專利名稱：輪蟲雄體整體熒光染色與精子體外觀察方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生殖生物學(xué)和生態(tài)學(xué)環(huán)境檢(監(jiān))測領(lǐng)域，具體是涉及輪蟲精子活體熒光染色與精子離體觀察方法。
背景技術(shù)：
輪蟲(rotifer)是淡水生態(tài)系統(tǒng)主要功能群，90%以上魚類早期開口生物餌料，也是環(huán)境污染和環(huán)境風(fēng)險評價受試動物。輪蟲有性生殖只在環(huán)境脅迫下出現(xiàn)，雄體的精子活力作為環(huán)境激素風(fēng)險評價具有重要理論和實際應(yīng)用價值。但是雄體大小只有30微米左右 (圖1)，精子在離體狀態(tài)下僅僅能存活30-40秒種。無法在離體狀態(tài)下識別精子，為其形態(tài)研究帶來困難。本發(fā)明具有所需設(shè)備簡單、操作簡便，易于的特點。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種輪蟲精子活體熒光染色與精子離體觀察方法。所提供方法包括輪蟲品系和雄體獲得、特異性染色和觀察操作等內(nèi)容。本發(fā)明所述輪蟲雄體整體熒光染色與精子體外觀察方法，包括以下步驟
(1)雄體輪蟲收集；
(2)精巢和精子活體熒光染色SYBR14預(yù)先稀釋50倍備用；取1.5mL離心管，加入ImL 輪蟲培養(yǎng)液，移入雄輪蟲20個，加入SYBR14稀釋液染色10分鐘、再加PI液5μ 染色 10分鐘后整體觀察；
(3)整體壓片觀察每次用ImL微吸管，吸取1個雄體，置于載玻片上，裝片、整體觀察。 在距離樣本0. 5cm處置一蓋玻片作為支撐，再在樣本上方蓋上蓋玻片；把樣本置于熒光顯微鏡下，在蓋玻片上加少許香柏油，在紫外光下精巢包被在體腔內(nèi)，發(fā)射綠色熒光；抽出支撐蓋玻片，輪蟲精子從足末端的生殖孔釋放出體外，30秒鐘后停止游動，在10X40放大倍數(shù)下直接觀察到精子的形態(tài)結(jié)構(gòu)。本發(fā)明方法中輪蟲雄性個體通過以下方法獲得水體撈取樣本，在體式顯微鏡下挑取攜帶非混交卵個體，從其孵化幼體中挑選1個，單獨培養(yǎng)，獲得純品系；投喂餌料微藻， 恒溫連續(xù)關(guān)照培養(yǎng)、用35微米篩絹過濾獲取。本發(fā)明中使用培養(yǎng)基均為常用培養(yǎng)基，其中輪蟲通用培養(yǎng)基為輪蟲人工配置培養(yǎng)基，每升含有 NaHCO3 96mg、CaSO4. 2H20 60mg、MgSO4. 7H20 123mg、KCl 4mg。根據(jù)需要利用HCl和NaOH調(diào)節(jié)pH值7. 5左右。餌料微藻采用BBM培養(yǎng)基，每升含有NaNO3 250mg, CaCl2. 2H20 MgSO4. 7H20 75mg, K2HPO4 75 mg, KH2PO4 175mg，NaCl 25 微量元素和維生素各2mL。光照采用20-40W日光燈，光照時間24小時，溫度控制在25_30°C，每日搖動若干次或者利用旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)裝置轉(zhuǎn)速10-15轉(zhuǎn)/分鐘。本發(fā)明的原理為精子對特異性染色的反應(yīng)標(biāo)記精子顏色，借助蓋玻片的微小壓力促使輪蟲精子釋放到體外，進行活體精子形態(tài)顯微觀察。
該方法操作簡便，快速，經(jīng)濟，便于應(yīng)用。


圖 1是輪蟲雄體示意圖。圖2是顯微鏡下壓片后精巢顯色與體外精子釋放。圖3是顯微鏡下壓片結(jié)束體外精子形態(tài)。1-精子，2-精巢。
