專利名稱：雞生長激素基因及其在大腸桿菌中的表達(dá)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一個雞生長激素基因和它的表達(dá)以及表達(dá)的雞生長激素的純化。更具體的是指本發(fā)明涉及一個可用于在大腸桿菌中進(jìn)行大量生產(chǎn)雞生長激素的雞生長激素基因，用此基因構(gòu)建的表達(dá)載體，用此表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的大腸桿菌細(xì)胞，以及用此大腸桿菌轉(zhuǎn)化體生產(chǎn)雞生長激素的方法和純化由大腸桿菌生產(chǎn)雞生產(chǎn)激素的方法。
到目前為止，在家畜育種中，通過在常規(guī)飼料中混入高蛋白物質(zhì)或類固醇激素而大大提高了飼料利用率并使家畜體重增加，然而，高蛋白物質(zhì)的來源是有限的，使用類固醇激素由于其在動物體內(nèi)長時期殘留，可能會對人體產(chǎn)生一定的副作用，因而已被嚴(yán)格控制。
相比之下，近期已被開發(fā)出來的動物生長激素卻不殘留在動物體內(nèi)，而且具有特異性，因此被認(rèn)為對人類是無害的。據(jù)此，動物生長激素被認(rèn)為在促進(jìn)動物快速生長方面是一種理想的材料。
動物生長激素是一種單股鏈球蛋白，大約由190至200個氨基酸組成(參見Barrinton等，AcademicPress，N.Y.，2(1979))，它是參與調(diào)節(jié)脂類和碳水化合物以及蛋白質(zhì)新陳代謝從而促進(jìn)動物組織生長的幾種蛋白質(zhì)激素之一。
在動物腦垂體前葉產(chǎn)生的生長激素是從在氨基端含有一段信號順序的生長激素前體中成熟而得。生長激素前體當(dāng)通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)時經(jīng)切去一段信號序列就成為成熟的功能性生長激素(Davies等，Nature283，433-438(1980))。
生長激素通過促進(jìn)氨基酸進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)而加快動物的平衡生長，同時刺激mRNA的轉(zhuǎn)譯，促使細(xì)胞的分裂增殖，這對于生長是一個非常重要的因素。因而，注射生長激素的動物在沒有增加飼料量作為提高組織蛋白質(zhì)的手段時，體重仍提高得很快。
目前大多數(shù)動物生長激素的全序列氨基酸順序已經(jīng)確定，也有一些動物生長激素基因已經(jīng)在大腸桿菌中克隆和表達(dá)，例如人、牛、豬和大鼠(Miller等，JBC255，7521-7524;Martial等，Science205，602-607(1979);Seeburg等，Nature270，486-494(1977))?？墒堑侥壳盀橹谷圆豢赡軕?yīng)用基因工程的方法在大腸桿菌中大規(guī)模地生產(chǎn)雞生長激素。
在大腸桿菌轉(zhuǎn)化體中生產(chǎn)的雞生長激素常常形成一個包涵體，因而應(yīng)將其包涵體溶解才能從大腸桿菌轉(zhuǎn)化體中分離出雞生長激素。然而，已知有幾種溶解方法，例如，使用脲、胍鹽或十二烷基硫酸鈉(Sodiumdodecylsulfate)等，但它們都有與如下因素有關(guān)的某些缺陷，如純化費用高，純化過程過于復(fù)雜以及產(chǎn)量低等。
此外，還有一些純化方法，例如，單克隆抗體親和層析法(B.Houston等.，J.Endocr.125，207-215(1990))和陰離子、陽離子交換層析的聯(lián)合應(yīng)用(L.M.Souza等，J.Exp.Zoology，232，465-474(1984))?？墒?，單克隆抗體親和層析法因生產(chǎn)單克隆抗體成本費用很高，不適宜大規(guī)模純化。Souza的方法高度復(fù)雜，還有要除去大腸桿菌源的熱源物質(zhì)的問題。
