專利名稱：利用木薯淀粉為原料生產(chǎn)異丁醇的重組菌株及其構(gòu)建方法和應(yīng)用的制作方法
利用木薯淀粉為原料生產(chǎn)異丁醇的重組菌株及其構(gòu)建方法和應(yīng)用技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域，特別是一種利用木薯淀粉為原料生產(chǎn)異丁醇的重組菌株及其構(gòu)建方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
異丁醇甲基丙醇)可用于生產(chǎn)石油添加劑、抗氧劑、油漆溶劑、增塑劑、合成橡膠、合成藥物，也是工業(yè)上重要的高級溶劑，是生產(chǎn)涂料、清漆的重要配料。
異丁醇具有易于生物降解，沒有生物蓄積作用，不會直接毒害魚類、兩棲動物、甲殼類和藻類的特性。因此，異丁醇作為重要的工業(yè)原料，它的生產(chǎn)受到了重視。
目前工業(yè)上大規(guī)模生產(chǎn)異丁醇是采用化學(xué)合成的方法。異丁醇是在用丙烯羰基合成生產(chǎn)丁 /辛醇工藝過程中產(chǎn)生的丙烯羰基合成反應(yīng)，粗醛精制得到正丁醛和異丁醛，正丁醛和異丁醛加氫得到產(chǎn)品正丁醇和異丁醇，正丁醛經(jīng)縮合、加氫得到產(chǎn)品辛醇。異丁醇其實(shí)是丁/辛醇生產(chǎn)過程的副產(chǎn)品。
由于丙烯羰基合成醇的生產(chǎn)能力有限，隨著化學(xué)品合成市場的轉(zhuǎn)變，國際上主要丁 /辛醇生產(chǎn)商，如美國伊斯曼化學(xué)、陶氏化學(xué)、塞拉尼斯公司等紛紛宣布提價(jià)，使異丁醇價(jià)格進(jìn)一步上漲。因此，尋找替代丙烯羰基化學(xué)合成方法生產(chǎn)異丁醇成為具有重要前途的工業(yè)技術(shù)。
在微生物發(fā)酵生產(chǎn)醇類化合物中，乙醇是通過酵母發(fā)酵的方法生產(chǎn)，正丁醇是通過梭菌的ABE發(fā)酵的方法生產(chǎn)。而異丁醇不同于正丁醇，它的羥基在第二位碳原子上面，在梭菌的ABE發(fā)酵中不產(chǎn)生異丁醇。在自然界中也沒有微生物天然大量產(chǎn)生異丁醇。
因此，針對異丁醇生物發(fā)酵的問題，只有利用途徑工程的方法改造微生物，以獲得新型的發(fā)酵菌株來生產(chǎn)異丁醇。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是提供一種利用木薯淀粉為原料生產(chǎn)異丁醇的重組菌株及其構(gòu)建方法和應(yīng)用，通過改造大腸桿菌的代謝途徑，獲得直接利用木薯淀粉發(fā)酵生產(chǎn)異丁醇的菌株，這個(gè)改造的菌株可以用于工業(yè)上以木薯為原料生產(chǎn)異丁醇。
本發(fā)明通過以下技術(shù)方案達(dá)到上述目的
一種利用木薯淀粉為原料生產(chǎn)異丁醇的重組菌株hcherichia coli gxas-AIKA, 該重組菌株的保藏單位為中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號為CCTCC M 2011281.
