專利名稱：制備抗球蟲劑組合物的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及生產抗生素UK-61，689的微生物學方法，抗生素UK-61，689是一種以前只是靠化學方法才能得到的酸性多環(huán)醚抗球蟲抗生素。更具體地說，本發(fā)明涉及通過培養(yǎng)具有玫瑰紅黃馬杜拉放線菌F.D.27684(Actinomadura roseorufa F.D.27684，CCTCC NoM88088，88年9月5日保藏;ATCC53，666)的鑒定特征的玫瑰紅黃馬杜拉放線菌(Actinomadura roseorufa)來發(fā)酵生產UK-61，689的方法，涉及具有玫瑰紅黃馬杜拉放線菌F.D.28474、F.D.28499和F.D.28454(Actinomadura roseorufa F.D.28474，F(xiàn).D.28499和F.D.28454，1988年9月5日保藏在CCTCC，編號分別為M88087、M88086和M88089;ATCC保藏號分別為ATCC53，665、ATCC53，664和ATCC53，674)鑒定特征的玫瑰紅黃馬杜拉放線菌突變株。
1986年1月22日分布的EP-0169011描述了生產多環(huán)醚抗生素UK-58，852的方法，該抗生素是通過在深層通氣條件下用液體營養(yǎng)培養(yǎng)基培養(yǎng)玫瑰紅黃馬杜拉放線菌新亞種(Actinomadura roseorufa Huang sp.nov.)ATCC39，697而產生的。
UK-61，689是一種單配糖基酸性多環(huán)醚，其結構如式(Ⅰ)所示，
1986年8月1日提交的英國專利申請第8618844號描述了其制備方法，即對式(Ⅱ)所示的二配糖基多環(huán)醚UK-58，852進行選擇性酸水解。
其中所描述的方法包括UK-58，852的酸水解，水解最好在室溫下以乙腈/水作溶劑用1∶1當量的對甲苯磺酸和UK-58，852鈉鹽進行。
1986年1月22日分布的歐洲申請169011描述了UK-58，852的制備方法。UK-58，852本身就是一種有效的抗生素，更是有效的抗球蟲劑。它是由玫瑰紅黃馬杜拉放線菌新亞種ATCC39，697在液體營養(yǎng)培養(yǎng)基中深層通氣發(fā)酵所產生。在發(fā)酵生產UK-58，852的同時還產生兩個相關的微量組份，每個組份在控制球蟲病方面均是有效的抗生素。這二個微量組份分別定名為CP-70，228和CP-70，828，它們具有上述式(Ⅱ)所示的結構，前者R是H，R1是CH3;后者R和R1均為甲基。
本發(fā)明涉及制備UK-61，689的微生物學方法，它包括在液體營養(yǎng)培養(yǎng)基中，最好在深層通氣條件下培養(yǎng)玫瑰紅黃馬杜拉放線菌CCTCC NoM88088的突變株。UK-61，689是一種有價值的酸性多環(huán)醚抗生素和強抗球蟲劑。本發(fā)明特別涉及得自玫瑰紅黃馬杜拉放線菌CCTCC NoM88088的突變株CCTCC NoM88089和M88087，其特征在于它們能在產生UK-61，689的同時產生UK-58，852;涉及CCTCC NoM88087的一個突變株，其特征在于它能在產生UK-61，689時基本上不產生UK-58，852，所述突變株具有玫瑰紅黃馬杜拉放線菌CCTCC NoM88086的鑒定特征。
產生UK-61，689和UK-58，852的微生物是從玫瑰紅黃馬杜拉放線菌的一個稱為FD-27684(CCTCC NoM88088)的新菌株突變而得到的，該新菌株是從采自日本鐮本山江村(YamaeVillage，Kamamoto，Japan)的土壤樣品中分離的。
用N-甲基-N′-硝基-N-亞硝基胍(NTG)作為誘變劑，然后考察經(jīng)處理微生物的單菌落的UK-61，689的產生。一般的步驟包括在28℃下，在深層好氣條件下在液體營養(yǎng)培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)CCTCC NoM88088。生長階段培養(yǎng)基的選擇并不重要。培養(yǎng)基中含有西瑞糖(10.0克)、玉米淀粉(5.0克)、玉米漿(5.0克)、N Z Amine YTT(5.0克)(酪蛋白酶解物的注冊商標，Humko Sheffield化學公司)、氯化鈷(0.002克)，將該培養(yǎng)基懸浮在1升水中，用氫氧化鈉調PH至7.0，分裝(800毫升)到一個費氏燒瓶中。