本發(fā)明的目的是提供一個被設(shè)計成能在大腸桿菌中有效表達(dá)和能用于大規(guī)模生產(chǎn)雞生長激素(CGH)的雞生長激素基因。
本發(fā)明的另一個目的是提供一種含有所說的CGH基因的表達(dá)載體和用該載體轉(zhuǎn)化的大腸桿菌細(xì)胞。
本發(fā)明的進(jìn)一步目的是提供一種用大腸桿菌轉(zhuǎn)化體生產(chǎn)CGH的方法。
本發(fā)明的另一個目的是提供一種有效分離和純化在大腸桿菌轉(zhuǎn)化體上生產(chǎn)的CGH的方法，在該方法中主要采用了用堿試劑溶解在大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的CGH包涵體。
相應(yīng)地，與本發(fā)明的一個方面是在

圖1示出了CGH基因的核苷酸序列，該序列被設(shè)計成能在大腸桿菌中生產(chǎn)成熟CGH。
本發(fā)明的另一個方面是提供一個含有所述CGH基因的表達(dá)載體和用該載體轉(zhuǎn)化的大腸桿菌細(xì)胞。
本發(fā)明還有一個方面是提供一個在大腸桿菌轉(zhuǎn)化體上生產(chǎn)CGH的方法，這主要是在適合表達(dá)CGH基因的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)大腸桿菌轉(zhuǎn)化體而獲得CGH。
為本發(fā)明的另一個方面是提供一種純化CGH的方法，它包括從生產(chǎn)雞生長激素的大腸桿菌轉(zhuǎn)化體中分離不溶性包涵體;用含有表面活性劑和乙二胺四乙酸(EDTA)的溶液洗不溶性包涵體，然后，進(jìn)一步用含有NaCl的緩沖液或蒸餾水洗;在一種堿性溶液中懸浮已洗過的包涵體以溶解集聚在包涵體內(nèi)的CGH;離心該懸液收集上清液，進(jìn)行超濾，濾液中即含有溶解的CGH;再通過一個陽離子交換樹脂層析柱。
本發(fā)明的CGH基因是以L.M.Souza等(J.ofExp.Zoology232，465-473(1984))所描述的氨基酸序列為基礎(chǔ)設(shè)計出來的，具體如下(ⅰ)在成熟CGH的N-末端氨基酸蘇氨酸密碼之前放入一個甲硫氨酸的起始密碼。
(ⅱ)在成熟CGH的C-末端氨基酸異亮氨酸的密碼后放入兩個終止密碼TAG和TAA以便轉(zhuǎn)譯時在異亮氨酸處終止。
(ⅲ)幾種限制性內(nèi)切酶的識別位點被引入該基因以便使修飾該基因方便些，這些位點為SacI(5′-GAGCTC-3′，含有第17位氨基酸精氨酸的密碼)，EcoRI(5′-GAATTC-3′;含有第31位氨基酸谷氨酸的密碼)，BalⅡ(5′-GAGTCT-3′;含有第115位氨基酸天冬氨酸的密碼)，和HindⅢ(5′-AAGCTT-3′;含有第121位氨基酸谷氨酰胺的密碼);以及，(ⅳ)能夠形成二級結(jié)構(gòu)的核苷酸序列或亞序列通過替代某些核苷酸而加以修飾，這樣可使CGH的表達(dá)在轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)譯水平達(dá)到最佳狀態(tài)。
CGH基因的全部核苷酸序列可按已知的常規(guī)方法，如用DNA合成儀或聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)，進(jìn)行合成而得。
本發(fā)明用于在大腸桿菌表達(dá)所述的CGH基因的表達(dá)載體可通過使用能夠適應(yīng)大腸桿菌的各種表達(dá)系統(tǒng)來制備。
例如，可使用ptrp322H-HGH載體來制備，該載體在韓國公開專利出版物No.91-457中有描述(含有所述的ptrp322H-HGH載體的宿主細(xì)胞大腸桿菌W3110已經(jīng)保藏于韓國微生物菌種保藏中心，代號為KFCC-10667)。具體說就是該載體制備是用在圖1中所示的CGH基因替換在ptrp322H-HGH中的人生長激素基因，這將在后面的實施例中加以描述。
