專利名稱：生物合成絲氨酸及絲氨酸相關(guān)產(chǎn)物的材料和方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及絲氨酸以其相關(guān)產(chǎn)物，特別是色氨酸的生物合成領(lǐng)域，以及涉及生物合成的方法和生物合成中采用的材料。
絲氨酸是大量細(xì)胞代謝物生物合成中的初級(jí)中間產(chǎn)物，這些細(xì)胞代謝物包括一些具有重要經(jīng)濟(jì)價(jià)值的化合物，如膽堿，甘氨酸，半胱氨酸和色氨酸。另外，絲氨酸作為唯一的碳源供體，并負(fù)責(zé)提供四氫葉酸生成5，10-亞甲四氫葉酸過程中對(duì)一碳單位60～75%的細(xì)胞總需求。這些一碳單位被用于大量生物合成途徑中，包括合成蛋氨酸，肌苷，一磷酸鹽，其它嘌呤類以及一些嘧啶類物質(zhì)(例如，胸腺嘧啶脫氧核苷和羥甲基胞嘧啶核苷)。
如

圖1所示絲氨酸的生物合成路線在許多組織和微生物中一般都適用。在這一合成路線中，確定的第一步是將3-磷酸D-甘油酸(PGA)轉(zhuǎn)化成3-磷酸羥基丙酮酸(PGA)，這一轉(zhuǎn)化是由3-酸甘油酸脫氫酶(PGD)的作用完成的。目前編碼PGD的基因已經(jīng)克隆并已定序，PGD亞單位的氨基酸序列也已從DNA序列中被推斷出來，參見TobeyandGrant，J.Bio.Chem.261∶12179-12183(1980)在原核生物(特別是細(xì)菌)和如酵母類微生物中，野生型PGD的活性在細(xì)胞絲氨酸水平就可被抑制，但在高等的真核生物中并非如此。這種抑制作用已經(jīng)用動(dòng)力學(xué)方法加以研究過并報(bào)告存在異構(gòu)效應(yīng)。參見TobeyandGrant，J.Biol.Chem.，261∶12179-12183(1986);DubrowandPizer，J.Biol.Chem.252∶1527-1557(1977);MckitrickandPizer，J.Bacteriol.141∶235～245(1980)。
Tosa和Pizer在J.Bacteriol.106∶972～982的報(bào)告中研究過一種正常有毒的絲氨酸類似物，L-serinehydroxamate對(duì)大腸桿菌菌株的作用。在含那種類似物的生長(zhǎng)培養(yǎng)基上適應(yīng)性選擇產(chǎn)生抵抗絲氨酸的誘變體。有些誘變體表明對(duì)于與PGD無關(guān)的酶，Seryl-tRNA合成酶具有一定的修飾作用。一株誘變體的粗提物顯示出有降低絲氨酸敏感性的PGD活性(參見J.Bacteriol106∶972-982(1971);圖5;表6;以及973頁(yè)左側(cè)最下部，977頁(yè)左側(cè)最下部分)。
本發(fā)明通常涉及編碼3-磷酸甘油酸脫氫酶(PGD)的DNA，這種酶同野生型PGD相比，對(duì)絲氨酸抑制作用有低敏感性，即，這種DNA編碼PGD，該P(yáng)GD在生物合成中至少具有一定程度的酶活性，并使這種活性比野生型PGD(未修飾的)保持更高的絲氨酸水平。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述的野生型PGD是微生物，或酵母PGD。也可能更好地是工程DNA編碼的PGD，該P(yáng)GD在野生型PGDC-末端有25%的變化，最好是在C-末端的50個(gè)氨基酸內(nèi)。例如，工程DNA可以編碼含部分或全部C末端缺失的PGD。另外優(yōu)選地是，工程DNA編碼的PGD除了有上述的缺失之外，或者是另外的改變，但仍在C末端有一個(gè)插入片段(例如介于VAL363和ASN364之間插入片段或介于ALA392和GLN394之間插入片段)。
本發(fā)明還涉及a)具有上述工程DNA之氨基酸序列的PGD;b)含工程DNA的以及在宿主表達(dá)體系中，表達(dá)為工程DNA定向和定位的調(diào)節(jié)性DNA的表達(dá)載體;c)含這種表達(dá)載體的細(xì)胞;以及d)經(jīng)培養(yǎng)這一細(xì)胞生產(chǎn)絲氨酸，或絲氨酸衍生物的方法。關(guān)于上述的c)，其所述的細(xì)胞最好是缺失了野生型serA的受體細(xì)胞。