高壓滅菌后，用斜面生長懸浮液或凍干的營養(yǎng)菌絲體接入瓶中，而后在約200轉/分的搖床上28℃下振蕩培養(yǎng)8天。然后取出50毫升樣品，菌絲體用特氟隆杵組織研磨器勻漿，隨后再進行超聲波斷裂。離心斷裂的菌絲體，洗去培養(yǎng)液，再懸浮在裝有50毫升新鮮培養(yǎng)液的300毫升三角瓶中，在32℃下?lián)u瓶培養(yǎng)2小時，然后再離心細胞，用無菌水洗去培養(yǎng)液，再懸浮于50毫升PH9.0的三(羥甲基)氨基甲烷-蘋果酸緩沖液中。各份懸浮液再在34℃下，在250-300轉/分的旋轉水浴搖床上，用濃度為每毫升750-1500微克的誘變劑NTG處理1小時。離心處理后的細胞，用無菌水洗去誘變劑，并懸浮于裝有新鮮生長培養(yǎng)基的三角瓶中，32℃下在200轉/分的柜式搖床上振蕩培養(yǎng)。3天后，對生長良好的菌絲體作勻漿和超聲處理。對每份超聲過的菌懸液進行逐級稀釋并涂在固體營養(yǎng)培養(yǎng)基上，平皿在28℃下進行培養(yǎng)，直到菌落形成單位的大小足以轉接到斜面上為止。一種適合于平皿和斜面的培養(yǎng)基是N-Z Amine Type A(Humko Sheffield化學公司)減至1.0克/升的172號ATCC培養(yǎng)基。使接種后的斜面在28℃生長10-14天，而后就可以用作試驗了。該試驗是接種300毫升三角瓶中裝有的25毫升合適培養(yǎng)基(這樣一種培養(yǎng)基含有西端糖，45.0克;黃豆粉，10.0克;玉米漿，15.0克;MnSO4·H2O，0.1克;MgSO4·7H2O，0.1克;氯化鈷，0.002克;碳酸鈣，3.0克;水1升，調培養(yǎng)基的PH至7.0)。121℃高壓滅菌30分鐘后，用斜面生長懸浮液分別接入三角瓶中，在New Brunswick搖床上，28℃振蕩培養(yǎng)7天。為檢測突變株培養(yǎng)物FD-28454(CCTCC NoM88089)，使用所收集的全培養(yǎng)液經(jīng)甲基異丁酮抽提，薄層層析(硅膠)展層后用香草醛試劑噴層析板，在100℃下加熱5分鐘后進行考察。展層系統(tǒng)為9份氯仿與1份甲醇，在該系統(tǒng)中，UK-61，689的Rf值約為0.3，UK-58，852的Rf值約為0.65。這樣獲得的突變株培養(yǎng)物產生UK-61，689和UK-58，852的混合物。UK61，689與UK58，852的比例變化在某種程度上似乎取決于發(fā)酵條件。所得突變株的形態(tài)和培養(yǎng)特征基本如本文所述的玫瑰紅黃馬杜拉放線菌CCTCC NoM88088。該突變株的不同特征在于它能產生UK-61，689和UK-58，852的混合物，其中UK-61，689是主要產物。突變株的培養(yǎng)和UK-61，689抗生素的分離可在與以前發(fā)酵生產聚醚類抗生素所用的相似條件下進行。參見例如美國專利4，361，649。最好采取在24-36℃溫度下，用液體營養(yǎng)培養(yǎng)基在深層攪拌通氣條件下進行培養(yǎng)。培養(yǎng)用營養(yǎng)培養(yǎng)基包括可同化的碳源，如糖、淀粉和甘油;有機氮源，如酪蛋白、酶解酪蛋白、黃豆餅、棉籽餅、花生餅、麩皮、豆粉、肉粉、魚粉。生長物質的原料如可溶性谷物、魚粉、棉籽粉、酵母浸汁，還有無機鹽，如氯化鈉、碳酸鈣，以及微量元素如鐵、鎂、銅、鋅、鈷和錳也可以加以利用而產生有益的結果。發(fā)酵中如果泡沫過多，可向發(fā)酵培養(yǎng)基中加入諸如植物油或硅酮等消沫劑。容器中培養(yǎng)基的通氣對深層培養(yǎng)較合適的速度是每體積的發(fā)酵液每種通過噴嘴送入培養(yǎng)基的無菌空氣保持在0.5-2個體積?？捎冒l(fā)酵領域技術人員一般熟知的攪拌裝置來維持攪拌。攪拌的速度根據(jù)所用攪拌器的類型而定。搖瓶的轉速通常是每分鐘150-300轉，而發(fā)酵罐則通常為每分鐘300-1700轉。當然必須在接種和整個生長過程中保持無菌條件。