這樣獲得的含有CGH基因的表達(dá)載體被命名為ptrp-CST。由此轉(zhuǎn)化的大腸桿菌W3110(ATCC27325)為專利程序目的按國際微生物保藏布達(dá)佩斯條約于1991年6月26日保藏在韓國微生物菌種保藏中心，編號為KCCM-10005。
用含有CGH基因的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的大腸桿菌細(xì)胞在能夠使CGH基因表達(dá)的條件下培養(yǎng)，進(jìn)一步按載體和大腸桿菌受體細(xì)胞的特征進(jìn)行確定。
例如，用ptrp-CST表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的大腸桿菌W3110細(xì)胞在含有氨芐青霉素的M9培養(yǎng)基中培養(yǎng)，當(dāng)在650nm下光密度值(OD)達(dá)到0.5時，加入吲哚丙烯酸繼續(xù)培養(yǎng)。
在大腸桿菌轉(zhuǎn)化體內(nèi)生產(chǎn)的CGH可通過一系列步驟進(jìn)行分離和純化，這些步驟包括細(xì)胞破裂、離心、溶解，調(diào)pH至堿性，過濾和層析。
具體講就是通過在培養(yǎng)好的細(xì)胞內(nèi)加入溶菌酶再進(jìn)行超聲以破碎細(xì)胞。破碎的細(xì)胞離心沉淀，收集含有CGH包涵體的沉淀物。
該沉淀物用含用表面活性劑(如0.1%-1%曲拉通(Triton)X-100)和EDTA的緩沖液洗一次，然后，再換用另外一種緩沖液(如含有100-500mM NaCl或NH4Cl的pH7.2溶液)或蒸餾水洗以除去細(xì)胞膜和其它雜蛋白。這樣獲得的CGH包涵體重新懸浮在蒸餾水中，然后緩慢加入堿溶液(NaOH或KOH溶液)、邊加邊攪，使pH調(diào)整到11.5至13.0之間，優(yōu)選為11.8至12.3。將該懸液進(jìn)一步離心以除去不溶性雜質(zhì)。上清懸液用超濾過濾獲得含有可溶性CGH的溶液，調(diào)濾液pH到8.5和10.5之間，優(yōu)選為9.0至9.5。經(jīng)調(diào)整后的濾液加入到陰離子交換層析柱，最好為DEAE(二乙氨乙基纖維素)柱進(jìn)行層析以獲得純度為95%以上的高純CGH和低于10單位/毫克濃度的內(nèi)毒素。
本發(fā)明克服了現(xiàn)有技術(shù)中CGH生產(chǎn)方法的不足，得到了一種高純度低內(nèi)毒素含量的雞生長激素。
下面的實施例將在不限于本發(fā)明的范圍內(nèi)具體說明本發(fā)明的內(nèi)容。在實施例中使用的試驗方法如果沒有特別說明應(yīng)按參考例所給的內(nèi)容進(jìn)行。
附圖簡要說明如下圖1顯示本發(fā)明CGH基因核苷酸序列和由此推衍的氨基酸序列;
圖2描述了獲得圖1所示CGH基因的方案。
圖3顯示了構(gòu)建含有用于在大腸桿菌中表達(dá)CGH基因的表達(dá)載體。
圖4顯示在適合CGH基因表達(dá)的條件下培養(yǎng)的大腸桿菌轉(zhuǎn)化體SDS-PAGE(十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳)的結(jié)果。
圖5提供了在適合CGH基因表達(dá)條件下培養(yǎng)的大腸桿菌內(nèi)純化后CGH的SDS-PAGE結(jié)果。
圖6揭示了純化CGH的HPLC(離效液相色譜)的結(jié)果。
除非特別提及、否則下述中出現(xiàn)的固體混合物中的固體成份，溶液中的液體成份以及液體中的固體成份均分別以重量/重量(wt/wt)，體積/體積(vol/vol)和重量/體積(wt/vol)為基礎(chǔ)。
參考例1限制性核酸內(nèi)切酶消化DNA
這里使用的限制性核酸內(nèi)切酶和反應(yīng)緩沖液均購自NEB(NewEnglandBiolabs，Jolla，MA，U.S.A.)。
