專(zhuān)利名稱：胰島素類(lèi)似物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于人體醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，特別是對(duì)糖尿病的治療。更具體地說(shuō)，本發(fā)明涉及人體胰島素分子的類(lèi)似物，使用這些類(lèi)似物的方法以及含有這些胰島素類(lèi)似物的藥物組合物。
糖尿病癥是一種新陳代謝紊亂癥，其特征在于人體組織不能以正常速度氧化碳水化合物。在糖尿病癥中胰島素的缺乏是最重要的因素。在過(guò)去70年中，糖尿病患者通過(guò)接受控制量的胰島素而大有幫助。直到80年代初期糖尿病所用的胰島素都是由動(dòng)物胰腺中分離的，一般是由牛和豬的胰腺。隨看重組體DNA技術(shù)的引入，就有可能大量生產(chǎn)天然人體胰島素以及天然地和非天然地產(chǎn)生的人胰島素類(lèi)似物。與天然人胰島素相比，這些胰島素類(lèi)似物具有不同的物理和化學(xué)性質(zhì)。
天然人胰島素在B-鏈的10位置上含有一組氨酸殘基。用天冬氨酸殘基代替該組氨酸殘基，并除去在B-鏈29和30位置上的賴氨酸和蘇氨酸殘基而形成在溶液中聚集的一種類(lèi)似物ASP(B10)、des(B29-30)人胰島素。意外的是，將這個(gè)類(lèi)似物28位置上的脯氨酸殘基除去而得到的Asp(B10)，des(B28-30)人胰島素會(huì)導(dǎo)致成為一種穩(wěn)定的、快速作用的分子，并且它在溶液中基本上保持單體形式。另外，將Asp(B10)，(B28-30)人胰島素B-鏈的27位置上的蘇氨酸殘基除去而生成Asp(B10)，des(27-30)人胰島素，它在溶液中也是穩(wěn)定的，快速作用并呈單體。
本發(fā)明涉及人胰島素類(lèi)似物，它通過(guò)將天然人胰島素B-鏈的氨基酸10由組氨酸變?yōu)樘於彼?，并通過(guò)由天然人胰島素B-鏈的羧基末端去除三肽或四肽而進(jìn)行改性。這些分子也可以在天然人胰島素A-鏈的21位置上以及在天然人胰島素B-鏈的1和3位置上進(jìn)行改性。所述的胰島素類(lèi)似物是更為穩(wěn)定并更少地進(jìn)行二聚化和自結(jié)合為更高分子量形式，從而具有更快地啟動(dòng)活性同時(shí)保持天然人胰島素的生物活性。
本發(fā)明也公開(kāi)和要求了一種通過(guò)給患者施用其所需有效量的所申請(qǐng)類(lèi)似物以治療高血糖的方法。另外，公開(kāi)和要求了含有與一種或多種可藥用賦形劑相結(jié)合的有效量的本發(fā)明胰島素類(lèi)似物的藥物組合物。
為了本發(fā)明作為本文公開(kāi)和要求的目的，下列術(shù)語(yǔ)和縮略語(yǔ)的定義如下Asp(B10)，des(B28-30)HI-一種人胰島素類(lèi)似物，其中，在天然人胰島素B-鏈的10位置上的組氨酸殘基已變?yōu)樘於彼釟埢以撎烊蝗艘葝u素B-鏈的氨基酸殘基28至30已被去除。
Asp(B10)，des(B27-30)HI-一種人胰島素類(lèi)似物，其中，在天然人胰島素B-鏈的10位置上的組氨酸殘基已變?yōu)樘於彼釟埢?，而且該天然人胰島素B-鏈的氨基酸殘基27至30已被去除。
BHI-生物合成的人胰島素。
交聯(lián)-在半胱氨酸殘基間形成二硫鍵。一種適當(dāng)交聯(lián)的天然人胰島素或胰島素類(lèi)似物含有三個(gè)二硫橋鍵。發(fā)現(xiàn)第一個(gè)二硫橋鍵是在A鏈6和11位置上的半胱氨酸殘基之間。第二個(gè)二硫橋鍵將在A-鏈位置7上的半胱氨酸連接到在B-鏈位置7上的半胱氨酸上。第三個(gè)二硫橋鍵將在A-鏈位置20的半胱氨酸連接到處于B-鏈位置19的半胱氨酸上。
SEQIDNo1-列于順序表的第一順序是一種人胰島素A-鏈的類(lèi)似物，其順序?yàn)镚ly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln1 5 1015Leu Glu Asn Tyr Cys Xaa20其中Xaa是Asn，Asp，Glu，Gln，Ala，Gly或Ser。
SEQIDNo2-列于順序表的第二順序是一種人胰島素B-鏈的類(lèi)似物，其順序?yàn)閄aa Val Xaa Gln His Leu Cys Gly Ser Asp Leu Val Glu Ala Leu1 5 10 15Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr20 25其中，在位置1的Xaa是Phe或Asp，而在位置3的Xaa是Asn或Asp。
在本文所用的全部氨基酸的縮略語(yǔ)都采用由美國(guó)專(zhuān)利和商標(biāo)局列于37C.F.R.§1.822(b)(2)(1990)中的那些。
本發(fā)明涉及胰島素類(lèi)似物，其表達(dá)式為SEQ ID No1
(Gly Ile Val Glu Glu Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr1 5 10Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Xaa)15 20適當(dāng)?shù)亟宦?lián)到SEQ ID NO2(Xaa Val Xaa Gln His Leu Cys Gly Ser Asp Leu Val Glu Ala15 10Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr15 2025或其可藥用的鹽，其中在SEQ ID NO1(胰島素A-鏈)位置21上的Xaa是Asn，Asp，Glu，Gln，Ala，Gly或Ser;在SEQ ID NO2(胰島素B-鏈)位置1上的Xaa是Phe或Asp;而在SEQ ID NO2位置3上的Xaa是Asn或Asp。在SEQ ID NO1的位置21上的Xaa優(yōu)選的是Gly，Ala，Ser或Asn。在位置21上的最優(yōu)選的氨基酸是天冬氨酸。在SEQ ID NO2位置1的優(yōu)選的氨基酸是Phe，而且在SEQ ID NO2的位置3的最優(yōu)選的殘基是Asn。本發(fā)明的一種特別優(yōu)選的胰島素類(lèi)似物是，其中在SEQ ID NO1位置21上的Xaa是Asn，在SEQ ID NO2位置1上的Xaa是Phe和在SEQ ID NO2位置3上的Xaa是Asn的一個(gè)。在本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的標(biāo)準(zhǔn)生物化學(xué)表示中，所述特別優(yōu)選的類(lèi)似物是Asp(B10)，des(B28-30)人胰島素。