制備本發(fā)明抗生素所用的接種物可以使用培養(yǎng)物的斜面生長物或用該培養(yǎng)物或該培養(yǎng)物的凍融的菌絲體懸浮液接種的Roux瓶。一種適于菌株最初在斜面和Roux瓶上生長的固體培養(yǎng)基是ATCC172號培養(yǎng)基。前面提到的突變研究用的液體培養(yǎng)基也適于在凍干前制備營養(yǎng)菌絲體。生長物既可用來接種搖瓶，也可用來接種種子罐，也可用搖瓶作為種子罐的種子。搖瓶中達到最大生長通常需4-8天，而深層接種罐中的接種物通常在最適合的時間4-5天內達到最大生長。
發(fā)酵期間抗生素產物的積累可以用薄層色譜法在如前述用香草醛試劑噴霧顯跡后進行定性檢測。也可以將展層后的薄層板鋪以接種枯草桿菌(Bacillus subtilis)的腦心浸汁瓊脂，在37℃下培養(yǎng)16小時后觀察抗生素。薄層色譜也是發(fā)酵液中抽提的粗制品和純制品組成分析的有用工具。一種應用10厘米×4.6毫米C-18微孔柱，流動相是0.01M碳酸銨/乙腈/甲醇(40/200/760)的高壓液相色譜法，用折光率檢測器可以定量測出發(fā)酵液中UK-61，689和一同產生的UK-58，852的量。
由本文所述的突變株發(fā)酵產生的抗生素UK-61，689，在菌絲體和發(fā)酵液中積累，并可通過抽提所收集的全部未經(jīng)過濾的發(fā)酵液來分離和回收，即用有機溶劑如氯仿、乙酸乙酯、甲基異丁酮或丁醇在自然PH下抽提全發(fā)酵液。為了避免嚴重的乳化問題，也可分離出菌絲體，將菌絲體和澄清的發(fā)酵液分別用有機溶劑抽提。然后有機溶劑抽提液濃縮至稀漿狀，用色譜法得到純的UK-61，689。
一種典型的分離和回收抗生素的方法如下用甲基異丁酮抽提突變株發(fā)酵得到的全發(fā)酵液。真空蒸發(fā)抽提液，得到淺紅色油狀物，把它溶于乙酸乙酯中，而后倒在硅膠柱上，用乙酸乙酯洗脫硅膠柱，洗脫物用薄層色譜法進行檢測。合并含有UK-61，689的組分并蒸發(fā)至干。由此得到的UK-61，689可以用異丙醚結晶而進一步純化。
UK-61，689可以用已知方法把菌絲體發(fā)酵所得的全發(fā)酵液蒸發(fā)而回收，這些方法包括噴霧干燥或過濾或離心而從發(fā)酵液中分離菌絲體。這樣得到的菌絲體產物在菌絲體表面和菌絲體間含有UK-61，689，使得菌絲體成為UK-61，689的良好載體。
按上述制備FD-28454(CCTCC NoM88089)的方法，取上述突變株FD-28454的單菌落分離株(稱為FD-28474)本身進行NTG誘變處理。用這一方法得到另一個突變株(FD-28499)，該菌株具有玫瑰紅黃馬杜拉放線菌CCTCC NoM88088的形態(tài)和培養(yǎng)特征，當然也具有第一個產生的突變株的形態(tài)和培養(yǎng)特征。然而這個突變株(FD-28499)不同于突變株FD-28454和FD-28474，即它只產生UK-61，689而基本上不產生(即＜1%)UK-58，852。用與培養(yǎng)首先描述的突變株(FD-28454)相同的方法培養(yǎng)突變株FD-28499，用上述方法從發(fā)酵液中回收UK-61，689。
最后一個突變株(由Pfizer公司培養(yǎng)物收集處鑒定為FD-28499)、突變株FD-28454和FD-28474及起始微生物FD-27684，均已按布達佩斯條約的有關條款保藏在美國典型培養(yǎng)物保藏中心(Rockville，Maryland)，該中心是公認的提供永久保藏的保藏機構，一旦本申請被授予專利，公眾就可以索取。這幾個菌株分別定名為玫瑰紅黃馬杜拉放線菌ATCC53，664、ATCC53，674、ATCC53，665和ATCC53，666。在本申請未決期間，由美國專利和商標局局長按37CFR1.14和35 USC 122的授權并根據(jù)提交了該申請的對應申請或后續(xù)申請的國家的專利法確定誰可以索取保藏物。對公眾索取保藏微生物的所有限制，都將在對該微生物授予專利后不可改變地取消。
L.H.Huang進行了FD-27684、FD-28474及FD-28499的分類學研究，他提供了下列描述。
將每一種斜面培養(yǎng)物接種到ATCC172號培養(yǎng)液中，在28℃下?lián)u床培養(yǎng)4天。然后離心20分鐘，用無菌蒸餾水洗三次，再接種到鑒定放線菌常用的培養(yǎng)基上。