該反應(yīng)通常在一個滅菌的Eppendorf管中進(jìn)行，反應(yīng)體積在50μl-100μl，在37℃反應(yīng)1-24小時，之后，該反應(yīng)混合物在65℃進(jìn)行15分鐘熱處理(或用酚抽提、乙醇沉淀以防止熱抗性內(nèi)切酶的作用)用于滅活限制性核酸內(nèi)切酶。
用于限制性核酸內(nèi)切酶反應(yīng)的10X反應(yīng)緩沖液有下列組成10X NEB反應(yīng)緩沖液1100mM雙Tris丙烷鹽酸(bis Tris propane-HCl)、100mM氯化鎂(MgCl2)、10mM二硫蘇糖醇(dithiothreitol，DTT)，pH7.0;
10X NEB反應(yīng)緩沖液2100mM Tris-HCl，100mM MgCl2，500mM NaCl，10mM DTT，pH7.0;
10X NEB反應(yīng)緩沖液3100mM Tris-HCl，100mM MgCl2，1000mM NaCl，10mM DTT，pH7.0;
10XNEB反應(yīng)緩沖液4200mMTris-乙酸、100mM乙酸鎂，500mM乙酸鉀，10mMDTT，pH7.0。
參考例2酚抽提和乙醇沉淀在完成酶反應(yīng)之后，反應(yīng)混合物用酚抽提，其目的是要滅活限制性核酸內(nèi)切酶的作用和獲得反應(yīng)混合物中的DNA。這里需要指出的是使用的酚需預(yù)先用含有10mMTris-HCl(pH8.0)和10mMEDTA(乙二胺四乙酸)緩沖液平衡。酚抽提過程按下步進(jìn)行混合等體積的酚溶液和樣品液，劇烈震蕩;以15000rpm離心混合物5分鐘;再將水相轉(zhuǎn)入一新管中，重復(fù)進(jìn)行上述過程2-3次。
然后，用等體積氯仿溶液(氯仿∶異丁醇＝24∶1)抽提水相，再分離出水相，向內(nèi)加入0.1體積的3M乙酸鈉溶液和2.5體積的乙醇，置-70℃停留30分鐘或在-20℃停留12小時以便使核酸析出，之后，在4℃，以15000rpm離心混合物20分鐘，收集沉淀。
參考例3連接反應(yīng)DNA連接反應(yīng)是用購自NEB的T4連接酶和10X連接酶緩沖液(pH 7.8，0.5M Tris-HCl、0.1M MgCl2，0.2M DTT，10mM ATP，0.5mg/ml牛血清白蛋白(BSA))來進(jìn)行。反應(yīng)體積通常為20μl，10單位的T4連接酶被用于連接DNA的粘性末端，而100單位被用于連接鈍端的DNA。
反應(yīng)在16℃進(jìn)行5小時或4℃進(jìn)行14小時以上。反應(yīng)結(jié)束后，該反應(yīng)混合物在65℃加熱15分鐘以滅活T4DNA連接酶。
參考例4大腸桿菌的轉(zhuǎn)化下述實施例中使用的大腸桿菌菌株包括大腸桿菌HB101(ATCC33694)大腸桿菌W3110(ATCC27325)和大腸桿菌JM105(ATCC47016)。大腸桿菌的轉(zhuǎn)化使用了本領(lǐng)域公知的一種方法，即在Maniatis等，MolecularCloningALaboratoryManual，ColdSpringHarborPress，N.Y.(1982)或Cohen，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，69，2110(1972)上所介紹的轉(zhuǎn)化大腸桿菌的方法。
參考例5寡聚核苷酸片段的合成寡聚核苷酸片段的合成是用一個自動固相磷胺化學(xué)法(automaticsolidphasephosphoamiditechemistry)DNA合成儀(AppliedBiosystemsInc.，3808，U.S.A.)完成的。
合成的寡聚核苷酸用變性聚丙烯酰胺凝膠(2M脲、12%丙烯酰胺和雙叉丙烯酰胺(29∶1)，50mMTris，50mM硼酸，1mMEDTA)電泳和SEP-PAK(WatersInc.，U.S.A.)柱層析進(jìn)行純化的，通過在260nm處測定光密度(O.D.)值來確定其含量。
