專利名稱：一種水生雙順反子病毒的rt-pcr檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于病毒檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種水生雙順反子病毒(Aquatic dicistrovirus, AQDV)的 RT-PCR 檢測方法。

發(fā)明內(nèi)容
水生雙順反子病毒(Aquatic dicistrovirus, AQDV)是水生甲殼動物的重要病原，屬于雙順反子病毒科，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)三個未定種，包括造成對蝦套拉綜合癥的套拉綜合癥病毒(Taura syndrome virus, TSV)、造成鋸緣青蟹“嗜睡癥”的鋸緣青蟹雙順反子病毒 (Mud crab dicistrovirus，MCDV)和造成羅氏沼蝦幼體綜合癥的羅氏沼蝦雙順反子病毒 (Macrobrachium rosenbergii dicistrovirus，MRDV)。而對蝦、青蟹和羅氏沼蝦都是我國甲殼類動物主要養(yǎng)殖品種，其中羅氏沼蝦養(yǎng)殖產(chǎn)量于2008年已成為全球第一。然而在以上三種病毒的困擾下，對蝦死亡率達90%以上，青蟹死亡率達80%以上，羅氏沼蝦死亡率達80% 以上，這給我國對蝦、青蟹和羅氏沼蝦育苗及養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失。以上三種病毒除了 TSV的易感宿主已比較明確外，MCDV和MRDV的敏感宿主還未進行研究，這就給疾病的預(yù)防，病原傳播途徑的切斷造成了困難。而在養(yǎng)殖業(yè)中及時監(jiān)測水生雙順反子病毒的發(fā)病情況，尋找有效的預(yù)防和防治方法，是當(dāng)前水生甲殼動物養(yǎng)殖需要解決的主要問題。目前由于缺乏能同時檢測以上三種水生雙順反子病毒的檢測方法，這就給需要同時檢測以上三種病原造成麻煩。本發(fā)明研制的能同時檢測以上三種水生雙順反子病毒的 RT-PCR方法和套式RT-PCR檢測方法，彌補了該技術(shù)領(lǐng)域的缺陷，為以上三種水生雙順反子病毒的同時監(jiān)測提供有力手段。

發(fā)明內(nèi)容
針對現(xiàn)有技術(shù)存在的問題，本發(fā)明的目的在于設(shè)計提供一種水生雙順反子病毒的 RT-PCR檢測方法的技術(shù)方案，該方法能同時檢測桃拉綜合癥病毒、鋸緣青蟹雙順反子病毒和羅氏沼蝦雙順反子病毒基因組。該方法直觀優(yōu)越、敏感性好、特異性高，對檢測微量、保存時間久的標(biāo)本中水生雙順反子病毒基因組的效果良好，可用于水生雙順反子病毒感染的實驗室檢測和水生雙順反子病毒的分子流行病學(xué)調(diào)查。所述的一種水生雙順反子病毒的RT-PCR檢測方法，其特征在于包括以下步驟 1)用水生雙順反子病毒特異性引物PO對待測RNA樣品進行逆轉(zhuǎn)錄得到CDNA第一鏈，cDNA 用水生雙順反子病毒通用引物組P1/P0進行PCR擴增；2)上述得到的擴增產(chǎn)物用電泳鑒定；
所述的水生雙順反子病毒特異性引物PO為5’ -TACTCCACATRCACATATCTTC-3’ ； 所述的水生雙順反子病毒通用引物組P1/P0中上游引物Pl為5’ -GTKTATTCKTATGATTGGWC-3'，下游引物 PO 為 5，-TACTCCACATRCACATATCTTC-3，。所述的一種水生雙順反子病毒的RT-PCR檢測方法，其特征在于所述的步驟1)中逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件為:37 V反應(yīng)60min，9(TC 5min終止反應(yīng)，置冰上冷卻5min，得到cDNA第一鏈。所述的一種水生雙順反子病毒的RT-PCR檢測方法，其特征在于所述的步驟1)中 PCR反應(yīng)條件為95°C預(yù)變性3min，94°C變性40s，50°C復(fù)性40s，72°C延伸1 min，循環(huán)35 次，最后72°C延伸IOmin0所述的一種水生雙順反子病毒的RT-PCR檢測方法，其特征在于所述的步驟1)中當(dāng)待測RNA樣品所含病毒RNA量過低而未檢出時，再以PCR擴增產(chǎn)物為模板，采用水生雙順反子病毒通用引物組P2/P3進行套式PCR ；