在28℃下培養(yǎng)這些培養(yǎng)物，在不同時間記錄結果，但最經(jīng)常的是在第14天記錄。使用常用術語描述顏色，但確切的顏色用Color Harmony Manual(第4版)的色條進行比較來確定。全細胞氨基酸分析方法為Becker等人所述的方法(Appl.Microbiol.，12421-423，1964)。全細胞糖分析利用Lechevalier(J.Lab.Clin.Med.71934-944，1968)及Staneck和Roberts(Appl.Microbiol.，28226-231，1974)的方法。用玫瑰紅黃馬杜拉放線菌ATCC39，697的典型培養(yǎng)物作對照。
用于培養(yǎng)物特性鑒定的鑒定培養(yǎng)基及描述其組成的參考文獻如下1.胰蛋白胨酵母浸汁液體培養(yǎng)基-(ISP1號培養(yǎng)基，Difco公司)。
2.酵母浸汁-麥芽汁瓊脂-(ISP2號培養(yǎng)基，Difco公司)。
3.燕麥粉瓊脂-(ISP3號培養(yǎng)基，Difco公司)。
4.無機鹽-淀粉瓊脂-(ISP4號培養(yǎng)基，Difco公司)。
5.甘油-天冬酰胺瓊脂(ISP5號培養(yǎng)基，Difco公司)。
6.蛋白胨-酵母浸汁鐵瓊脂-(ISP6號培養(yǎng)基，Difco公司)。
7.蔗糖察氏瓊脂-S.A.Waksman，The Actinomycetes Vol.2，1號培養(yǎng)基，P.328，1961。
8.葡萄糖-天冬酰胺瓊脂-同上，2號培養(yǎng)基，P.328。
9.本奈特氏瓊脂-同上，30號培養(yǎng)基，P.331。
10.伊姆松氏瓊脂-同上，28號培養(yǎng)基，P.331。
11.營養(yǎng)瓊脂-同上，14號培養(yǎng)基，P.330。
12.高爾登和史密斯氏酪氨酸瓊脂-R.E.Cordon and M.M.Smith，J.Bacteriol.69147-150，1955。
13.酪蛋白瓊脂-同上。
14.蘋果酸鈣瓊脂-S.A.Waksman，Bacteriol.Rev.211-29，1957。
15.明膠-R.E.Gordon and J.M.Mihm，J.Bacterol.7315-27，1957。
16.淀粉-同上。
17.有機硝酸鹽液體培養(yǎng)基-同上。
18.葡萄糖硝酸鹽液體培養(yǎng)基-S.A.Waksman，The Actinomycetes，VoL.2，1號培養(yǎng)基，P.328，1961。用3克葡萄糖代替30克蔗糖，不加瓊脂。
19.馬鈴薯胡蘿卜瓊脂-M.F.Lechevalier，J.Lab.and Clinical Med.，71934-944，1968，但只用30克馬鈴薯，2.5克胡蘿卜和20克瓊脂。
20.自來水2%瓊脂。
21.高氏1號無機鹽瓊脂-C.F.Cauze et al.，Problems in the Classificazion of Antagtonistic Actinomycetes，Eng.Ed.，P.13，1957。
22.高氏2號有機瓊脂-同上。
23.脫脂牛奶-Difco公司。
24.纖維素利用-(a)H.L.Jensen，Proc.Linn.Soc.N.S.W.55231-248，1930。
(b)M.Levine and H.W.Schoenlein，A.Compilation of Culture Media，2511號培養(yǎng)基，1930。
25.有機酸利用-R.E.Gordon et al.，Int.J.Syst.Bacteriol.2454-63，1974。
26.利用碳水化合物產酸-同上。
27.水解馬尿酸和七葉苷-同上。
28.分解腺嘌呤、次黃嘌呤、黃嘌呤和尿素-同上。
29.溶菌酶抗性-同上。
30.碳水化合物利用-C-2培養(yǎng)基，H.Nonomura and Y.Ohara，J.Ferment.Technol.49887-894，1971。
31.溫度范圍-ATCC 172號培養(yǎng)基，ATCC Culture Collection Catalogue，15th ed.，P.608，1982。
FD-27684培養(yǎng)物的描述酵母浸汁-麥芽汁瓊脂生長良好，粉紅至紅色(61/2ia，7ia，6ia)，隆起，皺折，長有白色氣絲;反面紅色(7ia);無可溶性色素。
燕麥粉瓊脂生長中度，奶油色(2ca)，略隆起，光滑或出現(xiàn)單菌落;無氣絲或氣絲稀少，白色;反面奶油色(2ca);無可溶性色素。
無機鹽-淀粉瓊脂生長弱至中度，無色至奶油色(2ca)，稀薄，光滑;無氣絲或氣絲稀少，白色;反面顏色同表面;無可溶性色素。
