專利名稱：通過重組宿主生產(chǎn)乙醇的制作方法
技術領域：
本發(fā)明通過佛羅里達農(nóng)業(yè)實驗站，由以下政府基金資助美國農(nóng)業(yè)部乙醇燃料項目基金第86CRCR12134，88-37233-3987和90-37233-5372號，以及能源部基礎能源辦公室基金第FG05-86ER13574號。聯(lián)邦政府對本發(fā)明保留適當權利。
本發(fā)明是下列申請的部分繼續(xù)申請申請?zhí)?7/670，821(1991年3月18日申請)和07/624，277(1990年12月7日申請)。此兩項為另一申請的部分繼續(xù)申請申請?zhí)?7/352，062(1989年5月15日申請，現(xiàn)美國專利號5，000，000)，此申請本身又是另一申請的部分繼續(xù)申請申請?zhí)?7/239，099(1988年8月31日申請，現(xiàn)已放棄)。這些專利文件各自的內(nèi)容以文獻的形式列入本文。
糖酵解過程中，細胞將簡單糖類如葡萄糖轉(zhuǎn)換成丙酮酸，并凈產(chǎn)生ATP和NADH。當缺乏有功能的電子傳遞系統(tǒng)，不能進行氧化磷酸化時，至少95%的丙酮酸會消耗在短的途徑中，再生NAD+，這是繼續(xù)糖酵解和產(chǎn)生ATP所必需的。這些NAD+再生系統(tǒng)所生成的廢物通常稱為發(fā)酵產(chǎn)物。
不同屬的微生物產(chǎn)生多種多樣的發(fā)酵產(chǎn)物，包括有機酸如乳酸、乙酸、琥珀酸和丁酸;也包括中性產(chǎn)物如乙醇、丁醇、丙酮和丁炔二醇。實際上，細菌發(fā)酵產(chǎn)物的多樣性已被用作細菌分類的主要指標之一。參見《伯杰氏細菌學分類手冊》(Williams和Wilkins公司，巴爾的摩，1984年。以下簡稱“伯杰氏手冊”)等手冊。
發(fā)酵終產(chǎn)物具有一些共同的基本特征。在產(chǎn)物起初生成的條件下，它們相對無毒性;然而隨著產(chǎn)物的積累，其毒性越來越大。與丙酮酸相比，它們處在更還原的狀態(tài)，因為其直接前體在糖酵解中是作為末端電子受體的。通過微生物產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)物，構(gòu)成了生物工藝學中最悠久、經(jīng)濟上最成功的應用的基礎。產(chǎn)物包括乳制品、肉制品、飲料和燃料。近年來，由于新的技術，生物工藝學領域取得了很多進展。使得研究工作者能有選擇地改變某些微生物的遺傳組成。
細菌大腸桿菌(Escherichiacoli)是生物工藝學中一種重要載體，用于克隆和修飾基因;它也是用于產(chǎn)生重組產(chǎn)物的最重要的宿主之一。近年來，用于重組DNA研究的宿主范圍已經(jīng)擴大到包括不同的細菌、酵母、真菌和真核細胞。本發(fā)明涉及應用重組DNA技術，通過某種經(jīng)修飾的宿主產(chǎn)生特定的有用產(chǎn)物。
用于修飾本發(fā)明中宿主的DNA分離自運動發(fā)酵單胞菌(Zymomonasmobilis)，這種細菌常常出現(xiàn)在植物汁液和蜂蜜中。運動發(fā)酵單胞菌(Z.mobilis)長期以來一直用作接種體，用于釀制棕櫚酒和發(fā)酵龍舌蘭汁液制造pulque(一種含酒精的墨西哥飲料)。該微生物也用于生產(chǎn)燃料乙醇，而且據(jù)報道，其乙醇得率明顯高于酵母。
盡管運動發(fā)酵單胞菌(Z.mobilis)營養(yǎng)要求簡單，并且能合成氨基酸，核苷酸和維生素，但是它能代謝的糖的范圍十分有限，通常只包括葡萄糖、果糖和蔗糖。發(fā)酵這些糖后的底物水平磷酸化是其生物合成和體內(nèi)平衡的唯一能源。如果沒有可發(fā)酵的糖運動發(fā)酵單胞菌(Z.mobilis)甚至不能在豐富培養(yǎng)基如營養(yǎng)肉湯中生長。
運動發(fā)酵單胞菌(Z.mobilis)是一種專性發(fā)酵的細菌，它缺乏有功能的氧化磷酸化系統(tǒng)。如同啤酒酵母(Saccharomycescerevisiae)，運動發(fā)酵單胞菌(Z.mobilis)產(chǎn)生乙醇和二氧化碳作為主要發(fā)酵產(chǎn)物。它產(chǎn)生乙醇通過一短的途徑，只需要兩種酶活性丙酮酸脫羧酶和乙醇脫氫酶。丙酮酸脫羧酶是此途徑中的關鍵酶，它使丙酮酸轉(zhuǎn)向產(chǎn)乙醇途徑。丙酮酸脫羧酶催化丙酮酸的非氧化性脫羧，產(chǎn)生乙醛和二氧化碳。有兩種乙醇脫氫酶的同工酶存在于該有機體，它們在發(fā)酵過程中催化乙醛還原成乙醇的反應，同時使NADH氧化成NAD+。盡管細菌乙醇脫氫酶在許多有機體中常見，但具有丙酮酸脫羧酶的細菌較少。在改造運動發(fā)酵單胞菌提高其作為乙醇生產(chǎn)菌的商業(yè)利用率的研究中，取得的成果十分有限。
目前，大多數(shù)燃料乙醇是利用啤酒酵母(S.cerevisiae)或運動發(fā)酵單胞菌(Z.mobilis)從玉米淀粉或莖桿漿汁中的己糖產(chǎn)生的。但是這種糖類是比較昂貴的生物量糖源，也可用作食品。淀粉和糖只代表植物中總糖的一部分。在植物的莖、葉、谷殼、果殼和玉米棒子等諸如此類的結(jié)構(gòu)中，碳水化合物的主要形式是結(jié)構(gòu)性細胞壁多聚體，纖維素和半纖維素。這些多聚體水解后釋放出中性糖類混合物，包括葡萄糖、木糖、甘露糖、半乳糖和阿拉伯糖。自然界中尚未發(fā)現(xiàn)有單獨的有機體能夠快速有效地代謝所有這些糖生成乙醇或任何其他有價值的單一產(chǎn)物。
運動發(fā)酵單胞菌(Z.mobilis)中編碼乙醇脫氫酶Ⅱ和丙酮酸脫羧酶的基因已經(jīng)分別克隆和鑒定，并在E.coli中獲得表達。見Braeu和Sahm[1986a]Arch.Microbiol144296-301，[1986b]Arch.Microbiol.146105-10;Conway等[1987a]J.Bacteriol169949-54;Conway等[1987b]J.Bacteriol1692591-97;Ingram和ConwayAppl.Environ.Microbiol.54397-404;Ingram等Appl.Environ.Microbiol.532420-25。
Braeu和Sahm[1986a](見上)首先證實，在過量表達運動發(fā)酵單胞菌(Z.mobilis)丙酮酸脫羧酶的重組大腸桿菌(E.coli)中，雖然產(chǎn)生的乙醇濃度很低，乙醇產(chǎn)量可以有所增加。進一步的研究擴充了此項工作。利用另外兩種腸道細菌，即菊歐文氏菌(Erwiniachrysanthemi)和植生克氏桿菌(Klebsiellaplanticola)，從己糖、戊糖和糖類混合物獲得了較高的乙醇產(chǎn)量。見Tolan和FinnAppl.Environ.Microbiol.532033-38，2039-44。
因此，當以簡單糖類為原料時，上述微生物才有應用價值。但是，我們發(fā)現(xiàn)，地球上大部分廉價而不絕的生物量資源不是以單糖形式，而是以木質(zhì)纖維素形式存在，后者主要是纖維素、半纖維素和木質(zhì)素的混合物。纖維素是葡萄糖同聚體，而半纖維素是較為復雜的雜聚體，不僅包含木糖(主要組分)，而且包含相當數(shù)量的阿拉伯糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖。據(jù)估計，利用微生物對充斥美國的廢紙和生活垃圾中的糖殘基進行轉(zhuǎn)化后，可以提供一百億加侖以上的乙醇。改管上述討論的微生物可以有效地發(fā)酵木質(zhì)纖維素中的纖維素和半纖維素多聚體的結(jié)構(gòu)單糖，改進的木質(zhì)纖維素的糖化方法仍是一個主要的研究課題。
目前糖化木質(zhì)纖維素的方法包括酸水解和酶法水解。酸水解通常需要熱量，而且有一些缺點。包括消耗能源，產(chǎn)生酸廢物，以及產(chǎn)生毒性化合物妨礙隨后的微生物發(fā)酵。因而酶法水解就是一種理想的方法。例如，酶可以直接加進包含木質(zhì)纖維素原料的介質(zhì)中。
通過遺傳工程途徑，使產(chǎn)乙醇或乳酸的微生物加上糖化性狀，這方面的工作一直著眼于使微生物分泌高水平的酶量到培養(yǎng)基中。就是說，修飾已帶有將細胞內(nèi)產(chǎn)生的酶轉(zhuǎn)動到發(fā)酵培養(yǎng)基中所需蛋白質(zhì)的微生物，這樣這些酶就可以作用于多糖底物，產(chǎn)生單糖和寡糖。所以要采用這種方法，是因為很難成功地對不能轉(zhuǎn)動這些蛋白質(zhì)的菌體進行改造。
因此，本發(fā)明的目的之一，就是提供有關微生物，它們在有氧和厭氧生長條件下，都能有效地將丙酮酸轉(zhuǎn)入產(chǎn)乙醇途徑。
本發(fā)明的另一目的，就是促進重組宿主生長，降低培養(yǎng)基中不需要的代謝產(chǎn)物的積累。
本發(fā)明的另一目的，就是提供重組宿主，它們能夠在細胞內(nèi)產(chǎn)生足夠的多糖酶，分解葡萄糖或木糖寡聚體，使得同一宿主能夠發(fā)酵這些分解產(chǎn)物，生成乙醇。
為了實現(xiàn)上述這些以及其他一些目的，依照本發(fā)明第一主領域，提供了一種非大腸桿菌(Escherichiacoli)重組宿主，其中包含編碼產(chǎn)生乙醇脫氫酶和丙酮酸脫羧酶的異源DNA。該宿主能表達其中異源DNA到足夠的功能水平，使乙醇成為該宿主的初級發(fā)酵產(chǎn)物。
一項有利的措施是在重組宿主中使用了運動發(fā)酵單胞菌(Z.mobilis)中編碼乙醇脫氫酶和丙酮酸脫羧酶的基因。第一領域其他方面包括一些帶有編碼乙醇脫氫酶和丙酮酸脫羧酶基因的質(zhì)粒，這些質(zhì)粒有助于本發(fā)明中重組宿主的獲得。
在本發(fā)明的第二主領域中，重組宿主除了包含編碼乙醇脫氫酶和丙酮酸脫羧酶的DNA外，還包含編碼有關蛋白質(zhì)DNA，這些蛋白質(zhì)能使宿主轉(zhuǎn)動和代謝某種寡糖。宿主表達該DNA達到一定水平后，宿主代謝寡糖所產(chǎn)生的乙醇成為初級發(fā)酵產(chǎn)物。該發(fā)明領域中所選的宿主包括腸道細菌，如歐文氏菌(Erwinia))和克氏桿菌(Klebsiella)。其它所選的宿主能代謝由五碳糖和/或六碳糖單體(如葡萄糖、木糖)及麥芽糖組成的雙糖和或叁糖。