另外，另一實(shí)施方案一般來說涉及一種工程化的細(xì)胞，(例如，它含有一個(gè)重組遺傳結(jié)構(gòu))以產(chǎn)生一種在3′端有改變編碼PGD的mRNA轉(zhuǎn)錄拷貝，所述的轉(zhuǎn)錄拷貝經(jīng)細(xì)胞翻譯而產(chǎn)生同野生型PGD相比，具有對(duì)絲氨酸抑制的低敏感性PGD產(chǎn)品。
本發(fā)明提供一種重要的生物合成控制點(diǎn)的解除控制過程。從而提高從那一點(diǎn)以后下端區(qū)生產(chǎn)大量化合物，特別是包括絲氨酸，絲氨酸衍生物，如色氨酸。其它的絲氨酸細(xì)胞代謝物(即，絲氨酸在它們生物合成中是初級(jí)中間物)包括膽堿甘氨酸，半脫氨酸和依賴C1一供體化合物，如蛋氨酸，肌苷，一磷酸鹽，嘌呤類，和某些嘧啶類物質(zhì)(如，胸腺嘧啶脫氧核苷和羥甲基胞嘧啶核苷)。
附圖簡(jiǎn)要說明圖1描述了用葡萄糖來生物合成L-絲氨酸的步驟。
圖2是Tobey和Grant(前述的)報(bào)道的大腸桿菌serA基因的序列，以及從該基因中推斷出的氨基酸序列。
圖3描述了L-絲氨酸和四氫葉酸生物轉(zhuǎn)化成甘氨酸以及N5-N10-亞甲四氫葉酸的過程。
以下將結(jié)附圖詳細(xì)描述本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案制備絲氨酸不敏感的PGD1.遺傳工程的構(gòu)建物本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案涉及絲氨酸和絲氨酸相關(guān)產(chǎn)物的生物合成，如，從絲氨酸生物合成衍生上述產(chǎn)物。按照本發(fā)明、生物合成這些化合物的第一步是提供下面討論的絲氨酸不敏感的PGD。
已經(jīng)確定在PGD中存在一個(gè)特殊的絲氨酸反饋中間區(qū)域(feedbackmediatingdomain)而這一區(qū)域的改變可以降低對(duì)絲氨酸的敏感性，同時(shí)還使PGD的活性保持在能使用的水平上。圖2示出一特殊的PGD基因和氨基酸序列，這一序列可在下面討論中用做參考對(duì)照。圖2的序列包括410個(gè)氨基酸殘基(包括從成熟蛋白上切割下來的起始蛋氨酸)。這一區(qū)域能降低絲氨酸敏感性，而不破壞PGD活性，并位于該蛋白分子C-末端前25%區(qū)段，最好是C-末端前50個(gè)氨基酸殘基。
本發(fā)明的PGD修飾部分是C-末端42個(gè)氨基酸的部分或全部缺失，或者在降低絲氨酸敏感性又同時(shí)保持PGD功能的那個(gè)區(qū)域中插入一段其他片段替代這一區(qū)域。例如在纈氨酸363和天冬酰胺364之間插入一段氨基酸殘基將會(huì)增加超過野生型PGD的Ki，同時(shí)保持PGD的活性。
C-末端氨基酸殘基的部分或全部缺失會(huì)更急劇地增加Ki。例如，C-末端殘基GTIRARLLY的缺失以及用ASLD來取代這一段，經(jīng)過幾種量值指令會(huì)增加Ki，并同時(shí)使PGD的活性保持在可使用的水平。在本發(fā)明領(lǐng)域內(nèi)其它的插入片段通常介于丙氨酸392和谷氨酰胺394之間。
其他有用的修飾包括，除了上述討論的插入片段和修飾片段之外還有C-末端的其他缺失。
通過遺傳工程技術(shù)可以構(gòu)建上述提及的編碼絲氨酸不敏感的PGD基因，這種技術(shù)涉及改變編碼C-末端氨基酸的編碼區(qū)的3′末端，然后使用一個(gè)載體轉(zhuǎn)化入受體菌來表達(dá)改變后的PGD酶。
用下述的方法對(duì)絲氨酸親和性(Ki)和PGD活性來篩選出候選的改變后的酶。
2篩選遺傳工程構(gòu)建體在用上述的方法篩選遺傳構(gòu)建體中，采用了下面的測(cè)定分析PGD活性和絲氨酸敏感性的方法。
