專利名稱：重組△9脫氫酶以及編碼該酶的基因的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及能將連接到甘油脂上的一種飽和脂肪酸，硬脂酸轉(zhuǎn)化為一種不飽和脂肪酸，油酸的重組△9脫氫酶，以及涉及編碼該酶的離體基因。
藍(lán)藻細(xì)菌的△9脫氫酶是一種將連接到甘油脂上的硬脂酸轉(zhuǎn)化為油酸，以及將連接到甘油的C-1上的軟脂酸轉(zhuǎn)化為棕櫚油酸的酶。
在藍(lán)藻細(xì)菌中，已經(jīng)證明脂肪酸的去飽和過程是通過在碳鏈的△9位點(diǎn)引入一個(gè)雙鍵開始，接著在△12位上引入雙鍵，隨后在△6或△15位引入雙鍵?！?脫氫酶是一種重要的酶，它與一系列去飽和反應(yīng)的第一個(gè)步驟有關(guān)，并且與在硬脂酸或棕櫚酸的碳鏈的△9位引入雙鍵的反應(yīng)有關(guān)，其中的碳鏈連接在甘油脂上。該反應(yīng)需要依賴于鐵氧還蛋白和NADPH的還原力。
另一方面，已有人報(bào)道將雙鍵引入到?jīng)]有結(jié)合甘油脂的硬脂酸的△9的酶，在動(dòng)物細(xì)胞質(zhì)中為硬脂酰CoA脫氫酶，在植物葉綠體中該酶是硬脂酰ACP(?；?載體蛋白)脫氫酶。這些酶的DNA序列已得到測(cè)定。
藍(lán)藻細(xì)菌的△9脫氫酶的特征在于將連接至甘油脂上的棕櫚酸或硬脂酸轉(zhuǎn)化為不飽和脂肪酸，而上文中提到的動(dòng)物和植物中的兩種△9脫氫酶不能催化該反應(yīng)。為了鑒別該酶底物特異性的決定因子，應(yīng)在分子水平上分析幾種類型的藍(lán)藻細(xì)菌△9脫氫酶。
生物膜的相轉(zhuǎn)變溫度取決于組成膜的極性脂類中不飽和脂肪酸的含量;因此，相轉(zhuǎn)變溫度隨著未飽和脂肪酸含量的增加而降低。已經(jīng)報(bào)道，在較低溫度時(shí)藍(lán)藻細(xì)菌中不飽和脂肪酸的量增加，暗示著細(xì)胞膜中脂肪酸的組分也與植物的低溫忍受性有關(guān)。因此，可以認(rèn)為脂肪酸脫氫酶的表達(dá)是受低溫調(diào)節(jié)的。為了探討調(diào)節(jié)表達(dá)的機(jī)理，需要分離相關(guān)基因。
鑒于上述理由，分離藍(lán)藻細(xì)菌的△9脫氫酶基因是必需的，但是除了從異項(xiàng)圈藍(lán)藻(Anabaena Variabilis)中分離外，尚沒有分離該基因的其他報(bào)道。
為了分析藍(lán)藻細(xì)菌的△9脫氫酶，本發(fā)明人已在分子水平上進(jìn)行了廣泛的研究，并且利用Synechocystis PCC 6803基因組文庫(kù)分離到藍(lán)細(xì)菌Synechocystis sp.PCC 6803△9脫氫酶的基因組DNA克隆。這步工作使本發(fā)明達(dá)到了目的。
因此，本發(fā)明的關(guān)鍵在于由序列表中的SEQ ID NO1表示的氨基酸序列代表的△9脫氫酶，以及編碼該酶的離體基因。
下文中將對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)描述。
在本發(fā)明中，藍(lán)藻細(xì)菌(例如Synechocystis sp.PCC 6803)是光能自養(yǎng)型生長(zhǎng)的，用玻璃珠破碎細(xì)胞，通過苯酚萃取和乙醇沉淀，提取基因組DNA。
用限制性酶(例如Sau 3A)部分消化完整的基因組DNA并且連接到噬菌體載體(例如λDASHⅡ)以產(chǎn)生基因組文庫(kù)，該基因組文庫(kù)通過噬菌斑雜交進(jìn)行篩選，其中以藍(lán)藻細(xì)菌異項(xiàng)圈藻的△9脫氫酶的編碼區(qū)(下文中將它簡(jiǎn)略為des C(A)用作為探針。從陽(yáng)性噬菌斑中提取噬菌體DNA。用限制酶消化后，使用des C(A)的0.75kb.p.DNA片段作為探針進(jìn)行Southern雜交。采用二脫氧鏈終止方法對(duì)與探針DNA進(jìn)行雜交的DNA片段進(jìn)行序列分析。
