專利名稱：化學(xué)突變具有底物結(jié)合部位的單克隆抗體制備含硒抗體酶的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明是屬于含硒抗體酶的制備技術(shù)。
開發(fā)制備抗體酶的新方法是生物科學(xué)研究領(lǐng)域的前沿之一。鑒于抗體本身的分子可塑性，分子識(shí)別專一性和抗體變化的多樣性等特點(diǎn)，予示抗體酶對(duì)于分子生物學(xué)、生物工程學(xué)及醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。因此，英、美等國都在積極開發(fā)制備抗體酶的新方法。迄今，已成功開發(fā)的方法有過渡態(tài)類似物法，熵阱法和引入法，引入法中又包括選擇性化學(xué)修飾和蛋白質(zhì)工程法?？贵w酶所催化的反應(yīng)也有40多種，尤其是有些反應(yīng)是天然酶不能催化的?？贵w酶的專一性一般等于或強(qiáng)于天然酶對(duì)底物的專一性，然而催化效率要比天然酶低2-3個(gè)數(shù)量級(jí)。因此，開發(fā)高活力抗體酶制備技術(shù)就成了科學(xué)家奮斗的目標(biāo)。
抗體酶在醫(yī)學(xué)上有巨大的應(yīng)用潛力，現(xiàn)任歐州自由基研究會(huì)會(huì)長R.Evans于1993年指出，未來藥物的發(fā)展方向是，既要有很強(qiáng)的藥效，又要有指向病變器官的導(dǎo)向性?？贵w酶是滿足上述要求的最佳候選者。鑒于谷胱甘肽過氧化物酶(GPX)是抗衰老酶系的重要成員之一，能清除體內(nèi)自由基，防止脂質(zhì)過氧化，對(duì)防治各種炎癥，心腦血管疾病、腫瘤等有明顯療效，因此制備具有GPX活力的抗體酶就顯得特別有意義。
本發(fā)明的目的在于應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)的單克隆抗體制備技術(shù)與化學(xué)突變相結(jié)合的方法成功地制備了具有很高GPX活力的含硒抗體酶。
本發(fā)明是，先制備具有底物結(jié)合部位的單克隆抗體，然后用化學(xué)突變法將催化基團(tuán)引入到單抗的結(jié)合部位，結(jié)果產(chǎn)生高活力抗體酶。含硒抗體酶的制備過程是還原型谷胱甘肽(GSH)與2，4-二硝基氯苯(DCNB)反應(yīng)，制得S-取代的谷胱甘肽衍生物(GSH-S-DNP)作為半抗原;用戊二醛將GSH-S-DNP與牛血清白蛋白(BSA)偶聯(lián)在一起，作為全抗原;將合成的全抗原加入福氏佐劑，注射給雌鼠進(jìn)行免疫，然后用標(biāo)準(zhǔn)單抗制備法制備具有GSH結(jié)合部位的單抗。用苯甲基磺酰氟(PMSF)活化單抗可變區(qū)中絲氨酸殘基(Ser)上的羥基，再用H2Se處理，則將Ser突變成硒代半胱氨酸(SeCys)。由于SeCys是GPX的催化基團(tuán)，因而在單抗可變區(qū)既有底物結(jié)合部位，又有催化基團(tuán)，結(jié)果產(chǎn)生高活力的含硒抗體酶。
本發(fā)明具有如下特點(diǎn)1.制備方法簡單，僅使用標(biāo)準(zhǔn)單抗制備法和簡單的化學(xué)突變法。
2.在不能知道反應(yīng)的催化機(jī)理，不知道反應(yīng)過渡態(tài)的情況下，仍可制備抗體酶。
3.可用本法擴(kuò)大生產(chǎn)抗體酶，克服了天然GPX來源有限的缺點(diǎn)。
4.用本發(fā)明制出的含硒抗體酶活力高，已達(dá)到天然GPX的數(shù)量級(jí)水平。
5.用本發(fā)明制出的含硒抗體酶的穩(wěn)定性比天然GPX高。
6.含硒抗體酶保持原有單抗的效價(jià)，因而可定向靠近病變靶部位。
實(shí)施例1.02g GSH(3.32mmol)溶在10ml 1mol/L NaOH中，在冰浴中降溫。再取溶在10ml乙醇中的DCNB 0.67g(3.6mmol)攪拌下慢慢加入到GSH溶液中，混合物在0℃保持10min，用稀調(diào)pH至4左右，得到亮黃色晶體，用熱水重結(jié)晶，70℃烘干，即得純品GSH-S-DNP 1.3g，產(chǎn)率90%。