本發(fā)明也涉及一種胰島素類(lèi)似物，其表達(dá)式為SEQ ID NO1適當(dāng)?shù)亟宦?lián)到SEQ ID NO2的氨基酸1到26，或其藥物可用鹽，其中在SEQ ID NO1位置21的Xaa是Asn，Asp，Glu，Gln，Ala，Gly或Ser;在SEQ ID NO2位置1上的Xaa是Phe或Asp;在SEQ ID NO2位置3上的Xaa是Asn或Asp。在SEQ ID NO1位置21上的Xaa優(yōu)選的是Gly，Ala，Ser或Asn，其中Asn最好。在SEQ ID NO2位置1上的優(yōu)選氨基酸是Phe，而在SEQ ID NO2位置3上的最好殘基是Asn。本發(fā)明特別優(yōu)選的一種類(lèi)似物是其中在SEQ ID NO1位置21上的Xaa是Asn，在SEQ ID NO2位置1上的Xaa是Phe，在SEQ ID NO2位置3上的Xaa是Asn而SEQ ID NO2末端是在殘基26上的那一個(gè)。在標(biāo)準(zhǔn)的生物化學(xué)表示中，所述特別優(yōu)選的類(lèi)似物是Asp(B10)，des(B27-30)人胰島素。
本發(fā)明的另一個(gè)類(lèi)似物的表達(dá)式為SEQ ID NO1適當(dāng)?shù)亟宦?lián)到SEQ ID NO2的氨基酸2-27上，或其藥物可用鹽，其中在SEQ ID NO1位置21上的Xaa是Asn，Asp，Glu，Gln，Ala，Gly或Ser;在SEQ ID NO2位置3上的Xaa是Asn或Asp。在SEQ ID NO1位置21上的Xaa優(yōu)選的是Asn，而在SEQ ID NO2位置3上的Xaa優(yōu)選的也是Asn。所述優(yōu)選的類(lèi)似物對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的稱為Asp(B10)，des(B1)，des(B28-30)人胰島素。
本發(fā)明又一個(gè)類(lèi)似物，其表達(dá)式為SEQ ID NO1適當(dāng)?shù)亟宦?lián)到SEQ ID NO2的氨基酸2-26上，或其藥物可用的鹽，其中，在SEQ ID NO1位置21上的Xaa是Asn，Asp，Glu，Gln，Ala，Gly或Ser;在SEQ ID NO2位置3上的Xaa是Asn或Asp。優(yōu)選地，在SEQ ID NO1位置21上的Xaa是Asn而在SEQ ID NO2位置3上的Xaa也是Asn。所述優(yōu)選類(lèi)似物在標(biāo)準(zhǔn)生物化學(xué)表示中熟知為Asp(B10)，des(B1)，des(B27-30)人胰島素。
本發(fā)明的胰島素類(lèi)似物，既可在含鋅溶液也可在不含鋅溶液中，具有減少二聚化或自結(jié)合為更高分子量形式的傾向。其中，類(lèi)似物在溶液中一般呈單體的，并在給藥時(shí)達(dá)到快速啟動(dòng)活性。
如上所述，本發(fā)明包括該胰島素類(lèi)似物的藥物可用鹽。優(yōu)選的這種鹽有鋅鹽、鈉鹽、鉀鹽、鎂鹽、鈣鹽，或這些鹽的結(jié)合物。
本發(fā)明的胰島素類(lèi)似物能通過(guò)各種已知的肽合成技術(shù)中的任一種方法而制備，其中包括經(jīng)典(溶液)法、固相法、半合成法以及最近使用的重組體DNA方法。
在固相技術(shù)中，氨基酸順序是由一起始的、不溶的、樹(shù)脂載體上的C-末端氨基酸按順序地構(gòu)建的。固相法的技術(shù)描述于J.Stewart等人的Solid-Phase Peptide Synthesis，F(xiàn)reeman and Co.，San Francisco，1969中。
通常，在固相技術(shù)中，將與所要求的肽的C-末端氨基酸相當(dāng)?shù)陌被峁潭ㄔ谝环N不溶性的樹(shù)脂載體上，然后在樹(shù)脂載體上的C-末端氨基酸上開(kāi)始形成肽鏈。單個(gè)的氨基酸按順序引入，直到獲得所要求的氨基酸順序。或者，可以制備小的肽片段，并將其按所要求的順序引入肽鏈。在整個(gè)合成過(guò)程中，肽鏈保持與樹(shù)脂相接，在完成鏈時(shí)，將肽由樹(shù)脂上分開(kāi)。
通過(guò)在C-末端部分的羧基基團(tuán)和在樹(shù)脂基體上存在的作為這種連接位點(diǎn)的特定亞甲基基團(tuán)之間所形成的酯鍵將肽鏈連接到聚苯乙烯樹(shù)脂上。
氨基酸是使用現(xiàn)有技術(shù)中熟知的技術(shù)進(jìn)行偶合而形成肽鍵。一種方法是將氨基酸轉(zhuǎn)化成一種衍生物，該衍生物將使得羧基基團(tuán)更易于與肽片段的游離N-端氨基基團(tuán)反應(yīng)。例如，氨基酸通過(guò)用氯甲酸乙酯、氯甲酸苯酯、氯甲酸仲丁酯或氯甲酸異丁酯的保護(hù)氨基酸的反應(yīng)而轉(zhuǎn)化成一種混合的酸酐。或者，氨基酸能轉(zhuǎn)化為一種活性酯，例如一種2，4，5-三氯苯基酯，五氯苯基酯、P-硝基苯基酯、N-羥基琥珀酰亞胺酯、或一種由1-羥基苯并三唑形成的酯。
另一種偶合方法是使用一種合適的偶合劑，如N，N′-二環(huán)己基碳化二亞胺(DCC)或N，N′-二異丙基碳化二亞胺(DIC)。其它合適的偶合劑對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是顯而易見(jiàn)的。參閱Schroder and Lubke，The Peptides，Academic Press，1965，第三章，在此引入作為參考。
必須看到，在肽合成中所使用的每個(gè)氨基酸的α-氨基基團(tuán)，在偶合反應(yīng)過(guò)程中必須進(jìn)行保護(hù)，以防止支反應(yīng)，包括反應(yīng)的α-氨基功能。也應(yīng)認(rèn)識(shí)到，某些氨基酸含有反應(yīng)的側(cè)鏈功能基團(tuán)(如，硫氫基、ε-氨基、β-和γ-羧基、咪唑、胍基和羥基)，而這些功能性基團(tuán)在起始和以后的偶合步驟中也都必須進(jìn)行保護(hù)。合適的保護(hù)基團(tuán)在現(xiàn)有技術(shù)中是已知的。參閱例如，Protective Groups In Organic Chemistry M.McOmie，Editor，Plenum Press，N.Y.1973和美國(guó)專(zhuān)利4617149，在此引入作為參考。