參考例6聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)給10-100ng的模板DNA混合物中加入以下物質(zhì)10μl 10X Taq聚合酶反應(yīng)緩沖液(10mM Tris-HCl，500mM KCl，15mM MgCl2，0.1%(w/v)明膠，pH8.3)，10μl dNTP′s混合物(在dGTP、dATP、dTTP和dCTP各1.25mM)，2μg每一種引物(通常，反應(yīng)使用2種引物，一旦使用4種引物，位于中間的引物使用量為0.02μg)和0.5μl Ampli Taq DNA聚合酶(Perkin Elmer Cetus，U.S.A.)，用蒸餾水調(diào)至總體積為100μl，再加入50μl礦物油以防止混合反應(yīng)蒸發(fā)。
PCR是在一個熱循環(huán)儀(PerkinElmerCetus，U.S.A)中進(jìn)行，按熱循環(huán)程序適當(dāng)重復(fù)多次，循環(huán)順序為95℃30秒鐘→55℃30秒鐘→72℃1分鐘;最后一次循環(huán)時，反應(yīng)在72℃進(jìn)行10分鐘。
在反應(yīng)完成后，混合物用酚抽提，PCR產(chǎn)品用乙醇沉淀出，再將該沉淀物溶解在20μlTE緩沖液(10mMTris-HCl，1mMEDTApH7.5)中。
實施例1雞生長激素基因的制備(1-A)構(gòu)建CGH基因的寡聚核苷酸的設(shè)計和合成為了準(zhǔn)備含在5′-端有限制性內(nèi)切酶NdeⅠ識別位點和2個終止密碼和限制性內(nèi)切酶SalⅠ的識別位點，用參考例5描述的
寡聚核苷酸CGH1在5′-端含有一個限制性內(nèi)切酶NdeⅠ的識別位點5′-CATATG-3′和在3′-端有20個核苷酸殘基與CGH2的5′-端互補。
CGH3的5′-端有20個核苷酸殘基與CGH43′-端互補，CGH5的5′-端有20個核苷酸殘基與CGH6的3′-端互補，CGH7的5′-端有20個核苷酸殘基與CGH8的3′-端互補，CGH9的5′-端有20個核苷酸殘基與CGH10的3′-端互補。
(1-B)全CGH基因的制備<第一步>
按參考例6進(jìn)行如下的第一次PCR反應(yīng)給反應(yīng)管A中加入2μg CGH1，0.02μg CGH2，0.02μg CGH3和2μg CGH4;給反應(yīng)管B中加入2μg CGH5，0.02μg CGH6，0.02μg CGH7和2μg CGH8;給反應(yīng)管C中加入2μg CGH9和2μg CGH10。分別再給上述3管中加入10μl 10X Taq聚合酶緩沖液(100mM Tris-HCl，pH8.3，500mM KCl，15mM MgCl2，0.1%(w/v)明膠)、10μl dNTP′s混合物(dGTP，dATP，dTTP，dCTP各1.25mM)，0.5μl(5單位/μl)Ampli Taq DNA聚合酶和67μl蒸餾水。熱循環(huán)順序為95℃ 30秒鐘→55℃ 30秒鐘→72℃ 1分鐘，重復(fù)該順序4次后，該后應(yīng)進(jìn)一步在72℃ 10分鐘進(jìn)行。最后的反應(yīng)混合物加樣于聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳分離出第一次PCR產(chǎn)品。該產(chǎn)品進(jìn)一步用Elutip-D(Schleicher & Schuell，U.S.A.)純化，溶解在20μl TE緩沖液(10mM Tris-HCl，pH7.5，1mM EDTA)中。
<第2步>
用第1次PCR產(chǎn)品按下述進(jìn)行第2次聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)過程。
在反應(yīng)管A中的約100ngPCR產(chǎn)品與在反應(yīng)管B中的約100ngPCR產(chǎn)品混合在反應(yīng)管D中，再加入2μgCGH1，2μgCGH8，10μl10XTaq聚合酶緩沖液、10μldNTP′s混合物、0.5μl(5單位/μl)AmpliTaqDNA聚合酶和67μl蒸餾水。該混合物進(jìn)行20次PCR循環(huán)。這樣獲得的PCR產(chǎn)品按<第1步>相同的方法處理，最后將產(chǎn)品溶解在20μlTE緩沖液之中。
