專利名稱：以era或gst為第一順反子的原核雙順反子表達(dá)載體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及在基因工程領(lǐng)域中以大腸桿菌為宿主菌的原核雙順反子表達(dá)載體的構(gòu)建。
眾所周知，利用基因工程方法來大量獲取自然界中含量極微的蛋白質(zhì)，是一條切實可行的途徑。其中，在科研和生產(chǎn)中應(yīng)用比較廣泛的是大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)。雖然大腸桿菌表系統(tǒng)不能象真核系統(tǒng)一樣進(jìn)行翻譯后加工，在一定程度上制約著其應(yīng)用，但由于其遺傳背景相對比較清楚，并且具有使用安全、操作簡便、周期短、經(jīng)濟(jì)等特點，故而它仍然是目前使用最廣泛的、也是不可替代的基本系統(tǒng)。
表達(dá)系統(tǒng)中起關(guān)鍵作用的是表達(dá)載體。對于大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)來說，表達(dá)載體理想的性能應(yīng)包括以下幾點第一，表達(dá)量高；第二，適用范圍廣；第三，表達(dá)易于嚴(yán)格調(diào)控；第四，表達(dá)產(chǎn)物容易純化；第五，表達(dá)產(chǎn)物活性高；第六，小規(guī)模、大規(guī)模均容易操作且經(jīng)濟(jì)；第七，穩(wěn)定性好。到目前為止，還沒有一個表達(dá)載體能完全滿足上述要求。
大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)經(jīng)過幾十年的研究，在分子生物學(xué)基礎(chǔ)研究和基因工程生產(chǎn)等方面都取得了令人矚目的成就。目前已知的大腸桿菌表達(dá)載體有以下幾種類型非融合表達(dá)、融合表達(dá)、分泌表達(dá)、帶純化標(biāo)簽的表達(dá)、帶伴同蛋白的表達(dá)、表面呈現(xiàn)表達(dá)等，各有其優(yōu)缺點。其中融合表達(dá)雖然可以解決通用性的問題，但去除融合的肽段就非常困難；分泌表達(dá)產(chǎn)量低等等。尤其是目前所使用的表達(dá)載體大多都是單順反子的，固定的SD-AUG間隔難以適用于所有基因的表達(dá)。
本發(fā)明的目的是，提供以era或gst基因為第一順反子的原核雙順反子表達(dá)載體，為基因工程生產(chǎn)有活性的重組蛋白以及表達(dá)調(diào)控的研究提供前提條件。
本發(fā)明的目的是通過以下途徑來實現(xiàn)的，此表達(dá)載體由以下關(guān)鍵四部分經(jīng)各種組合而形成許多獨立的表達(dá)載體。第一，采用了雙順反子形式，以高表達(dá)的era或gst基因合理的翻譯起始區(qū)(TIR)作為第一順反子，合理組織第一順反子的終止碼和第二順反子的起始碼的結(jié)構(gòu)；第二，啟動子為PL或Ptac；第三，“原核翻譯增強(qiáng)子”序列；第四，cI857基因序列。
構(gòu)建過程首先是啟動子的選擇，PL和Ptac具有啟動能力強(qiáng)，可嚴(yán)格調(diào)控的特點，因此選用PL和Ptac作為啟動子。
其次是選用強(qiáng)終止信號rrnBT1T2，以保證轉(zhuǎn)錄的效率，避免無效轉(zhuǎn)錄。它源于大腸桿菌5S RNA的轉(zhuǎn)錄終止序列。盡管它對于基因表達(dá)是非必需的，但是對于提高轉(zhuǎn)錄效率以及表達(dá)載體的穩(wěn)定性卻是非常有益的。
第三、選用pUC系統(tǒng)的復(fù)制起始位點(ori)，以保證質(zhì)粒的拷貝數(shù)較高，易于操作，易于提高產(chǎn)量。
第四、采用雙順反子方式構(gòu)建表達(dá)載體，其第一順反子是曾在大腸桿菌中高表達(dá)的era的部分序列、全長或截短的gst序列，從而保證RBS或TIR的組織的合理性，進(jìn)而帶動第二個順反子即目的基因的表達(dá)。由于原核基因許多以多順反子形式轉(zhuǎn)錄和翻譯，核糖體與第一個順反子mRNA 5′端形成翻譯起始復(fù)合物，開始翻譯，當(dāng)遇到終止信號，而此時緊隨其后又是第二個順反子的起始碼時，第一條多肽鏈合成雖已結(jié)束，但此時核糖體可發(fā)生通讀，即不離開mRNA，而隨之合成第二個順反子的多肽鏈。實驗中發(fā)現(xiàn)，盡管使用了強(qiáng)的啟動子，但經(jīng)常發(fā)現(xiàn)雖然基因已轉(zhuǎn)錄為mRNA，卻無目的蛋白表達(dá)，所以翻譯水平的表達(dá)調(diào)控對外源基因的表達(dá)至關(guān)重要。因此，可以采用雙順反子形式，由于第一個順反子翻譯起始區(qū)的合理組織有利于目的基因的表達(dá)，將待表達(dá)基因作為第二個順反子，以求獲得基因高表達(dá)。