所述的水生雙順反子病毒通用引物組P2/P3中上游引物P2為5’ -GRWGATGATGMRGARAATGGT-3'，下游引物 P3 為 5，-RAACCACTCACWMACYTTATC-3'。所述的一種水生雙順反子病毒的RT-PCR檢測方法，其特征在于所述的套式PCR反應(yīng)條件為95°C預(yù)變性3min，94°C變性40s, 52°C復(fù)性40s，72°C延伸1 min，循環(huán)35次，最后 72°C延伸 IOmin0本發(fā)明中所設(shè)計的兩對水生雙順反子病毒通用引物，是GenBank中獲得Taura syndrome virus isolate ZHZC3TSV, Taura syndrome virus isolate Th04Lv> Taura syndrome virus from USA、Mud crab dicistrovirus 共 3 株桃拉綜合癥病毒(Taura syndrome virus, TSV)、1 株鋸緣青蟹雙順反子病毒(Mud crab dicistrovirus, MCDV) 的基因組序列，禾口羅氏沼蟲下雙順反子病毒(ifecro^racAi腫rosenbergiidicistrovirus, MRDV)的基因組全序列。輸入ClustalX2. 1軟件進行排列，尋找核苷酸序列保守區(qū)域作為引物設(shè)計區(qū)，設(shè)計對三種病毒通用的引物(見表1)。國內(nèi)外尚未見此水生動物源雙順反子病毒通用引物設(shè)計的研究報道。
表1水生動物源雙順反子病毒引物設(shè)計
引物序列(5，一3，)極性退火Sl度 CO目的片段長度POTACTCCACATRCACATATCTTC—PlGTKTATTCKTATGATTGGWC+50634P2GRWGATGATGiRGARMTGGT+P3RAACCACTCACW1ACYTTATCI52297 I
為保證各種株型的水生雙順反子病毒RNA都能有效地逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，本發(fā)明選用了水生雙順反子病毒特異性引物PO為共同逆轉(zhuǎn)錄引物，PU P2和P3引物的設(shè)計參照水生雙順反子病毒中僅有3個種的病毒核酸序列比對后的保守區(qū)。為了增強引物的特異性，在保守區(qū)篩選引物的基礎(chǔ)上，應(yīng)用了簡并引物，這樣可以用一對簡并引物擴增所有3種不同雙順反子病毒。同時考慮到目的基因序列越長，其擴增的敏感性越低，故引物設(shè)計時選擇了擴增短片段的引物，以增加水生雙順反子病毒RNA檢測的陽性率。 為了能進一步增加本法檢測水生雙順反子病毒RNA的敏感性，以用于病毒低拷貝樣本的檢出率，引物組P0/P1和P2/P3可以用于套式PCR反應(yīng)，在用引物組P0/P1檢測陰性的情況下，再利用引物組P2/P3對引物組P0/P1擴增產(chǎn)物進行二次PCR，這樣可以顯著提高低拷貝樣品的檢出率，防止假陰性。
由于雙順反子病毒RNA極易因為長時間保存環(huán)境中RNA酶的存在而發(fā)生降解，導(dǎo)致樣本中的雙順反子病毒RNA含量少，因此在提取RNA試劑的選擇上，選用了專門從樣本中提取總RNA的提取試劑盒OiIAGEN公司的RNeasy Plus Kit)，該試劑盒通過gDNA去除柱有效地去除基因組DNA，并基于離子吸附原理可有效地提取樣本中的總RNA，去蛋白質(zhì)污染， 同時又因具備無需低溫操作、離心時間短等優(yōu)點可盡量減少RNA降解和破壞，得到高品質(zhì)的RNA樣品。另外，本發(fā)明選用了針對低拷貝樣本中RNA含量少，進行逆轉(zhuǎn)錄Wknsiscript 逆轉(zhuǎn)錄酶，該酶能將少于50ng的總RNA高效逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，可達到單細(xì)胞cDNA合成靈敏度，且具有RNase H活性，能降解RNA:DNA雜合子中的RNA，為PCR反應(yīng)提供純品的cDNA模板。本發(fā)明中引物PO序列如SEQ ID NO: 1所示，引物Pl序列如SEQ ID N0:2所示，引物P2序列如SEQ ID NO: 3所示，引物P3序列如SEQ ID NO: 4所示，羅氏沼蝦雙順反子病毒序列如SEQ ID NO:5所示。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有下列優(yōu)點