在選擇特定的保護(hù)基團(tuán)時(shí)，必須注意某些條件。一種α-氨基保護(hù)基團(tuán)(1)在偶合反應(yīng)中所用的條件下必須使α-氨基官能成惰性，(2)在偶合反應(yīng)后必須易于去除，而且在不會(huì)去除支鏈保護(hù)基團(tuán)和不會(huì)改變肽片段結(jié)構(gòu)的條件下，以及(3)在偶合前必須即刻消除在活性作用上可能的外消旋作用。一種支鏈保護(hù)基團(tuán)(1)在偶合反應(yīng)所用的條件下，必須使支鏈官能基團(tuán)成惰性，(2)在去除α-氨基保護(hù)基團(tuán)中所用的條件下必須是穩(wěn)定的，以及(3)在完成所要求的氨基酸順序時(shí)必須易于除去，而且在該反應(yīng)條件下不會(huì)改變肽鏈結(jié)構(gòu)。
對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯然的，用于肽合成的已知保護(hù)基團(tuán)對(duì)其去除所用試劑的反應(yīng)性是不同的。例如，某些保護(hù)基團(tuán)，如三苯基甲基和2-(P-聯(lián)苯基)異丙基氧基羰基是非常不穩(wěn)定的，并在溫和的酸性條件下就能裂解。其它的保護(hù)基團(tuán)，如t-丁基氧基羰基，t-戊基氧基羰基，金剛烷基氧基羰基和P-甲氧基芐基氧基羰基，是較穩(wěn)定的，需要適當(dāng)?shù)膹?qiáng)酸，如三氟乙酸，鹽酸或在乙酸中的三氟化硼才能去除它們。還有另一些保護(hù)基團(tuán)，如芐基氧基羰基，鹵代芐基氧基羰基、P-硝基芐基氧基羰基、環(huán)烷基氧基羰基和異丙基氧基羰基是更穩(wěn)定，需要更強(qiáng)的酸如氟化氫、溴化氫或在三氟乙酸中的三氟乙酸硼才能將它們除去。
在完成所要求的肽順序時(shí)，保護(hù)的肽必須從樹(shù)脂載體上分離，而且全部保護(hù)基團(tuán)也應(yīng)除去。分離反應(yīng)和保護(hù)基團(tuán)的除去可以同時(shí)或分步驟進(jìn)行。當(dāng)樹(shù)脂載體是一種氯代甲基化的聚苯乙烯樹(shù)脂時(shí)，將肽固定在樹(shù)脂上的鍵是在C-末端部分的游離羧基基團(tuán)和在樹(shù)脂基質(zhì)上所存在的許多氯代甲基基團(tuán)中的一個(gè)之間所形成的酯鍵。
可以認(rèn)為，所固定的鍵能通過(guò)試劑進(jìn)行裂開(kāi)，該試劑已知具有破壞酯鍵并滲入樹(shù)脂基質(zhì)的能力。一種特別方便的方法是用液體無(wú)水氟化氫進(jìn)行處理。這試劑不僅從樹(shù)脂中分開(kāi)肽，而且也能除去全部保護(hù)基團(tuán)。因此，使用這種試劑將會(huì)直接得到完全去保護(hù)的肽。如果要求分開(kāi)肽而不去除保護(hù)基團(tuán)，則保護(hù)的肽-樹(shù)脂可進(jìn)行甲醇分解作用而得到C-末端的羧基基團(tuán)是甲基化的保護(hù)肽。然后使該甲基酯在溫和的堿性條件下水解而得到游離的C-末端羧基。然后在肽鏈上的保護(hù)基團(tuán)可通過(guò)用強(qiáng)酸(如液體氟化氫)進(jìn)行處理而除去。對(duì)于甲醇分解的一種特別有用的技術(shù)，可參閱G.Moore等人的Peptides，Proc.5th Amer.Pept.Symp.，M.Goodman and J.Meienhofer.Eds.，John Wiley，N.Y.，1977，pp518-521，其中保護(hù)的肽-樹(shù)脂是在冠醚存在下，使用甲醇和氰化鉀進(jìn)行處理的。
由樹(shù)脂中分開(kāi)保護(hù)肽的另一種方法是通過(guò)氨解作用或通過(guò)用肼處理。若需要，所得的C-末端酰胺或酰肼可以水解為游離C-末端羧基，而方便地去除保護(hù)基團(tuán)。
也可以認(rèn)為，存在于N-末端的α-氨基基團(tuán)的保護(hù)基團(tuán)可以在由樹(shù)脂載體上分開(kāi)肽之前或同時(shí)優(yōu)選地除去。
本發(fā)明的胰島素類(lèi)似物的A和B鏈也能通過(guò)重組體DNA方法來(lái)制備。在其制備中，使用用于這種合成的現(xiàn)在常規(guī)(now-routine)技術(shù)制備編碼A或B鏈所要求的肽的核苷酸順序。這些方法一般是制備編碼所要求的編碼順序片段和其互補(bǔ)順序兩者的寡核苷酸。寡核苷酸是設(shè)計(jì)提供具有互補(bǔ)順序的兩個(gè)片段的編碼順序的一個(gè)片段的交疊而且反之亦然。該寡核苷酸是成對(duì)的并連接的，最終生產(chǎn)出所要求的基團(tuán)順序。
將順序插入一克隆載體的一個(gè)位置處，該位置可使肽產(chǎn)品以其編碼表達(dá)。能表達(dá)胰島素原和胰島素原類(lèi)似物的質(zhì)粒結(jié)構(gòu)描述于Chance等人的歐洲專(zhuān)利說(shuō)明書(shū)EP 0383472，公開(kāi)于1990年8月22日，其全部報(bào)導(dǎo)引入本文，作為參考。
本發(fā)明的胰島素類(lèi)似物的A和B鏈也可以通過(guò)使用重組體DNA技術(shù)的一種類(lèi)胰島素原前體分子而進(jìn)行制備。參閱Frank等人，Peptides.Synthesis-Structure-Function，Proc.Seventh Am.Pept.Sym.，Eds.D.Rich and E.Gross(1981)，該文在此引入以作參考。
然而，所生產(chǎn)單個(gè)A和B鏈的組合步驟可以通過(guò)Chance等人(PeptidesSynthesis Structure and FunctionProc of Seventh American Peptide Symposium(1981))的方法來(lái)實(shí)現(xiàn)，在此引入該文作為參考。
提出以下實(shí)施例作為本發(fā)明的說(shuō)明，而不認(rèn)為是對(duì)其限制。