得到的DNA片段的堿基序列以及由此推導(dǎo)出的氨基酸序列顯示于序列表中的SEQ ID NO1。
本發(fā)明還包括通過從顯示于SEQ ID NO1的序列缺失，替代或迭加一個(gè)或多個(gè)氨基酸或核苷酸而得到的衍生物，條件是由該DNA片段編碼的多肽的△9脫氫酶活性不受影響。
然后檢查該合成的基因與del C(A)的同源性從而識(shí)別出該基因?yàn)椤?脫氫酶基因族的一個(gè)新成員。該新基因在大腸桿菌中表達(dá)后可以測(cè)定△9脫氫酶的活性。通過提取用離體基因轉(zhuǎn)化的大腸桿菌的膜，加入鐵氧還蛋白，NADPH和硬脂酸，并且測(cè)定油酸的形成來分析△9脫氫酶活性。
Knoell和Knappe，Eur.J.Biochem.50，245-252(1974)報(bào)道了在大腸桿菌中存在鐵氧還蛋白，一種電子供體。通過將該離體基因連接到大腸桿菌的表達(dá)載體上，用誘導(dǎo)能編碼△9脫氫酶的DNA進(jìn)行表達(dá)的載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌，并且檢測(cè)產(chǎn)生的油酸，來證實(shí)酶活性。
例如將合成的△9脫氫酶基因?qū)氲街参锛?xì)胞中后可以與能在植物細(xì)胞中表達(dá)的一個(gè)啟動(dòng)子(如CaMV 35 s等)以及一個(gè)終止子(例如NOS等)相連接從而產(chǎn)生一個(gè)嵌合基因，然后將它連接至大腸桿菌質(zhì)粒(例如pUC19，pBR 322等)上，擴(kuò)增，并利用電擊穿方法導(dǎo)入到一種植物細(xì)胞中。通過將該基因連接到農(nóng)桿菌的Ti質(zhì)?；騌i質(zhì)?；蛲ㄟ^利用這二種質(zhì)粒作為二元載體，借助于農(nóng)桿菌還可以將該基因轉(zhuǎn)移到多種植物中?；蜣D(zhuǎn)化后可導(dǎo)致脂肪酸組分的變化以改善對(duì)低溫的忍耐性。
本發(fā)明所述的藍(lán)藻細(xì)菌的編碼△9脫氫酶的基因可用于改善動(dòng)物，植物和微生物的脂肪酸組分并且通過轉(zhuǎn)化可用于制備能忍受低溫的動(dòng)物，植物或生物體。
下列實(shí)施例進(jìn)一步闡明本發(fā)明，但本發(fā)明并不限制于這些實(shí)施例，這些實(shí)施例包括在本發(fā)明范圍中。
實(shí)施例(1)Synechocystis PCC 6803基因組DNA的提取將300ml的Synechocystis PCC 6803(從巴斯德培養(yǎng)物收集中心獲得)培養(yǎng)物(730nm處的吸光率為5至10之間)以4，500×g離心6分鐘。收集1-2克細(xì)胞。向1克細(xì)胞中加入2ml碘化鈉溶液(4克碘化鈉/2ml蒸餾水)并且通過振蕩懸浮。將懸浮液在37℃培養(yǎng)20分鐘，并加入蒸餾水至終體積為40ml，將得到的溶液以10，000×g離心10分鐘。將沉淀加到10ml的DNA萃取緩沖液(50mM Tris-HCL(PH8.5)，50mM氯化鈉和5mM EDTA)和1.5ml的溶菌酶溶液(50mg/ml)中，并在37℃培養(yǎng)45分鐘。向該混和物中加入1ml的10%(W/V)N-十二烷酰肌氨酸，并且再保溫20分鐘，在此期間將破碎細(xì)胞溶液吸移幾次以便減少溶液的粘性。向該破碎細(xì)胞溶液中加入3ml的溴化乙錠溶液(10mg/ml)，并且加入蒸餾水到最終重量為23克。向該溶液中加入21克氯化銫并將混合物以45，000×g離心20小時(shí)。通過與1-丁醇重復(fù)混和，從含有重新獲得染色體DNA的溶液中除去溴化乙錠后，將染色體DNA溶液在4升無菌水中透析90分鐘。透析后，用等體積的苯酚萃取得到的DNA，然后用等體積的氯仿萃取，并用乙醇沉淀。通過離心收集沉淀的DNA，再用70%乙醇洗滌，干燥，并溶于100μl緩沖溶液(10mM Tris-HCL(PH 7.5)/0.1mM EDTA)中。