第五、鑒于原核翻譯增強(qiáng)子的發(fā)現(xiàn)及其對原核翻譯水平的影響，本載體亦不失時機(jī)地將其引入，以期提高翻譯效率、提高表達(dá)水平。近年來有關(guān)mRNA翻譯起始區(qū)(TIR)對基因表達(dá)的影響越來越受到人們的重視。大量研究資料表明，位于mRNA 5′端的TIR范圍內(nèi)的堿基可形成各式各樣的二級結(jié)構(gòu)，一旦起始密碼子AUG和SD序列位于二級結(jié)構(gòu)的堿基配對區(qū)域，就會影響其翻譯起始，只有AUG和SD序列呈單鏈結(jié)構(gòu)時才會呈現(xiàn)高表達(dá)。而且SD-AUG間距離、SD-AUG間隔區(qū)組成以及AUG上下游各20bp對基因表達(dá)影響極大，因此設(shè)計表達(dá)載體時必須充分考慮到這些結(jié)構(gòu)間的相互影響。
第六、本載體中亦包含質(zhì)粒所必需的其它元件，如氨芐抗性基因、多克隆位點等。
第七、為了使載體易于操作，盡量將其縮小。為此，有的載體未將cI857基因引入，采用基因型中含cI857基因的大腸桿菌TAP106、TAP56、TAP130等為宿主菌。
第八、此表達(dá)載體具有如下特殊結(jié)構(gòu)
第九、此表達(dá)載體表達(dá)的是非融合蛋白，特別適合于作為工程菌進(jìn)行生產(chǎn)。
構(gòu)建中所使用的部分序列(有的僅使用其中部分序列)PL啟動子的序列AACCATCTGCGGTGATAAATTATCTCTGGCGGTGTTGACATAAATACCACTGGCCGTGATACTGAGCACATCAGCAGGACGCACTGACCACCATGAAGGTGACGCTCTTAAAAATTAAGCCCTGAAGAAGGGCAGCATTCAAAGCAGAAGGCTTTGGGGTGTGTGATACGAAACGAAGCATTGGCCGTAAGTGCGATTCCGGATTAGCTGCCAATGTGCCAATCGCGGGGGGTTTTCGTTCAGGACTACAACTGCCACACACCACCAAAGCTAACTGACAGGAGAATCCAGATGGATGCACAAACACGCCGCCGCGAACGTCGCGCAGAGAAACAGGCTCAATGGAAAGCAGCAAATCCCCTGTTGGTTGGGGTAAGCGCAAAACCAGTTCCGAAAGATTTTTTTAACTATAAACGCTGATGGAAGCGTTTATGCGGAAGAGGTAAAGCCCTTCCCGAGTAACAAAAAAACAACAGCATAAATAACCCCGCTCTTACACATCCCAGCCCTGAAAAAGGGCATCAAAATAAAPtac啟動子的序列ACGTTATCGACTGCACGGTGCACCAATGCTTCTGGCGTCAGGCAGCCATCGGAAGCTGTGGTATGGCTGTGCAGGTCGTAAATCACTGCATAATTCGTGTCGCTCAAGGCGCACTCCCGTTCTGGATAATGTTTTTTGCGCCGACATCATAACGGTTCTGGCAAATATTCTGAAATGAGCTGTTGACAATTAATCATCGGCTCGTATAATGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGTATTCgst基因序列ATGTCCCCTATACTAGGTTATTGGAAAATTAAGGGCCTTGTGCAACCCACTCGACTTCTTTTGGAATATCTTGAAGAAAAATATGAAGAGCATTTGTATGAGCGCGATGAAGGTGATAAATGGCGAAACAAAAAGTTTGAATTGGGTTTGGAGTTTCCCAATCTTCCTTATTATATTGATGGTGATGTTAAATTAACACAGTCTATGGCCATCATACGTTATATAGCTGACAAGCACAACATGTTGGGTGGTTGTCCAAAAGAGCGTGCAGAGATTTCAATGCTTGAAGGAGCGGTTTTGGATATTAGATACGGTGTTTCGAGAATTGCATATAGTAAAGACTTTGAAACTCTCAAAGTTGATTTTCTTAGCAAGCTACCTGAAATGCTGAAAATGTTCGAAGATCGTTTATGTCATAAAACATATTTAAATGGTGATCATGTAACCCATCCTGACTTCATGTTGTATGACGCTCTTGATGTTGTTTTATACATGGACCCAATGTGCCTGGATGCGTTCCCAAAATTAGTTTGTTTTAAAAAACGTATTGAAGCTATCCCACAAATTGATAAGTACTTGAAATCCAGCAAGTATATAGCATGGCCTTTGCAGGGCTGGCAAGCCACGTTTGGTGGTGGCGACCATCCTCrrnBT1T2序列CTGTTTTGGCGGATGAGAGAAGATTTTCAGCCTGATACAGCTTAAATCAGAACGCAGAAGCGGTCTGATAAAACAGAATTTGCCTCCCGGCAGTAGCGCGGTGGTCCCACCTGACCCCATGCCGAACTCAGAAGTGAAACGCCGTAGCGCCGATGGTAGTGTGGGGTCTCCCCATGCGAGAGTAGCCAACTGCCAGGCATCAAATAAAACGAAAGGCTCAGTCGAAAGACTGGGCCTTTCGTTTTATCTGTTGTTTGTCGGTGAACGCTCTCCTGAGTAGGACAAATCCGCCGGGAGCGGATTTGAACGTTGCGAAGCAACGGCCCGGAGGGTGGCGGGCAGGACGCCCGCCATAAACTGCCAGGCATCAAATTAAGCAGAAGGCCATCCTGACGGATGGCCTTTTTGCGTTTCTACAAACTCTTTera基因5’端序列ATGAGCATCGATAAAAGTTACTGCGGATTTATTGCCATCGTCGGACGTCCGAACGTTGGCAAATCCACATTGTTGAACAAACTGCTGGGGCAGAAAATCTCCATCACTTCCCGCAAGGCGCAGACAACTCGTCACCGCATTGTGGGGATCCATACTGAAGGCGCGTATCAGGCGATCTACGTCGATACACCGGGCCTGCATATGGAAGAAAAACGCGCCATTAACCGCCTGATGAACAAAGCGGCGAGCAGCTCTATTGGCGATGTTGAGCTGGTGATTTTTGTCGTTGAAGGCACCCGCTGGACGCCGGACGACGAAATGGTGCTCAACAAACTGCGCGAAGGCAAAGCGCCGGTAATCCTCGCGGTGAACAAAGTGGACAACGTGCAGGAGAAAGCCGATCTGCTGCCGCACCTGCAGTTCCTGGCAAGCCAGATGAACTTCCTCGATATCGTGCCAATCTCTGCCGAAACCGGGCTGAATGTTGACACTATTGCGGCAATCGTGCGTAAGCATCTACCTGAAGCGACTCATCACTTCCCGGAAGATTACATCACCGATCGCTCACAGCGTTTTATGGCGTCTGAAATCATCCGCGAAAAACTGATGCGTTTCCTCGGCGCTGAACTGCCGTACTCCGTGACCGTGGAGATCGAACGTTTCGTCTCTAACGAACGCGGTGGTTATGAcI857互補(bǔ)序列GCCAAACGTCTCTTCAGGCCACTGACTAGCGATAACTTTCCCCACAACGGAACAACTCTCATTGCATGGGATCATTGGGTACTGTGGGTTTAGTGGTTGTAAAAACACCTGACCGCTATCCCTGATCAGTTTCTTGAAGGTAAACTCATCACCCCCAAGTCTGGCTATGCAGAAATCACCTGGCTCAACAGCCTGCTCAGGGTCAACGAGAATTAACATTCCGTCAGGAAAGCTTGGCTTGGAGCCTGTTGGTGCGGTCATGGAATTACCTTCAACCTCAAGCCAGAATGCAGAATCACTGGCTTTTTTGGTTGTGCTTACCCATCTCTCCGCATCACCTTTGGTAAAGGTTCTAAGCTTAGGTGAGAACATCCCTGCCTGAACATGAGAAAAAACAGGGTACTCATACTCACTTCTAAGTGACGGCTGCATACTAACCGCTTCATACATCTCGTAGATTTCTCTGGCGATTGAAGGGCTAAATTCTTCAACGCTAACTTTGAGAATTTTTGTAAGCAATGCGGCGTTATAAGCATTTAATGCATTGATGCCATTAAATAAAGCACCAACGCCTGACTGCCCCATCCCCATCTTGTCTGCGACAGATTCCTGGGATAAGCCAAGTTCATTTTTCTTTTTTTCATAAATTGCTTTAAGGCGACGTGCGTCCTCAAGCTGCTCTTGTGTTAATGGTTTCTTTTTTGTGCTCAT原核翻譯增強(qiáng)子部分序列GACTCACTATAGGGAGACCACAACGGTTTCCCTCTAGAAATAATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATATCCATGG本發(fā)明的構(gòu)建流程見附圖
。
本發(fā)明的主要優(yōu)點1)此表達(dá)載體以大腸桿菌為宿主菌，因此具有操作簡便、使用安全、成本低以及周期短等優(yōu)點。
2)表達(dá)的是非融合蛋白，從而保證目的蛋白與天然蛋白在結(jié)構(gòu)、免疫原性、理化性質(zhì)等方面基本一致。表達(dá)載體特別適用于在大腸桿菌中表達(dá)真核或原核基因，不管基因是否帶有起始碼，均可通過不同的酶切位點克隆并表達(dá)非融合蛋白，因此有利于作為工程菌進(jìn)行生產(chǎn)。
3)通用性好。由于此雙順反子表達(dá)載體的翻譯起始區(qū)已經(jīng)進(jìn)行了充分合理的設(shè)計，因此利于第二順反子即目的基因的表達(dá)。
4)表達(dá)量高。由于此雙順反子表達(dá)載體的翻譯起始區(qū)設(shè)計合理，并引入了“原核翻譯增強(qiáng)子”，因此非常有利于翻譯的起始。
5)載體穩(wěn)定。由于在表達(dá)載體中引入了強(qiáng)轉(zhuǎn)錄終止信號rrnBT1T2，以及載體比較小，因此其穩(wěn)定性好，適用于作為工程菌。
6)調(diào)控嚴(yán)格。由于此載體采用可嚴(yán)格調(diào)控的PL、Ptac作為啟動子，因此調(diào)控嚴(yán)格，有利于科研和生產(chǎn)的應(yīng)用。
7)拷貝數(shù)高。此表達(dá)載體采用了pUC的復(fù)制起點，因此拷貝數(shù)高，易于操作，易于獲得大量重組蛋白。
實施例1 IFN-y的高表達(dá)我們利用此表達(dá)載體中的pEC34(啟動子是溫敏型PL啟動子，其第一順反子是已高表達(dá)的era部分序列，不含PL啟動子的阻遏物基因cI857，故其合適的宿主菌為基因型中含cI857的大腸桿菌，所以TAP106為本表達(dá)質(zhì)粒宿主菌)來表達(dá)IFN-γ。首先將IFN-γcDNA基因以EcoR和Isa1 I雙酶切，與用相同酶切的載體進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌TAP106，經(jīng)篩選鑒定得重組表達(dá)質(zhì)粒pEC34-IFN。按常規(guī)方法培養(yǎng)，42℃誘導(dǎo)后行SDS-PAGE，與未誘導(dǎo)菌株對比，在15.5KD處有一條新的蛋白帶，以鼠抗人γ-干擾素單克隆抗體作為一抗，進(jìn)行Western blot分析，結(jié)果僅此蛋白與γ-干擾素單抗雜交信號陽性，未誘導(dǎo)的菌株、標(biāo)準(zhǔn)分子量蛋白及表達(dá)菌中其它條帶無陽性反應(yīng)，說明此表達(dá)帶確為IFN-γ蛋白。
為確定此表達(dá)質(zhì)粒的最佳誘導(dǎo)時間，誘導(dǎo)1-6小時后分別取出制備樣品，進(jìn)行電泳，結(jié)果表明誘導(dǎo)1小時后即有蛋白大量表達(dá)，3小時時最高，此后又略有下降，6小時時其表達(dá)量仍高于50％。
表達(dá)的IFN-γ蛋白經(jīng)確認(rèn)存在于沉淀中，即以包涵體形式存在。包涵體經(jīng)初步純化復(fù)性，活性測定結(jié)果表明，其活性為104u/mg。雖然活性低，但由于我們的目的不是去研究純化和復(fù)性，故只做了一次純化測活，只要有活性就達(dá)到了我們檢測表達(dá)載體的目的。
經(jīng)島津自動光密度掃描儀掃描，結(jié)果示表達(dá)量占菌體總蛋白的85.5％，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于目前已報道的各類基因的表達(dá)情況。