在本發(fā)明的第三主領域中，上述的重組宿主還包含產(chǎn)生一種或幾種多糖酶所需的DNA。宿主產(chǎn)生多糖酶，隨后將其釋放到培養(yǎng)基中。這樣能減少商業(yè)酶用量。這些酶能夠?qū)⒃辖到獬蔀榭砂l(fā)酵的單糖和寡糖。
編碼多糖的DNA可以是宿主自身的，但在更多情形下是外來的，即異源的。有用的多糖酶包括纖維素分解酶、木聚糖分解酶和淀粉降解酶。宿主至少要能夠部分地分泌多糖酶，或者多糖酶能在細胞內(nèi)大量積累，隨后釋放出來。有利的是，細胞內(nèi)積累的酶是熱穩(wěn)定的，當需要時，可以通過熱誘導裂解而釋放。異源DNA可編碼不同的酶，一些酶分泌出來，一些酶積累起來。
可進行其它修飾來增進前述宿主乙醇的產(chǎn)生。例如，宿主還可包含其它異源DNA片段，其表達的蛋白質(zhì)產(chǎn)物參與運輸單糖和/或寡糖進入重組宿主。同樣，宿主也可包含糖酵解途徑中其他的基因。由此，可以取得高的乙醇得率。
本發(fā)明也提供了利用所有前述宿主生產(chǎn)乙醇的方法。還提供了有關處理寡糖原料的方法，可將寡糖轉(zhuǎn)化成乙醇和更簡單的寡糖和/或單糖。另一方面還提供了一種方法，利用本發(fā)明的轉(zhuǎn)化宿主在培養(yǎng)基中產(chǎn)生乙醇，來降低培養(yǎng)基中酸性代謝產(chǎn)物的積累。此外還提供了一種方法，以增加在過量表達的運動發(fā)酵單胞菌(Z.mobilis)adhB基因的重組宿主中功能蛋白質(zhì)的產(chǎn)生。本發(fā)明的另一方面包括有關工序設計，將含寡糖生物量發(fā)酵生成乙醇。
下面的詳細描述將使本發(fā)明的其他目的、特征和優(yōu)點變得顯而易見。但是必須了解，發(fā)明的詳述和實施例，在表明本發(fā)明優(yōu)先使用范圍的同時，僅僅是以例證說明的方式給出，因為在本發(fā)明的主旨和范圍內(nèi)，各種改變和修改對于本領域行家，都是顯而易見的。


圖1示包含運動發(fā)酵單胞菌中(Z.mobilis)編碼丙酮酸脫羧酶和乙醇脫氫酶Ⅱ基因的質(zhì)粒pLOI295的構(gòu)建?？s寫說明RI，EcoRI;H，HindⅢ;B，BamHI;t，終止子;adh，運動發(fā)酵單胞菌乙醇脫氫酶Ⅱ;pdc，運動發(fā)酵單胞菌丙酮酸脫羧酶;cat，氯霉素?；D(zhuǎn)移酶;Ap，β-內(nèi)酰胺酶;ZmProfrags，具有啟動子活性的運動發(fā)酵單胞菌DNA片段;ColE1，衍生自pBR322的復制起點;oriV，衍生自RSF1010的復制起點;Plac，乳糖操縱子啟動子;Pzm，運動發(fā)酵單胞菌的啟動子;P？，載體上隱秘啟動子;kb，千堿基。
圖2示包含編碼運動發(fā)酵單胞菌丙酮酸脫羧酶和乙醇脫氫酶Ⅱ基因的幾個質(zhì)粒。
圖3示菌株TC4及其包含編碼產(chǎn)乙醇酶類質(zhì)粒的重組子的生長和產(chǎn)酸。
圖4示重組宿主丙酮酸脫羧酶活性和生長程度的關系。24小時生長后的細胞量以550納米處光密度值(O.D.550)表示。
圖5示pLOI510的構(gòu)建。
圖6示歐文氏菌和克氏桿菌產(chǎn)乙醇重組子發(fā)酵纖維二糖產(chǎn)生的乙醇濃度。
圖7A、7B和7C示包含xynZ和xylB基因的重組質(zhì)粒的構(gòu)建。
圖8A和8B示利用大腸桿菌(E.coli)KO11(pLOI2003)水解木聚糖的薄層層析分析結(jié)果。細菌在45℃(圖8A)或60℃(圖8B)培養(yǎng)于包含4%樺木木聚糖的Luria肉湯培養(yǎng)基中(pH6.0)。
圖9A和9B示重組大腸桿菌KO11(圖9A)和催娩克氏桿菌(K.oxytoca)M5A1(圖9B)利用寡聚木糖的生長情況。
圖10A和10B示重組催娩克氏桿菌(K.oxytoca)M5A1轉(zhuǎn)化木糖和木聚糖水解物成為乙醇。圖10A示生長，圖10B示乙醇產(chǎn)生。
圖11A和11B示通過重組催娩克氏桿菌(K.oxytoca)M5A1菌株產(chǎn)生乙醇。圖11A示菌株M5aI(pLOI555)，帶有整合的pet基因菌株P2，帶有整合的pet基因菌株B1。利用葡萄糖(100克/升)生成乙醇，圖11B示通過菌株P2從纖維二糖(100克/升)發(fā)酵產(chǎn)生乙醇。
圖12示經(jīng)120小時后，加入商品纖維素酶對從SOLKAFLOCSW40(50克/升)產(chǎn)乙醇的量的影響。
圖13A、B和C示利用菌株P2(pCT603T)水解和發(fā)酵纖維素后的薄層層析分析結(jié)果。圖13A，酸漲纖維素;圖13B，堿漲纖維素;圖13C，晶狀纖維素。
圖14示用celD基因產(chǎn)物預處理和利用1%纖維素酶對乙醇產(chǎn)生的促進作用，結(jié)果與用5%CYTOLASE處理相同。
圖15示質(zhì)粒pLOI140和pLOI141的構(gòu)建。它們包含來自嗜熱脂肪芽孢桿菌(Bacillusstearothermophilus)的α-淀粉酶基因和熱厭氧細菌(Thermoanaerobinmbrockii)的支鏈淀粉酶基因。
圖16A和B分別示KO11發(fā)酵葡萄糖和麥芽糖的乙醇產(chǎn)生和細胞量。
圖17示重組大腸桿菌(Ecoli)KO11(pLOI140)和KO11(pLOI141)淀粉發(fā)酵之結(jié)果。(因兩者結(jié)果基本相同，只顯示了KO11(pLOI141)數(shù)據(jù)。)圖18示發(fā)酵過程中(72小時)，KO11(pLOI141)玉米淀粉發(fā)酵的薄層層析分析結(jié)果。
圖19為根據(jù)本發(fā)明進行的發(fā)酵過程示意圖。
Ⅰ.常規(guī)碳水化合物代謝在大多數(shù)動物和植物以及細菌、酵母和真菌中，葡萄糖在進行氧化或發(fā)酵代謝之前，先要通過厭氧途徑降解。最普通的這種途徑稱為糖酵解，包括一系列酶促步驟，通過形成許多中間產(chǎn)物將六碳葡萄糖分子，分解成兩分子的三碳化合物丙酮酸。在此過程中，兩分子的NAD+還原成NADH。葡萄糖轉(zhuǎn)換成丙酮酸過程的凈反應為葡萄糖+2Pi+2ADP+2NAD+→2丙酮酸+2ATP+2NADH+2H+為使糖酵解繼續(xù)進行，此過程消耗的NAD+必須通過NADH氧化再生。氧化代謝過程中，NADH通常經(jīng)過一系列步驟把氫遞給氧而形成水。但是大多數(shù)有機體包含另外的厭氧途徑，使糖酵解過程在氧氣等不存在時得以繼續(xù)。這種厭氧過程稱為發(fā)酵，而單純?nèi)樗岚l(fā)酵可能是許多細菌和動物中最常見的厭氧發(fā)酵途徑之一。在單純?nèi)樗岚l(fā)酵過程中，葡萄糖最終轉(zhuǎn)化為兩分子的三碳酸乳酸。NADH被氧化，其氫傳遞給丙酮酸，生成乳酸。乳酸發(fā)酵再生NAD+過程凈反應為2丙酮酸+2NADH→2乳酸+2NAD+如前所述，產(chǎn)乙醇生物如運動發(fā)酵單胞菌和啤酒酵母，它們具有另一條(乙醇)發(fā)酵途徑，葡萄糖由此代謝生成兩分子乙醇和兩分子二氧化碳。乙醇發(fā)酵與乳酸發(fā)酵不同點在于再生NAD+的步驟。乙醇發(fā)酵需兩個不同的步驟。丙酮酸脫羧酶使丙酮酸分解或乙醛和二氧化碳。乙醇脫氫酶將氫從NADH轉(zhuǎn)到乙醛，而再生NAD+，并產(chǎn)生乙醇。乙醇發(fā)酵再生NAD+過程反應為2丙酮酸→2乙醛+2CO22乙醛+2NADH→2乙醇+2NAD+凈反應2丙酮酸+2NADH→2乙醇+2CO2+2NAD+編碼每種酶的DNA已分別克隆，并且運動發(fā)酵單胞菌丙酮酸脫羧酶已通過重組方法表達。如參見Braeu和Sahm[1986a](見前)。但是，并不能確定，在不產(chǎn)生乙醇作為初級代謝產(chǎn)物的生物(“非產(chǎn)乙醇生物”)中，糖酵解途徑是否能在丙酮酸階段大幅度轉(zhuǎn)向，即使能夠在某種程度上修飾這種生物，使其表達乙醇發(fā)酵所需的兩種酶。
相反，有人認為這種轉(zhuǎn)向也許會使重組宿主發(fā)生丙酮酸及其正常產(chǎn)物饑餓。見Braeu和Sohm[1986a，b](見前)。還有一種可能性，就是在本來不產(chǎn)生乙醇的生物中，從糖酵解轉(zhuǎn)到產(chǎn)乙醇過程的碳的轉(zhuǎn)向，可能會打亂對相互關聯(lián)的產(chǎn)能途徑和生物合成途徑至關重要的NAD/NADH比例。
Ⅱ.按照本發(fā)明的發(fā)酵但是，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)可對進行糖酵解或類似過程的生物進行遺傳工程改造。按照本發(fā)明，通過改造，在丙酮酸階段，糖酵解過程95%的碳會轉(zhuǎn)向一實質(zhì)上的合成途徑。該途徑包含由異源丙酮酸脫羧酶(pdc)和乙醇脫氫酶(adh)基因編碼的兩種酶。結(jié)果產(chǎn)生一種遺傳工程菌，其產(chǎn)生乙醇作為它的初級發(fā)酵產(chǎn)物。就是說，產(chǎn)生的乙醇超過總的發(fā)酵產(chǎn)物的50%。
另外發(fā)現(xiàn)，可以選擇宿主來進行這種異源表達，依靠宿主本身轉(zhuǎn)運和代謝寡糖的能力，它們能夠發(fā)酵更復雜的原料。(本文中，“寡糖”指一種分子，其包含兩種或更多的糖單體。包括但不限于雙糖如纖維二糖、麥芽糖和木二糖，叁糖如纖維叁糖和木叁糖，及長鏈的多糖如纖維素、半纖維素、淀粉、糖原、果膠和菊粉。)這樣選擇和轉(zhuǎn)化的宿主，其能力可進一步擴充，即可通過在同一宿主中表達一種或幾種編碼多糖酶的基因，多糖酶能催化復雜的寡糖分解或較小的寡糖和/或單糖。
(A)通過遺傳工程產(chǎn)生人工產(chǎn)乙醇途徑本發(fā)明的一個重要方面是一個能使細胞產(chǎn)生乙醇的操縱子。本發(fā)明的一個構(gòu)建體是這種操縱子的一個示例，稱為“pet操縱子”。它包含運動發(fā)酵單胞菌分別編碼乙醇脫氫酶Ⅱ和丙酮酸脫羧酶活性的基因，以及相應的調(diào)節(jié)序列，如啟動子、操縱基因、核糖體結(jié)合部位和轉(zhuǎn)錄終止子。這樣，通過聯(lián)合運動發(fā)酵單胞菌編碼乙醇脫氫酶Ⅱ和丙酮酸脫羧酶基因構(gòu)成一個pet操縱子，摒棄了以前重組系統(tǒng)中的依賴內(nèi)源乙醇脫氫酶產(chǎn)生乙醇的方式。而且，在有氧和厭氧條件下，包含pet操縱子的重組子都能產(chǎn)生大量的乙醇。