(2)篩選Synechocystis PCC 6803基因組文庫(kù)。
用限制性內(nèi)切酶Sau 3A部分消化Synechocystis PCC 6803基因組DNA，并連接到噬菌體載體-λDASHⅡ的BamHI位點(diǎn)。在用大腸桿菌感染含有Synechocystis PCC 6803基因組DNA的噬菌體后，利用異項(xiàng)圈藻的des C基因的編碼區(qū)的0.75kbDNA片段作為探針將2500噬菌斑進(jìn)行噬菌斑雜交。從與探針雜交的噬菌斑中選出22個(gè)克隆并且提取噬菌體DNA。用HindⅢ消化Synechocystis PCC 6803的整個(gè)基因組DNA并且利用上文中描述的同樣探針進(jìn)行Southern雜交分析，最后檢測(cè)到6.0kb譜帶。在陽(yáng)性克隆中，選出含有6.0kb HindⅢ片段再克隆到質(zhì)粒模本Ⅱks(+)的HindⅢ位點(diǎn)。
(3)Synechocystis PCC 6803的△9脫氫酶基因(desC)的分離。
提取含有HindⅢ片段的質(zhì)粒DNA，并利用限制性核酸內(nèi)切酶Pst Ⅰ，Bam HI，EcoRI，SpeI和ApaⅠ制備該DNA的物理圖譜。而且，用上述限制性核酸內(nèi)切酶消化該質(zhì)粒DNA并且利用含有在噬菌斑雜交中使用的desC基因的DNA片段作為探針以限定一個(gè)同源區(qū)而完成Sourthern雜交分析。
采用二脫氧鏈終止方法將該限定的區(qū)域進(jìn)行測(cè)序從而找到了由975個(gè)堿基組成的蛋白質(zhì)編碼區(qū)(下文中簡(jiǎn)稱為“ORF”)。該基因與異項(xiàng)圈藻的desC(A)有64%氨基酸同源。將各種藍(lán)藻細(xì)菌的△12脫氫酶基因進(jìn)行比較結(jié)果為，Synechocystis PCC 6803(Wada et al.Nature，347，200-203(1990))與異項(xiàng)圈藻(Sakamoto et al，Plant，Mol.Biol.24，643-650(1994))有59%同源，與Synechococcus Pcc 7002(Sakamoto et al.Plant.Mol.Biol.24，643-650(1994))有57%同源，上述情況表明在該分離到的ORF與異項(xiàng)圈藻的desC(A)之間有高度同源性。該ORF與大鼠及酵母的硬脂酰CoA脫氫酶分別有31%和30%同源性(大鼠Thiede et al.，J.Biol.Chem.261，13230-13235(1986);酵母Stukey et al.，J.Biol.Chem.，265，20144-20149)。從這些結(jié)果可得出結(jié)論，該分離到的ORF是Synechocystis PCC 6803的△9脫氫酶基因(desC)。Synechocystis PCC 6803 desC的堿基序列和由此推導(dǎo)出的氨基酸序列列于序列表中的SEQ ID NO1。
(4)構(gòu)建表達(dá)載體以及在大腸桿菌中表達(dá)△9脫氫酶通過PCR擴(kuò)增前面獲得的含有desC的5＇-半?yún)^(qū)域的0.5kb片段并且連接到質(zhì)粒模本Ⅱ(pBSⅡ)。將該DNA片段再克隆到含有desC編碼區(qū)的3＇-半?yún)^(qū)域的質(zhì)粒pBSⅡ/H6上得到合成質(zhì)粒pBSⅡ/desC。用SpeⅠ消化pBSⅡ/desC并且將含有編碼區(qū)的1.1kb DNA片斷連接到pET 3a載體的NheⅠ位點(diǎn)，其中該DNA片段定位于T7噬菌體啟動(dòng)子的下游，得到pET 3a/desC質(zhì)粒。為了進(jìn)行比較，將pET3a/desC和不含desC基因的pET3a轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3)pLYsS。將每個(gè)轉(zhuǎn)化子培養(yǎng)于含有硬脂酸的LB培養(yǎng)基直到OD600為0.6。并且在有或無1mM IPTG時(shí)繼續(xù)培養(yǎng)1小時(shí)。通過離心收集細(xì)胞，用1.2%NaCl溶液洗滌，并且通過離心再次收集。