實(shí)施例1Asp(B10)，des(B27-30)人胰島素A、酶促半合成法標(biāo)題胰島素類(lèi)似物是通過(guò)使用Asp(B10)脫八肽(B23-30)人胰島素和合成的四肽Gly-Phe-Phe-Tyr的酶促半合成(逆蛋白水解)而制備的。四肽是通過(guò)固相肽合成而制備的而Asp(B10)脫一八肽人胰島素是通過(guò)胰蛋白酶水解反應(yīng)除去順序23-65而從Asp(B10)人胰島素原中衍生而得的。Asp(B10)胰島素原類(lèi)似物是通過(guò)基本上按照Chance等人的報(bào)導(dǎo)，(歐洲專(zhuān)利EP 0383472，公開(kāi)于1990年8月22日，其全部報(bào)導(dǎo)在此引入作為參考)重組體DNA工藝來(lái)制備的。EP0383472第35頁(yè)公開(kāi)了核苷酸銜接物順序(ⅱ)，它是用于構(gòu)建編碼Met-Tyr-[Asp(B1)，Lys(B28)，Pro(B29)HPI]的質(zhì)粒PRB176。用于產(chǎn)生本發(fā)明起始材料的Asp(B10)質(zhì)粒包括一種與銜接物(ⅱ)相類(lèi)似的銜接物，只是在順序(ⅱ)中編碼Asp的順序CGAC是用編碼Phe的順序TTTT所代替，而編碼His的順序CAT用順序GAC代替而形成一種編碼Asp(B10)，Lys(B28)，Pro(B29)人胰島素原的質(zhì)粒?；蚓幋a的重復(fù)和本技術(shù)領(lǐng)域技術(shù)人員的知識(shí)能夠進(jìn)行許多取代，而構(gòu)建編碼一種Asp(B10)人胰島素原的質(zhì)粒。
Asp(B10)脫一八肽人胰島素制備如下將700ml(9.8g)在pH2.5甘氨酸緩沖液中的折疊Asp(B10)人胰島素原，通過(guò)在攪拌下加入25ml氫氧化銨而調(diào)PH至10.2。然后加入20ml濃鹽酸將PH值快速調(diào)到9.10。在這溶液中加入7ml氯化鈣水溶液(14.7mg/ml)，接著加入70ml 14mg/ml的豕胰蛋白酶的水溶液，得到以重量計(jì)酶與基質(zhì)之比為約1∶10。將胰蛋白酶的水解反應(yīng)物充分混合，然后貯于25℃下17小時(shí)，這時(shí)，通過(guò)加入160ml冰乙酸得到最后PH為3.09而停止反應(yīng)。然后加入105ml乙腈。
為分離和純化所得Asp(B10)脫一八肽人胰島素，將胰島蛋白酶的消化溶液在25℃下泵入到一個(gè)5.5×30cm C-18Vydac HPLC柱上。用于這色譜步驟制備兩種緩沖液緩沖液A，包括10份乙腈和90份0.5%TFA(三氟乙酸)溶液，而緩沖液B，包括50份乙腈和50份0.5%TFA。在簡(jiǎn)單地用緩沖液A洗滌后，將由0-20%緩沖液B的線性梯度液，按2.4ml/min的速率泵經(jīng)柱16小時(shí)，接著以8ml/min的速率將20-70%緩沖液B的線性梯度液淋洗8小時(shí)。含有Asp(B10)脫一八肽人胰島素的主峰在約50%緩沖液B時(shí)洗脫，將含有本材料(基于分析的反相HPLC)的餾份合并并冷凍干燥，最后回收的重量為5.5g，其HPLC純度為93%。通過(guò)氨基酸分析，質(zhì)譜分析法，和NH2-末端分析證實(shí)Asp(B10)脫一八肽(B23-30)人胰島素的可靠性。
為制備標(biāo)題胰島素類(lèi)似物，將545mgAsp(B10)脫一八肽人胰島素和300mg合成的四肽Gly-Phe-Phe-Tyr，在37℃下，在15ml含有1份二甲基亞砜，2份1.4-丁二醇和1份0.35Mtris緩沖液(不調(diào)節(jié)PH)的溶液中合并。加入豬的胰蛋白酶(85mg)。充分混和該溶液，并在37℃下不時(shí)地?cái)嚢?60分鐘。蛋白質(zhì)用冷的丙酮沉淀，用二乙醚洗滌，氮?dú)饬鞲稍?，最后溶?5ml 6M胍-HCl(0.01HCl中)中。
在5×200cm的Sephadex G-50(超細(xì))柱上凝膠過(guò)濾清徹的樣品溶液，并在4℃下用1M乙酸洗脫。流出液在276nm處并通過(guò)反相HPLC而監(jiān)測(cè)。集中含有標(biāo)題產(chǎn)品的餾份(～275ml)，用水稀釋到500ml，泵到21×250mm C-8 Zorbax柱上，在0.1M磷酸鈉PH2的緩沖液中的乙腈梯度液中洗脫產(chǎn)品。
收集含有標(biāo)題胰島素類(lèi)似物的適當(dāng)餾份(由分析HPLC測(cè)定)，用水稀釋四倍，且泵到25×300mmC-18Vydac柱上。脫鹽的蛋白質(zhì)用在0.5%三氟乙酸中的乙腈梯度液洗脫。收集含有純化的胰島素類(lèi)似物的餾份并冷凍干燥，而得到22mg。通過(guò)快原子轟擊質(zhì)譜法(FAB/MS)和氨基酸分析證實(shí)其結(jié)構(gòu)。FAB/MS的結(jié)果得到分子量為5358.3(理論值5358.0)。氨基酸組成如下，基于天冬氨酸作為摩爾單位(理論的氨基酸比在括弧中)
Asp，4.00(4);Thr，1.00(1);Ser2.50(3);Glu，6.90(7);Gly，3.92(4);Ala，1.01(1);1/2Cys，4.92(6);Val，3.55(4);Ile，1.73(2);Leu，6.03(6);Tyr，3.70(4);Phe，2.86(3);His，1.31(1);Arg，1.00(1).
B、鏈結(jié)合1、制備Asp(B10)，des(B27-30)人胰島素B-鏈?zhǔn)褂肁pplied Biosystems 430A肽合成器(包括軟件修訂版1.4)以制備粗制的肽基樹(shù)脂。使用0.5毫摩爾(mMol)的起始固相樹(shù)脂(t-BOC-Thr(Bzl)OCH2Pam樹(shù))(0.61mMol/g×0.91g).所用的全部氨基酸是BOC保護(hù)的，除了谷氨酸、天冬氨酸、和組氨酸，全部都是按得到的直接使用(即，由Applied Biosystems，Inc的柱筒中，每個(gè)柱筒含有約2mMol保護(hù)的氨基酸)。谷氨酸、天冬氨酸和組氨酸得自市售源，轉(zhuǎn)移到柱筒，以使每個(gè)柱筒含有約2mMol所要求保護(hù)的氨基酸。粗制的肽基樹(shù)脂在室溫真空下干燥5小時(shí)，其重量與起始重量相比較，以保證適當(dāng)?shù)闹亓吭鲆?。將小部分樣品進(jìn)行氨基酸分析，以確保所要求的氨基酸是按正確的比例加入。
通過(guò)在一種按10份(V/W)HF(含5%V/V p-甲苯硫酚和5%V/v m-甲苯酚)對(duì)1份肽基樹(shù)脂的溶液中在0℃攪拌約1小時(shí)，將肽由肽基樹(shù)脂上分開(kāi)并支鏈脫保護(hù)。通過(guò)真空去除大部分HF后，在乙醚中沉淀肽。在用乙醚洗滌幾次后，接著真空過(guò)濾，將肽溶于約200ml含有0.1Mtris，35mg/ml Na2SO3和25mg/ml Na2S4O6的8M胍-HCl，PH11，的溶液中。用5N NaOH調(diào)節(jié)溶液PH到8.8，并在室溫劇烈攪拌3小時(shí)。