檢測(cè)PGD活性雖然對(duì)于本發(fā)明并不是十分必要，但一般來講有必要分析PGD的活性，其目的在于建立所述的改變過的酶對(duì)絲氨酸敏感性的程度。正如現(xiàn)有技術(shù)可知，酶的活性是酶分子總數(shù)與每個(gè)分子的催化活性的函數(shù)，因此，同PGD反饋?zhàn)凅w的催化活性相比，必需采取步驟以適當(dāng)?shù)乜刂朴麑?duì)比的相應(yīng)催化活性樣品PGD分子的相對(duì)數(shù)目。有許多方法可以完成這些步驟。然而，由于很難適當(dāng)?shù)亟⑵鹪谟媒厝ツ┒说膕erA基因轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞中基因表達(dá)水平(由于降低了的活性)，因此比較各種構(gòu)建體以及野生型產(chǎn)生的PGD活性最適當(dāng)?shù)姆绞绞窃谝粋€(gè)單一考貝中，染色體整合了含有標(biāo)準(zhǔn)調(diào)節(jié)部分改變后的serA基因，隨后收獲轉(zhuǎn)化體，測(cè)定相對(duì)催化活性，以同野生型細(xì)胞進(jìn)行比較。
可以采用任何能適合于測(cè)定PGD活性的方法?？梢圆捎肕ckitrick，JohnC.andLewisI.Pizer(1980)J.Bacteriol.141∶235-245的方法中正向或者反向反應(yīng)的測(cè)定來檢測(cè)PGD的活性。
上述酶分析可適用于對(duì)任何PGD酶的絲氨酸敏感性的測(cè)定，包括用化學(xué)修飾C-末端的那些PGD酶。在不同水平的絲氨酸存在下，可進(jìn)行這種分析，將絲氨酸存在下的催化活性同無絲氨存在時(shí)的催化活性進(jìn)行比較，并計(jì)算出Ki值。
大多數(shù)情況下，最好是降低絲氨酸的敏感性，而并不明顯的改變PGD催化活性，在其他的實(shí)施方案中，可能最好是既能降低反饋敏感性又能降低催化活性。這可以采用表1中列出的具有3-磷酸甘油酸脫氫酶的一段C-末端氨基酸序列的構(gòu)建體。
詳見表1其它修飾過3′-端的構(gòu)建體也是本發(fā)明的范圍，因?yàn)榘凑毡景l(fā)明制備試驗(yàn)構(gòu)建體和轉(zhuǎn)化細(xì)胞以及測(cè)定的PGD活性的絲氨酸抑制作用是一件簡(jiǎn)單的事情。
任何導(dǎo)致表達(dá)缺乏對(duì)絲氨酸抑制的敏感性PGD蛋白載體都與本發(fā)明有關(guān)。一般在沒有絲氨積累時(shí)，應(yīng)該避免反饋?zhàn)杂傻腜GD高水平表達(dá)，因?yàn)閷?duì)于細(xì)胞來說產(chǎn)生的大量絲氨酸或者絲氨酸代謝物可能具有細(xì)胞毒性。因此，總的來說，任何編碼具有正常催化活性和與天然基因相同水平表達(dá)的反饋抑制PGD構(gòu)建物，轉(zhuǎn)化將可能導(dǎo)致高水平PGD表達(dá)并且降低了細(xì)胞自身活性。生成高水平絲氨酸的毒性，事實(shí)上，可以選擇降低PGD表達(dá)的誘變體，因此當(dāng)用多拷貝質(zhì)粒轉(zhuǎn)化可能在某些實(shí)施方案的早期篩選構(gòu)建物中很有用處，同時(shí)，最好是在單一拷貝中將采用染色體的方式把serA構(gòu)建體整合到基因組中。此外，上述的染色體整合便反饋缺失PGD的活性測(cè)量變得容易起來。因此，上述的染色體整合使反饋缺失PGD的活性測(cè)量變得容易起來。所以，在絕大多數(shù)希望獲得很強(qiáng)催化活性的實(shí)施方案中，最好利用適合單拷貝染色體整合的載體。現(xiàn)有技術(shù)中已知有許多種這類載體和使用它們的策略，參見，如Backman，美國(guó)專利07/091，837，申請(qǐng)日為1987年9月1日，可以制備有用的載體和構(gòu)建物，以在適當(dāng)?shù)氖荏w中成功地進(jìn)行轉(zhuǎn)化和酶的表達(dá)，以生產(chǎn)所需的產(chǎn)品。進(jìn)行這種工作的方法已為本領(lǐng)域技術(shù)人員所知，且對(duì)本發(fā)明并不重要。除了改變的編碼PGDDNA之外，表達(dá)載體將包含的下各種其他組分。