一個表達(dá)載體表達(dá)目的基因，作為工程菌，其穩(wěn)定性是十分重要的。為此，我們進(jìn)行了穩(wěn)定性檢驗，結(jié)果在傳代30次時仍有IFN的高表達(dá)，說明此表達(dá)載體是穩(wěn)定的。
2.IL-3的高表達(dá)IL-3以EcoRI部分酶切，再經(jīng)BamHI完全酶切，將IL-3完整cDNA自pBV220-IL-3中切出，以EcoRI-BamHI克隆入經(jīng)EcoRI-BamHI酶切的pEC34表達(dá)載體中得表達(dá)質(zhì)粒pEC34-IL-3。
與重組表達(dá)質(zhì)粒pEC34-IFN一樣，重組表達(dá)質(zhì)粒pEC34-IL-3的宿主菌也是TAP106.按上述方法進(jìn)行誘導(dǎo)及電泳，與未誘導(dǎo)的培養(yǎng)物對比，誘導(dǎo)后在15.2KD處有一條新的蛋白帶，經(jīng)島津自動光密度掃描儀掃描，結(jié)果示表達(dá)量占菌體總蛋白的23％。
3.入BMP-3的高表達(dá)將人BMP-3 C端215氨基酸cDNA片段以Nco I-Hind III雙酶切，分別與經(jīng)過相同酶切的表達(dá)載體pGC34(pGC34啟動子是Ptac，其第一順反子是已高表達(dá)的gst基因部分序列，其合適的宿主菌為JM109)和pEC34相連接，構(gòu)建得表達(dá)質(zhì)粒pGC-BMP和pEC-BMP。前者以IPTG誘導(dǎo)3小時，后者42℃溫度誘導(dǎo)5小時，行SDS-PAGE，與未誘導(dǎo)菌株對比，在25KD處有一條新的蛋白帶，光密度掃描示蛋白帶分別占菌體總蛋白的18.5％和35％。表達(dá)蛋白以包涵體形式存在。用我室摸索出的一套簡便易行的包涵體純化、變性、復(fù)性方法，將初步純化的重組人BMP-3 C端肽植入小鼠肌肉中，結(jié)果發(fā)現(xiàn)具有很強(qiáng)的誘骨活性，其最小誘骨量為0.2mg。在大腸桿菌中表達(dá)具有誘骨活性的人BMP-3，這在世界上尚屬首次。
權(quán)利要求
1 以era或gst為第一順反子的原核雙順反子表達(dá)載體，其特征在于此表達(dá)載體采用了雙順反子形式，以高表達(dá)的ora或gst基因作為第一順反子；表達(dá)載體的啟動子為PL或Ptac；表達(dá)載體含有“原核翻譯增強(qiáng)子”序列。
2 根據(jù)權(quán)利要求1所述的表達(dá)載體，其特征在于第一順反子分別是高表達(dá)的era(E.coli ras-like protein 基因)部分序列、gst(Glutathione S-transferase 基因)全序列和截短的gst序列。
3 根據(jù)權(quán)利要求1和2所述的表達(dá)載體，其特征在于引入了“原核翻譯增強(qiáng)子”序列(enhanccr of protein sys thesis initiation)，“原核翻譯增強(qiáng)子”處于第一順反子和第二順反子(即日的基因)之間的位置。從而構(gòu)成雙順反子-“原核翻譯增強(qiáng)子”表達(dá)載體。
4 根據(jù)權(quán)利要求1所述的表達(dá)載體，其特征在于，此表達(dá)載體具有如下特殊結(jié)構(gòu)
5 根據(jù)權(quán)利要求4所述的表達(dá)載體，其特征在于此表達(dá)載體表達(dá)的是非融合蛋白，特別適合用作工程菌進(jìn)行生產(chǎn)。
全文摘要
以era或gst為第一順反子的原核雙順反子表達(dá)載體，涉及在基因工程領(lǐng)域中以大腸桿菌為宿主菌的原核雙順反子表達(dá)載體的構(gòu)建，其目的是提供以era或gst基因為第一順反子的原核雙順反子表達(dá)載體，為基因工程生產(chǎn)有活性的重組蛋白以及表達(dá)調(diào)控的研究提供前提條件。所述表達(dá)載體主要采用雙順反子形式，以高表達(dá)的era或gst基因合理的翻譯起始區(qū)作為第一順反子；以P
文檔編號C12N15/70GK1165190SQ96118680
公開日1997年11月19日 申請日期1996年5月10日 優(yōu)先權(quán)日1996年5月10日
發(fā)明者陳蘇民, 趙忠良, 陳南春, 柴玉波, 薄勤, 劉新平 申請人:中國人民解放軍第四軍醫(yī)大學(xué)