具體實施例方式在本發(fā)明中所使用的術(shù)語，除非有另外說明，一般具有本領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常理解的含義。下面結(jié)合具體實施例，并參照數(shù)據(jù)進一步詳細(xì)地描述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例只是為了舉例說明本發(fā)明，而非以任何方式限制本發(fā)明的范圍。在以下的實施例中，未詳細(xì)描述的各種過程和方法是本領(lǐng)域中公知的常規(guī)方法。 所用試劑的來源、商品名以及有必要列出其組成成分者，均在首次出現(xiàn)時標(biāo)明，其后所用相同試劑如無特殊說明，均以首次標(biāo)明的內(nèi)容相同。實施例中所說的輪蟲是從養(yǎng)殖水體挑選的單個體，室內(nèi)“克隆”培養(yǎng)分離培養(yǎng)獲得。實施例1 輪蟲雄體獲取 (1)輪蟲培養(yǎng)
利用13號浮游物網(wǎng)從養(yǎng)殖池塘表層撈取活體樣本200mL。帶回實驗室。挑選1個攜帶非混交雌體，移入微孔細(xì)胞培養(yǎng)板中。微孔加入微綠球藻濃度3X 106ind/mL的輪蟲混合懸液。在20-40W日光燈下連續(xù)光照培養(yǎng)、溫度25-28° C、連續(xù)充氣培養(yǎng)。2天后挑選50個攜帶非混交卵的個體移入IOOmL微綠球藻濃度3X 106ind/mL的輪蟲培養(yǎng)懸液。(2)雄體獲取
上述培養(yǎng)持續(xù)7天，用35ΜΠ1孔徑篩絹過濾。保留濾液，濃縮濾液獲得雄體。實施例2 :分子探針儲備液制備
取碘化丙啶的SYBR 14，用二甲基亞砜稀釋50倍，制備稀釋液備用。實施例3 輪蟲雄體整體染色
1. 5mL Eppendort離心管，加入ImL的輪蟲培養(yǎng)液。用1. 5mL微吸管移入20個雄體。 加入SYBR14稀釋液，室溫下染色10分鐘，再加入5μ PI復(fù)染10分鐘。實施例4 整體壓片制備
每次用ImL微吸管，吸取1個雄體，置于載玻片上，在距離樣本0. 5cm處置一蓋玻片作為支撐物，再在樣本上方蓋上蓋玻片。實施例5 精子離體觀察
把樣本置于熒光顯微鏡下，在蓋玻片上加少許香柏油，在紫外光下精巢2包被在體腔內(nèi)，發(fā)射綠色熒光(圖2)。抽出支撐玻片，精子1從足末端生殖孔釋放出體外，30秒鐘后停止游動?？稍?0X40放大倍數(shù)下直接觀察到精子1的形態(tài)結(jié)構(gòu)(圖3)。
權(quán)利要求
1.一種輪蟲雄體整體熒光染色與精子體外觀察方法，其特征在于包括以下步驟(1)雄體輪蟲收集；(2)精巢和精子活體熒光染色SYBR14預(yù)先稀釋50倍備用；取1.5mL離心管，加入ImL 輪蟲培養(yǎng)液，移入雄輪蟲20個，加入SYBR14稀釋液染色10分鐘、再加PI液5μ 染色 10分鐘后整體觀察；(3)整體壓片觀察每次用ImL微吸管，吸取1個雄體，置于載玻片上，在距離樣本 0. 5cm處置一蓋玻片作為支撐，再在樣本上方蓋上蓋玻片；把樣本置于熒光顯微鏡下，在蓋玻片上加少許香柏油，在紫外光下精巢包被在體腔內(nèi)，發(fā)射綠色熒光；抽出支撐玻片，精子從足末端，釋放出體外，30秒鐘后停止游動，在10X40放大倍數(shù)下直接觀察精子的形態(tài)結(jié)構(gòu)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，輪蟲雄體通過以下方法獲得水體撈取樣本，在體式顯微鏡下挑取攜帶非混交卵個體，從其孵化幼體中挑選1個，單獨培養(yǎng)，獲得純品系；投喂餌料微藻，恒溫連續(xù)關(guān)照培養(yǎng)、用35微米篩絹過濾獲取。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于輪蟲培養(yǎng)液為人工配制的培養(yǎng)液；藻類培養(yǎng)液為BBM培養(yǎng)基。
全文摘要
本發(fā)明涉及輪蟲雄體整體熒光染色與精子體外觀察方法。該方法包括雄體輪蟲收集、精巢和精子活體熒光染色和整體壓片觀察的步驟。本發(fā)明根據(jù)精子對特異性染色的反應(yīng)標(biāo)記精子顏色，借助蓋玻片的微小壓力促使輪蟲精子釋放到體外，進行活體精子形態(tài)顯微觀察；具有操作簡便，快速，經(jīng)濟，便于應(yīng)用的優(yōu)點。
文檔編號C12Q1/02GK102433371SQ201110315588
公開日2012年5月2日 申請日期2011年10月18日 優(yōu)先權(quán)日2011年10月18日
發(fā)明者楊家新 申請人:南京師范大學(xué)