首先，載體內(nèi)的編碼序列將伴隨著適當(dāng)調(diào)節(jié)序列，這類調(diào)節(jié)序列是進(jìn)行適當(dāng)水平表達(dá)所必需的，包括啟動(dòng)子，核糖體結(jié)合位點(diǎn)，以及終止序列，在大多數(shù)情況下，天然serA調(diào)節(jié)序列是分子催經(jīng)活性部位的最好來源，但是已知不可以利用現(xiàn)有技術(shù)中熟知的或還需發(fā)現(xiàn)的許多其他的調(diào)節(jié)序列。
其次，最好的是，編碼選擇性標(biāo)記的序列和/或通訊基因(Reportergenes)，同適當(dāng)?shù)恼{(diào)節(jié)組分一道重組在載體上。這種選擇性標(biāo)記的表達(dá)在鑒別轉(zhuǎn)化株中非常有用。適當(dāng)?shù)倪x擇標(biāo)記基因包括那些編碼氨芐青霉素，四環(huán)素和氯霉素的抗性基因。
再次，在質(zhì)粒載體上的一種完整復(fù)制源的合乎要求性主要取決在染色體內(nèi)和染色體外保持基因的合乎需要性。那些現(xiàn)有技術(shù)中熟知的方法可以適用于各種設(shè)計(jì)方案中，采用這種方案能開發(fā)出缺少一個(gè)完整復(fù)制源復(fù)合單位，從而促進(jìn)整合進(jìn)入染色體，參見，Backman等人，美國(guó)專利4，743，546號(hào)。
一旦構(gòu)建成表達(dá)載體之后，用一含有編碼絲氨酸不敏感的PGD蛋白的轉(zhuǎn)錄單元的載體轉(zhuǎn)化適當(dāng)?shù)氖荏w細(xì)胞。在大多數(shù)情況下，采用其內(nèi)源PGD蛋白已知被絲氨酸所抑制的細(xì)胞，以及缺失其中內(nèi)源性serA基因和用本發(fā)明改變的基因進(jìn)行替代均非常有用。這種受體細(xì)胞系統(tǒng)被用于超量生產(chǎn)絲氨酸相關(guān)的代謝產(chǎn)物。已知含絲氨酶敏感蛋白的細(xì)胞是原核生物和酵母。
下列實(shí)施例說明本發(fā)明，但非限制。
實(shí)施例1構(gòu)建編碼反饋抗性3-磷酸甘油酸脫氫酶的serA基因等位基因從一個(gè)Sau3A酶部分消化克隆到pTR264質(zhì)粒的Bc1I位點(diǎn)中一段6.4KbDNA片段上分離出大腸桿菌K12serA基因。參見Backman等人，美國(guó)專利07/285，128，申請(qǐng)日1988年12月16日和Robertsetal.，Gene12∶123(1980)。這個(gè)質(zhì)粒命名為pKB1302。一段3Kb含serA基因的pKB1302DNA經(jīng)SalI至SphI酶切片段被克隆到質(zhì)粒pUC19，從而獲得pKB1321。經(jīng)將3Kb經(jīng)HindIII至SalI酶切含有serA基因的片斷段克隆到pBR322制備出pKB1370。
將XbaI連接子(linker)在限制位點(diǎn)上插入serA基因的3′區(qū)獲得編碼反饋抗3-磷酸甘油酸脫氫酶的serA等位基因。用HincII部分消化質(zhì)粒pKB1321在1793處產(chǎn)生鈍性末端，在那里插入連接子，從而產(chǎn)生a)pKB1459，它編碼截短的3-磷酸甘油酸脫氫酶;b)pKB1507，它也編碼一個(gè)截短的3-磷酸甘油酸脫氫酶;以及c)pKB1508，它編碼一個(gè)4個(gè)氨基酸殘基插入物的3-磷酸甘油酸脫氫酶。PstI酶消化pKB1321使得3′在1888位點(diǎn)處伸出。經(jīng)過DNA聚合酶I的Klenow片段的作用而獲得鈍性末端。將連接子連接在鈍端片段，衍生出的質(zhì)粒是pKB1509，它編碼帶有2個(gè)氨基酸插入物的3-磷酸甘油酸脫氫酶，以及pKB1510，它編碼截短了的3-磷酸甘油酸脫氫酶。