<第3步>
用第2次PCR產(chǎn)品按下述介紹的程序進(jìn)行第3次PCR反應(yīng)。
在反應(yīng)管E中加入以下各反應(yīng)物大約100ng反應(yīng)管D中的PCR的產(chǎn)品、大約100ng反應(yīng)管C中的PCR產(chǎn)品，2μgCGH1，2μgCGH10，10μl10XTaq聚合酶緩沖液，10μldNTP′s混合物、0.5μl(5單位/μl)AmpliTaqDNA聚合酶和67μl蒸餾水。該混合物進(jìn)行20次PCR循環(huán)。這樣獲得的第3個PCR產(chǎn)品按<第1步>相同的方法處理，最后獲得一個片段(這里稱為CGH片段)含有完整CGH基因或全長CGH基因，也同樣溶解在20μlTE緩沖液中。制備CGH片段的全部過程在圖2中已經(jīng)說明。
實施例2表達(dá)載體的制備(2-A)CGH-N/L、PL和PN片段的制備大約2μg在實施例1中獲得的CGH片段在50μl10XNEB反應(yīng)緩沖液4中用限制性核酸內(nèi)切酶NdeⅠ(10單位)于37℃消化，之后進(jìn)行酚抽提和乙醇沉淀。含有核酸的沉淀物溶解在5μl10XNEB反應(yīng)緩沖液3中進(jìn)一步用限制性內(nèi)切酶SalⅠ(10單位)在37℃處理2小時。
另一方面，2μg以大腸桿菌W3110(KFCC-10667)分離出的質(zhì)粒ptrp322H-HGH與上述相同方式用限制性核酸內(nèi)切酶PstⅠ和SalⅠ消化，另外2μg質(zhì)粒ptrp322H-HGH用限制性核酸內(nèi)切酶PstⅠ和NdeⅠ消化。消化后的質(zhì)粒均在0.7%瓊脂糖凝膠上電泳分離出0.6Kb，1.5Kb和0.8Kb片段，分別命名為CGH-N/L片段，PL片段和PN片段。
(2-B)CGH-N/L，PL和PN片段的連接給大約100ng CGH-N/L片段，大約100ng PL片段和大約100ng PN片段的混合液中加入2μl 10X連接酶緩沖液和10單位的T4DNA連接酶;然后，加蒸餾水調(diào)整到總體積為20μl，將這種混合物溶液在16℃反應(yīng)12小時。在完成該反應(yīng)后，用反應(yīng)混合物轉(zhuǎn)化大腸桿菌HB 101(ATCC 33694);篩選出用含有CGH基因片段的ptrp-CST轉(zhuǎn)化的大腸桿菌菌落。從轉(zhuǎn)化菌體中分離出質(zhì)粒ptrp-CST，再用引物2090(5′-CATCACCGAAACGCGCGAG-3′)和引物ptrpl(5′-GACAATTAATCATCGAACTA-3′)對ptrp-CST進(jìn)行雙脫氧DNA序列分析(Sanger，F(xiàn).et al，P.N.A.S.74，5463(1977))以確定全長CGH基因的核苷酸序列。
實施例3用表達(dá)載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌和表達(dá)CGH基因在實施例2中獲得的ptrp-CST質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌W3110(ATCC 27325)，使用的方法與參考例4的方法相同;轉(zhuǎn)化菌在含有50μg/ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基(每升含10g Bacto-胰蛋白胨(Bacto-triptone)、15g酵母浸膏、5g氯化鈉)中37℃震蕩培養(yǎng)12小時。取5ml培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移至11個容量為5升含有1L40μg/ml氨芐青霉素M9培養(yǎng)基(40mM K2HPO4)，22mM KH2PO4，8.5mM NaCl，18.7mM NH4Cl，1%葡萄糖，0.1mM MgSO4，0.1mM CaCl2，0.4%酪蛋白氨基酸，10μg/ml維生素B1)培養(yǎng)瓶中在37℃下蕩培養(yǎng)3-4小時。