(5)分析大腸桿菌單個(gè)脂類的脂肪酸組分采用Bligh和Dyer的方法(Can.J.Biochem.Physiol，37，911-917(1959))從收集到的大腸桿菌中提取脂類。采用在CHCL3/CH3OH/CH3COOH(65∶25∶10)展開的硅膠薄層層析法將提取到的脂類分離為PE(磷脂酰乙醇胺)，PG(磷脂酰甘油)和CL(心磷脂)的單個(gè)脂類。在分離之后，用小刀將含有單個(gè)脂類的硅膠刮下，在5%HCL/甲醇中85℃進(jìn)行甲醇分解5.5小時(shí)。用2ml的正己烷萃取合成的甲酯，濃縮后，采用氣相色譜法分離，測(cè)定單個(gè)脂類的含量(表1)。
在無硬脂酸的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的大腸桿菌產(chǎn)生的所有脂類中的硬脂酸的濃度低于1%。而在含有硬脂酸的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)時(shí)硬脂酸濃度約10%。作為對(duì)照研究，在用pET3a轉(zhuǎn)化的大腸桿菌中，IPTG誘導(dǎo)前和后，油酸量并不增加，在任何單脂類中其含量低于2%(表1)。另一方面，在用pET3a/desC轉(zhuǎn)化的大腸桿菌中，由于IPTG的誘導(dǎo)作用，油酸的量與誘導(dǎo)前相比增加到2-3倍(6-10%)(表1)。棕櫚酸，棕櫚油酸16∶1(a)和異油酸18∶1(11)的量設(shè)有改變。
表1 將desC基因?qū)氲酱竽c桿菌后在單個(gè)脂類中脂肪酸成分的改變脂種類 脂肪酸14:0 16:0 16:1(9) 18:0 18:1(9) 18:1(11)(mol%)誘導(dǎo)作用之前pET3aPE(78%) 2 31±2 25±1 14±2 t 25±1PG(21%) 1 27±2 17±1 16±1 1 36±1CL(1%) 1 32±1 14±1 19±2 2 32±2pET3a/decCPE(80%) 3±1 34±1 24±1 10±1 2 26±1PG(19%) 1 31±1 17±1 10±1 3±1 36±1CL(1%) 0 30±1 11±1 10±2 5±1 39±1IPTG誘導(dǎo)1小時(shí)pET3aPE(82%) 4±1 36±3 24±1 11±2 t 23±3PG(17%) 1 30±2 15±1 14±1 1 39±1CL(1%) 1 30±1 11±1 10±2 16±2 1 33±2pET3a/desCPE(74%) 3±1 33±1 24±1 9±1 6±1 24±1PG(21%) 1 30±1 19±1 8±1 10±1 31±1CL(5%) 1 27±1 18±1 8±1 10±1 36±1表中數(shù)值是從三種單獨(dú)培養(yǎng)的培養(yǎng)物獲得的。
t痕量(低于0.5%)(6)分析甘油主鏈的各個(gè)結(jié)合位點(diǎn)的脂肪酸成分采用上面描述的方法，從由IPTH誘導(dǎo)的大腸桿菌中提取脂肪酸，由硅膠薄層層析法分離PE和PG。使用德列馬根霉的脂酶，根據(jù)Fischer等人的方法(Hoppe-Seyler's Z.physiol.CHem.354，1151-1123(1973))選擇性地將它們水解。在甲醇分解后，采用氣相色譜測(cè)定脂肪酸甲基酯的量。
在用pET3a轉(zhuǎn)化大腸桿菌的對(duì)照試驗(yàn)中，無論在PE或PG情況下，在連接到甘油主鏈的C-1位脂肪酸中油酸的比例低于0.5%。另一方面，在用pET3a/desC轉(zhuǎn)化的大腸桿菌中，分別在PE或PG的情況，在連接到甘油主鏈的C-1位的脂肪中油酸的比例分別增加到11%和18%(表2)。但是，連接在C-2位點(diǎn)時(shí)沒有區(qū)別。棕櫚酸，棕櫚油酸和異油酸的比例沒有改變。