用KpnI酶消化pKB1370，片段經(jīng)在末端接上DNA聚合酶I的Kleuow片段后成為鈍端(blunt)插入的連接子產(chǎn)生了一些質(zhì)粒，如，編碼截短的3-磷酸甘油酸脫氫酶，即pKB1455以及pKB1512，或者具有兩個(gè)氨基酸殘基插入物的3-磷酸甘油酸脫氫酶，即pKB1511。分別將pKB1508的0.8KbBamHI至XbaI片段，或者將pKB1509的0.9KbBamHI插入至XbaI片段或?qū)KB1511的5.8KbBamHI片段插入至XbaI片段內(nèi)制成缺失質(zhì)粒pKB1530和pKB1531。
下面的表2總結(jié)各種制得的構(gòu)建物。
詳見表2對(duì)于所有這些構(gòu)建物，簡(jiǎn)要地說明起始載體，采用的限制性內(nèi)切酶，以及插入的連接子的序列。絲氨酸Ki值以及染色體整合成的其中三個(gè)構(gòu)建物的相關(guān)催化活性見表1。N/A是指該構(gòu)建過程不是染色體整合，因此活性水平也無法標(biāo)準(zhǔn)化。
3化學(xué)修飾本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將明白野生型PGD的C-末端之缺失或者修飾可以用酶或化學(xué)方式來完成，例如，采用各種羧肽酶包括羧基肽酶丫或者采用乳過氧化物酶介導(dǎo)的碘化作用來完成。
4反義mRNA的應(yīng)用完全可能在活體內(nèi)降低絲氨酸的敏感性，方法是通過產(chǎn)生編碼PGD在3′端截短的轉(zhuǎn)錄體，該轉(zhuǎn)錄體是生產(chǎn)反義mRNA，它包括與天然或轉(zhuǎn)化PGD編碼序列3′編碼區(qū)部分互補(bǔ)的核苷酸序列。
C目的化合物的生產(chǎn)如圖3所示，絲氨酸是生產(chǎn)甘氨酸的中間體。它也是生產(chǎn)N5，N10-亞甲四氫葉酸的中間體，而后者通常被認(rèn)為是一碳單位的(C1)供體，安對(duì)于蛋氨酸，嘌呤類(包括肌苷)以及某些嘧啶類的合成是必需的。因此，從磷酸甘油酸超量生產(chǎn)絲氨酸可在大范圍的細(xì)菌生產(chǎn)體系中采用，這些體系包括膽堿、甘氨酸、半脫氨酸，蛋氨酸;色酸，以及所有含有一磷酸苷的嘌呤類生產(chǎn)體系。
以下的特例用于說明本發(fā)明。
實(shí)施例2受體菌株的制備用一個(gè)卡那霉素抗性基因替代一個(gè)針對(duì)來自質(zhì)粒的serA基因內(nèi)部分序列。然后，以下述的等位基因交換方法，將這一質(zhì)粒用于滅活受體菌株的serA基因從用Sau3AI部分酶切從染色體DNA中克隆得到Y(jié)MC9(ATCC33920)的serA區(qū)域，這一點(diǎn)是經(jīng)與PCL523(argI61，argF58，serA27，purA54，thr-25，tonA49，relA1，spoT1)互補(bǔ)而篩選出。PC1523來源于大腸菌基因工程保藏中心(ColiGeneticStockCenter)，YaleUniversity，NewHaven，CT。一個(gè)攜帶所述的serA基因的3Kb片段被進(jìn)一步亞克隆入質(zhì)粒pUC19，形成稱為pKB1321的質(zhì)粒。從這個(gè)質(zhì)粒再將一個(gè)3Kb的SalI至HindⅢ片段重新克隆到pBR322，形成pKB1370質(zhì)粒。在serA基因的3′端KpnI位點(diǎn)被轉(zhuǎn)化成帶有一個(gè)聯(lián)接子的BamHI片段上，得到的serA內(nèi)部的BamHI片段用pUC-4-KSAC(Pharmacia)的BamHI片段替換，所述pUC-4-KSAC含有Tn903卡那霉素抗性基因。這一新構(gòu)建的質(zhì)粒被叫作pKB1429。被稱之為pKB701(ATCC39772)的pBR322衍生物產(chǎn)生，參見USSN061757，019，其中位于復(fù)制系統(tǒng)側(cè)面的MboI和TThⅢ1被轉(zhuǎn)化成KpnI位點(diǎn)。