將得到的S-磺化的肽溶液在室溫裝載到5×215cm Sephadex G-25(粗)柱上。樣品在室溫用50mM NH4HCO3以21ml/m流速洗脫。流出液在276nm處監(jiān)測(cè)，收集所要求的流出液，1000ml，冷卻并冷凍干燥。
2、Asp(B10)des(B27-30)人胰島素B-鏈與人胰島素A-鏈的結(jié)合。
A和B鏈的結(jié)合是通過(guò)按描述于EPO 0383472(同上)的，使用重組體的生產(chǎn)A-鏈的上述Chance等人的方法來(lái)進(jìn)行的。將2.27g重組體DNA-衍生的A-鏈S-磺酸鹽和511mg合成的Asp(B10)des(27-30)B-鏈S-磺酸鹽合并于一燒瓶中，并在室溫溶于245ml0.1M甘氨酸。溶液的PH值用5N NaOH調(diào)節(jié)到10.5并冷卻至4℃。在室溫制備一種15.5mg/ml二硫代蘇糖醇(DTT)在0.1M甘氨酸緩沖液中的溶液，用5N NaOH調(diào)節(jié)到PH10.5，然后冷卻至4℃。
將18.5ml DTT溶液快速加入到合并的A-鏈和B-鏈S-磺酸鹽溶液(SH/ssO-3＝1.0)中。反應(yīng)溶液在500mlEhrlenmeyer燒瓶中，在4℃下攪拌26小時(shí)。加入磷酸(3.7ml)，反應(yīng)液的PH值降低到2.9。
所得的沉淀混合物用milli-Q水和乙腈稀釋?zhuān)⑼ㄟ^(guò)反相HPLC(使用-50×300mmVgdac c-18柱，在室溫下，用在0.1M NaH2PO4中的增加乙腈的線性梯度液(PH2.3)，按2.6ml/min速率洗脫而純化。流出液在280nm處進(jìn)行監(jiān)測(cè)。所選擇的餾份通過(guò)分析HPLC進(jìn)行測(cè)定。收集所要求的餾份(405ml)。用400mlmilli-Q水稀釋?zhuān)c1.2g Na2S4O6結(jié)合，用5N NaOH調(diào)節(jié)到PH7，并且通過(guò)反相HPLC(使用21×250mm Dupont Zorbax C-8柱，在室溫，用在0.1M(NH4)2HPO4中的增加乙腈的線性梯度液，按2.0ml/min速率洗脫)而再純化。流出液在280nm監(jiān)測(cè)。所選擇的餾份通過(guò)分析的HPLC測(cè)定。收集所要求的餾份，用H3PO4調(diào)節(jié)到PH2.3，并裝到-Vydac C-18 HPLC柱(21×250mm)上，并用在0.5%TFA水液中的增加乙腈的線性梯度液洗脫。流出液在280nm監(jiān)測(cè)。所選擇的餾份通過(guò)分析HPLC測(cè)定。收集適宜的餾份并冷凍干燥而得到135mg胰島素類(lèi)似物產(chǎn)品，通過(guò)反相PHLC其純度大于91%。結(jié)構(gòu)通過(guò)快原子轟擊質(zhì)譜法(FAB/MS)和氨基酸分析進(jìn)行驗(yàn)證。FAB/MS的結(jié)果得到的分子量為5358.5(理論值5358.0)。氨基酸組成如下，基于天冬氨酸作為摩爾單位(理論的氨基酸比例在括弧中)Asp，4.00(4);Thr，0.98(1);Ser，2.72(3);Glu，7.14(7);Gly，3.93(4);Ala，0.98(1);1/2 Cys，5.44(6);Val，3.44(4);Ile，1.51(2);
Leu，6.14(6);Tyr，3.86(4);Phe，2.88(3);His，1.09(1);
Arg，0.97(1).
實(shí)施例2Asp(B10)，des(B28-30)人胰島素標(biāo)題胰島素類(lèi)似物通過(guò)按實(shí)施例1的使用Asp(B10)脫-八肽(B23-30)人胰島素和合成的五肽Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr的酶促半合成法(逆蛋白水解)而進(jìn)行制備的。五肽是通過(guò)固相肽合成而制備的，而Asp(B10)脫-八肽人胰島素通過(guò)按實(shí)施例1中所述，以胰蛋白酶水解反應(yīng)而除去順序23-65，而從Asp(B10)人胰島素原中衍生出來(lái)。
為制備標(biāo)題胰島素類(lèi)似物，將765mgAsp(B10)脫-八肽胰島素和500mg合成的五肽Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr在21ml含有1份二甲基亞砜、2份1，4-丁二醇和1份0.35Mtris緩沖液的溶液中(不調(diào)PH)在37℃下合并。加入豬胰蛋白酶(127mg)。充分混和溶液并在37℃下不時(shí)地?cái)嚢?40分鐘。用冷的丙酮沉淀蛋白質(zhì)，用二乙醚洗滌，用氮?dú)饬鞲稍?，最后溶?0ml6M胍-HCl(用0.01N HCl制備)中。將清徹的樣品溶液在50×200cm的Sephadex G-50(超細(xì))柱上進(jìn)行凝膠過(guò)濾并在4℃用1M乙酸洗脫。流出液在276nm并通過(guò)反相HPLC進(jìn)行監(jiān)測(cè)。收集含有標(biāo)題產(chǎn)品的餾份(～250ml)，用水稀釋到500ml，泵入到21×250mm C-8 Zorbax柱上，而產(chǎn)品洗脫在0.1M磷酸鈉PH2緩沖液中的乙腈梯度液中。收集含有標(biāo)題胰島素類(lèi)似物的適宜餾份，該餾份通過(guò)分析HPLC測(cè)定，用水(400ml)稀釋5倍，并泵到25×300mm C-18 Vydac柱上。脫鹽的蛋白質(zhì)用在0.5%三氟乙酸中的乙腈梯度液進(jìn)行洗脫。收集含有純化胰島素類(lèi)似物的餾份并冷凍干燥而產(chǎn)生47mg。結(jié)構(gòu)通過(guò)快速原子轟擊質(zhì)譜法(FAB/MS)和氨基酸分析進(jìn)行驗(yàn)證。FAB/MS的結(jié)果給出的分子量為5459.2(理論值5459.1)。氨基酸組成如下，基于以天冬氨酸作為摩爾單位(在括弧中的是理論的氨基酸比率)Asp，4.00(4);Thr，1.86(2);Ser，2.56(3);Glu，7.03(7);Gly，4.01(4);Ala，1.07(1);1/2 Cys，5.38(6);Val，3.76(4);Ile，1.85(2);Leu，6.14(6);Tyr，3.80(4);Phe，2.94(3);His，1.15(1);Arg，0.96(1).