為了賦予微生物產(chǎn)生多糖酶(如木聚糖酶和纖維素酶)的能力，可加上編碼所需酶的基因以修飾本發(fā)明的產(chǎn)乙醇操縱子。或者，可將一種或幾種多糖酶編碼基因組入質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化已經(jīng)帶有指導乙醇產(chǎn)生的操縱子(如上所述)的宿主。(本發(fā)明這方面內(nèi)容詳見下面第二節(jié)(E)。)通過另一種途徑，可選擇本身具有表達多糖酶的能力的宿主作為轉(zhuǎn)化產(chǎn)乙醇操縱子的宿主。還有一種方法是將外加的多糖酶基因整合到染色體中。
在單一的構(gòu)建體中，把編碼一代謝途徑的酶的基因組合在一起，這一方法普遍適用于不同情形，可把來自不同座位的基因裝到一起，構(gòu)成一人工操縱子。這樣，pet操縱子的構(gòu)建，只不過是本發(fā)明應用的一個例子。例如，來自不同生物的編碼乙醇脫氫酶的基因，可與其它編碼丙酮酸脫羧酶的基因組合在一起，以構(gòu)建編碼所需途徑的操縱子。編碼其它途徑的操縱子也可以構(gòu)建。同樣明顯的是，對于上面討論的產(chǎn)乙醇途徑，編碼乙醇脫氫酶和丙酮酸脫羧酶的基因不必受共同控制;它們可受分別的控制，甚至位于不同的質(zhì)?；蛭挥谌旧w上不同位置。同樣，編碼多糖酶的基因可受共同的或分別的控制，或位于不同質(zhì)粒，或在染色體不同位置上。
本發(fā)明另一方面涉及利用產(chǎn)乙醇重組宿主來有效地產(chǎn)生重組多肽或蛋白質(zhì)，就是說，重組子細胞可進一步用編碼有用產(chǎn)物(非多糖酶)的基因轉(zhuǎn)化(這些另外的基因可位于質(zhì)粒上，或整合到染色體中)。
尤其是，編碼產(chǎn)乙醇酶的基因通常高水平地表達，在厭氧生長時，支配自丙酮酸和NADH氧化的碳流。在這樣條件下，丙酮酸碳架的流動可從產(chǎn)有機酸轉(zhuǎn)向產(chǎn)乙醇，作為主要的發(fā)酵產(chǎn)物。
這樣，每單位細胞蛋白酸化的程度，通過乙醇的產(chǎn)生而不是有機酸的產(chǎn)生，降到最低程度。在微生物密集的培養(yǎng)物中生長的過程中，氧氣的轉(zhuǎn)移常常是一主要的限制因素。正是由于這一限制，導致培養(yǎng)養(yǎng)基中酸的產(chǎn)生和pH值變化。與此相反，本發(fā)明中，表達產(chǎn)乙醇操縱子的重組體中，異源的產(chǎn)乙醇酶能將部分丙酮酸從糖酵解轉(zhuǎn)向產(chǎn)乙醛，再氧化NADH產(chǎn)生乙醇，一種損害較小的代謝產(chǎn)物。這樣，包含氧化磷酸化功能呼吸鏈和乙醇產(chǎn)生酶類的菌株，甚至可以生長達到更高的細胞密度，因為在再生NAD+和降低酸性廢物產(chǎn)生的過程中這兩個系統(tǒng)均起作用。這種內(nèi)在的變化的結(jié)果是對流程控制要求較少并增加重組產(chǎn)品的容積產(chǎn)量。
從其它方式產(chǎn)生的有機酸的積累被認為是在厭氧生長過程發(fā)酵的結(jié)果。但是即使在有氧條件下，也會產(chǎn)生可觀量的乙酸。這樣，乙酸可能從生長最初階段就逐漸產(chǎn)生，并不限于后期，后期細胞密度很高，厭氧條件占主導。從葡萄糖產(chǎn)生的酸，即使在有氧條件下，也會限制在液體和固體培養(yǎng)基中的生長，這可由在含磷酸緩沖液的培養(yǎng)基中最終細胞密度的增加來顯示。
因此，本發(fā)明的產(chǎn)乙醇轉(zhuǎn)化子，也是生產(chǎn)重組產(chǎn)物的好的宿主，它即使在厭氧條件下，也只伴隨產(chǎn)生最低限度的酸。許多重組蛋白質(zhì)和多肽包含半胱氨酸或二硫鍵，其適當?shù)恼郫B或反應為形成有活性的酶所必需。由于氧促進二硫鍵的形成，因此在厭氧條件下合成的這類蛋白質(zhì)，在分離和在控制條件下折疊之前，較少有機會不正常折疊，由此可回收較多的有生物活性的產(chǎn)物。
將adhB用于這些構(gòu)建體可能具有特別的優(yōu)越性。AdhB編碼一種逆境蛋白質(zhì)(An等FEBSLETTERS282205-208)。業(yè)已表明逆境蛋白質(zhì)有助于異源蛋白質(zhì)的適當折疊以保留其生物活性。(Lee等.J.Biol.Chem.2672849-2852)。因此使用adhB可能增進重組生物中有功能蛋白質(zhì)的產(chǎn)生。
有氧條件下，大腸桿菌中糖酵解產(chǎn)生的丙酮酸主要由丙酮酸脫氫酶復合體和乳酸脫氫酶代謝，多余的乙酰輔酶A被轉(zhuǎn)化成乙酸。見Gottschalk著BACTERIAL METABOLISM pp.210-80(Springer-Verlag 1986)。這兩種酶的表觀米氏常數(shù)Km值分別是0.4和7.2mM。運動發(fā)酵單胞菌丙酮酸脫羧酶的表觀Km值與大腸桿菌丙酮酸脫氫酶的相等，而低于乳酸脫氫酶表觀Km值，這樣有助于乙醛產(chǎn)生。有氧條件下NAD+的再生主要來自于生物合成和NADH氧化酶(與電子傳遞系統(tǒng)偶聯(lián)，其表現(xiàn)Km值為50μM)。運動發(fā)酵單胞菌乙醇脫氫酶Ⅱ表現(xiàn)Km值比大腸桿菌NAD+氧化酶表觀Km值要低四到五倍，使得運動發(fā)酵單胞菌該酶能有效地競爭內(nèi)源NADH庫，以還原乙醛成乙醇。由此，運動發(fā)酵單胞菌產(chǎn)乙醇酶類的性質(zhì)及其相對高水平的表達非常適合于在有氧條件下使碳流轉(zhuǎn)向生成乙醇。
厭氧條件下，大腸菌桿中糖酵解產(chǎn)生的丙酮酸主要由乳酸脫氫酶和丙酮酸甲酸裂合酶代謝。該兩種酶的表觀Km值比運動發(fā)酵單胞菌丙酮酸脫羧酶表觀Km值分別高18倍和5倍。類似地，大腸桿菌中參與NAD+再生的主要酶類其Km值也都顯著高于運動發(fā)酵單胞菌乙醇脫氫酶Ⅱ的表觀Km值。這樣，與大腸桿菌正常的發(fā)酵酶類和氧化磷酸化相比，來自運動發(fā)酵單胞菌的產(chǎn)乙醇酶類對碳(丙酮酸)和還原力(NADH)具有相當?shù)母偁幜?，使得糖酵解產(chǎn)物有效地流向產(chǎn)乙醇途徑。
已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，乳糖和存在于纖維素和半纖維素中的主要糖類(即葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、半乳糖和甘露糖)，根據(jù)本發(fā)明，均可被能夠表達產(chǎn)乙醇酶類(如組成上面討論的運動發(fā)酵單胞菌乙醇途徑的酶)的重組宿主轉(zhuǎn)化成乙醇。
在選擇適合按照本發(fā)明進行乙醇生產(chǎn)的宿主菌株時，必須考慮種種因素。這些因素包括底物范圍和對環(huán)境的耐受性如耐糖性、耐鹽性、耐乙醇性、耐低pH性及耐熱性。例如，如下所述，大腸桿菌菌株ATCC9637(WaksmanW株)表現(xiàn)出優(yōu)越的環(huán)境耐受性，盡管從葡萄糖產(chǎn)生的乙醇量低于其他菌株。選擇菌株ATCC9637主要是因其具有利用蔗糖的獨特能力。有利的是，ATCC9637此特性使該菌株得以用于發(fā)酵甜菜糖、甘蔗糖和其它含蔗糖原料。ATCC11303(LuriaB株)和ATCC15244(KepesML300株)包含pLOI297時，產(chǎn)生出最高水平的乙醇，并表現(xiàn)出可接受水平的環(huán)境耐受性。在這兩個構(gòu)建體中，質(zhì)粒相當穩(wěn)定，它們被選為最佳候選菌株以進一步改進乙醇產(chǎn)量。兩構(gòu)建體都高水平表達有效產(chǎn)生乙醇所需的運動發(fā)酵單胞菌丙酮酸脫羧酶。見Ingram等(1987)。
包含來自運動發(fā)酵單胞菌乙醇途徑的重組大腸桿菌，能將植物生物量中所有主要糖分轉(zhuǎn)化成乙醇。其葡萄糖和木糖轉(zhuǎn)化成乙醇的效率高于以前報道的啤酒酵母，見Lovitt等(1988)CRCCrit.Rev.Biotechnol7107-186，和戊糖發(fā)酵酵母系統(tǒng)。見BackBiotechnol.bioeng.Symp.17617-627;Jeffries等Biotechnol.Bioeng.31502-506;Skoog等EnzymeMicrobiolTechnol1066-79;Slininger等Biotechnol.Lett7431-436)。重組大腸桿菌轉(zhuǎn)化木糖成乙醇的效率高于啤酒酵母轉(zhuǎn)化葡萄糖的效率，如Lovitt等報道(見前)。用木糖發(fā)酵獲得不尋常的高乙醇得率(超過理論值的100%)，這可能歸結(jié)于復合營養(yǎng)基質(zhì)的分解代謝產(chǎn)生了乙醇。許多氨基酸和復合培養(yǎng)基組分可分解代謝成糖酵解中間物或丙酮酸。這樣生成的丙酮酸然后可被轉(zhuǎn)化為乙醇。
根據(jù)本發(fā)明，pdc和adh基因可轉(zhuǎn)化進入種種不同宿主，用不同啟動子表達。本領域中受過訓練者很容易進行這些轉(zhuǎn)化。例如，可容易地將pdc和adh基因插入具有不同宿主范圍的各種質(zhì)粒。構(gòu)建的能在大腸桿菌和另一種目標生物中復制的質(zhì)粒特稱為“穿梭載體”，因其能在兩種或更多宿主中復制。這些質(zhì)粒便于得到，易于使用。大多數(shù)常見的穿梭組合為大腸桿菌與其他細菌，大腸桿菌與酵母及大腸桿菌與動物細胞。這些載體可見于產(chǎn)品目錄，且為本領域行家熟知。
運動發(fā)酵單胞菌pdc和adh基因已被插入黃單胞菌(Xanthomonas)、克氏桿菌(Klebsiella)和歐文氏菌(Erwinia)并在其中表達。在其它生物中也可容易取得類似結(jié)果。雖然可能需要進行一些直接修飾如改造啟動子以產(chǎn)生最適構(gòu)建體，但根據(jù)可溶性細胞質(zhì)蛋白質(zhì)的生化性質(zhì)及當前有關其表達的知識，取得成功是在預料之中的。表達改變丙酮酸代謝所需酶活性的外源基因，依照本發(fā)明，甚至可以整合到染色體中，不需要質(zhì)粒就能表達。見第二節(jié)(C)(見下)。例如缺乏啟動子的pet基因構(gòu)建體可以整合到大腸桿菌染色體中，剛好位于丙酮酸甲酸裂合酶基因(pfl)啟動子之后。類似地可整合到大多數(shù)生物中pfl或其它基因中，這只需要一段這些目標基因的片段來決定通過同源重組而整合的位點。除pfl基因，其它目標基因也可用于整合。因為在指示平板上可容易地鑒別表達pet的構(gòu)建體，這一方法廣泛地適用于快速有效地構(gòu)建其他生物體，用于乙醇生產(chǎn)。