甘油-天冬酰胺瓊脂生長弱至中度，奶油色(2ca)，帶粉色至紅色斑點(6ea，61/2ga);無氣絲或氣絲稀少，白色;反面無色至奶油色(2ca)，帶紅色斑點;無可溶性色素。
蔗糖察氏瓊脂生長弱至中度，奶油色(2ca)，帶粉色至紅色斑點(5ea，6 1/2 ia);無氣絲或氣絲稀少，白色;反面無色至奶油色(2ca);無可溶性色素。
葡萄糖-天冬酰胺瓊脂生長中度至良好，粉色至紅色(6 1/2 ga，6 1/2 na)，隆起;光滑，顆粒至皺折;氣絲白色至淺粉色(6ea);反面紅色(6 1/2 ga，6 1/2 ia);淺淡黃色(3ca)可溶性色素。
高爾登-史密斯氏酪氨酸瓊脂生長中度至良好，粉-橙色(5ea)，中度隆起，皺折;無氣絲或氣絲稀少，白色;反面顏色同正面;淺黃色(2lc)可溶性色素。
蘋果酸鈣瓊脂生長貧乏，無色，稀薄，光滑，無氣絲;反面無色;無可溶性色素。
酪蛋白瓊脂生長中度至良好，粉-橙色至橙色(4ia，5ia)，中度隆起，皺折，無氣絲;反面淺黃至淡粉色(3ga，5ea);有褐色(3lc)可溶性色素。
本奈特色瓊脂生長良好，紅色至深紅色(6 1/2 ne，6 1/2 ng)，隆起，皺折;氣絲白色至粉色(6ea);反面紅色(6 1/2 lc);有褐色(3ne)可溶性色素。
伊姆松氏瓊脂生長良好至很好，橙色(5la，5na)，隆起，皺折，有白色氣絲;反面橙色(5ic);無可溶性色素。
營養(yǎng)瓊脂生長中度，淡橙色(5ea，5ga)，略隆起，光滑或出現(xiàn)單個菌落，無氣絲;反面淡橙色(5ga);無可溶性色素。
明膠瓊脂生長中度至良好，淺橙色(4ga)，中度隆起，光滑至皺折;氣絲稀少，白色;反面淺橙色(4ga);無可溶性色素。
淀粉瓊脂生長中度至良好，淺橙色(5ga)，中度隆起，光滑至皺折;氣絲稀少，白色;反面同正面;無可溶性色素。
馬鈴薯胡蘿卜瓊脂生長弱至中度，奶油色至淺粉色(2ca，4ca)，稀薄至略隆起;氣絲稀少，白色;反面奶油色至淺粉色(4ca);無可溶性色素。
自來水瓊脂生長弱，無色至奶油色(1 1/2 ca)，稀薄，光滑;氣絲稀少，白色;反面同正面;無可溶性色素。
高氏無機鹽培養(yǎng)基1生長中度，粉色至紅色(5ca，6la)，帶有紅色斑點(6lc)，略隆起，光滑;無氣絲或氣絲稀少，白色;反面同正面;無可溶性色素。
高氏有機培養(yǎng)基2生長中度至良好，粉-橙色(5ga)，中度隆起，略皺折，氣絲稀少，白色;反面同正面;無可溶性色素。
形態(tài)學特性培養(yǎng)7周后，在所用的任何培養(yǎng)基上都沒有發(fā)現(xiàn)孢子。然而在馬鈴薯胡蘿卜瓊脂上，菌絲末端、側枝或中間產生膨大，這些膨大體是單個的，且光滑。它們呈球形、卵圓至橢圓形，其直徑為1.2-2.5m或大小為1.2-2.2×0.9-1.8m。類似的結構也在酵母浸汁-麥芽汁瓊脂、燕麥粉瓊脂、自來水瓊脂、明膠瓊脂、蔗糖察氏瓊脂及高氏無機鹽1號培養(yǎng)基上發(fā)現(xiàn)。
生化特性不產生黑色素;不產生硫化氫;液化明膠;不水解淀粉;硝酸鹽還原至亞硝酸鹽;在Jensen氏纖維素培養(yǎng)基上稍有生長，而在Levine和Schoenlein氏纖維素培養(yǎng)基上不生長;在二種纖維素培養(yǎng)基上均不被分解;在牛奶上凝固并胨化;蘋果酸鈣分解陰性;酪氨酸分解陽性;酪蛋白分解陽性。
碳水化合物利用利用葡萄糖、鼠李糖和蔗糖;不利用阿拉伯糖、果糖、肌醇、甘露醇、棉籽糖和木糖。
陽性試驗有醋酸鹽、丙酸鹽和丙酮酸鹽的利用;利用葡萄糖、鼠李糖、麥芽糖和海藻糖產酸。
以下試驗為陰性分解腺嘌呤、黃嘌呤、次黃嘌呤和尿素七葉苷、馬尿酸鹽水解;溶菌酶抗性;利用苯甲酸鹽、檸檬酸鹽、糊精、乳酸鹽、蘋果酸鹽、粘酸鹽、草酸鹽、酚和琥珀酸鹽;利用下列物質產酸阿拉伯糖、果糖、肌醇、甘露醇、棉籽糖、蔗糖、木糖、核糖醇、纖維二糖、衛(wèi)茅醇、赤蘚糖醇、半乳糖、甘油、乳糖、甘露糖、松三糖、蜜二糖、α-甲基-D-葡萄糖苷、核糖、水楊苷、山梨醇、山梨糖和淀粉。
全細胞分析全細胞水解液含內消旋二氨基庚二酸、半乳糖、葡萄糖、馬杜拉糖、核糖和鼠李糖。
溫度關系21℃ 28℃ 37℃ 45℃中度生長 生長良好 中度生長 不生長培養(yǎng)物FD-27684的特征是不產生黑色素基絲粉紅色、粉-橙色、橙色至紅色;全細胞組分含內消旋二氨基庚二酸和馬杜拉糖。盡管培養(yǎng)時間長達7周，培養(yǎng)物仍不產生孢子，但在一些培養(yǎng)基上產生菌體膨大現(xiàn)象。它可歸于馬杜拉放線菌屬。