1、本發(fā)明中所設(shè)計的兩對水生雙順反子病毒通用引物針對水生雙順反子病毒保守序列設(shè)計，可擴增出已發(fā)現(xiàn)的任何一種水生動物源雙順反子病毒，陽性檢出率高，適用于臨床檢測未知種的水生雙順反子病毒樣本。2、本發(fā)明中所設(shè)計的兩對水生動物源雙順反子病毒通用引物可以用于套式PCR， 靈敏度相當(dāng)于普通PCR的IO3倍，減少了水生雙順反子病毒檢測假陰性的可能。3、本發(fā)明中所設(shè)計的水生雙順反子病毒通用引物PI、P2和P3采用了簡并引物的設(shè)計方法，增加了檢測水生雙順反子病毒的廣譜性，減少了假陰性的可能，大大提高了水生雙順反子病毒的陽性檢出率。4、本發(fā)明中所確立的水生雙順反子病毒基因組檢測方法，選用了專門針對微量 RNA的RNA提取試劑盒和knsiscript逆轉(zhuǎn)錄酶，對低拷貝病毒樣本、保存條件較差的水生雙順反子病毒RNA亦有良好的檢測效果，對凍融次數(shù)多達20次的帶毒樣本依然具有100% 的檢出率，可用于臨床、實驗室檢測以及流行病學(xué)研究。


圖1為本發(fā)明檢測水生雙順反子病毒基因組的特異性對照圖； 圖2為本發(fā)明檢測水生雙順反子病毒基因組的敏感性對照圖3為本發(fā)明用于水生雙順反子病毒反復(fù)凍融組織樣本的擴增圖。圖 1 中 M =DLlOOO DNA Marker ；1 =MRDV ；2 =TSV ；3 =MCDV ；4 =MRNV ；5 =WSSV ；6 GCRV ； 7 :ddH20 對照。圖 2 中 M =DLlOOO DNA Marker ； 1-8 =MRDV RNA 自 0. 27ug 開始 10 倍稀釋后擴增； 9-12 5-8中第一輪PCR產(chǎn)物再進行套式PCR擴增；13 :ddH20對照。圖3 中 M =DLlOOO DNA Marker ； 1-8 分別凍融 8，12，16，…，36 次的樣品。
具體實施例方式以下結(jié)合實施例來進一步說明本發(fā)明。實施例1 RT-PCR方法檢測水生雙順反子病毒陽性模板的基因組RNAA、合成兩對水生雙順反子病毒通用引物，交由南京金斯瑞生物科技有限公司進行 A =AQDV P1/P0，上游引物 Pl 為 5，- GTKTATTCKTATGATTGGffC-3'，
下游引物 PO 為 5’ - TACTCCACATRCACATATCTTC-3，； B: AQDV P2/P3，上游引物 P2 為 5，- GRWGATGATGMRGARAATGGT-3'， 下游引物 P3 為 5，- RAACCACTCACWMACYTTATC-3'。B、水生雙順反子病毒基因組檢測方法 1、陽性模板的制備
稱取病毒陽性羅氏沼蝦幼體，用總RNA提取試劑盒OiIAGEN公司的RNeasy Plus Kit) 提取樣本總RNA作為陽性模板。同時設(shè)置陰性對照(正常無病毒羅氏沼蝦幼體)。2、RNA的純度和濃度
分別測量RNA標(biāo)本在260nm和280nm波長下的光密度值0D260和0擬80，通過計算 0擬60/0擬80，確定RNA純度，結(jié)果顯示所有RNA標(biāo)本0擬60/0D280 ^ 1. 9，表明RNA純度較高，無DNA和蛋白質(zhì)污染；同時讀取并記錄各個RNA樣本濃度，取50ng進行RT-PCR反應(yīng)。3、RT-PCR 反應(yīng)
在DEPC (焦碳酸二乙酯)處理的PCR管中分別加入50ng模板RNA，200U Sensiscript 逆轉(zhuǎn)錄酶 ^liagen 公司產(chǎn)品)、2 μ 10XRT BuffeHQiagen 公司產(chǎn)品)，1 μ 10mmol/L WdNTP Mix、40U RNasin和10 pmol引物P0，無RNase水補足體積至20μ 。充分混勻，短暫離心收集反應(yīng)液。37°C反應(yīng)lhr，然后90°C 5min終止反應(yīng)，迅速置冰上冷卻，-80°C保存待用，得到cDNA第一鏈。取上述反應(yīng)cDNA產(chǎn)物5 μ ,加入總體積50 μ 的反應(yīng)體系中，其中含 IU Taq DNA 聚合酶(Fermentas)、5μ 10XPCR Buffer,0. 5mmol dNIPs 和通用引物 (AQDV P1/P0)各IOpmol。充分混勻后，放入PCR擴增儀反應(yīng)。循環(huán)反應(yīng)參數(shù)為95°C預(yù)變性 3min，94°C變性40s，50°C復(fù)性40s，72°C延伸lmin，循環(huán)；35次，最后72°C延伸IOmin0整個實驗從RNA提取開始設(shè)置陰性對照和陽性對照。4、瓊脂糖凝膠電泳