有許多教科書描述表達外源基因的步驟。產(chǎn)品目錄也列出有關載體，可用于不同生物體。用于革蘭氏陰性細菌克隆載體，革蘭氏陽性細菌克隆載體，具廣泛宿主能力的載體，真菌克隆載體，昆蟲克隆載體，動物細胞克隆載體，和植物細胞克隆載體，這些都為本領域行家所熟知。有關產(chǎn)品目錄很容易得到，從中可預定這些克隆載體，這已為本領域內(nèi)行家所熟知。例如，參見MarinoBioPharm218-33;VECTORSASURVEYOFMOLECULARCLONINGVECTORSANOTHEIRUSES(《載體分子克隆載體及其應用概覽》)(Butterworths1988)。
利用上面提到的運動發(fā)酵單胞菌基因為探針，或更好一點，通過在指示平板上觀察活性，以此為鑒定，熟練操作者還可獲得其它來源的pdc和adh基因或其它與之類似的基因。為達到本發(fā)明之目的，編碼乙醇脫氫酶活性的基因來源并不要緊，無論是分離自馬、酵母、人、昆蟲，還是其它細菌。由于乙醇脫氫酶活性的表達可以直接從乙醛指示平板上觀察到，因此不需要有關順序資料，來分離編碼具此酶活性的蛋白質(zhì)的其它基因。的確，許多乙醇脫氫酶基因已為本領域行家熟曉，以為佐證，至1991年3月，Genbank數(shù)據(jù)庫中列舉了252種adh基因(IntelliGeneticsInc.，700E.ElCaminoDrive，MountainView，CA94040)。
運動發(fā)酵單胞菌包含兩種編碼有功能的乙醇脫氫酶的基因，其中一種adh進化上與下列基因相關丙酮丁醇梭菌(Clostridiumacetobutylicum)丁醇脫氫酶，大腸桿菌丙二醇氧化還原酶，和酵母乙醇脫氫酶ADHIV。所有這些基因都已被克隆并測定序列。運動發(fā)酵單胞菌另一種乙醇脫氫酶基因adhA是一種鋅乙醇脫氫酶，也已被克隆并測定序列。根據(jù)上與動物和植物的典型的乙醇脫氫酶基因及酵母中占優(yōu)勢的adh基因有相關。adhA基因和其它乙醇脫氫酶基因可代替于此說明的原先的adhB基因。
由于同樣的原因，為達到本發(fā)明的目的，編碼丙酮酸脫羧酶活性的基因來源也無關緊要，無論其來自運動發(fā)酵單胞菌，還是來自玉米，酵母或某些其他生物體。生命形式是從共同的祖先進化而來，這已廣為接受，并通過分子遺傳學方法詳盡地予以說明。不僅生物體可以根據(jù)其宏觀特征排列成系統(tǒng)進化樹，而且在進化過程中，進化產(chǎn)生的具特定功能的祖先基因保留有這些功能所需的保守特征。這種高度保守性使本領域行家能夠利用酶家族的一個或多個成員的原始信息，從其它生物體中分離出功能相同的、遺傳上相關的酶。糖酵解酶類就屬于這方面最好的例子，因為這些酶已被廣泛研究。
的確，就是利用這樣的方法，根據(jù)運動發(fā)酵單胞菌pdc和啤酒酵母pdc有關資料設計DNA探針，成功地從玉米中分離出丙酮酸脫羧酶基因。參見KellyPlantMolecularBiology13213-22。其它方法也可用整個基因作探針。由于具丙酮酸脫羧酶活性(丙酮酸轉(zhuǎn)化成乙醛及二氧化碳)的蛋白質(zhì)的合成可以直接從乙醛指示平板上觀察到，并不需要序列資料來找出其它基因，盡管利用了序列資料來分離玉米基因。許多具有同樣功能的丙酮酸脫羧酶基因可以從其它生物體中分離出來。這些基因可能適于代替運動發(fā)酵單胞菌的pdc基因，就正象有幾種乙醇脫氫酶基因已證明有此類似功能。至1991年3月，GenBank數(shù)據(jù)庫列舉了至少5種pdc基因。
作為進一步的改進，本發(fā)明中的一種重組宿主可用運動發(fā)酵單胞菌中編碼葡萄糖轉(zhuǎn)運的關鍵組分的基因，即編碼運動發(fā)酵單胞菌葡萄糖激酶(glk)和葡萄糖協(xié)助擴散蛋白(glf)的基因轉(zhuǎn)化。特別是，glk和glf可以組合到一個人工操作縱子中，如上述的產(chǎn)乙醇操縱子pet，并轉(zhuǎn)化到已帶有pet操縱子的重組體中。glk/glf操縱子的表達將導致過膜葡萄糖流量增加，由此導致乙醇產(chǎn)率增加。同樣，其它宿主中編碼寡糖轉(zhuǎn)運功能的關鍵組分的基因，或編碼糖酵解途徑的關鍵組分的基因，按照本發(fā)明，也可用來進一步轉(zhuǎn)化宿主?？梢灶A計，用編碼流通過程限速步驟的基因轉(zhuǎn)化宿主后，將增加乙醇產(chǎn)率，提高作為生物合成骨架來源的糖酵解中間物的水平。
(B)發(fā)酵參數(shù)按照本發(fā)明，異源的產(chǎn)乙醇基因的表達水平有利于重組宿主發(fā)酵產(chǎn)生乙醇。如上所述，將異源的產(chǎn)乙醇基因插入合適的不能產(chǎn)生乙醇的宿主后，轉(zhuǎn)化的宿主可以利用纖維二糖、纖維三糖、木二糖和木三糖等寡糖產(chǎn)生相當數(shù)量的乙醇。如下所述，本發(fā)明中的重組宿主所產(chǎn)生的乙醇濃度為1M，高的可達1.5M。
(C)外源基因整合進入染色體同質(zhì)粒攜帶相比較，外源基因整合在染色體上有幾方面的好處。質(zhì)粒構(gòu)建體在商業(yè)方面有許多限制。與染色體基因相比，質(zhì)粒構(gòu)建體本身較不穩(wěn)定，而且是一種環(huán)境公害，一種轉(zhuǎn)移異源性狀的庫源。質(zhì)粒構(gòu)建體的不穩(wěn)定性常由于多種質(zhì)粒的加入而加劇。盡管如此，由于能夠容易地轉(zhuǎn)化宿主細胞，質(zhì)粒構(gòu)建體在異源基因表達的初始實驗中非常有用，例如編碼纖維素酶的基因。但是為了方便所需蛋白質(zhì)(例如，一種纖維素酶)的篩選，常常需要用染色體整合的基因來替代質(zhì)粒攜帶的產(chǎn)乙醇基因，就象本發(fā)明中所示。產(chǎn)乙醇基因已經(jīng)被整合在大腸桿菌B株(E.coliB)的染色體上，見Ohta等(1991)Appl.Environ.Microbiol.57893-900?？偠灾?，先要純化一個DNA片段，它包括位于氯霉素基因上游的目的基因和來源于受體細胞的一段同源DNA片段。這個DNA片段連接形成沒有復制子的DNA環(huán)后用來轉(zhuǎn)化受體。這樣，在大腸桿菌(E.coli)中，pfl基因可作為受體基因，克氏桿菌(Klebsiella)中短的隨機的Sau3A酶切片段可在連接后用來促進同源重組。
用20毫克/升的氯霉素(Cm)平板讓單拷貝整合的重組子生長來初篩重組子。重組子獲得的頻率可能非常低。乙醇產(chǎn)生基因剛開始的表述可能非常低，不足以有效地發(fā)酵乙醇。高水平的表達可通過在600-1000毫克/升氯霉素的平板上一次性篩選而獲得。這樣獲得的菌株非常穩(wěn)定?？梢灶A見，這種方法在更合適的克氏桿菌(Kebsiella)和歐文氏菌(Erwinia)菌株中同樣能成功地使用。對一些野生型菌株的初步試驗表明，電穿孔法能增加質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化率但可能降低染色體整合的頻率。(見下述實施例16)。
(D)宿主選擇如上所述，適合于用來表達異源pdc和adh基因的生物包括真核細胞、非天然產(chǎn)乙醇的酵母和不能產(chǎn)生乙醇的細菌，真核細胞例如有動物細胞、昆蟲細胞和真菌細胞。例如，除了大腸桿菌(E.coli)以外，其它屬的腸道細菌，如歐文氏菌屬(Ewinia)的菊歐文氏菌(E.chrysathemi)和克氏桿菌屬(Klebsiella)的植生克氏桿菌(K.planticola)和催娩克氏桿菌(K.oxytoca)，都是特別有吸引力的宿主，因為它們能利用許多不同的糖類，包括戊糖。有優(yōu)勢的宿主還可以從更廣的范圍內(nèi)來選擇，革蘭氏陰性菌中例如黃桿菌屬(Xanthomonas)的菌種，革蘭氏陽性菌中例如芽孢桿菌屬(Bacillus)、梭狀芽孢桿菌屬(Clostridium)和纖維單胞菌屬(Lellulomonas)中的菌種。上述不同種類的宿主都可用適當?shù)霓D(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)化。按照本發(fā)明，前述微生物中的某些種類也具備了將寡糖發(fā)酵為乙醇的宿主的條件。更具體地說，如果(1)能產(chǎn)生將寡糖轉(zhuǎn)移進入細胞所必需的蛋白質(zhì)和(2)能代謝寡糖的位于細胞內(nèi)(細胞質(zhì))的酶，那么這種微生物可以被選作宿主。前述的符合這些條件的微生物包括腸道細菌中的菊歐文氏菌(E.chrysanthemi)和其它歐文氏菌、克氏桿菌屬(klebsiella)的催娩克氏桿菌(K.oxytoca)和植生克氏桿菌(K.planticola)。催娩克氏桿菌自身產(chǎn)生β-木糖苷酶。某些大腸桿菌(E.coli)也滿足這些標準，因為它們能運輸和代謝纖維二糖、麥芽糖和(或)麥芽三糖。例見Hall等(1987)J.Bacteriol.1692713-17。
按上述標準(1)和(2)，可以在較寬的范圍內(nèi)選擇宿主，例如革蘭氏陰性菌中黃桿菌屬(Xanthomonas)的菌株和革蘭氏陽性菌中的屬于芽孢桿菌屬(Bacillus)的短小芽孢桿菌(B.pumilus)、枯草芽孢桿菌(B.subtilis)和凝結(jié)芽孢桿菌(B.coagnlans)，屬于梭芽孢桿菌屬(Clostridium)的丙酮丁醇梭狀芽孢桿菌(Cl.acetobutyricum)、耐氣梭狀芽孢桿菌(Cl.aerotolerans)、熱纖梭狀芽孢桿菌(Cl.thermocellum)、熱氫硫化物梭狀芽胞桿菌(Cl.thermohydrosulfurium)和熱解糖梭狀芽孢桿菌(Cl.thermosaccharolytium)，屬于纖維單胞菌屬(Lellulomonas)的潮濕纖維單胞菌(C.uda)、丁酸弧形纖維單胞菌(C.butyrivibrio)和溶纖維纖維單胞菌(C.fibrisolvens)?？勺魉拗鞯慕湍钢杏须[球酵母屬(Cryptococcus)的白色隱球酵母(C.albidus)、屬于念珠菌屬(Monilia)的種，樹干畢赤氏酵母(Pichiastipitis)和出芽短梗孢糖芽霉菌(Pullulariapullulans)?？勺魉拗鞯钠渌艽x寡糖的細菌還包括但不限于產(chǎn)琥珀酸擬桿菌(Bacteroidessuccinogenes)、熱厭氧桿菌屬(Thermoanae-robacter)的乙醇熱厭氧桿菌(T.ethanolicus)、熱厭氧細菌屬(Thermoanaerobium)的熱厭氧細菌(T.brochii)、熱擬桿菌屬(Thermobacteroides)的丙酮乙烯熱擬桿菌(T.acetoethylicus)、瘤胃球菌屬(Ruminococcus)的生黃瘤胃球菌(R.flavefaciens)、高溫單孢菌屬(Thermonospora)的高溫單孢菌(T.fusca)和醋化弧菌屬(Acetivibrio)的溶纖維醋化弧菌(A.cellulolyticus)。所有這些不同的宿主均已有適當?shù)霓D(zhuǎn)化方法。