培養(yǎng)物FD-27684在大多數(shù)培養(yǎng)特征和幾乎所有生化特性上與玫瑰紅黃馬杜拉放線菌Huang ATCC39，697(見歐洲專利申請169001)相似。在明膠瓊脂和淀粉瓊脂上，F(xiàn)D-27684的菌落是淺橙而不是淡奶油色。在酪氨酸瓊脂和伊姆松氏瓊脂上，它們呈淡橙色而不是褐色。培養(yǎng)物FD-27684不同于玫瑰紅黃馬杜拉放線菌，它使牛奶凝固。這些區(qū)別甚小，因而認為培養(yǎng)物FD-27684為玫瑰紅黃馬杜拉放線菌的新菌株。
同親代培養(yǎng)物FD-27684相比較，突變株FD-28474在酵母浸汁-麥芽汁瓊脂、本奈特氏瓊脂、高氏有機2號培養(yǎng)基、明膠瓊脂和淀粉瓊脂上產生的氣絲較少，在伊姆松氏瓊脂上該突變株的菌落是奶油色而不是橙色;在馬鈴薯胡蘿卜瓊脂上是淺粉色而不是奶油色至淺粉色。該突變株與其親代不同而產生硫化氫。其余所有培養(yǎng)特征和生化特性都相同。因此認為突變株FD-28474為玫瑰紅黃馬杜拉放線菌的一個新菌株。
來自培養(yǎng)物FD-28474的突變株FD-28499與親代比較，它幾乎具有FD-28474的所有培養(yǎng)特征和所有的生化特性。該突變株不同于培養(yǎng)物FD-28474的只是在酵母汁-麥芽汁瓊脂上為深褐色而不是深紅色菌落，在高氏有機2號培養(yǎng)基上出現(xiàn)一些粉色斑點。因此，認為突變株FD-28499是玫瑰紅黃馬杜拉放線菌的新菌株。
FD-28454未進行分類學研究。然而由于它來自玫瑰紅黃馬杜拉放線菌的一個菌株，并且經(jīng)突變后產生玫瑰紅黃馬杜拉放線菌的一個菌株，因此認為它是玫瑰紅黃馬杜拉放線菌的一個菌株。
抗生素UK-61，689對多種革蘭氏陽性微生物的生長具有抑制作用。下面表1總結了體外試驗的結果。在這一試驗中將每一種微生物接種在含有營養(yǎng)培養(yǎng)基和不同濃度的UK-61，689抗生素的一組試管中，測定該化合物在24小時內抑制微生物生長的最低濃度(MIC)，以微克/毫升表示。
表Ⅰ抗菌活性微生物 菌株號 MIC(微克/毫升)產氣莢膜梭菌(Clostridium perfringens) 10A006 5010A009 12.5化膿放線菌(Actinomyces pyogenes) 14D002 5014D008 5014D011 50豕痢疾密螺旋體(Treponema hyodysenteriae) 94A001 3.1294A002 3.1294A007 1.5694A008 1.56用下列方法得到UK-61，689及其鹽抑制雞球蟲感染效力的數(shù)據(jù)。每組3-5只10日齡的無病白色來航公雛雞，喂以含有UK-61，689或其鈉鹽和/或鉀鹽均勻分散于其中的糊狀飼料。喂養(yǎng)24小時后，每只雞口服接種艾美球蟲(Eimeria)特定種的蟲囊進行試驗。另一群10日齡雛雞，以3-5只為一組，喂以不含UK-61，689抗生素或其鹽的相同糊狀飼料。24小時后也用球蟲感染作為感染的對照。另外一組3-5只10日齡雛雞喂以不含UK-61，689抗生素的同樣飼料，但不用球蟲感染，作為正常對照。5天后評價小腸艾美球蟲(E.acervulina)的處理結果，六天后評價所有其余的處理結果。
用于衡量抗球蟲活性的準則為柔嫩艾美球蟲(E.tenella)病變以0-4評分(J.E.Lynch，“A New Method for the Primary Evaluation of Anticoccidial Activity”，Am.J.Vet.Res.，22，324-326，1961);其它球蟲根據(jù)J.Johnson和W.H.Reid所設計的評分系統(tǒng)進行改進而以0-3評分(“Anticoccidial Drugs.Lesion Scoring Techniques in Battery and Floor Pen Experiments in Chicks，”Exp.Parasit.，28，30-36，1970)。由每個處理組的病變評分除以感染對照的病變評分來確定常數(shù)比率。
