175Leu Gln Ser Val Thr Leu Gly Gly Thr Gly Lys Ser Gly Gly Asp Arg180 185 190His Pro Lys Ile Arg Glu Gly Val Met Ile Gly Ala Gly Ala Lys Ile195 200 205Leu Gly Asn Ile Glu Val Gly Arg Gly Ala Lys Ile Gly Ala Gly Ser210 215 220Val Val Leu Gln Pro Val Pro Pro His Thr Thr Ala Ala Gly Val Pro225 230 235 240Ala Arg Ile Val Gly Lys Pro Asp Ser Asp Lys Pro Ser Met Asp Met245 250 255Asp Gln His Phe Asn Gly Ile Asn His Thr Phe Glu Tyr Gly Asp Gly260 265 270Ile(2)SEQ ID NO25的信息(i)序列特征(A)長度1135個(gè)堿基對(B)類型核苷酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(ii)分子類型基因組DNA(vi)原始來源(A)有機(jī)體大腸桿菌(B)菌株W3110(vii)直接來源(B)克隆pPC43(xi)序列描述SEQ ID NO25TCCGCGAACT GGCGCATCGC TTCGGCGTTG AAATGCCAAT AACCGAGGAA ATTTATCAAG 60TATTATATTG CGGAAAAAAC GCGCGCGAGG CAGCATTGAC TTTACTAGGT CGTGCACGCA 120AGGACGAGCG CAGCAGCCAC TAACCCCAGG GAACCTTTGT TACCGCTATG ACCCGGCCCG 180CGCAGAACGG GCCGGTCATT ATCTCATCGT GTGGAGTAAG CAATGTCGTG TGAAGAACTG 240GAAATTGTCT GGAACAATAT TAAAGCCGAA GCCAGAACGC TGGCGGACTG TGAGCCAATG 300CTGGCCAGTT TTTACCACGC GACGCTACTC AAGCACGAAA ACCTTGGCAG TGCACTGAGC 360TACATGCTGG CGAACAAGCT GTCATCGCCA ATTATGCCTG CTATTGCTAT CCGTGAAGTG 420GTGGAAGAAG CCTACGCCGC TGACCCGGAA ATGATCGCCT CTGCGGCCTG TGATATTCAG 480GCGGTGCGTA CCCGCGACCC GGCAGTCGAT AAATACTCAA CCCCGTTGTT ATACCTGAAG 540GGTTTTCATG CCTTGCAGGC CTATCGCATC GGTCACTGGT TGTGGAATCA GGGGCGTCGC 600GCACTGGCAA TCTTTCTGCA AAACCAGGTT TCTGTGACGT TCCAGGTCGA TATTCACCCG 660GCAGCAAAAA TTGGTCGCGG TATCATGCTT GACCACGCGA CAGGCATCGT CGTTGGTGAA 720ACGGCGGTGA TTGAAAACGA CGTATCGATT CTGCAATCTG TGACGCTTGG CGGTACGGGT 780AAATCTGGTG GTGACCGTCA CCCGAAAATT CGTGAAGGTG TGATGATTGG CGCGGGCGCG 840AAAATCCTCG GCAATATTGA AGTTGGGCGC GGCGCGAAGA TTGGCGCAGG TTCCGTGGTG 900CTGCAACCGG TGCCGCCGCA TACCACCGCC GCTGGCGTTC CGGCTCGTAT TGTCGGTAAA 960CCAGACAGCG ATAAGCCATC AATGGATATG GACCAGCATT TCAACGGTAT TAACCATACA 1020TTTGAGTATG GGGATGGGAT CTAATGTCCT GTGATCGTGC CGGATGCGAT GTAATCATCT 1080ATCCGGCCTA CAGTAACTAA TCTCTCAATA CCGCTCCCGG ATACCCCAAC TGTCG 1135
國際表格電化學(xué)工業(yè)有限公司(國際)德國慕尼黑存活證明由本頁下邊所示的國際保藏單位根據(jù)10.2條款出具
1指原始保藏日期，或者當(dāng)已保藏了新保藏物或已作轉(zhuǎn)移的情況下指最相關(guān)的日期(新保藏物的保藏日期或轉(zhuǎn)移的日期)。
2當(dāng)指條款10.2(a)(ii)和(iii)時(shí)，指最近的存活試驗(yàn)。
3在合適的括號內(nèi)用×標(biāo)記。
4如果需要信息和試驗(yàn)結(jié)果為陰性時(shí)填充內(nèi)容。DSM-BP/9表(單頁)07/94
國際表格電化學(xué)工業(yè)有限公司(國際)德國慕尼黑原始保藏物的保藏證明由本頁下邊所示的國際保藏單位根據(jù)7.1條款出具
1當(dāng)適用條款6.4.d)時(shí)，該日期為已獲得國際保藏單位資格的日期。DSM-BP/4表(單頁)07/94
I.發(fā)放聲明在此授權(quán)下述保藏單位名稱德意志微生物保藏中心地址德國不倫瑞克將德國專利申請P