實(shí)施例3溶液的穩(wěn)定性降解分析是通過(guò)將約3.5mg/ml.濃度的胰島素或胰島素類(lèi)似物樣品在50℃下在0.1M磷酸鈉，PH7.4(除另有說(shuō)明)，0.25%甲苯酚和1.6%甘油中進(jìn)行培養(yǎng)而實(shí)施的。在不同的時(shí)間，取部分培養(yǎng)混合物，用過(guò)量10倍的6M胍-HCl，0.1M磷酸鈉，PH3.0的溶液在23℃停止反應(yīng)，直至用HPLC篩析色譜(size exclusion)進(jìn)行分析為止。所淬火的培養(yǎng)反應(yīng)物在5℃下貯存可達(dá)二星期而在HPLC篩析性質(zhì)方面不會(huì)變化。HPLC篩析分析是使用DuPont Zorbax GF-250柱(50μl注入量)，用6MGdnHCl，0.1M磷酸鈉作為洗脫溶液(流速＝1ml/min，23℃并在278nm監(jiān)測(cè))。單體降解率是由單體峰面積的對(duì)數(shù)隨時(shí)間關(guān)系的斜率來(lái)確定的，而降解的半衰期(t1/2)是根據(jù)t1/2＝0.693÷速率來(lái)測(cè)定的。結(jié)果示于表1。
表1溶液穩(wěn)定性t 1/2單體在50℃下的天數(shù)(+/- 10%)分子 PH7.4 PH6.1BHI+鋅 94Asp(B10),des(B27-30)HI 89des(B29-30)HI 49Asp(B10),des(B30)HI 49des(B27-30)HI 46Asp(B10),des(B28-30)HI 37 193Asp(B10)HI 33
des(B28-30)HI 32des(B30)HI 24BHI(無(wú)鋅) 12des(B26-30)HI INaAsp(B10),des(B26-30)HI INaa在整個(gè)實(shí)驗(yàn)時(shí)間過(guò)程中，化合物將不保持可溶性。
實(shí)施例4平衡變性平衡變性實(shí)驗(yàn)是按照Brems等人(Biochemistry299289-9293)的報(bào)導(dǎo)而進(jìn)行的，該文獻(xiàn)的全部報(bào)導(dǎo)在此引入作為參考。制備蛋白質(zhì)的儲(chǔ)液，其濃度為約10mg/ml胰島素或類(lèi)似物，20mM HEPES，PH7.5，20%(V/V)乙醇和1mM EDTA，有或沒(méi)有GdnHCl.變性儲(chǔ)液制備成約7MGdnHCl，20mM Hepes，PH7.5，20%(v/v)乙醇和1mMEDTA。變性樣品是通過(guò)不同比例的蛋白質(zhì)和變性儲(chǔ)液以及一種含20mM HEPES，PH7.5，20%(V/V)乙醇和1mM EDTA的溶液相混合而制備，以得到所要求的變性濃度。GdnHCl濃度是通過(guò)使用Abbe-3L折射儀的折射法來(lái)測(cè)定。
當(dāng)制備變性樣品時(shí)，蛋白質(zhì)儲(chǔ)液是最后加入，然后通過(guò)旋轉(zhuǎn)而輕輕混和整個(gè)樣品。GdnHCl在20%乙醇水溶液中的最大溶解度約7M，因而具有大于7M的樣品要由不含乙醇的約8M的GdnHCl儲(chǔ)液來(lái)制備。園二色性的測(cè)量是用一種Aviv620分光光度計(jì)在23℃下進(jìn)行的。其結(jié)果示于表Ⅱ和表Ⅲ。
表Ⅱ平衡變性Delta G(+/- 6%)1. Asp(B10),des(B27-30)HI 6.22. Asp(B10),des(B29-30)HI 6.03. Asp(B10),des(B26-30)HI 5.84. Asp(B10),des(B30)HI 5.55. Asp(B10),des(B28-30)HI 5.46. Asp(B10)HI 5.17. BHI(無(wú)鋅) 5.18. Asp(B10) des(B23-30)HI 5.19. des(B28-30)HI 5.010. des(B30)HI 4.611. des(B26-30)HI 4.512. des(B27-30)HI 4.313. des(B29-30)HI 4.314. des(B23-30)HI 3.8表Ⅲ平衡變性中點(diǎn)(+/- 2%)1. Asp(B10),des(B27-30)HI 5.8
2. Asp(B10),des(B26-30)HI 5.73. Asp(B10),des(B30)HI 5.64. Asp(B10),des(B23-30)HI 5.65. Asp(B10),des(B29-30)HI 5.56. Asp(B10),des(B28-30)HI 5.57. Asp(B10)HI 5.38. des(B29-30)HI 5.29. des(B27-30)HI 5.110. des(B26-30)HI 5.111. des(B30)HI 5.012. des(B28-30)HI 5.013. des(B23-30)HI 4.714. BHI(無(wú)鋅) 4.5實(shí)施例5平衡超離心作用胰島素的凝聚性質(zhì)是通過(guò)沉降平衡超離心來(lái)進(jìn)行測(cè)定的。每個(gè)類(lèi)似物的結(jié)合態(tài)是使用描述于Pekar，A.H.和Frank，B.H.(1872)Biochemistry，11;4013-4016中的技術(shù)來(lái)測(cè)量的。其全文在此引入，作為參考。表Ⅳ中列出的結(jié)果是對(duì)胰島素和有關(guān)化合物，在其蛋白質(zhì)濃度為3.5mg/ml和PH7.2 0.05M NaCl-0.05M磷酸鈉和22℃條件下。所給出值是平均分子量的觀測(cè)重量除以化合物的單體分子量。所以這個(gè)比值是該胰島素類(lèi)似物聚集程度的指數(shù)。對(duì)于無(wú)鋅的BHI也給出了結(jié)果，顯然，在與人胰島素相比，本化合物具有很弱的自結(jié)合性質(zhì)。
表Ⅳ平衡超離心作用化合物 Mw/M11. Asp(B10),des(B27-30)HI 1.062. Asp(B10),des(B28-30)HI 1.203. des(B27-30)HI 1.804. Asp(B10),des(B29-30)HI 2.05. Asp(B10)HI 2.36. des(B28-30)HI 2.37. des(B29-30)HI 4.68. BHI(無(wú)鋅) 6.6實(shí)施例6受體結(jié)合本發(fā)明的胰島素類(lèi)似物的生理作用示于下列體外胰島素受體結(jié)合試驗(yàn)。微粒體膜是通過(guò)已公開(kāi)的方法(如，Marshall等人(1974)Characterization of the Insulin and somatomedin-c Receptors in Human Placental Cell Membranes，J.Clin.Endocrin.Metab.39283-292)從足月的人胎盤(pán)中制得的。約30μg蛋白質(zhì)用45000～50000 cpm的125I[A14]-人胰島素和冷的競(jìng)爭(zhēng)配位體的增加劑量在0.5ml 100mM Hepes，PH7.8，120mM NaCl，5mM KCl，1.2mM MgSO4，8mM葡萄糖和0.25%BSA中進(jìn)行培養(yǎng)。在4℃24小時(shí)后，用Skatron細(xì)胞收集器在玻璃纖維濾器上收集膜。并測(cè)定結(jié)合125I。為將各種胰島素類(lèi)似物與一種人胰島素標(biāo)準(zhǔn)相比較(參閱表Ⅴ的數(shù)據(jù))，作出競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合曲線以測(cè)定125I胰島素的50%置換的有效激素濃度(ED50)。Asp(B10)，des(B27-30)人胰島素和Asp(B10)，des(B28-30)人胰島素在這些受體結(jié)合研究中是極有效的。
表Ⅴ對(duì)人胰島素受體a的相對(duì)結(jié)合效力化合物 平均值±S.E.M.