當(dāng)每一個培養(yǎng)中培養(yǎng)物的光密度值(O.D.)在650nm處達(dá)到0.5時，以各種濃度的吲哚丙烯酸(IAA)加入使CGH基因表達(dá)(IAA以每次提高0.1mM的濃度使培養(yǎng)液中的IAA濃度從0mM到1.0mM)。在加入IAA5小時后(未加IAA的，可增加培養(yǎng)時間至12-24小時)，用離心機(Beckman J6-B，轉(zhuǎn)頭JS 4.2)3000rpm離心培養(yǎng)物25分鐘，獲得大腸桿菌細(xì)胞沉淀物。將細(xì)胞沉淀物懸浮在樣品緩沖液中，按Laemmli方法(Laemmli，Nature 227，680(1970))在12%聚丙烯酰胺凝膠上進(jìn)行電泳以確定該基因的表達(dá)，結(jié)果參見圖4。
圖4中第1和第4行表明了不含CGH基因大腸桿菌細(xì)胞樣品蛋白質(zhì)凝膠圖譜;第2和3行為含CGH基因大腸桿菌在未加IAA時培養(yǎng)12-24小時后細(xì)胞樣品蛋白質(zhì)凝膠圖譜，第5行表示在加入IAA濃度達(dá)0.1mM時培養(yǎng)含CGH基因大腸桿菌5小時細(xì)胞樣品蛋白質(zhì)凝膠圖譜。
正如在圖4中所見，可以發(fā)現(xiàn)CGH在第2，3和5行22Kd位置上可出現(xiàn)清晰的蛋白帶譜，表達(dá)量至少占整個大腸桿菌菌體蛋白量的30%。
實施例4大腸桿菌生產(chǎn)出的CGH純化(4-A)從大腸桿菌培養(yǎng)物中分離CGH包涵體給1公斤大腸桿菌培養(yǎng)物中加入4升緩沖液(50mMTris，50mMEDTA，pH7.4)，然后用Polytron攪拌器(Lightnin，ModelTS1515)攪拌3分鐘。將該液用超聲波發(fā)生儀(Cole-Pamer，Model4720)處理3分鐘，再加入0.4g溶菌酶(該品來自雞蛋蛋清部分)使在溶液中濃度達(dá)到0.1g/L，然后37℃攪拌30分鐘。
向該溶液中加入200ml20%曲拉通X-100，劇烈攪拌約5分鐘，用離心機(BeckmanJM-21)離心30分鐘，棄去上清，收集沉淀。用2升緩沖液(100mMNaCl，10mMTris，pH7.2)洗沉淀物，重新離心分離出CGH包涵體。
(4-B)CGH包涵體的溶解在上述(4-A)中獲得的CGH包涵體懸浮在8升蒸餾水中;然后向其內(nèi)分批加入1NNaOH溶液使pH達(dá)到約12.3，進(jìn)一步攪3小時，最后離心除去不溶性雜質(zhì)。
(4-C)超濾和陰離子交換層析在上述(4-B)中獲得8升上清液用分子量截流大小為3×105的濾膜進(jìn)行超濾，濃縮至1升剩余液。這個過程重復(fù)4-5次以獲得大約40升分子量為3×105或低于3×105的濾出液，該濾出液再以分子量載流大小為1×104的濾膜濃縮至20升或20升以下，用1N HCl溶液調(diào)pH至9.0。含有CGH的濃縮液上樣于DEAE-Sepharose層析柱。該柱事先用10mM甘氨酸緩沖液(pH 9.0)平衡洗柱，洗脫流速約10升/小時，洗5個柱體積10mM甘氨酸緩沖液后，再換用含有90mM NaCl的甘氨酸緩沖液洗脫。這樣獲得的洗脫液(pH 9.0)用分子量載流大小為1×104或低于1×104的濾膜超濾濃縮以獲得約3.6g 93%純單體CGH(純度為99.7%)，內(nèi)毒素含量為10單位/毫克或低于該值。
圖5顯示表達(dá)CGH大腸桿菌轉(zhuǎn)化體細(xì)胞抽提物和純化CGH的SDS-PAGE結(jié)果。
在圖5中，A行為標(biāo)準(zhǔn)蛋白分子量標(biāo)志蛋白;B行為未表達(dá)CGH大腸桿菌轉(zhuǎn)化體全細(xì)胞蛋白;C行為表達(dá)CGH大腸桿菌轉(zhuǎn)化體全細(xì)胞蛋白;D行為純化CGH，表現(xiàn)為一條清晰的約為23.5Kd帶。