UK-61，689及其陽離子鹽表面出極好的抗家禽球蟲感染的活性。當以15-120ppm量摻入雞飼料時，這些化合物可有效地控制由柔嫩艾美球蟲、小腸艾美球蟲、巨型艾美球蟲(E.maxima)、布氏艾美球蟲(E.brunetti)和盲腸艾美球蟲(E.necatrix)引起的感染。
本發(fā)明化合物用來防治家禽球蟲病時，以合適的載體口服給藥。較為方便的是將藥物簡單地分散在飲用水或家禽飼料中，使藥物的治療劑量隨每天飲水或家禽喂飼時攝入。藥物可直接計量混和在飲水中，最好以液體劑型、水溶性濃縮劑型(如水溶性鹽的水溶液)混合，或者直接以上述形式加入飼料中，或以預混物或濃縮液形式加入飼料中。常用治療劑在載體中的預混物或濃縮液將藥物摻入飼料。適合的載體按要求可為液體或固體，如常用于家禽飼料的水;各種餅料如豆餅粉、亞麻油餅粉、玉米蕊粉;以及無機鹽混合物。一種十分有效的載體是家禽飼料本身，即家禽飼料的一小部分。此外，菌絲體可以作為載體。載體使活性物質均勻分布在與預混物混和的成品飼料中。這一點很重要，因為要求這個強效藥劑有很小的比例。重要的是該化合物要充分混和到預混物中，隨后混和到飼料中。為此，藥劑可分散或溶解到合適的油性載體中，諸如豆油、玉米油、棉籽油等，或者溶解在一種揮發(fā)性有機溶劑中，然后再與載體混和。應該認識到，濃縮物中活性物質的比例可有廣泛的變化，因為成品飼料中藥劑的量可以靠適當比例的預混物與飼料混合加以調節(jié)來達到所要求的治療劑量。
高效濃縮劑可以由飼料加工廠用蛋白質載體如豆餅粉和其他上述餅粉進行混和，產生濃縮的輔料，它適于直接飼喂家禽。在這些情況下，允許家禽消耗普通的飼料。此外，這些濃縮輔料可直接加到家禽飼料中產生一種營養(yǎng)上平衡的，含有有效治療量的本發(fā)明化合物的成品飼料?；旌衔锟梢圆捎脴藴实姆椒ǔ浞只旌停缬靡慌_雙殼混合機來達到均勻。
當然，對本領域技術人員顯而易見的是，這里所述的化合物的用量在不同情況會有不同。在生長期間，即在雛雞的頭6-12周期間連續(xù)低劑量投藥，是一種有效的預防措施。在治療已發(fā)生的感染時，可能需要用較高劑量來消除感染。飼料中的用量一般在15-120ppm范圍內。在飲用水中給藥時，其劑量應提供同樣的藥物日劑量，即15-120ppm，這要用飼料的平均日耗量和水的平均日耗量的重量比來換算。
用以下實施例說明本發(fā)明。然而要理解的是本發(fā)明不限于這些實施例的具體描述。
實例1A.接種物的制備制備具有下列組成的無菌液體培養(yǎng)基。
成分 克/升西瑞糖 10.0玉米淀粉 5.0玉米漿 5.0NZ Amine YTT★ 5.0氯化鈷 0.002
★(為酶解酪蛋白的注冊商標，Humko Sheffield化學公司)調PH至7.0后，培養(yǎng)基分裝(800毫升)到2800毫升的費氏燒瓶中，塞上棉塞并包上紙，121℃下(15磅/英寸2)高壓滅菌60分鐘。冷卻后，用FD-28454(CCTCC NoM88089)斜面的營養(yǎng)細胞懸浮液接種培養(yǎng)基。將燒瓶放在振幅1.5-2.5英寸，每分鐘150-200轉的旋轉搖床上，28℃振蕩培養(yǎng)6天。
B.UK-61，689的發(fā)酵和分離用裝有800毫升培養(yǎng)后的培養(yǎng)物的費氏燒瓶接種14升發(fā)酵罐，發(fā)酵罐內裝有8升加有4毫升硅酮消泡劑的無菌培養(yǎng)基，其組成如下成分 克/升西瑞糖 45.0豆粉 10.0玉米漿 15.0血粉 5.0玉米粉 5.0MnSO4·H2O 0.1MgSO4·7H2O 0.1CoCl2·6H2O 0.002CaCO33.0調PH至6.9-7.0發(fā)酵在30℃下進行至產生大量活性，攪拌轉速為每分鐘500轉，通氣量每分鐘每體積培養(yǎng)基0.75體積空氣。發(fā)酵液及回收液中的UK-61，689/UK-58，852可以用硅膠薄層色譜板觀察，展層系統(tǒng)為氯仿∶甲醇(9∶1)。展層后的層析板噴以香草醛試劑(6克香草醛在100毫升乙醇和3%濃硫酸中的溶液)，100℃加熱5分鐘。UK-61，689顯示淡紅-藍色斑點。也可以將層析板鋪以接有枯草桿菌的瓊脂，瓊脂中先加入0.4毫升5%2，3，5，-三苯基-2H-四唑氯化物溶液。37℃培養(yǎng)16小時后觀察在紅色背景上的無色抗生素區(qū)。
全發(fā)酵液用甲基異丁酮進行抽提，濃縮溶劑得到14.4克殘留物。殘留物在用含乙酸乙酯的柱用硅膠G(70-230目，Woelm)裝填的6×100厘米柱上進行層析，用乙酸乙酯洗脫，流速約每分鐘20毫升。每10毫升收集一份。