來自pKB1429的SalI至EcoRI含有serAKanR重組片段被克隆到pKB701中，形成了pKB1438。用KpnI消化所述pKB1438以去掉ori區(qū)域。含有氨卡青霉素抗性編碼區(qū)以及所述的serA∶KanR的大片段被環(huán)化并進(jìn)一步在CaCl2條件下轉(zhuǎn)化至受體菌轉(zhuǎn)化后，受體YMC9細(xì)胞被放至含氨芐素霉素培養(yǎng)基上選擇，在這種條件下，經(jīng)過在serA基因側(cè)區(qū)域內(nèi)進(jìn)行同源重組，環(huán)狀DNA的整合就產(chǎn)生了氨芐青霉素抗性克隆體。在氨芐青霉素選擇不存在時(shí)，氨芐青霉素抗性分離菌的生長(zhǎng)經(jīng)過同源重組serA基因區(qū)的重復(fù)序列將導(dǎo)致缺失氨芐青霉素抗性基因。按照制造商手冊(cè)采用AmpScreen(BRL)培養(yǎng)基可通過失去β-乳酸酶活性來鑒別這種菌株。在含和不含絲氨酸培養(yǎng)基上，個(gè)別菌落的雙重條斑(duplicate streaking)呈現(xiàn)氨芐青霉素敏感克隆，這種克隆在最低培養(yǎng)基上生長(zhǎng)時(shí)需要絲氨酸，而且也對(duì)卡那素有抗性，有一株這種分離菌被稱做KB875。
實(shí)施例3通過等位基因交換對(duì)改變的serA序列的染色體整合通過同實(shí)施例2中描述的導(dǎo)入serA∶∶KanR所采用的相類似的方法，將serA1455等位基因?qū)肴旧w，簡(jiǎn)言之，攜帶所述的serA1455等位基因的片段(SalI至HindⅢ)被克隆進(jìn)入pKB701。用KpnI消化除去質(zhì)粒自身的序列。采用環(huán)化的DNA轉(zhuǎn)化成氨芐青霉素抗性，從而產(chǎn)生一個(gè)指定的菌株。在非選擇性培養(yǎng)基生長(zhǎng)之后，采用Ampscreen培養(yǎng)基和卡那霉素平板影印培養(yǎng)法，分離出KB904(serA1455)并可見其對(duì)氨芐和卡那霉素敏感。按Miller報(bào)道的P1轉(zhuǎn)導(dǎo)方法(Miller(1972)ExperimentsInMol.GeneticsColdSpringHarborPress，PP.201～205)可將得到的serA1544等位基因轉(zhuǎn)入生產(chǎn)菌株。
實(shí)施例4通過recD依賴基因替換對(duì)修飾過的serA序列進(jìn)行染色體整合另一種方法被用于將serA1508等位基因轉(zhuǎn)移到染色體上。從V220通過P1轉(zhuǎn)導(dǎo)方法可使KB875成為菌株recD。(recD，argA∶Tn10.Amundsenetal.，(1986)Proc.Acad.Sci.，U.S.A.825558-5562)(DSM6823)核酸外切酶V。基本的第三亞單位的基因生產(chǎn)出JGP101。質(zhì)粒pKB1508成為線狀，并且用于將JGP101轉(zhuǎn)化成絲氨酸光色互變，正如Shevell等人報(bào)道(Shevelletal.，(1988)J.Bacteriol.1703294-3296，)從而產(chǎn)生JGP103。然后經(jīng)過P1轉(zhuǎn)導(dǎo)(Milleretal.，ExperimentsinMol.GeneticscoldSpring.HarborLab.，PP.201～205(1972)將serA1508等位基因移入生產(chǎn)菌株。