與符合宿主標準的微生物相關的文獻例見Biely(1985)TrendsinBiotech.3286-90、Robsen等(1989)EnzymeMicrob.Technol.11626-44和Beguin(1990)Ann.Rev.Microbiol.44219-48。這些文獻各自的內(nèi)容在此以參考文獻的形式整入本文。本領域行家將發(fā)現(xiàn)，許多其它宿主適用于本發(fā)明。因此，通過試驗微生物是否能轉(zhuǎn)運和代謝寡糖就能選擇出合適的宿主。這樣的篩選可用多種方法來實現(xiàn)。例如，通過試驗能否在合適的寡糖底物上生長，那些不僅僅是能將單糖轉(zhuǎn)動進入細胞的微生物可被篩選出來。例見上述Hall等(1987)。另外，可以通過測定細胞內(nèi)酶(如β-木糖苷酶)的活性來篩選宿主。
適用于本發(fā)明的一個篩選示例是用包含果膠的基本培養(yǎng)基從腐爛的植物材料中分離出致軟腐的歐文氏菌(Erwinia)菌株。見Star，“TheGenusErwinia”載于PROKARYOTES第二卷，1260-71頁(Springer-Verlag1981)。能在鈣穩(wěn)定的果膠中形成紋孔的分離菌株可進行進一步的鑒定。見《伯杰氏手冊》第一卷，469-76頁。
合適的克氏桿菌屬(Klebsiella)菌株例如可從佛羅里達州的Peny和Palatka等地加工植物的廢溪中獲得。克氏桿菌(Klebsiella)在廢紙漿中極為豐富(Huntley等(1976)J.WaterPollutionControlFederation481766-71;Knittel等(1977)Appl.Environ.Microbiol.34557-63)。在這些廢物中大量克氏桿菌(Klebsiella)的存在將促進篩選具有抗毒性化學品和能利用寡糖這些優(yōu)點的特別有用的菌株。這些菌株可通過在特異的篩狀培養(yǎng)基上的生長進行初篩，見Seidler“克氏桿菌屬(非醫(yī)學方面)”《原核生物》PROKARYOTES第二卷1166-72。進一步可通過吲哚產(chǎn)生、Voges-Proskauer反應和檸檬酸等來鑒定。見《伯杰氏手冊》第一卷，461-65頁。
分離的克氏桿菌(Klebsiella)和歐文氏菌(Erwinia)可在pH6.0(30℃)的平板上來比較它們降解模式底物的能力。模式底物包括羧甲基纖維素木聚糖蘭、甲基-傘形糖基-β-D-吡喃葡萄糖苷、甲基-傘形糖基纖維二糖、甲基-傘形糖基木糖苷和甲基-傘形糖基阿拉伯糖苷，降解所需的相應的酶是內(nèi)切葡聚糖酶、木聚糖酶、β-葡萄糖苷酶、纖維二糖水解酶、木糖苷酶和阿拉伯糖苷酶。菌株也可通過其代謝單糖(己糖和戊糖)和纖維二糖、纖維三糖、木二糖和木三糖的能力而被篩選?？捎帽訉游龅姆椒▉頊y定過夜試管培養(yǎng)物中二糖和三糖被利用的水平。用熱纖維梭狀芽孢桿菌(C.thermorellum)的木聚糖酶處理樺木的木聚糖(sigma公司)后，可產(chǎn)生木糖苷酶。
使用同篩選大腸桿菌B株(E.coliB)基本相似的方法，可進一步篩選出耐乙醇、耐鹵和耐溫的有前途的菌株。見Altenhum等(1989)Appl.Environ.Microbiol.551943-8;Beall等(1991)Biotechnol.&Bioeng.38296-303。雖然大多數(shù)分離菌株在液氮中冰凍保存，每一組中最有希望的三個菌株被選出來作進一步操作。保存的菌株可作為新的多糖酶基因的來源，在以后的研究中非常有用。
最佳的菌株應該保留有效利用所有木質(zhì)纖維素組分(二糖、三糖和單糖)的能力，能在大于440克/升的乙醇濃度中生長，能耐受0.3M的鹽水平，能耐受0.2M的乙酸，能耐受40℃高溫以及能產(chǎn)生高水平的分解纖維素、半纖維素和果膠的酶并具最少的蛋白酶活性。某些菌也可能包含有內(nèi)源的木聚糖酶和纖維素酶。外源的產(chǎn)乙醇基因整入后，最適的構(gòu)建體應該可以利用所有試驗過的糖產(chǎn)生乙醇，達到理論得率的90%以上，并且保持上述有用的性狀。
進一步的研究可估算分泌的纖維素酶的最適pH值和溫度并測定熱穩(wěn)定性。這些資料將有助于設計將水解和發(fā)酵過程合為一體的最適條件。
(E)異源多糖酶的表達如上所述，本發(fā)明的一項優(yōu)先措施，是考慮產(chǎn)生能表達異源多糖酶的重組子，以便降低寡糖發(fā)酵物中商業(yè)酶的需要量。多糖酶例如包括纖維素裂解酶、半纖維素裂解酶、木聚糖裂解酶和淀粉降解酶。
其中一項有利措施是，多糖酶是熱穩(wěn)定的。從這點上考慮，熱纖維梭狀芽孢桿菌(Clostridiumthermorellum)中的嗜熱蛋白基因(celA、B、C和D)可分別在細胞質(zhì)中高水平表達。發(fā)酵結(jié)束后收集細胞，將這些細胞加熱到它們幾乎具有最大活力和良好穩(wěn)定性的溫度(如60℃)以便將熱穩(wěn)定的酶從細胞中釋放出來，這樣就可以收集到重組產(chǎn)生的酶。然后，這些酶可用來在預定的時間內(nèi)(如12小時)對復合多糖底物起作用。去掉目的基因的信號肽部分，大大增加它們在大腸桿菌(E.coli)中的表達活力，并且可能在克氏桿菌(Klebsiella)和歐文氏菌(Erwinia)有相似的效果。
本發(fā)明特地使用celD基因。本發(fā)明中用celD轉(zhuǎn)化得到的重組子可以用來發(fā)酵SOLKA-FLOC，一種將純化的木漿機械粉碎后得到的粉狀纖維素產(chǎn)品。如下實施例18和圖14所示，同沒有celD基因的重組子相比較，預先用celD編碼的酶水解底物可將商業(yè)纖維素酶用量減少約五分之一。按照本發(fā)明，用在細胞內(nèi)累積的異源表達的酶，快速起動復合底物糖化過程，這種方去可用于任何用多糖酶基因轉(zhuǎn)化的產(chǎn)乙醇重組子，其回收的表達產(chǎn)物可用來裂解復合寡糖(纖維素、半纖維素、淀粉、糖原、果膠、菊粉等)。見下實施例17-19。
這樣，前一步發(fā)酵的細胞可用來作為后一步發(fā)酵過程所需的酶的來源。另外，也不需要酶向外分泌，而利用酶在細胞內(nèi)的累積來回收。剛開始就會出現(xiàn)高水平表達的酶，而不是在生長和發(fā)酵過程中緩慢累積。而且微生物污染的危險很小，因為能利用寡糖的微生物很少，所以很少有污染的微生物群落來競爭這些糖。
另一項有利措施是，如上所述的產(chǎn)乙醇重組子表達的多糖酶至少能部分分泌到細胞外催化細胞外復合寡糖的水解。這樣的基因的產(chǎn)物，例如cenA基因的產(chǎn)物內(nèi)切葡聚糖酶和cex基因的產(chǎn)物外切葡聚糖酶，可以增加在糖化和乙醇生成過程中常規(guī)添加的一種或多種酶的活力。適用于這種用途的編碼多糖酶的基因是糞肥纖維單胞菌(lellulomonasfimi)中的纖維素酶基因，當轉(zhuǎn)化進入克氏桿菌(Klebslella)和歐文氏菌(Erwinia)中時，能向細胞外部分分泌(約50%到60%)。在一個用cex基因轉(zhuǎn)化的歐文氏菌(Erwinia)實驗室菌株中，超過50%的異源表達產(chǎn)物分泌到了培養(yǎng)基中。
分泌的效率可通過分別同克氏桿菌(Klebsiella)中的支鏈淀粉酶和歐文氏菌中的果膠酸裂解酶的信號順序相融而提高。見Murooka(1990)Ferment.Technol.Ind.Appl.40-50、Pugsley等(1990)Ann.Rev.Genetics2467-90、He等(1991)Proc.Nat′lAcad.Sci.USA881079-83和Saarilahti等(1990)Gene909-14。
本發(fā)明中特別令人注意的是既能表達熱穩(wěn)定的基因產(chǎn)物又能表達可分泌的基因產(chǎn)物的產(chǎn)乙醇轉(zhuǎn)化子。這種轉(zhuǎn)化子既有裂解，酶的活力，在預處理時能將纖維素或其它復合底物裂解成為寡糖和單糖，又有分泌酶的活力，在發(fā)酵過程中不斷使底物解聚。
在特殊情形下，具有異源基因和能引起自身性狀過量表達的突變或遺傳修飾的宿主是非常有用的。例如，可在歐文氏菌中通過突變而篩選能提高內(nèi)源內(nèi)切葡聚糖酶表達水平的菌株。某些情況中，內(nèi)切葡聚糖酶被高濃度的葡萄糖所抑制。在葡萄糖-羧甲基纖維素平板上可篩選到去抑制的突變體，這些突變體已不受葡萄糖濃度所控制，其中有些菌株還可能過量表達內(nèi)切葡聚糖酶。
本領域行家知道，根據(jù)本發(fā)明這一方面，可以利用許多不同的多糖。同樣，根據(jù)本發(fā)明這一方面，許多轉(zhuǎn)化載體均可使用。進行必要的常規(guī)實驗可選出最佳配合的宿主和載體。例如，可構(gòu)建質(zhì)粒RSF1010衍生的載體，見Conway等(1987C)Appl.Environ.Microbiol.53235-41，其宿主范圍廣的性質(zhì)可允許將異源基因引入許多革蘭氏陰性菌中，包括所有的歐文氏菌和克氏桿菌，其選擇標記是四環(huán)素抗性。與此相反，puc衍生的質(zhì)粒在某些歐文氏菌中不穩(wěn)定，因此，puc衍生的質(zhì)粒比RSF1010衍生的質(zhì)粒使用得少。
其它適用于本發(fā)明的多糖酶基因包括編碼下例任何一種具有纖維素裂解活性的酶的基因
內(nèi)切葡聚糖酶隨機水解β-1，4，糖苷鍵。它不能作用于纖維二糖，但是可以水解纖維糊精、磷酸發(fā)脹的纖維素和纖維素替代品如羧甲基纖維素和羥乙基纖維素。某些內(nèi)切葡聚糖酶也能作用于晶狀纖維素。
相反，纖維二糖水解酶作用于纖維素，具體是從鏈的非還原端切下纖維二糖單位。纖維二糖水解酶水解纖維糊精，但不水解纖維二糖。β-葡萄糖苷酶水解纖維二糖和纖維寡糖生成葡萄糖，但不能作用于纖維素和高聚的纖維糊精。