人胰島素 (HI) 100%(n=2)Asp(B10)HI 175±17%(n=2)des(B28-30)HI 69±2%(n=3)des(B27-30)HI 125±14%(n=2)Asp(B10),des(B28-30)HI 309±19%(n=2)Asp(B10),des(B27-30)HI 275±15%(n=2)Asp(B10),des(B26-30)HI 172±95(n=2)a對(duì)人胰島素的ED50是0.29nM實(shí)施例7鼠的研究本發(fā)明胰島素類(lèi)似物的生理作用示于下面體內(nèi)試驗(yàn)組。
使用從Charles River Laboratories(Portage，MI)得到的正常的Sprague Dawley雄鼠作為試驗(yàn)動(dòng)物。它們的體重范圍在160-180gms之間，并在有控制光照循環(huán)(在上午700-下午700開(kāi)燈，在下午700-上午700關(guān)燈)的動(dòng)物室中在75°F下維持一星期。動(dòng)物喂以任意的Purina鼠食品50010對(duì)每個(gè)測(cè)試所用的鼠在使用前禁食16小時(shí)。當(dāng)?shù)谝淮问褂脮r(shí)，它們的體重約200克。當(dāng)禁食后的體重達(dá)到約275克(超過(guò)三星期)，則該動(dòng)物不再使用。對(duì)于每一個(gè)試驗(yàn)化合物(即生物合成人胰島素，豬胰島素和人胰島素類(lèi)似物)每天使用一組十只雄鼠。在一星期期間每組僅使用一次。十只鼠分成每五只的二組。一組作為對(duì)照組，僅以皮下給予載體。而另5只鼠的組則給以要試驗(yàn)的化合物。將蛋白質(zhì)溶于0.05N HCl(pH 1.6)而提供每毫升100μgm的儲(chǔ)液。由此，在常用的鹽水中制備成許多稀釋液，以皮下注射入鼠體。在施藥后的0小時(shí)和30分鐘，1小時(shí)、2小時(shí)、3小時(shí)和4小時(shí)的時(shí)候從每個(gè)鼠的尾靜脈采取100μl血樣品。通過(guò)葡萄糖氧化酶法(Sigma Chemical Co.)比色測(cè)定葡萄糖。計(jì)算每只鼠的血中葡萄糖對(duì)0小時(shí)值的百分比變化，而且其最終結(jié)果是以那天對(duì)照組的平均變化校正的實(shí)驗(yàn)組的平均百分比的變化±SEM表示。
劑量一應(yīng)答曲線是使用在給定時(shí)間最大應(yīng)答(通常是給藥后1或2小時(shí))的，由4-7個(gè)不同濃度的測(cè)試化合物的試驗(yàn)中所畫(huà)出來(lái)的。由該曲線測(cè)定ED50值以給出最大低血糖應(yīng)答的一半的蛋白質(zhì)的的皮下給藥劑量(μg/kg)。結(jié)果示于下面表Ⅵ。
表Ⅵa相對(duì)的低血糖化合物 EDb50活性(%)c
人胰島素(HI)d7.75 100Asp(B10)HI 9.8 79des(B28-30)HI 8.1 96des(B27-30)HI 12.7 61Asp(B10),des(B28-30)HI 7.7 101Asp(B10),des(B27-30)HI 11.9 65Asp(B10),des(B26-30)HI 11.0 70a列出的全部數(shù)值是指化合物的給藥1小時(shí)后所取的血樣。
b以μg/kg表示，皮下給藥。
c相對(duì)于人胰島素d生物合成的人胰島素如上所述，本發(fā)明的胰島素類(lèi)似物具有降低二聚化或自結(jié)合為更高分子量形式的趨勢(shì)。因此，在施藥一種或多種所述類(lèi)似物時(shí)，可達(dá)到一種快速的啟動(dòng)活性。本發(fā)明的胰島素類(lèi)似物，通過(guò)對(duì)病人以所需有效量的表達(dá)式Ⅰ的胰島素類(lèi)似物給藥，可有效地處置高血糖。在此所用的“有效量”術(shù)語(yǔ)，是指本發(fā)明的一種或多種胰島素類(lèi)似物用于治療性地或預(yù)防性地降低或保持血糖水平所必要的劑量。通常這種劑量可以是每天從約10單位至高達(dá)約60單位或更高(或假定每毫克約29單位的，約0.3至約2mg)。但是，要明白，該胰島素類(lèi)似物的實(shí)際給藥量應(yīng)由醫(yī)生按照有關(guān)的情況而決定，該情況包括要處置的條件(即，高血糖的起因)，要給藥的特定類(lèi)似物，選擇腸胃外的給藥途徑，年令，各個(gè)病人的體重和應(yīng)答以及病人癥狀的嚴(yán)重程度。所以上述劑量范圍不認(rèn)為是以任何方式限制本發(fā)明的范圍。
本發(fā)明胰島素類(lèi)似物是通過(guò)將含有至少一種表達(dá)式Ⅰ的胰島素類(lèi)似物的有效劑量與一種或多種可藥用的賦形劑或載體相結(jié)合的藥物組合物對(duì)病人以其所需劑量(即，患有高血糖的病人)給藥。為此，藥物組合物可以通常地制劑，以便含有每毫升約100單位或含有有效量胰島素類(lèi)似物的相似濃度。這些組合物通常實(shí)際是非腸道(雖然不是必須是)的，并可以通過(guò)現(xiàn)有技術(shù)中熟知的用于非腸道產(chǎn)品的普通賦形劑或載體所用的任何各種技術(shù)進(jìn)行制備。例如，參見(jiàn)Remingtons Pharmaceutical Sciences，17th Edition，Mack Publishing Company，Easton，PA，USA(1985)，在此引入該文作為參考。例如，非腸道給藥的配劑可以通過(guò)將至少一種表達(dá)式Ⅰ的胰島素類(lèi)似物的要求量懸浮或溶解在一種適宜注射的無(wú)毒液態(tài)載體中，如一種含水介質(zhì)，并消毒懸浮液或溶液。在給藥前為混合的目的，可以提供附有小玻瓶或載體。對(duì)于非腸道所采用的藥物組合物使用稀釋劑，賦形劑，和載體，如水和水-可混的有機(jī)溶劑如甘油，芝麻油，花生油，含水的丙二醇，N，N′-二甲基甲酰胺等等。這些藥物組合物的實(shí)例包括表達(dá)式Ⅰ胰島素類(lèi)似物的無(wú)菌的、等滲壓的、鹽水溶液，它可以用可藥用的緩沖液緩沖而且是無(wú)熱原的。另外，非腸道藥物制劑可含有防腐劑，如，苯酚，或間-甲酚。也可以使用試劑，如氫氧化鈉或鹽酸，以調(diào)節(jié)最終產(chǎn)品的PH值。
本發(fā)明的胰島素類(lèi)似物也可以制備成為適宜于鼻內(nèi)給藥(intranasal administration)的藥物組合物，這類(lèi)組合物詳細(xì)地公開(kāi)于歐洲專(zhuān)利說(shuō)明書(shū)EP 0200383 A3，該文在此引入作為參考。簡(jiǎn)單地說(shuō)，這類(lèi)組合物的配制是用一種或多種可藥用的稀釋劑，一種可藥用量的堿金屬鹽，胺鹽，或一種基本上無(wú)鋅的胰島素的游離酸，以及任選地至少一種吸收增強(qiáng)劑的吸收增強(qiáng)量，該增強(qiáng)劑選自下列試劑(1)油酸或其酯或鹽，(2)一種液態(tài)山梨聚糖脂肪酸酯，(3)一種液態(tài)山梨聚糖脂肪酸酯的聚氧乙烯衍生物，和(4)一種液態(tài)羥基聚氧乙烯-聚氧丙烯-聚氧乙烯共聚物。
實(shí)施例Ⅷ狗的研究為了說(shuō)明與常規(guī)的可溶性人胰島素制劑(Humulin R
)相比較，胰島素類(lèi)似物Asp(B10)，des(B27-30)人胰島素和Asp(B10)，des(B28-30)人胰島素的皮下給藥的效能以及快速作用，進(jìn)行了以下研究。將體重10-12kg的雄性獵犬在研究之前和整個(gè)研究過(guò)程中保持其良好身體條件。將犬禁食16小時(shí)，但可飲水，以確保在胰島素水平上防止所不希望的波動(dòng)。在整個(gè)研究過(guò)程中，將犬用戊巴比妥鈉麻醉，并加熱鋪墊保持其體溫以使葡萄糖波動(dòng)減至最小。將胰島素試驗(yàn)樣品(即，Asp(B10)des(B27-30)人胰島素和Asp(B10)des(B28-30)人胰島素配制成在Humulin R
所用的相同稀釋劑中濃度為3.5mg/ml的制劑。在這些研究中基于重量，假定每個(gè)胰島素類(lèi)似物的低血糖能力相當(dāng)于胰島素，所以考慮這些試驗(yàn)溶液含有100單位/毫升。全部胰島素測(cè)試溶液，取決于樣品，都以每公斤0.1單位向每8只或10只狗的脅部外側(cè)的表皮下面皮下注射給藥。血樣是在給藥前的30、15、和0分鐘時(shí)，以及在給藥后的10，20，30，45，60，90，120，180和240分鐘時(shí)進(jìn)行采取。通過(guò)葡萄糖氧化酶法比色測(cè)定葡萄糖。對(duì)比研究的結(jié)果示于表Ⅶ。
表Ⅶ血中的葡萄糖量0時(shí)的%(a)時(shí)間 Asp(B10) Asp(B10)(Min) Humulin R
des(B27-30)HI des(B28-30)HI(n=8) (n=8) (n=10)-30 102±1.6 92±2.1 103±2.9-15 101±1.6 99±1.2 101±2.00 100 100 10010 100±1.3 93±1.5 98±1.820 99±1.9 80±3.3 93±2.030 97±2.1 63±3.1 81±2.945 86±4.1 47±4.1 67±4.460 79±4.9 43±3.4 60±4.890 67±4.6 48±2.9 67±5.7120 64±4.8 58±4.1 73±4.9180 62±5.0 87±2.6 89±1.9240 77±4.9 89±2.0 90±2.2a血中葡萄糖量平均值±S.E.M.