取PCR擴增產(chǎn)物在含5 Pg/ml嗅化乙啶(EB)的1. 5%瓊脂糖凝膠上電泳，5V/ cm, 30min后紫外透射反射儀上觀察結(jié)果，目的擴增片段為634bp。5、RT-PCR方法的特異性
結(jié)果顯示TSV、MCDV和MRDV核酸擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，在634bp處出現(xiàn)一條特異性核酸帶；而羅氏沼蝦諾達病毒(MRNV)、白斑綜合癥病毒(WSSV)、草魚呼腸孤病毒 (GCRV)和陰性對照擴增產(chǎn)物電泳后未見特異性核酸帶(見圖1所示)。本發(fā)明所設(shè)計引物經(jīng)DNA STAR I^rimerklect軟件檢測其特異性，結(jié)果顯示上述兩對通用引物(AQDV P1/P0和 AQDV P2/P3)對已知全序列的3株桃拉綜合癥病毒(TSV)、1株青蟹雙順反子病毒(MCDV)和 1株羅氏沼蝦雙順反子病毒(MRDV)的cDNA序列進行擴增時均只產(chǎn)生一個目的片段產(chǎn)物，無非特異性擴增。6、RT-PCR方法的敏感性
將0. Ig陽性樣品提取的總RNA在核酸分析儀上進行定量為0. 27ug，經(jīng)10倍系列稀釋， 本法可檢出的最高稀釋度為10_4，即相當(dāng)于27pg核酸中的病毒RNA;對稀釋度過高，采用引物P1/P0進行RT-PCR反應(yīng)未檢出目的條帶時，再采用P2/P3進行套式PCR，目的擴增片段為 297bPo取采用引物P1/P0進行RT-PCR反應(yīng)的產(chǎn)物1 μ ，加入總體積50 PL的反應(yīng)體系中，其中含 IU Taq DNA 聚合酶(Fermentas)、5μ 10XPCR Buffer,0. 5mmol dNTPs 和通用引物(AQDV P2/P;3)各IOpmol。充分混勻后，放入PCR擴增儀反應(yīng)。循環(huán)反應(yīng)參數(shù)為95°C預(yù)變性3min，94°C變性40s，52°C復(fù)性40s，72°C延伸lmin，循環(huán)35次，最后72°C延伸IOmin0 結(jié)果套式PCR靈敏度比單次PCR高100倍，最高稀釋度可達為10_6 (見圖2所示)。
實施例2: RT-PCR方法檢測反復(fù)凍融樣本中AQDV RNA
取病毒陽性樣本分裝EP管后分別-80°C 30分鐘/室溫30分鐘反復(fù)凍融。對不同凍融次數(shù)的樣品進行RNA提取，通過使用AQDV新型引物(AQDV P1/P0)對每一份提取的核酸標(biāo)本進行分管平行擴增。1、RNA 提取
取反復(fù)凍融樣本0. lg，用總RNA提取試劑盒OiIAGEN公司的RNeasy Plus Kit)，按試劑盒說明提取總RNA。2、RNA的純度和濃度測定
分別測量RNA標(biāo)本在260nm和280nm波長下的光密度值0D260和0擬80，通過計算 0擬60/0擬80，確定RNA純度，結(jié)果顯示所有RNA標(biāo)本0擬60/0D280 ^ 1. 9，表明RNA純度較高，無DNA和蛋白質(zhì)污染；同時讀取并記錄各個RNA樣本濃度，取50ng進行RT-PCR反應(yīng)。3、RT-PCR 反應(yīng)
取 50ng 模板 RNA，加入 200U Sensiscript 逆轉(zhuǎn)錄酶(Qiagen 公司產(chǎn)品)、2 μ 10XRT BuffeHQiagen 公司產(chǎn)品)，1μ 10mmol/L 的 dNTP Mix、40U RNasin 禾Π IOpmol PO 引物，無 RNase水補足體積至20μ 。充分混勻，短暫離心收集反應(yīng)液。37°C反應(yīng)lhr，然后90°C 5min 終止反應(yīng)，迅速置冰上冷卻，-80°C保存待用。取上述反應(yīng)cDNA產(chǎn)物5 μ ,加入總體積50 PL 的反應(yīng)體系中，其中含 IU Taq DNA聚合酶(Fermentas)，5μ 10XPCR Buffer、0. 5mmol dNIPs和特異性引物(AQDV P1/P0)各10 pmoL·充分混勻后，放入PCR擴增儀反應(yīng)。循環(huán)反應(yīng)參數(shù)為95°C預(yù)變性3 min, 94°C變性40s, 50°C復(fù)性40s, 72°C延伸1 min,循環(huán)35次，最后72°C延伸IOmin。整個實驗從RNA提取開始設(shè)置陰性對照和陽性對照。4、瓊脂糖凝膠電泳