用Analtech硅膠CF板進行薄層層析，用氯仿∶甲醇(9∶1)展層，噴以香草醛試劑顯示，加熱后檢查各組分。
合并含有UK-61，689抗生素的部分(總體積大約200毫升)，加約2克Darco G60攪拌15分鐘。過濾除去碳后，濾液(乙酸)乙酯)用5%經(jīng)1N氫氧化鈉調PH至10.0的磷酸氫二鈉緩沖液洗。分離后，乙酸乙酯層用無水硫酸鈉干燥，然后真空蒸發(fā)。蒸發(fā)后剩下的粘性油再用少量庚烷溶解而出現(xiàn)結晶。過濾收集結晶，真空干燥后得到1.4克抗生素UK-61，689鈉鹽;熔點167℃;C13核磁共振(CDCl3)(ppm)179.16，107.54，103.21，97.80，97.01，87.02，84.65，84.28，82.39，82.10，80.92，80.28，79.96，77.62，77.18，76.60，74.91，74.65，73.15，70.19，67.74，66.94，59.07，56.84，45.49，39.92，39.00，36.55，33.88，33.79，33.63，33.51，33.21，32.51，32.33，30.63，27.64，26.98，26.91，26.16，23.25，18.43，17.53，17.00，12.13，11.05，10.4，
合并含有UK-58，852的部分，如上述用約2克Darco G60處理，然后濃縮。將殘留物懸浮于己烷中，用硅膠在過濾漏斗上分批處理。用己烷洗吸附劑，然后用氯仿和乙酸乙酯洗脫。濃縮乙酸乙酯部分，殘留物在硅膠上再層析，產物用庚烷結晶得到白色固體的UK-58，852抗生素。
實例2按照實例1的方法進行，但用FD-28499(CCTCC NoM88086)代替FD-28454(CCTCC NoM88089)。全發(fā)酵液的甲基異丁酮抽提物經(jīng)高壓液相色譜得到的UK-61，689基本上不含UK-58，852(＜1%)。它的薄層層析行為與實例1報告的UK-61，689相同。
酸型UK-61，689的制備是用鈉鹽的氯仿溶液與等體積的水攪拌，并用磷酸將PH降至3.0。然后分離各相，真空下蒸發(fā)氯仿，得到抗生素UK-61，689的游離酸。
實例3按照實例1的方法發(fā)酵FD-28474(CCTCC NoM88087)，不同的是發(fā)酵培養(yǎng)基不含玉米漿或血粉。合并4份發(fā)酵全液進行過濾。濾液和菌絲體分別用甲基異丁酮(3×200毫升)抽提。合并抽提液后減壓濃縮至油狀(18.5克)。將油狀物溶于丙酮(200毫升)，然后將該溶液分為二等份(Ⅰ和Ⅱ)。
Ⅰ份加氫氧化鈉溶液(20%)調PH至12。將此堿性溶液過濾并減壓濃縮成油狀。向該油狀物中加入丙酮(10毫升)、庚烷(79毫升)和水(39毫升)，產生深褐色結晶。將結晶再溶解在庚烷中，得到2克淺褐色結晶，用高壓液相色譜分析含有75% UK-61，689和5% UK-58，852。
將Ⅱ份減壓濃縮至油狀，將油狀物溶于100毫升乙酸乙酯中。然后上硅膠(500克)柱進行層析，用乙酸乙酯作洗脫劑。合并富含UK-61，689的部分并濃縮至油狀。把油狀物溶于丙酮(10毫升)-庚烷(110毫升)中，所得UK-61，689結晶進行過濾和干燥(1.2克)。UK-58，852未回收。
權利要求
1.一種制備抗球蟲劑組合物的方法，該方法包括回收由發(fā)酵玫瑰紅黃馬杜拉放線菌CCTCC M88087、M88086或M88089所產生的菌絲體所帶的UK-61，689，所述發(fā)酵是在深層通氣發(fā)酵條件下，在含有可同化的碳源、氮源和無機鹽的液體營養(yǎng)培養(yǎng)基中，發(fā)酵至在全發(fā)酵液中積累大量所述化合物。
全文摘要
公開了幾個玫瑰紅黃馬杜拉放線菌突變株，其特征在于，它們能通過發(fā)酵而產生UK-61，689，UK-61，689是一種以前只靠UK-58，852的選擇性酸水解才能得到的酸性多環(huán)醚類抗球蟲抗生素；還公開了具有CCTCC NoM88088、CCTCC NoM88087、CCTCC NoM88086和CCTCC NoM88089的鑒定特征的玫瑰紅黃馬杜拉放線菌。
文檔編號C12P19/58GK1089657SQ9311275
公開日1994年7月20日 申請日期1993年12月14日 優(yōu)先權日1987年10月26日
發(fā)明者愛德華·約瑟夫·泰南 申請人:美國輝瑞有限公司