一種質(zhì)粒pSTM9-AIIK，它含有alsS、ilvC、ilvD和kdcA基因，這四個(gè)基因分別是來自枯草桿菌的乙酰乳酸合成酶基因、來自大腸桿菌的乙酰羥酸還原異構(gòu)酶基因和二羥酸脫水酶基因、來自乳脂乳球菌的酮酸脫羧酶基因。
一種質(zhì)粒pSE380-AMY，它含有amy基因，這個(gè)基因是地衣芽孢桿菌Bacillus Iicheniformis的淀粉酶基因。
質(zhì)粒pSTV29-AIIK和pSE380_AMY共同在大腸桿菌菌株中表達(dá)。
含有質(zhì)粒pSTM9-AIIK和pSE380_AMY的大腸桿菌菌株gxas_AIKA在以木薯淀粉為唯一碳源的培養(yǎng)基上進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)異丁醇，具體方法為將gxas-AIKA菌株接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，在37°C、250r/min條件下培養(yǎng)，待長至0D_為0. 4-0. 6時(shí)加入終濃度lmmol/L的 IPTG，并繼續(xù)培養(yǎng)M小時(shí)，得到含有異丁醇的發(fā)酵液，異丁醇含量為3克/升。
本發(fā)明突出的實(shí)質(zhì)性特點(diǎn)和顯著進(jìn)步是提供了一種直接發(fā)酵木薯淀粉生產(chǎn)異丁醇的方法。木薯淀粉不需預(yù)先加入淀粉酶進(jìn)行糖化處理，可以直接被本發(fā)明所構(gòu)建的菌株發(fā)酵生成異丁醇。


圖1是本發(fā)明所述重組菌株的發(fā)酵液異丁醇?xì)庀鄿y定圖。
2. 801分鐘為異丁醇，2. 872分鐘為內(nèi)標(biāo)正丁醇。
具體實(shí)施方式
以下通過實(shí)施例對本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)一步描述。
實(shí)施例1
本發(fā)明所述利用木薯淀粉為原料生產(chǎn)異丁醇的重組菌株的構(gòu)建方法，包括如下步驟
1、質(zhì)粒 pSTV29-AIIK 的構(gòu)建
1. 1基因擴(kuò)增
提取枯草芽孢桿菌的總DNA為模板，用上游引物 GCCTGCGCATGCCACAAAAGCAACAAAAGA,下游引物ACGCAGTCGACCTAGAGAGCTTTCG，PCR 擴(kuò)增 alsS基因；提取大腸桿菌的總DNA為模板，用上游引物ACGCAGTCGACAGGAAACAGACCATGGCTA ACTACTTCAAT，下游引物CGGGATCCTTAACCCGCAACAGCAATAC，擴(kuò)增 i 1 vC 基因，用上游引物CG GGATCCAGGAGATATACCATGCCTAAGTACCGTTC,下游弓丨物GCCGAGCTCTTAACCCCCCAGTTTCGATTTAT C，PCR擴(kuò)增ilvD基因；提取乳脂乳球菌NIZO B1157的總DNA為模板，用上游引物GCGAGCT CAGGAAACAGCTATGTATACAGTAGGAG，下游引物GCCGAGCTCCTATTTATTTTGCTCAG，PCR 擴(kuò)增 kdcA 基因。
L2PCR擴(kuò)增條件
反應(yīng)條件94°C2min，94°C 30s，54°C t1min,72°C t2min，30 個(gè)循環(huán)；72°C lOmin。引物 1-4 的退火時(shí)間 ti 和延伸時(shí)間 t2 分別是 53°C、1. 5min，58°C、l. 5min，62°C、2min，59°C、 1. 5min。
1. 3PCR產(chǎn)物的酶切和連接
先將Ml I、BamHI雙酶切的iIvC片段、BamHIjacI雙酶切的iIvD片段與用Mil、 SacI雙酶切的pSTM9質(zhì)粒，質(zhì)粒購買自大連寶生物公司，進(jìn)行三片段連接，構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒 pSTM9-ilvC-ilvD。再將SphI、Sail雙酶切的alsS片段與用SphI、Sail雙酶切的質(zhì)粒 pSTV29-ilvC-ilvD進(jìn)行連接，構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒pSTM9-alsS-ilvC-ilvD。最后將&icl酶切的kdcA片段與經(jīng)Mel酶切的質(zhì)粒pSTV29-alsS-ilVC-ilVD進(jìn)行平端連接，構(gòu)建表達(dá)載體 pSTV29-alsS-i1vC-i1vD-kdcA。
2、質(zhì)粒 pSE380-AMY 的構(gòu)建
2. 1淀粉酶基因AMY的擴(kuò)增。
提取地衣芽孢桿菌的總DNA作為模板，用上游引物5’-CGAGCCCATGGCTAAACAACAAA AACG-3，，含有 NcoI 酶切位點(diǎn)，和下游引物 5，-GTACCCATGGTCTGTTTCCTCTATCTTTGAACATAAAT TGAAACCG-3’，含有NcoI酶切位點(diǎn)，進(jìn)行PCR擴(kuò)增AMY基因。