上述這些結(jié)果表明，分離到的編碼△9脫氫酶的基因?qū)⑦B接到磷酸脂的C-1位的硬脂酸轉(zhuǎn)化為不飽和酸(不管是極性殘基是與否)。
表2 在用desC基因轉(zhuǎn)化的大腸桿菌細(xì)胞的單脂類中脂肪酸的位點(diǎn)分布脂種類 脂肪酸(位置) 14:0 16:0 16:1(9) 18:0 18:1(9) 18:1(11)(mol%)pET3aPE(C-1) 1 68 6 16 t 5(C-2) 3 4 42 6 1 41PG(C-1) 1 51 12 16 t 20(C-2) 1 8 18 11 3 58pET3a/desCPE(C-1) 1 61 7 9 11 11(C-2) 3 5 41 9 1 37PG(C-1) 1 51 16 1 18 14(C-2) 1 7 22 18 2 48
表中數(shù)值是從三個(gè)獨(dú)自培養(yǎng)的培養(yǎng)物獲得的。數(shù)值的偏差為小于2%。
t痕量(小于0.5%)參考實(shí)施例編碼異項(xiàng)圈藻△9脫氫酶的基因的分離(1)基因組DNA的提取將300ml的異項(xiàng)圈藻菌株M-3(從Institute of AppliedMicrobiology University of Tokyo獲得)培養(yǎng)物(在730nm處吸光度為5-10之間)以4，500×g離心6分鐘。收集1-2克細(xì)胞。向1克細(xì)胞中加入2ml的碘化鈉溶液(4克碘化鈉/2ml蒸餾水)，并且振蕩懸浮。將懸浮液在37℃保溫20分鐘，加入蒸餾水至終體積為40ml，將最后的溶液以10，000×g離心10分鐘。將沉淀重新懸浮于10ml的DNA萃取緩沖液(50mM Tris-HCL(PH8.5)，50mM氯化鈉和5mMEDTA)和5ml的溶菌酶溶液(50mg/ml)，并在37℃保溫45分鐘。向該混合物中加入1ml的10%(W/V)N-月桂酰肌氨酸，再保溫20分鐘，此期間將破碎細(xì)胞溶液吸移幾次以便降低該溶液的粘滯度。向該破碎細(xì)胞溶液中加入3ml溴化乙錠溶液(10mg/ml)，加入蒸餾水到最終重量為23克。向該溶液中加入21克氯化銫，并將該混和物以45.000×g離心20小時(shí)。重復(fù)用正丁醇混和，從含有重新得到的染色體DNA的溶液中除去溴化乙錠之后，將該染色體DNA溶液在4升蒸餾水中透析90分鐘。透析完成之后，用等體積苯酚，然后用等體積氯仿萃取得到的DNA，并用乙醇沉淀。通過離心收集沉淀的DNA并用70%乙醇洗滌，干燥，并溶于100μl的緩沖液(10mM Tris-HCL(PH7.5)/0.1mMEDTA)。
(2)分離異項(xiàng)圈藻的△12脫氫酶基因(desA)
用限制性內(nèi)切酶Sau 3A部分地消化按上述方法得到的異項(xiàng)圈藻DNA，并連接到噬菌體載體-λDASHⅡ的BamHⅠ位點(diǎn)。將含有異項(xiàng)圈藻的基因組DNA的λ噬菌體感染大腸桿菌之后，利用含有Sycechocystis PCC 6803的△12脫氫酶基因(desA)的1.1kbHincⅡ-SpeⅠDNA片段作為探針對(duì)3.5×103噬菌斑進(jìn)行噬菌斑雜交試驗(yàn)。隨機(jī)地從與該探針雜交的噬菌斑中選出三個(gè)克隆。提取噬菌體DNA，用限制性核酸內(nèi)切酶HincⅡ消化，利用上面描述的相同探針進(jìn)行Southern雜交分析。在二個(gè)噬菌體DNA中，發(fā)現(xiàn)存在與該探針雜交的2.1kb譜帶。對(duì)其中之一進(jìn)行檢查進(jìn)一步鑒定出所述基因。
鑒定基因按如下所述進(jìn)行用限制性核酸內(nèi)切酶EcoRⅠ消化噬菌體DNA，并進(jìn)行Southern雜交以證明一個(gè)7kb的片段與該探針同源。將該7kb片段連接到在大腸桿菌和synechococcus PCC7942之間穿梭的穿梭載體pUC303(Kuhlemier et al.，Plasmid 10.156-163(1983))的EcoRⅠ位點(diǎn)從而獲得pUC303/7-kb。