除了上述的熱纖維梭狀芽孢桿菌(C.thermocellum)中編碼纖維素酶的基因外，其它編碼纖維素裂解活性的基因也有描述。例見Beguin(1990)Ann.Rev.Microbiol.44219-48，其內(nèi)容特以參考文獻的方式列入本文。這些基因甚至可以通過GenBanK的數(shù)據(jù)庫更容易地得到。到1991年3月為止，GenBank的數(shù)據(jù)庫中包括13個內(nèi)切葡聚糖酶基因、3個纖維二糖水解酶基因和3個β-葡萄糖苷酶基因。
同樣，按照本發(fā)明，編碼木聚糖裂解酶的基因可如上所述地被使用。特別是編碼內(nèi)切-1，4-β-木聚糖酶、β-木糖苷酶、α-葡糖苷酸酶、α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶、乙酰酯酶和乙酰木聚糖酯酶等木聚糖水解酶類的基因。示例如熱纖維梭狀芽孢桿菌(C.thermocellum)的xynZ基因和溶纖維丁酸弧菌(Butyvivibriofibrisolvens)的xylB基因的各自的編碼產(chǎn)物，這兩個基因都在產(chǎn)乙醇的轉(zhuǎn)化子中表達，如下所述(見實施例17)。同樣，編碼木聚糖酶的基因很容易在GenBank條目中得到，至1991年3月，有7個內(nèi)切-1，4-β木聚糖酶基因，5個β-木糖苷酶基因和1個d-L-阿拉伯呋喃糖苷酶基因。
類似地，本發(fā)明同樣適用于使用那些編碼淀粉分解酶類的基因。這類酶及其生物來源和其它性質(zhì)見表。
a內(nèi)切淀粉酶b外切淀粉酶降解淀粉的酶的示例如下述的嗜熱脂肪芽孢桿菌的α-淀粉酶和熱厭氧細菌的支鏈淀粉酶。這些酶的基因在GenBank中很容易得到，至1991年3月，GenBank中有190個α淀粉酶基因、3個β-淀粉酶基因，8個葡糖淀粉酶基因和3個支鏈淀粉酶基因。其它的多糖酶如β-葡聚糖酶、阿拉伯糖苷酶、甘露聚糖酶、果膠水解酶和果膠酸裂解酶的基因在GenBank和克隆這些基因的文獻中很容易得到。
按照本發(fā)明，芽孢桿菌(Bacillus)的多糖酶基因常在大腸桿菌中表達很好，因此它也應該適合于在一般的腸道細菌中表達。事實上，芽孢桿菌科的許多菌株分泌許多種類的多糖酶，包括淀粉酶、β-葡聚糖酶和半纖維素酶。許多菌株分泌纖維素酶，這些菌株包括枯草芽孢桿菌(B.subtilis)，多粘芽孢桿菌(B.polymyxa)、地衣芽孢桿菌(B.licheniformis)和蠟狀芽孢桿菌(B.cereus)。見Beguin(1990)(見上)、Robson等(1989)EnzymeMicrob、Technol.11626-44，這些內(nèi)容以參考文獻的形式整入本文。如果信號肽序列與異源基因的融合體在所選宿主如克氏桿菌和歐文氏菌中沒有功能，那么常常用來自宿主的信號肽序列與外源基因融合而使異源的酶得以分泌。
嗜熱脂肪芽孢桿菌中編碼熱穩(wěn)定的水解酶和其它活性，如內(nèi)切葡聚糖酶(羧甲基纖維素酶和硝基苯基纖維二糖苷酶)的基因，可在本發(fā)明中使用并具有好處。這類基因已被鑒定并在GenBank和相關的文獻中可以得到。見Beguin(1990)(見上)。
(F)宿主篩選和轉(zhuǎn)化為了選擇能表達異源多糖酶基因的宿主，可以測試本發(fā)明中整合有產(chǎn)乙醇基因的重組菌株發(fā)酵纖維素底物SOLKA-FLOC的能力，同時用商業(yè)纖維素酶水解纖維素。作出乙醇產(chǎn)量和纖維素轉(zhuǎn)換率(商業(yè)用酶制劑的作用所致)相應的劑量曲線。工業(yè)纖維素酶制劑(如SPEZYME、MULTIFECT和CYTOLASE[Genencor產(chǎn)品])可用于這些pH受控制的發(fā)酵實驗(35℃，pH6.0)。
異源多糖酶的添加可通過實施例17-19所述的方式而完成。例如，利用同源重組將具有特殊優(yōu)點的多糖酶基因整合后，初始的重組子用5毫克/升的四環(huán)素篩選，較高濃度的四環(huán)素用于篩選高水平表達目的基因的突變體。5-丁基-吡啶-2-甲酸可用來失活四環(huán)素抗生基因，所以多種酶的基因可用相同的方法依次加入宿主。然后可以估算這些構(gòu)建體在一步和多步纖維素發(fā)酵過程中的作用。
構(gòu)建產(chǎn)乙醇的革蘭氏陽性菌，如枯草芽孢桿菌屬或纖維單胞菌屬菌株，常采用的路線是化學誘變后用運動發(fā)酵單胞菌(Z.mobilis)的丙酮酸脫羧酶的抗體篩選，來檢測表達水平提高了的克隆。有高水平表達的克隆進一步研究其形成該表型的機利。這些突變體可能有用并應適合于作為其它異源蛋白表達的宿主，一般認為這些宿主是安全的(GRAS)。
在用異源纖維素酶基因轉(zhuǎn)化產(chǎn)乙醇宿主以獲得高濃度的細胞內(nèi)活性酶時，可能需要使用其它常規(guī)的遺傳操作和篩選手段，這些手段視不同的宿主和所選擇的纖維素酶而不同。例如，宿主分泌的蛋白酶可能成為本發(fā)明中異源表達的一個障礙。可用幾個方法來獲得基本克服這個問題的突變體，例如使用蛋白酶活性的指示平板和選擇高水平表達異源酶的宿主。
但是，任何異源蛋白質(zhì)(包括多糖酶)的產(chǎn)生，常常要影響宿主的生長速率和效率。這種“基因負擔”可以通過測試特別有用的基因的多種構(gòu)建體來減小。整合的位點也可能影響到“基因負擔”，因此，按照本發(fā)明，應該測試不同整合位點的構(gòu)建體。
如此得到的構(gòu)建體然后可用于纖維素發(fā)酵試驗，如實施例18所示，來評估分泌酶的作用效率(同商品酶一起)和發(fā)酵的效率。在一步發(fā)酵過程中，商品用酶在用產(chǎn)乙醇能分泌纖維素酶的轉(zhuǎn)化宿主接種時就一起加入，因此，可以測試轉(zhuǎn)化宿主分泌的纖維素酶替代商品纖維素酶的能力。將預發(fā)酵中含有嗜熱纖維素酶的產(chǎn)乙醇細胞加入60℃的纖維素懸液中可以測試嗜熱纖維素酶的作用。在這種特殊酶的最適條件下保溫可持續(xù)一段時間，如12小時。在大多數(shù)情況下，可降低溫度和pH值以給商品酶提供最適條件。例如SPEZYME、MULTIFECT和CYTOLASE，并持續(xù)保溫12小時。把溫度降到35℃，pH值升至6.0后，將重組的產(chǎn)乙醇菌接種到培養(yǎng)基中。然后可測定乙醇的得率。這個方法可加以改變，以適應各個酶達到最大活性的特殊需要。
所需用的分子遺傳方法已很成熟。例見Maniatis等《分子克降實驗手冊》(冷泉港實驗室，1989)、Ausubel等《分子遺傳學實驗手冊》(1987)。發(fā)酵可在上述和實施例中所示的pH水平上進行。乙醇可用氣-液層析測定，見Goel等(1984)Biotechnol.Lett.3177-82和Dombek等(1985)Appl.Environ.Microbiol.5197-200。單體糖可用比色法或高壓液相層析測定，見Ashwell(1966)MethodsEnzymol.893-95、Wood等(1988)MethodsEnzymol，160。寡糖可用高壓液相層析和薄層層析分析。液體培養(yǎng)可在復合培養(yǎng)基(如Luria培養(yǎng)基)或基本培養(yǎng)基中進行。見Starr等《原核生物》第二卷1166-72，1260-71(Springer-Verlag1981)、Mizutani等(1986)BiotechnolBioeng.28204-9。微生物可長在含1.5%瓊脂的因體培養(yǎng)基上，保存在-70℃的甘油中。
纖維素酶的測定基本按照Curry等(1988)Appl.Environ.Microbiol.54476-84和Gripenet等(1988)J.Bacteriol.1704576-81。外切葡聚糖酶活性可用對硝基苯基纖維二糖作模式底物來測定。羧甲基纖維素酶(內(nèi)切葡聚糖酶)可通過還原糖釋放來測定。纖維素酶的活性也可用傳統(tǒng)的方法即在濾紙上測定釋放出來的還原糖的量來測定。甲基-傘形糖衍生物、羧甲基纖維素和果膠酸均可用來作定性比較的指示平板，以鑒別出能產(chǎn)生高水平的水解這些底物的酶的菌株。
(G)提高轉(zhuǎn)化子的乙醇耐受性和乙醇產(chǎn)量本發(fā)明中產(chǎn)乙醇重組子產(chǎn)生的乙醇的最大濃度可超過1M。大腸桿菌KO11(E.coliKO11)轉(zhuǎn)化子發(fā)酵乳糖所產(chǎn)生的乙醇可超過1.5M，該菌株保藏號是ATCC55124。因此，增加本發(fā)明中產(chǎn)乙醇重組子的乙醇耐受性特別有用。對膜脂和(或)逆境蛋白質(zhì)的改變也許能達到這個目的。運動發(fā)酵單胞菌(Z.mobilis)的adhB基因是本發(fā)明中所用的產(chǎn)乙醇操縱子的一個組分，其編碼產(chǎn)物已經(jīng)被鑒定為明顯是運動發(fā)酵單胞菌中對溫度和乙醇起反應的逆境蛋白質(zhì)。見Haejung等(1991)J.Bacteriol.1735975-82。其它運動發(fā)酵單胞菌中的編碼逆境蛋白質(zhì)的基因同樣應該是有用的。最后，大腸桿菌中表達主要選擇蛋白的基因，見Johnson等(1989)J.Bacteriol.1711590-6、Ang等(1989)J.Bcteriol.1712748-55、Lipinska等(1988)NucleicAcidsRes.167545-61和Fayet等(1986)Mol.Gen.Genet.202435-45，可作為探針分離運動發(fā)酵單胞菌中相應的基因。
脂類合成基因也有可能也對乙醇耐受性有用。將基因文庫直接轉(zhuǎn)化產(chǎn)乙醇菌株，在含過量糖的發(fā)酵培養(yǎng)基中經(jīng)過一系列傳代富集，可以篩選得到對乙醇耐受性有用的基因，過量的糖是為了保證在乙醇濃度超過原始接種物的耐性范圍后，那些具有乙醇抗性的菌可以進一步生長。使用恒化器也可能對這些選擇特別有利。
高乙醇抗性的同型腐酒乳桿菌(Lactobacillushomohiochii)和異型腐酒乳桿菌(Lactobacillusheterohiochii)的基因文庫，見Ingram(1990)Critical.Rev.Biotechnol，9305-19，也可在富集過程中測試。因為這些微生物影響米酒酸敗，所以它們能耐受15%(V/V)乙醇(超過2.5M)。通過這種方法，能常規(guī)產(chǎn)生至少每升80克乙醇的重組菌株可以得到。