取PCR擴增產(chǎn)物在含5 Pg/ml嗅化乙啶(EB)的1. 5%瓊脂糖凝膠上電泳，5V/ cm, 30min后紫外透射反射儀上觀察結(jié)果，目的片段大小為634bp。經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳可見， 反復(fù)凍融20次的樣本采用本法也可檢出(見圖3所示)。
權(quán)利要求
1.一種水生雙順反子病毒的RT-PCR檢測方法，其特征在于包括以下步驟1)用水生雙順反子病毒特異性引物PO對待測RNA樣品進行逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA第一鏈，cDNA用水生雙順反子病毒通用引物組P1/P0進行PCR擴增；2)上述得到的擴增產(chǎn)物用電泳鑒定；所述的水生雙順反子病毒特異性引物PO為5’ -TACTCCACATRCACATATCTTC-3’ ；所述的水生雙順反子病毒通用引物組P1/P0中上游引物Pl為5’ -GTKTATTCKTATGATTGGWC-3'，下游引物 PO 為 5，-TACTCCACATRCACATATCTTC-3，。
2.如權(quán)利要求1所述的一種水生雙順反子病毒的RT-PCR檢測方法，其特征在于所述的步驟1)中逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件為37°C反應(yīng)60min，90°C 5min終止反應(yīng)，置冰上冷卻5min，得到cDNA第一鏈。
3.如權(quán)利要求1所述的一種水生雙順反子病毒的RT-PCR檢測方法，其特征在于所述的步驟1)中PCR反應(yīng)條件為95°C預(yù)變性3min，94°C變性40s，50°C復(fù)性40s，72°C延伸1 min，循環(huán)35次，最后72°C延伸IOmin0
4.如權(quán)利要求1所述的一種水生雙順反子病毒的RT-PCR檢測方法，其特征在于所述的步驟1)中當(dāng)待測RNA樣品所含病毒RNA量過低而未檢出時，再以PCR擴增產(chǎn)物為模板，采用水生雙順反子病毒通用引物組P2/P3進行套式PCR ；所述的水生雙順反子病毒通用引物組P2/P3中上游引物P2為5’ -GRWGATGATGMRGARAATGGT-3'，下游引物 P3 為 5，-RAACCACTCACWMACYTTATC-3'。
5.如權(quán)利要求4所述的一種水生雙順反子病毒的RT-PCR檢測方法，其特征在于所述的套式PCR反應(yīng)條件為95°C預(yù)變性3min，94°C變性40s，52°C復(fù)性40s，72°C延伸1 min，循環(huán)35次，最后72°C延伸IOmin0
全文摘要
一種水生雙順反子病毒的RT-PCR檢測方法，屬于病毒檢測技術(shù)領(lǐng)域。其包括以下步驟1)用水生雙順反子病毒特異性引物P0對待測RNA樣品進行逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA第一鏈，cDNA用水生雙順反子病毒通用引物組P1/P0進行PCR擴增；2)上述得到的擴增產(chǎn)物用電泳鑒定；并且本發(fā)明設(shè)計了特異性引物P0、通用引物組P1/P0和通用引物組P2/P3。本發(fā)明能同時檢測桃拉綜合癥病毒、鋸緣青蟹雙順反子病毒和羅氏沼蝦雙順反子病毒基因組。本發(fā)明直觀優(yōu)越、敏感性好、特異性高，對檢測微量、保存時間久的標(biāo)本中水生雙順反子病毒基因組的效果良好，可用于水生雙順反子病毒感染的實驗室檢測和水生雙順反子病毒的分子流行病學(xué)調(diào)查。
文檔編號C12Q1/68GK102329896SQ20111031572
公開日2012年1月25日 申請日期2011年10月18日 優(yōu)先權(quán)日2011年10月18日
發(fā)明者姚嘉赟, 尹文林, 徐洋, 沈錦玉, 潘曉藝, 藺凌云, 袁雪梅, 郝貴杰 申請人:浙江省淡水水產(chǎn)研究所