順序表(1)綜合信息:
(ⅰ)申請(qǐng)人: Eli Lilly and Company(ⅱ)發(fā)明名稱: 胰島素類(lèi)似物(ⅲ)順序數(shù): 2(ⅳ)通訊地址:
(A)收件人: Mr. C. Mark Hudson(B)街道: Erl Wood Manor(C)市: Windlesham(D)州: Surrey GU20 6PH(E)國(guó): Grande Bretagne(F)ZIP:
(ⅴ)計(jì)算機(jī)可讀方式:
(a)設(shè)備型號(hào): Diskette, 3.50英寸, 1.0Mb貯存(B)計(jì)算機(jī): Macintosh(c)操作系統(tǒng): Macintosh(D)軟件: Microsoft word(ⅵ)本申請(qǐng)數(shù)據(jù)(A)申請(qǐng)?zhí)?
(B)申請(qǐng)日:
(C)分類(lèi):
(ⅶ)優(yōu)先申請(qǐng)數(shù)據(jù):
(A)申請(qǐng)?zhí)?br> (B)申請(qǐng)日(ⅷ)代理人信息(A)姓名: Mr.C.Mark Hudson(B)登記號(hào): 307(C)參考/索引號(hào): x8620 EPO(ⅸ)通訊信息:
(A)電話: 027678441(B)傳真: 858177(C)電傳:
(2)SEQ ID No:1 的信息:
(ⅰ)順序特征:
(A)長(zhǎng)度: 21個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型: 氨基酸(C)鏈型:
(D)拓樸結(jié)構(gòu): 線型(ⅱ)分子類(lèi)型: 多肽(ⅸ)特性:
(A)名稱/索引:各種位點(diǎn)(B)位置:21(C)鑒定方法:
(D)其它信息:"本氨基酸可以是Asn, Asp, Glu, Gln, Ala,Gly 或Ser."(ⅹⅰ)順序描述: SEQ ID No:1
Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln1 5 10 15Leu Glu Asn Tyr Cys Xaa20(3)SEQ IDNo:2的信息:
(ⅰ)順序特征:
(A)長(zhǎng)度: 27個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型: 氨基酸(C)鏈型:
(D)拓樸結(jié)構(gòu): 線型(ⅱ)分子類(lèi)型: 多肽(ⅸ)特性:
(A)名稱/索引: 各種位點(diǎn)(B)位置:1(C)鑒定方法:
(D)其它信息:"本氨基酸是Phe或Asp"(C)特性:
(C)名稱/索引:各種位點(diǎn)(C)位置:3(C)鑒定方法:
(D)其它信息:"本氨基酸是Asn或Asp"(ⅹⅰ)順序描述: SEQ ID No:2:
Xaa Val Xaa Gln His Leu Cys Gly Ser Asp Leu Val Glu Ala Leu
1 5 10 15Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr20 2權(quán)利要求
1.一種制備胰島素類(lèi)似物的方法，它包括將SEQ ID No1適當(dāng)交聯(lián)到SEQ ID No2上，其中，在SEQ ID No1的位置21的Xaa選自Asn，Asp，Glu，Gln，Ala，Gly或Ser，在SEQ ID No2的位置1的Xaa選自Asp或Phe，而在SEQ ID No2的位置3的Xaa選自Asp或Asn。
2.按照權(quán)利要求1的方法，其中在SEQ ID No1的位置21的Xaa是Asn.
3.按照權(quán)利要求2的方法，其中在SEQ ID No2的位置1的Xaa是Phe.
4.按照權(quán)利要求3的方法，其中在SEQ ID No2的位置3的Xaa是Asn.
5.一種制備胰島素類(lèi)似物的方法，它包括將SEQ ID No1適當(dāng)?shù)亟宦?lián)到SEQ ID No2的氨基酸殘基1-26上，其中，在SEQ ID No1的位置21的Xaa是選自Asn，Asp，Glu，Gln，Ala，Gly或Ser，在SEQ ID No2的位置1的Xaa是選自Asp或Phe，而在SEQ ID No2的位置3的Xaa是選自Asp或Asn.
6.按照權(quán)利要求5的方法，其中在SEQ ID No1的位置21的Xaa是Asn.
7.按照權(quán)利要求6的方法，其中SEQ ID No2的位置1的Xaa是Phe.
8.按照權(quán)利要求7的方法，其中SEQ ID No2的位置3的Xaa是Asn.
9.一種制備藥物制劑的方法，它包括將權(quán)利要求1-8的任一種胰島素類(lèi)似物與一種或多種可藥用的載體、稀釋劑或其賦形劑相混合。
全文摘要
在B鏈位置10上含有Asp殘基的人胰島素類(lèi)似物，具有B鏈的平截羧基末端，并且任意地，在其它位置上有修飾，顯示出修飾的生理化學(xué)和藥物代謝動(dòng)力學(xué)的特性。這些類(lèi)似物有用于治療高血糖癥。
文檔編號(hào)C12P21/04GK1069737SQ92105888
公開(kāi)日1993年3月10日 申請(qǐng)日期1992年6月19日 優(yōu)先權(quán)日1991年6月21日
發(fā)明者D·N·布雷姆斯, R·E·錢(qián)斯, B·H·弗蘭克 申請(qǐng)人:伊萊利利公司