2.2PCR 擴(kuò)增條件
反應(yīng)條件94°C3min，94°C 30s，48°C 30s，72°C 1. 5min，30 個(gè)循環(huán)；72°C IOmin0
2. 3PCR產(chǎn)物的酶切和連接
將AMY片段用NcoI酶切，然后與用同樣酶切的pSE380質(zhì)粒連接。構(gòu)建pSE380_AMY 質(zhì)粒。
3、質(zhì)粒 pSTM9-AI IK 和 pSE380_AMY 的共表達(dá)
制備大腸桿菌BW25113的CaCl2感受態(tài)細(xì)胞，先把質(zhì)粒pSTM9_AIIK轉(zhuǎn)化入 BW25113菌株。然后把含有pSTW9-AIIK質(zhì)粒的BW25113菌株再制備成CaCl2感受態(tài)，把 PSE380-AMY質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入，雙質(zhì)粒轉(zhuǎn)化菌株gxas-ΑΙΚΑ保存在平板中。
實(shí)施例2
本實(shí)施例為本發(fā)明所述利用木薯淀粉為原料生產(chǎn)異丁醇的重組菌株的發(fā)酵實(shí)例。
將含有pSTM9-AIIK和pSE380_AMY雙質(zhì)粒的重組菌株接種到LB培養(yǎng)基，所述LB 培養(yǎng)基成分及含量(g/L)為胰蛋白胨10，酵母提取物5，氯化鈉10。將過夜培養(yǎng)的種子液按5%接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，于37°C溫度下，250r/min培養(yǎng)，待長至OD6tltl為0. 4-0. 6 時(shí)加入終濃度lmmol/L的IPTG誘導(dǎo)，在37°C溫度下，250r/min發(fā)酵Mh。發(fā)酵產(chǎn)物中加入等體積的正丁醇作為內(nèi)標(biāo)進(jìn)行氣相色譜測定，通過和內(nèi)標(biāo)的比較測定發(fā)酵液中異丁醇的量。從圖1的發(fā)酵產(chǎn)物氣相色譜圖中測算異丁醇的發(fā)酵產(chǎn)量為3克/升。所述發(fā)酵培養(yǎng)基成分及含量(g/L)為木薯粉50，酵母粉0. 5。
異丁醇產(chǎn)量測定
儀器為Agilent6890氣相色譜儀。色譜條件phenomen觀-WAXplus色譜柱； FID(220°C )檢測器；進(jìn)樣口壓力為16. 92psi ；柱箱溫度為100°C;氫氣流量為30mL/min ；進(jìn)樣量0. 2uL。
內(nèi)標(biāo)正丁醇。
權(quán)利要求
1.一種利用木薯淀粉為原料生產(chǎn)異丁醇的重組菌株gxas-AIKA，其特征在于，該重組菌株的保藏單位為中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號為CCTCC M 2011281.
2.權(quán)利要求1所述的利用木薯淀粉為原料生產(chǎn)異丁醇的重組菌株的構(gòu)建方法，包括以下步驟1)把來自枯草桿菌的乙酰乳酸合成酶基因、來自大腸桿菌的乙酰羥酸還原異構(gòu)酶基因和二羥酸脫水酶基因、來自乳脂乳球菌的酮酸脫羧酶基因插入載體質(zhì)粒中，構(gòu)建重組質(zhì)粒 PSTV29-AIIK。2)把來自地衣芽孢桿菌的淀粉酶基因插入載體質(zhì)粒中，構(gòu)建重組質(zhì)粒PSE380-AMY。3)把重組質(zhì)粒pSTM9-AIIK和重組質(zhì)粒pSE380-AMY共同轉(zhuǎn)化宿主菌，構(gòu)建重組菌株 gxas—AIKA。
3.權(quán)利要求1所述的利用木薯淀粉為原料生產(chǎn)異丁醇的重組菌株，其特征在于所述重組菌株為大腸桿菌菌株。
4.權(quán)利要求1所述的利用木薯淀粉為原料生產(chǎn)異丁醇的重組菌株的應(yīng)用，其特征在于是以木薯淀粉為原料利用所述重組菌株進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，并在發(fā)酵液中產(chǎn)生異丁醇。
全文摘要
一種利用木薯淀粉為原料生產(chǎn)異丁醇的重組菌株，該重組菌株是通過在宿主中表達(dá)來自地衣芽孢桿菌的淀粉酶基因、來自枯草桿菌的乙酰乳酸合成酶基因、來自大腸桿菌的乙酰羥酸還原異構(gòu)酶基因和二羥酸脫水酶基因、來自乳脂乳球菌的酮酸脫羧酶基因獲得的重組菌株，利用該菌株可以直接將木薯淀粉轉(zhuǎn)化生產(chǎn)異丁醇。
文檔編號C12P7/16GK102533625SQ20111031539
公開日2012年7月4日 申請日期2011年10月17日 優(yōu)先權(quán)日2011年10月17日
發(fā)明者龐浩, 林麗華, 郭媛, 陳燕, 黃日波 申請人:廣西科學(xué)院