由于Synechococcus PCC7942具有16∶0，16∶1，18∶0和18∶1的脂肪酸，但不具有16∶2和18∶1的脂肪酸。該菌株被認(rèn)為缺失了△12脫氫酶基因。已有人報(bào)道，Synechococcus PCC 6803的desA基因?qū)氲絊ynechococcus PCC 7943導(dǎo)致產(chǎn)生16∶2和18∶2的不飽和脂肪酸(Wada et al.，1990 ibid)。然后采用Williams & Szalay，Gene，24，37-51(1983)的方法用pUC303/7-kb轉(zhuǎn)化Synechococcus PCC 7942。將PCC 7942培養(yǎng)于50ml的BG-11液體培養(yǎng)基中至濃度為5-8×107/ml，并以4，500×g于室溫下離心10分鐘。用BG-11培養(yǎng)基再次洗滌沉淀的細(xì)胞，通過離心收集，并重懸于BG-11培養(yǎng)基中至終濃度為1-2×109個(gè)細(xì)胞/ml。向該0.1ml的細(xì)胞懸浮液中加入0.1μg的DNA，在光照條件下緩慢振蕩1小時(shí)。在含有10μg/ml的鏈霉素的BG-11瓊脂培養(yǎng)基中，以1-5×107個(gè)細(xì)胞/平板的密度在黑暗中，30℃條件下將轉(zhuǎn)化細(xì)胞生長(zhǎng)16小時(shí)，進(jìn)一步在光照條件下生長(zhǎng)8小時(shí)。將0.5ml的1mg/ml鏈霉素滴加到瓊脂培養(yǎng)基之后，選擇出產(chǎn)生綠色信號(hào)的鏈霉素抗性轉(zhuǎn)化細(xì)胞。
將轉(zhuǎn)化體培養(yǎng)于100ml的BG-11培養(yǎng)基中，以4，500×g離心10分鐘并凍干。將干燥細(xì)胞加到含有5%HCL(W/W)的10ml甲醇中，并在85℃加熱2.5小時(shí)進(jìn)行甲醇分解。用3ml的正己烷提取得到的脂肪酸甲酯三次。通過蒸發(fā)移走正己烷后，將該櫚再溶解于0.1ml正己烷中。吸取該櫚溶液的一份試樣，通過氣相色譜法分析該樣品的脂肪酸甲酯組分。
Synechococcus PCC 7942野生型菌株不含有不飽和的18∶2脂肪酸，而用pUC303/7-kb轉(zhuǎn)化的細(xì)胞產(chǎn)生的18∶2不飽和脂肪酸占總脂肪酸的1%，因此，可以得出結(jié)論，異項(xiàng)圈藻的desA基因存在于7-kbEcoRⅠ片段中。
用限制性核酸內(nèi)切酶ClaⅠ，SpeⅠ和HindⅢ消化7-kbEcoRⅠ片段繪制物理圖譜。而且，通過Sou thern雜交反應(yīng)而鑒別與Synechocystis PCC 6803的desA同源的區(qū)域，并且采用雙脫氧鏈終止方法進(jìn)行測(cè)序。由于存在由1053個(gè)堿基組成的開放式閱讀框架(ORF)并且特別提到在該ORF的氨基酸序列中是有與Synechocystis PCC 6803高度同源(大于80%)的三個(gè)區(qū)域，因此結(jié)論是該ORF是異項(xiàng)圈藻的desA基因。
(3)分離異項(xiàng)圈藻的△9脫氫酶基因(desC(A))對(duì)5＇上游異項(xiàng)圈藻desA基因的堿基序列進(jìn)行測(cè)定結(jié)果表明在約1.2kb內(nèi)存在由819個(gè)堿基組成的開放式閱讀框架(ORF)。由于該ORF產(chǎn)物的氨基酸序列與大鼠和酵母的硬脂酰CoA脫氫酶分別有31%和29%的同源性。從而可得出結(jié)論該ORF是異項(xiàng)圈藻的△9脫氫酶基因(desC(A))。異項(xiàng)圈藻desC(A)的堿基序列以及由此推導(dǎo)出的氨基酸序列描述于序列表的SEQ ID NO2中。