10mg BSA與5.6mg GSH-S-DNP溶于1ml 0.2mol/L pH7.2的磷酸緩沖液(PBS)中，慢慢加入0.7ml戊二醛溶液，反應(yīng)10h后，加入10mg甘氨酸終止反應(yīng)，后用pH7.5，0.05mol/L PBS平衡的Ultrogel AcA 54柱(2.0×40cm)層析純化產(chǎn)品，收集第一峰為抗原蛋白。
將合成的抗原加入福氏佐劑，注射給雌鼠(BALB/c)進(jìn)行免疫。免疫的鼠脾細(xì)胞在PEG作用下與骨髓瘤細(xì)胞(NS-1)融合，播種在已加巨噬細(xì)胞的培養(yǎng)板中。用HAT培養(yǎng)液培養(yǎng)，用ELISA連續(xù)兩次檢測呈陽性的細(xì)胞株進(jìn)行克隆，得到一陽性單克隆細(xì)胞株4A4，進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)。細(xì)胞培養(yǎng)液上清經(jīng)層析純化，得到4A4 IgG，此單抗具有底物(GSH)結(jié)合部位。
0.5mg凍干單抗溶在0.5ml pH7.0 0.05mol/L PBS中，加入10μl PMSF溶液(21mg PMSF溶在1ml乙腈中)，室溫振蕩1h，在高純氮保護(hù)下通入H2Se氣體至飽和，再在40℃下保溫36-40h，使反應(yīng)完成。將反應(yīng)液透析，凍干即得含硒抗體酶。
含硒抗體酶的活力為1097u/μmol，已達(dá)到天然酶活力(5780u/μmol)的數(shù)量級(jí)水平;抗體酶對(duì)GSH的米氏常數(shù)為2.7×10-4M，與天然GPX的米氏常數(shù)(3.0×10-3M)相比，提高了1個(gè)數(shù)量級(jí);經(jīng)測定，抗體酶的效價(jià)與突變前的單抗相同;抗體酶的硒含量為5 Se/mol?？贵w酶的穩(wěn)定性列于下表含硒抗體酶的貯存穩(wěn)定性酶狀態(tài) 貯存條件 半壽期(天)溶液酶 15mg/ml pH7.2, 0.05mol/L PBS 15-20℃ 28溶液酶 15mg/ml pH7.2, 0.05mol/L PBS 4℃ 79凍干酶 室溫 90天后活力仍保持90%以上
權(quán)利要求
1.一種含硒抗體酶的制備方法，它包括單克隆抗體制備技術(shù)和化學(xué)突變技術(shù)，其特征在于還原型谷胱甘肽(GSH)與2，4-二硝基氯苯(DCNB)反應(yīng)，制得S-取代的谷胱甘肽衍生物(GSH-S-DNP)作為半抗原；用戊二醛將GSH-S-DNP與牛血清白蛋白(BSA)偶聯(lián)在一起，作為全抗原；將合成的全抗原加入福氏佐劑，注射給雌鼠進(jìn)行免疫，然后用標(biāo)準(zhǔn)單抗制備法制備具有GSH結(jié)合部位的單抗。用苯甲基磺酰氟(PMSF)活化單抗可變區(qū)中絲氨酸殘基(Ser)上的羥基，再用H2Se處理，則將Ser突變成硒代半胱氨酸(SeCys)。由于SeCys是GPX的催化基團(tuán)，因而在單抗可變區(qū)既有底物結(jié)合部位，又有催化基團(tuán)，結(jié)果產(chǎn)生高活力的含硒抗體酶。
全文摘要
本發(fā)明屬于含硒抗體酶的制備技術(shù)。用標(biāo)準(zhǔn)單抗制備技術(shù)和簡單的化學(xué)突變相結(jié)合的方法可以成功地制備高GPX活力的含硒抗體酶。該抗體酶在穩(wěn)定性、導(dǎo)向性、對(duì)底物的親和性上都優(yōu)于天然GPX，而且可以擴(kuò)大生產(chǎn)，避免了天然酶來源有限的缺點(diǎn)。本發(fā)明制備工藝簡單，尤其是在不了解反應(yīng)機(jī)理及反應(yīng)過渡態(tài)的情況下，仍能制備高活力抗體酶。用本發(fā)明制備的含硒抗體酶在醫(yī)療上有巨大的應(yīng)用潛力。
文檔編號(hào)C12N9/00GK1093405SQ9410248
公開日1994年10月12日 申請(qǐng)日期1994年3月9日 優(yōu)先權(quán)日1994年3月9日
發(fā)明者羅貴民, 朱振齊, 丁蘭, 孫啟安, 高貴, 劉仔, 楊同書, 沈家驄 申請(qǐng)人:吉林大學(xué)