另外，運動發(fā)酵單胞菌的糖酵解酶類可用來改進本發(fā)明中的產(chǎn)乙醇重組子。也就是說，編碼糖酵解酶類的十三個基因中的一個或多個的表達應該增加糖酵解流量并由此增加乙醇的產(chǎn)量。
(H)發(fā)酵工序設計根據(jù)本文可設計許多發(fā)酵工序來實施本發(fā)明。一般地講，這種工序至少分兩個步驟“糖化”步驟，其中，生物量同多糖酶接觸后寡糖被裂解為較簡單的寡糖或(和)單糖，接下來是“發(fā)酵”步驟，其中，簡單的寡糖和/或單糖被發(fā)酵成為乙醇。最好這兩個步驟分別進行，因為每一步的最適條件大不相同。糖化的最適條件是溫度約50-60℃，pH值約4.5-5.5。發(fā)酵的最適條件是溫度約30-35℃，pH值約6.0。
為了提高整個工序的效率，可能需要從發(fā)酵階段到糖化階段進行原料的再循環(huán)。因為發(fā)酵的溫度是約30-35℃，所以糖化階段的高溫流體先要在熱交換器中由再循環(huán)原料冷卻后再進入發(fā)酵階段。示例過程如下所述并見圖19。
在圖19中，酶反應器10中加入多糖酶和預先處理過的生物量，在其中，生物量中的起始寡糖被裂解為簡單寡糖和單糖。酶反應器10溫度維持在約50-60℃，pH約4.5-5.0。固體和液體的混合物通過通道12從酶反應器10進入固/液分離器14，在14中固體和液體被分離(例如通過離心)。
分離出的固體通過通道16回到酶反應器10，分離器中的流體通過通道18進入熱交換器20，在20中流體冷卻至約30-35℃。流體然后經(jīng)通道22到膜分離器24分離出高分子量多糖，后者經(jīng)通道26回到酶反應器10。膜分離器例如可以是超濾膜，如杜邦公司(Du Pont
)制造的CARRE濾膜，其分離能力大約為10-3至10-4微米?；蛘?，可以去掉膜分離器24，流體直接進入發(fā)酵罐30。其余由寡糖和單糖組成的糖溶液，經(jīng)通道28轉(zhuǎn)到發(fā)酵罐30。但在進入發(fā)酵罐前，糖溶液的pH值要通過例如加堿來調(diào)高。
發(fā)酵罐中二氧化碳經(jīng)由通道32排除。流體通過線34進入蒸餾柱(未顯示)以便蒸餾出乙醇。發(fā)酵罐中的糊狀物經(jīng)線36進入固液分離器40(例如一臺離心機)。分離器40中分出來的微生物經(jīng)通道42回到發(fā)酵罐。分離器40中的流體進入熱交換器20以冷卻來自固液分離器14中的流體。離開熱交換器20后，流體的pH通過加酸調(diào)節(jié)低至pH值約4.5-5.0，然后流體進入酶反應器10。酶反應器10和發(fā)酵罐30可以帶有混合器48和50，這兩者可以是任何傳統(tǒng)的種類。
或者，在連續(xù)的基礎上，含乙醇約0.5-5%，常是1-2%的液體(啤酒)還可經(jīng)通道52從發(fā)酵罐30進入氣化器54，在54中乙醇和水被氣化并經(jīng)線56進入另一蒸餾階段(未顯示)。線56中的乙醇濃度可約從20%到25%。離開氣化器54而經(jīng)線58回到發(fā)酵罐30的啤酒乙醇濃度常少于0.5%，通常也就大約為0.3%。以這種方式，發(fā)酵罐中乙醇濃度維持在較低水平，而乙醇的產(chǎn)量卻維持在較高水平。
同樣，經(jīng)通道36、44和46回到反應器10的流體乙醇濃度較低因而對反應器中的反應較少抑制。這個連續(xù)過程通過不斷在反應器10中加入生物量而驅(qū)動。但是要定期去掉反應器10和發(fā)酵罐30中的內(nèi)容物以便去掉凝結(jié)的固體和降低污染的可能性。
這樣，上述的發(fā)酵工序可以提供一個將生物量發(fā)酵為乙醇的有效方法。本領域行家知道發(fā)酵工序中可以附加許多步驟和(或)階段。例如，可包括生物量預處理階段，將生物量磨碎，水解(用或不用蒸汽和/或酸)和用多糖酶和/或其它酶處理等。另外，可以有一個起始步驟，將能在細胞內(nèi)表達和積累多糖酶的重組宿主細胞加熱到裂解以釋放出多糖酶。還有，可以采用多步發(fā)酵的方法，并附加有固體和流體的分離和再循環(huán)裝置。
Ⅲ.實施例本發(fā)明通過下列參考實例得到進一步描述，但不能作為限制。所有百分數(shù)均為重量比，所有溶液比例除特別指出外均為體積比。實施例中涉及的其他方法如下所述微生物及生長條件本文使用大腸桿菌(Escherichia coli)TC4(見Conway et al，[1987a])及其含質(zhì)粒的衍生菌。載有運動發(fā)酵單胞菌丙酮酸脫羧酶基因的質(zhì)粒(pLOI276)以及載有該菌乙醇脫氫酶Ⅱ基因的質(zhì)粒(PLOI284)見Conway et al.[1987b]所述。
菌株及生長條件質(zhì)粒pUC18和pUC19見Yanisch-Perronetal，(Gene33103-19)所述，質(zhì)粒pLOI204和pLOI295見Conwayetal.[1987b]及Ingrametal.。質(zhì)粒pLOI292，pLOI291，pLOI297，pLOI308，pLOI308-2，pLOI308-5和pLOI308-10的構(gòu)建及特性見后。
培養(yǎng)物在37℃下在每升含50克葡萄糖的Luria培養(yǎng)基(見Luria&M.DelbruckGenetics28491-511)中進行培養(yǎng)。用于酶分析和發(fā)酵種子的細胞在37℃下在裝3毫升LB的試管(13×100毫米)中進行培養(yǎng)，試管置于試管旋轉(zhuǎn)器上。培養(yǎng)過夜的培養(yǎng)物以一百倍稀釋接入新鮮培養(yǎng)基。好氧培養(yǎng)物(250毫升燒瓶中裝50毫升Luria培養(yǎng)液)在往復式水浴中振蕩(每分鐘120轉(zhuǎn))培養(yǎng)。厭氧培養(yǎng)物培養(yǎng)在封口血清瓶(130毫升瓶子中裝100毫升Luria培養(yǎng)液)中，用回旋式振蕩器(每分鐘150轉(zhuǎn))37℃培養(yǎng)。厭氧培養(yǎng)時，瓶塞上插一只25號針頭導出發(fā)酵的氣體產(chǎn)物。
菌體生長情況用Spectronic70分光光度計(Bausch&Lomb，Inc.Rochester，NY)在550nm處進行檢測，比色杯為一次性培養(yǎng)試管(10×75毫米)。在此處的實驗條件下，一個吸收單位大約相當于每毫升含0.25毫克細胞蛋白。
帶有本發(fā)明各重組質(zhì)粒的大腸桿菌宿主保存在AmericanTypeCultureCollection(ATCC)，12301ParklawnDrive，Rochville，Maryland20852USA。其注冊號如下培養(yǎng)物注冊號收藏日期E.coli pLOI308-10ATCC 679831989年5月15日TC4(pLOI292)ATCC 682371990年2月23日TC4(pLOI308-11)ATCC 682381990年2月23日TC4(pLOI297)ATCC 682391990年2月23日TC4(pLOI295)ATCC 682401990年2月23日E.coli pLOI1510ATCC 68484
K.oxytoca M5A1ATCC 685641991年3月14日(pLOI555)收藏本培養(yǎng)物須確保在本專利申請期間只有經(jīng)美國專利和商標管理官員據(jù)37CFR1.14和35USC122授權的人員才可得到該培養(yǎng)物。在本發(fā)明申請或其成果副本已注冊的國家，可按該國專利法要求索取該保存培養(yǎng)物。但必須清楚的是獲得本培養(yǎng)物并不意味著可以侵犯政府授予的專利權而應用本發(fā)明。
另外，本發(fā)明培養(yǎng)物將按布達佩斯微生物保存公約的條款保存和公開。即培養(yǎng)物必須十分小心地保存使之在每次提供被索取樣品后至少五年內(nèi)保持存活并不受污染，并且自保存之日起至少三十年時間里或在規(guī)定的培養(yǎng)物
公開日期前的專利有效期內(nèi)保持戚并不受污染。如果由于保存條件的問題而導致不能提供被索取樣品時，保存單位有義務更新該保存物。自專利公開之日起，所有有關該培養(yǎng)物公開的限制自動失效。
遺傳方法轉(zhuǎn)化、質(zhì)粒構(gòu)建、DNA酶切和分析均按前述方法進行。重組子在含葡萄糖(每升培養(yǎng)基2克)及適當抗菌素的固體平板(1.5%瓊脂)上進行選擇。其中形態(tài)特大的菌落即被認為是帶運動發(fā)酵單胞菌產(chǎn)乙醇基因的重組子。若觀察到該重組子在不含葡萄糖的Luria瓊脂平板上生長不良以及在乙醛指示培養(yǎng)基上有乙醇脫氫酶基因的表達，便可確證其重組性狀。
酶分析細胞的破碎、熱失活及丙酮酸脫羧酶活性(對熱穩(wěn)定)的測定見Conwayetal.[1987b]。細胞的制備及催化乙醇氧化反應的乙醇脫氫酶Ⅱ的活性的測定按前述方法，但細胞在現(xiàn)加固體硫酸亞鐵銨固體(終濃度0.5mM)和維生素C鈉鹽(終濃度1mM)的磷酸鉀鹽緩沖液中洗滌和破碎，見Nealeetal.Eur.J.Biochem.154119-24。經(jīng)修改的方法得到的制備物不經(jīng)存放立即測定乙醇脫氫酶潔性，其比活比報道的高得多。為計算乙醇產(chǎn)率，細胞量用福啉酚法測定(Lowryetal.，J.Biol.Chem.193265-75)，結(jié)果以培養(yǎng)物中蛋白含量表示。
發(fā)酵產(chǎn)物分析用澄清培養(yǎng)液，在附有折射率檢測儀和電子和積分析的Millpore/Waters高效液相層析儀(MilliporeCorporationBedford，MA)上測定發(fā)酵產(chǎn)物，產(chǎn)量分離在AminexHPX-87H柱(長300毫米，直徑7.8毫米)(購于Bio.RadLaboratories，RichmondCA)上進行。洗脫速度0.25毫升/分鐘(進樣量100微升)，溫度65℃，以可靠標準確定峰。先于葡萄糖出現(xiàn)的兩個峰及在45.4至45.8分鐘之間出現(xiàn)的另一稍遲的未知峰即為非接種培養(yǎng)基的組分。