中涉及的微生物科學(xué)描述大腸桿菌JM39申請人代號JM39的樣品1 在該申請文件第一次公布后(公開或授予專利權(quán))根據(jù)請求提供給任何第三方。
本發(fā)放聲明適用于甚至在申請文件第一次公布之前即處理專利授權(quán)程序的當(dāng)局和法院。2 在此永久放棄在申請文件第一次公布后要求返還或銷毀微生物培養(yǎng)物的權(quán)利。3 需在下列條件*)下提供樣品無限制地點(diǎn)，日期4 慕尼黑，1995年8月11日 [申請人簽名]*)除非保藏國家或保藏單位的規(guī)定允許無條件發(fā)放，否則可加入下列條件接受者必須5 將名稱和地址提供給保藏單位，以便在請求時(shí)可由保藏單位通知保藏人6 承諾在專利保護(hù)期限屆滿之前a)不將樣品提供給他人，b)不將樣品帶到專利法適用區(qū)之外。
II.證明茲證明上述微生物與1995年8月18日保藏于本國際保藏單位，該微生物為存活狀態(tài)，并給予保藏號DSM 101737 保藏期限為由上述專利申請的申請日起計(jì)算至少20年，即從
起，并在收到最后一次提供樣品請求之后或在上述專利申8 請授權(quán)期滿后加5年寬限期。根據(jù)微生物發(fā)放的國家規(guī)定，在這一期限內(nèi)在上述條件下將這一培養(yǎng)物的活樣品提供給付費(fèi)人。在9 所述期限屆滿之前，如果該微生物被轉(zhuǎn)移至另一家能保證所述余下期限并自由獲得微生物的保藏中心，我方可以終止本保藏。
對于將該培養(yǎng)物帶出德意志聯(lián)邦共和國，目前無限制，日期1995年8月24日德意志微生物保藏中心德國不倫瑞克[簽名][保藏單位]
權(quán)利要求
1.一種絲氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶，該酶表現(xiàn)出對抑制劑L-半胱氨酸的敏感性，與野生型酶比較該酶敏感性降低，其蛋白質(zhì)序列當(dāng)與野生型序列相比較時(shí)表現(xiàn)出至少一種突變或缺失，其中所說的突變位于從97位氨基酸到273位氨基酸并包括273位氨基酸的序列區(qū)，或所說的缺失在從227位氨基酸開始的羧基末端序列區(qū)，其中1位是圖5(SEQ IDNO1)中的起始甲硫氨酸，并且256位上的Met突變?yōu)镮le的突變除外。
2.如權(quán)利要求1中所述的絲氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶，該酶在1mM L-絲氨酸和0.1mM乙酰輔酶A存在下具有0.005-2.3mM的抑制劑常數(shù)Ki。
3.如權(quán)利要求1或2中所述的絲氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶，其中其蛋白質(zhì)序列含有表1a或1b中指出的至少一種cysE突變體的氨基酸取代。
4.一種DNA序列，該序列編碼如權(quán)利要求1-3之一所述的絲氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶。
5.一種DNA序列，該序列編碼絲氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶，該酶表現(xiàn)出對抑制劑L-半胱氨酸的敏感性，與野生型酶比較該敏感性降低，該序列在bp510至bp1040具有至少一種突變，其中bp1是圖6(SEQ IDNO2)中的第一個(gè)堿基，并且990位上的鳥嘌呤突變成腺嘌呤的突變除外。
6.一種微生物，該微生物具有被權(quán)利要求4或5所述的至少一種DNA序列去調(diào)節(jié)的半胱氨酸代謝。
7.一種制備O-乙酰絲氨酸、L-半胱氨酸或源自L-半胱氨酸的產(chǎn)物的方法，該方法包括以已知的方式在營養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)如權(quán)利要求6所述的微生物。
8.如權(quán)利要求7所述的方法，其中所說的營養(yǎng)培養(yǎng)基含有合適量的硫供體。
9.如權(quán)利要求8所述的方法，其中使用硫代硫酸鹽作為硫供體。
全文摘要
本發(fā)明涉及用反饋抗性絲氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶制備O－乙酰絲氨酸、L－半胱氨酸以及來源于它們的含硫化合物的方法。與野生型酶比較這些絲氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶對抑制劑L－半胱氨酸敏感性降低,其蛋白質(zhì)序列當(dāng)與野生型序列相比較時(shí)表現(xiàn)出至少一種突變或缺失。本發(fā)明方法的特征在于其中所說的突變位于從97位氨基酸到273位氨基酸并包括273位氨基酸的序列區(qū),或所說的缺失位于從227位氨基酸開始的羧基末端序列區(qū),其中1位是圖5(SEQ ID NO:1)中的起始甲硫氨酸,并且256位上的Met突變?yōu)镮le的突變除外。
文檔編號C12N15/54GK1200764SQ96197894
公開日1998年12月2日 申請日期1996年10月24日 優(yōu)先權(quán)日1995年10月26日
發(fā)明者瓦爾弗雷德·萊因費(fèi)爾德, 彼得·海因里希 申請人:電化學(xué)工業(yè)有限公司(國際)