序列表(1)一般資料(ⅰ)申請(qǐng)人TOHOKU ELECTRIC POWER COMPANY，INCORPORATED MITSUBISHI CORPORATIONMITSUBISHI KASEI CORPORATION(ⅱ)發(fā)明名稱重組△9脫氫酶和編碼該酶的基因(ⅲ)序列數(shù)2(ⅳ)通訊的地址(A)地址TOHOKU ELECTRIC POWER COMPANY，INCORPORATED(B)街道7-1，Ichibancho 3-chome，Aoba-ku(C)城市Sendai(D)國(guó)家日本(E)郵編980(V)計(jì)算機(jī)可讀形式
(A)存儲(chǔ)盤類型Floppy盤(B)計(jì)算機(jī)IBM PC兼容(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件Patentin Release ＃1.0，Version ＃1.25(ⅵ)本申請(qǐng)資料(A)申請(qǐng)?zhí)?B)申請(qǐng)日(C)分類(ⅷ)代理人/代理機(jī)構(gòu)資料(A)姓名(2)SEQ ID NO1的資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度957(B)類型核酸(C)股數(shù)雙(D)幾何結(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型基因組DNA(ⅵ)原始來源(A)生物體Synechocystis PCC 6803(ⅸ)特征(A)姓名/關(guān)鍵詞CDS
(B)位置1..954(C)識(shí)別方法S(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO1 (2)SEQ ID NO2的資料
(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度819(B)類型核酸(C)股數(shù)雙(D)幾何結(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型基因組DNA(ⅵ)原始來源(A)生物體異項(xiàng)圈藻(ⅸ)特征(A)姓名/關(guān)鍵詞CDS(B)位置1..816(C)識(shí)別方法P(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO2

權(quán)利要求
1.一種重組△9脫氫酶，其氨基酸序列描述于序列表的SEQ IDNO∶1。
2.一種編碼權(quán)利要求1所述的△9脫氫酶的離體基因。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述基因，其堿基序列描述于序列表中的SEQ ID NO1。
4.能夠表達(dá)由權(quán)利要求2或3所述基因編碼的多肽的重組載體。
5.由權(quán)利要求4所述重組載體轉(zhuǎn)化一種宿主細(xì)胞獲得的轉(zhuǎn)化子。
6.制備權(quán)利要求1所述重組△9脫氫酶的方法，該方法包括在一種培養(yǎng)基中培養(yǎng)如權(quán)利要求5所述的轉(zhuǎn)化子并且回收表達(dá)產(chǎn)物。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種編碼藍(lán)藻細(xì)菌△9脫氫酶的離體基因，含有該基因的表達(dá)載體，由該載體轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)化體以及一種重組△9脫氫酶。其中所述基因通過轉(zhuǎn)化可用于改善動(dòng)物、植物和微生物中脂肪酸的組份，并且可用于制備能忍受低溫的動(dòng)物、植物或微生物。
文檔編號(hào)C12N9/02GK1106456SQ9411788
公開日1995年8月9日 申請(qǐng)日期1994年9月22日 優(yōu)先權(quán)日1993年9月22日
發(fā)明者村田紀(jì)夫 申請(qǐng)人:東北電力株式會(huì)社, 三菱商事株式會(huì)社, 三菱化學(xué)株式會(huì)社