收獲過量生產(chǎn)的代謝物為了過量生產(chǎn)與絲氨酸相關(guān)的代謝產(chǎn)物，可以制備能生產(chǎn)PGD并具有低絲氨酸敏感性的細(xì)胞，在適當(dāng)?shù)臈l件下，在發(fā)酵罐中培養(yǎng)，在大多數(shù)情況下一直生長(zhǎng)至靜止(穩(wěn)定)期。然后，收集細(xì)胞，并融胞，按標(biāo)準(zhǔn)生化程序制得所需的代謝物。至于微生物生長(zhǎng)的條件和原理以及標(biāo)準(zhǔn)菌株，和收集特殊的代謝產(chǎn)物可參見Crueger和Crueger的報(bào)道(Biotechnology∶AtextbookofIndustrialMicrobiology)以及Herrmann和Somerville的報(bào)道(1983AminoAcid∶BiosynthesisandGeneticRegulation)。
權(quán)利要求
1.編碼3-磷酸甘油酸脫氫酶(PGD)的工程DNA，它同野生型PGD相比，具有對(duì)絲氨酸抑制的低敏感性。
2.如權(quán)利要求1所述的工程DNA，其中野生型PGD是微生物的或酵母PGD。
3.如權(quán)利要求1所述的工程DNA，其中所述的DNA編碼含有在野生型PGD的C-末端有25%的變化的PGD。
4.如權(quán)利要求3所述的工程DNA，其中所述的DNA編碼含有在野生型PGD的C-末端50個(gè)氨基酸的改變的PGD。
5.如權(quán)利要求3所述的工程DNA，其中所述的DNA編碼含有在野生型PGD的C-末端缺失的PGD。
6.如權(quán)利要求3所述的工程DNA，其中所述的C-末端改變包括對(duì)野生型PGD序列中的插入。
7.如權(quán)利要求6所述的工程DNA，其中所述的插入是位于野生型PGD的VAL363和ASN264之間，或是ALA392和GLN394之間。
8.如權(quán)利要求1所述的工程DNA，它選自a)serA 1455 f)serA 1510b)serA 1459 g)serA 1511c)serA 1507 h)serA 1512d)serA 1508 i)serA 1530e)serA 1509 j)serA 1531
9.一種3-磷酸甘油酸脫氫酶，它具有由權(quán)利要求1至8之一中所述的工程DNA編碼的氨基酸序列。
10.一種表達(dá)載體，它包含有權(quán)利要求1至8之一中所述的工程DNA，以及在受體菌成細(xì)胞表達(dá)體系中為表達(dá)所述工程DNA定位和定向的調(diào)節(jié)性DNA。
11.一種細(xì)胞，它含有如權(quán)利要求1至8之一中所述的工程DNA，以及在所述的細(xì)胞內(nèi)表達(dá)所述工程DNA的定位和定向的調(diào)節(jié)性DNA。
12.如權(quán)利要求11中所述的細(xì)胞，其中所述的細(xì)胞是野生型serA的缺失型。
13.一種生產(chǎn)絲氨酸或絲氨酸相關(guān)衍生物的目的產(chǎn)物的方法，包括培養(yǎng)如權(quán)利要求1所述的細(xì)胞，回收所述的目的產(chǎn)物。
14.如權(quán)利要求13所述的方法，其中所述的產(chǎn)物是絲氨酸。
15.一種產(chǎn)生具有一改變過的3′端的編碼PGD的轉(zhuǎn)錄體的工程細(xì)胞，所述細(xì)胞將所述的轉(zhuǎn)錄體翻譯成與野生型PGD相比具有對(duì)絲氨酸抑制的低敏感性的PGD。
全文摘要
一種同野生型相比具有對(duì)絲氨酸抑制低敏感性的編碼3-磷酸甘油酸脫氫酶(PGD)的DNA。本發(fā)明還涉及a)具有上述工程DNA氨基酸序列的PGD；b)含工程DNA和在一宿主表達(dá)體系內(nèi)表達(dá)工程DNA的定位定向的調(diào)節(jié)性DNA的表達(dá)載體；c)含這種表達(dá)載體的細(xì)胞，和d)經(jīng)培養(yǎng)這種細(xì)胞生產(chǎn)絲氨酸和其相關(guān)產(chǎn)物的方法。
文檔編號(hào)C12N15/09GK1073209SQ9211201
公開日1993年6月16日 申請(qǐng)日期1992年10月10日 優(yōu)先權(quán)日1991年12月12日
發(fā)明者理查德P·布林根 申請(qǐng)人:瓦克化學(xué)有限公司