純化CGH進(jìn)一步用高效液相色譜分析，結(jié)果表明純度達(dá)99.7%，HPLC的結(jié)果在圖6和表1中。
表1峰數(shù)目123總計保留時間4.6569.27811.284組份波濃度(ng/ml)0.00000.00000.00000.0000水平化濃度0.00000.00000.00000.0000峰面積0.05533124.306400.32342124.68514峰高0.000380.185920.001570.18787基質(zhì)碼BCBBCBBCB應(yīng)答系數(shù)0.00000.00000.00000.0000相對保留時間0.00000.00000.00000.0000峰面積百分值0.04499.6970.259100.000峰高百分值0.20598.9590.836100.000雖然本發(fā)明通過上述具體的實施例已得到描述，同時也應(yīng)該認(rèn)識到，本領(lǐng)域熟練的技術(shù)人員還可做各種各樣明顯與本發(fā)明有關(guān)的操作上的技術(shù)改動和變化。這些改動和變化也屬于本發(fā)明的范疇，將在權(quán)利要求中加以明確。
權(quán)利要求
1.具有下列核苷酸序列的雞生長激素基因
2.含有權(quán)利要求1中雞生長激素基因的表達(dá)載體，其中雞生長激素基因被放置在能夠在大腸桿菌細(xì)胞上表達(dá)的位置。
3.如權(quán)利要求2中的表達(dá)載體，它是ptrp-CST。
4.用權(quán)利要求2中所述的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的大腸桿菌細(xì)胞。
5.如權(quán)利要求4中的大腸桿菌細(xì)胞，它是用ptrp-CST(KCCM-10005)轉(zhuǎn)化的大腸桿菌W3110。
6.一種生產(chǎn)雞生長激素的方法，包括培養(yǎng)如權(quán)利要求4或5中的大腸桿菌。
7.一種純化雞生長激素的方法，包括從適合CGH基因表達(dá)的條件下培養(yǎng)的如權(quán)利要求4中所述大腸桿菌轉(zhuǎn)化體中分離不溶性CGH包涵體;用含有表面活性劑和乙二胺四乙酸的溶液洗包涵體，然后，再用含有NaCl或NH4Cl的緩沖液或蒸餾水清洗;在pH值范圍為11.5至13.0的堿性溶液懸浮洗過的包涵體以溶解集聚在包涵體內(nèi)的CGH;離心該懸液以獲得上清液;對上清液進(jìn)行超濾處理以獲得含有溶解的雞生長激素的濾液;將該濾液通過對陰離子交換樹脂層析柱以獲得純化的雞生長激素。
8.如權(quán)利要求7的方法，其中所述的表面活性劑為終濃度范圍為0.1至1%的曲拉通X-100(Triton X-100)。
9.如權(quán)利要求7的方法，其中所述的超濾是指用一種超濾膜進(jìn)行的，該膜只允許分子量為3×105或低于該值的物質(zhì)通過。
10.如權(quán)利要求7的方法，其中所述陰離子交換樹脂為DEAE(二乙氨乙基)樹脂。
11.如權(quán)利要求7的方法，其中所述的陰離子交換層析使用了70-150mM NaCl溶液作為洗脫液。
全文摘要
本發(fā)明涉及了雞生長激素基因和它的表達(dá)方法以及表達(dá)的雞生長激素的純化，特別是涉及了一個能在大腸桿菌中大規(guī)模生產(chǎn)激素的CGH基因，用所述表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的大腸桿菌的方法，以及用大腸桿菌轉(zhuǎn)化細(xì)胞生產(chǎn)雞生產(chǎn)激素的方法和純化大腸桿菌細(xì)胞生產(chǎn)的雞生產(chǎn)激素的方法。
文檔編號C12P21/02GK1079002SQ93102099
公開日1993年12月1日 申請日期1993年3月5日 優(yōu)先權(quán)日1992年5月9日
發(fā)明者曹重明, 樸榮烈, 林寬烈, 諸勛成, 李弘均, 崔形培 申請人:株式會社樂喜