實施例1.菌株的構(gòu)建編碼丙酮酸脫羧酶和乙醇脫氫酶Ⅱ的結(jié)構(gòu)基因大小分別為1.7Kb和1.1Kb。編碼的蛋白質(zhì)分子量分別為60KD和40.1KD。這兩個基因位于pUC18衍生質(zhì)粒上，受Lac啟動子的調(diào)控(圖1)。將pLOI284(載有乙醇脫氫酶基因)上EcoRI和SalI雙酶切的1.4Kb無啟動子片段插入pLOI276上丙酮酸脫羧酶基因下游的BamH1位點，形成二個基因的重組體。選擇對氨芐青霉素有抗性的菌落，同時在新發(fā)明的檢測乙醛生成的副品紅-乙醇指示培養(yǎng)基上檢查乙醇脫氫酶的表達。帶有pLOI295構(gòu)建質(zhì)粒的菌株，在不含葡萄糖的Luria瓊脂平板上生長不良(好氧條件下)，但不含2%葡萄糖的平板上其生長密度比不帶質(zhì)粒的菌和帶pLOI276或pLOI284質(zhì)粒的菌株都要高得多。
帶pet操縱子的重組子因其在含葡萄糖的Luria瓊脂平板(好氧條件下)上長成較大、較不透明的菌落而易于檢出。這種菌落大小和透明度方面的差異是鑒定帶有同時表達乙醇脫氫酶和丙酮酸脫羧酶質(zhì)粒重組子的有效標記。
已知pLOI295的全部堿基順序。編碼丙酮酸脫羧酶基因的開放閱讀框架始于Lac啟動子下游第163個堿基，并在編碼乙醇脫氫酶Ⅱ基因的開放閱讀框架上游的第85個堿基處以兩個終止密碼子結(jié)束。這兩個基因在緊鄰各自開放閱讀框架的上游區(qū)均有類似于核糖體結(jié)合位點的序列。編碼乙醇脫氫酶Ⅱ的基因有一個終止密碼子，其后還有一個13個堿基對的回文序列結(jié)構(gòu)作為轉(zhuǎn)錄終止子。
實施例2.運動發(fā)酵單胞菌基因在大腸桿菌中的表達丙酮酸脫羧酶基因和乙醇脫氫酶基因無論是單獨地(分別在pLOI276和pLOI284上)還是聯(lián)合地在Lac啟動子調(diào)控的大腸桿菌中，均高表達。野生型大腸桿菌沒有丙酮酸脫羧酶，僅有低濃度的誘導型的乙醇脫氫酶。重組大腸桿菌在有葡萄糖條件下生長時，其表達的運動發(fā)酵單胞菌酶的比活下降約50%，這與葡萄糖對Lac啟動子的阻遏相一致。pet操縱子近端基因編碼的丙酮酸脫羧酶在pLOI295中表達的比活比在pLOI276中的高三倍。pet操縱子遠端基因，即乙醇脫氫酶基因，編碼的酶在pLOI295中表達的比活是在pLOI284中的兩倍。
實施例3.重組菌株的葡萄糖發(fā)酵pet操縱子的表達使重組大腸桿菌相在厭氧生長時主要發(fā)酵產(chǎn)物為乙醇。親本株主要發(fā)酵產(chǎn)物則是琥珀酸(1.5mM)、乳酸(18mM)和乙酸(7mM)(圖3A)。在帶pLOI234(載有乙醇脫氫酶Ⅱ基因)的細胞中觀察到同樣的發(fā)酵曲線(圖3c)。在載有編碼丙酮酸脫羧酶基因的pLOI276宿主菌株中，乙醇峰很明顯(18mM)，占發(fā)酵積累產(chǎn)物的1/3。這種乙醇高水平的產(chǎn)生是大腸桿菌中外源運動發(fā)酵單胞菌丙酮酸脫羧酶和內(nèi)源乙醇脫氫酶共同作用所致。帶pet操縱子(含運動發(fā)酵單胞菌丙酮酸脫羧酶和乙醇脫氫酶基因)的pLOI295宿主大腸桿菌產(chǎn)生大量乙醇(750mM;4.3%體積比)，占發(fā)酵產(chǎn)物95%以上。
帶pet操縱子的大腸桿菌高水平表達乙醇脫氫酶和丙酮酸脫羧酶，控制著NADH的氧化。因而此細菌的發(fā)酵過程可轉(zhuǎn)變成同啤酒酵母和運動發(fā)酵單胞菌相同的發(fā)酵作用。在正常發(fā)酵生長時，丙酮酸由丙酮酸脫氫酶復合物作用轉(zhuǎn)變成乙酰輔酶A，或由磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶作用轉(zhuǎn)變成草酰乙酸(繼而變成琥珀酸)，或由丙酮酸甲酸裂解酶作用轉(zhuǎn)變?yōu)榧姿岷鸵阴］o酶，或由乳酸脫氫酶作用轉(zhuǎn)變?yōu)槿樗?。最后一種轉(zhuǎn)變途徑是野生型大腸桿菌再生NAD+的主要方式，但細菌乳酸脫氫酶KmS值相當高，約為10mM至1，000mM(Garvie，E.I.“Bacterial Lactate dehydrogenases，”Microbiol.Rev.44106-139;Tarmy，E.M.，and N.O. Kaplan“Kinetics of E·coli BD-lactate dehydrogenase and evidence for pyruvate controlled change in conformation，”J.Biol.Chem.2432587-2596)。運動發(fā)酵單胞菌丙酮酸脫羧酶的Km值為0.4mM(Bringer-Meyer，S.，K.-L.Schimz，and H.Sahm“Pyruvate decarboxylase from Zymononas mobilisIsolation and partial characterization”Arch.Microbiol.146105-110)，大量的該酶，加上較低的Km值可有效地將糖酵解不斷產(chǎn)生的丙酮酸轉(zhuǎn)變?yōu)橐掖肌?br> 在適度振搖或抖動培養(yǎng)容器以促進氣體交換的培養(yǎng)條件下，可以獲得高細胞密度的培養(yǎng)物。在這種條件下，培養(yǎng)液最終pH為6.3或更高，取決于氣體交換的程度。
實施例4.質(zhì)粒構(gòu)建及運動發(fā)酵單胞菌產(chǎn)乙醇酶在大腸桿菌中的表達質(zhì)粒pLOI295帶有l(wèi)ac啟動子調(diào)控的運動發(fā)酵單胞菌丙酮酸脫羧酶基因和乙醇脫氫酶Ⅱ基因。該構(gòu)建體稱作pet操縱子，在構(gòu)建其他帶不同啟動子的質(zhì)粒中作為產(chǎn)乙醇基因的來源。來自pLOI295帶產(chǎn)乙醇基因的EcoRI-SalI片段，用DNA聚合酶的Klenow片段填平末端后，插入pUC19(其lac啟動子下游緊接pdc基團)的SmaI位點，得到編號為pLOI293的質(zhì)粒，該質(zhì)粒帶有一側(cè)是BamHI位點的pet基因。將帶編碼產(chǎn)乙醇酶基因的BamHI片段插入表達載體pLOI204，構(gòu)成質(zhì)體pLOI291和pLOI292(插入方向相反)。該BamHI片段上有核糖體結(jié)合位點、兩個目的基因的完整序列和一個adhB遠端的轉(zhuǎn)錄終止子。在pLOI292中，這兩個基因的表達受原表達載體上運動發(fā)酵單胞菌啟動子的調(diào)控。
構(gòu)建質(zhì)粒pLOI308，去除控制pet基因的lac啟動子，但保留上游BamHI位點，以備插入其他啟動子。用BamH1部分酶解pLOI293，經(jīng)Klenow處理，去掉adhB基因遠端的BamHI位點。從該質(zhì)粒中切下帶產(chǎn)乙醇基因的無啟動子BamHI(緊鄰pdc)-EcoRI(遠離adhB)片段，定向插入pUC18BamHI-EcoRI位點，產(chǎn)生pLOI308。該質(zhì)粒在乙醛指示平板上低水平表達adhB，但并不表現(xiàn)出大菌落表型，該表型與其它pet功能質(zhì)粒pLOI295，pLOI291和pLOI292有關。
運動發(fā)酵單胞菌染色體DNA用SauBA部分酶解，使得大多數(shù)DNA片段小于4Kb。以此未經(jīng)分級分離的DNA作為啟動子片段來源，連接到pLOI308去磷酸化BamHI位點。在含葡萄糖的Luria培養(yǎng)基平板上，帶有表達良好的pet操縱子的氨芐青霉素抗性重組子以大菌落形式出現(xiàn)。選取其中三個重組子質(zhì)粒pLOI308-2，pLOI308-5和pLOI308-10進行研究。這些質(zhì)粒中具啟動子活性的運動發(fā)酵單胞菌DNA片段分別長6、2、和2Kb。
表1總結(jié)重組體大腸桿菌(E.coli)過夜培養(yǎng)物中丙酮酸脫羧酶和乙醇脫氫酶的活性。丙酮酸脫羧酶活力可從TC4(pLOI292)的0.37U/毫克細胞蛋白到TC4(pLOI295)的8.23U。按照丙酮酸脫羧酶活力從大到小，TC4重組體依次排列如下pLOI295＞pLOI308＞pLOI308-10＞pLOI308-2＞pLOI308-5＞pLOI292＞pLOI291。
表1
運動發(fā)酵單胞菌的產(chǎn)乙醇酶在大腸桿菌中的表達質(zhì)粒丙酮酸脫羧酶乙醇脫氫酶比活a%細胞蛋白b比活a%細胞蛋白cpLOI2910.370.40.210.02pLOI2920.480.50.300.03pLOI308-22.262.31.540.21pLOI308-51.111.10.760.10pLOI308-106.56.52.510.34pLOI2958.28.29.651.4無000.08a.以每毫克總細胞蛋白每分鐘轉(zhuǎn)化底物的毫摩爾數(shù)表示b.計算時假定純酶比活為100c.計算時假定扣除內(nèi)源乙醇脫氫酶活性后的純酶比活為710在各個帶不同質(zhì)粒的重組菌株中，乙醇脫氫酶活性變化趨勢與丙酮酸脫羧酶的相同。測得的乙醇脫氫酶活性是大腸桿菌內(nèi)源酶和運動發(fā)酵單胞菌酶共同作用的活力。與帶有運動發(fā)酵單胞菌基因質(zhì)粒的菌株相比，不帶質(zhì)粒的TCA菌株中觀察到的酶活性水平較低。運動發(fā)酵單胞菌酶活性(扣除大腸桿菌內(nèi)源乙醇脫氫酶活性)范圍為0.13IU/毫克細胞蛋白(帶pLOI291的TC4菌株)到9.6IU/毫克細胞蛋白(帶pLOI295的TC4菌株)。
實施例5.含運動發(fā)酵單胞菌產(chǎn)乙醇基因的重組菌株的生長由葡萄糖的分解代謝轉(zhuǎn)變?yōu)橐掖嫉暮铣纱x也會影響菌體的生長量和培養(yǎng)基的酸度變化。雖然發(fā)酵產(chǎn)物相對無毒，但有可能在發(fā)酵過程中累積至一定水平產(chǎn)生毒害效應。細菌在含10%葡萄糖的LB培養(yǎng)液中厭氧生長，不含質(zhì)粒的菌株和攜帶質(zhì)粒pLOI284(帶有編碼乙醇脫氫酶Ⅱ的基因)的菌株在培養(yǎng)48小時后都能達到每毫升培養(yǎng)液含0.25毫升菌細胞蛋白的終濃度，同時液體的pH值降到4.4。對于攜帶質(zhì)粒pLOI276(帶有編碼丙酮酸脫羧酶的基因)的菌株，細胞濃度可增加兩倍，pH值則降為4.5。攜帶質(zhì)粒pLOI295(即帶pet操縱子)菌株的最終細胞濃度為2.5毫克/毫升，比對照菌要高出10倍，最終pH則降到4.7。當細菌濃度達到每毫升有2.5毫克細胞蛋白時，鎂離子似乎成為限制因子;若此時加入0.5mM的MgSO4溶液，則細胞濃度還可提高1.5倍。
對重組菌株在好氧和厭氧兩種條件下的生長情況都作了觀察(見圖3)。在好氧培養(yǎng)條件下(見圖3A和表2)，菌株TC4在生長的最快速時期以約每30分鐘一代的速度增殖。攜帶質(zhì)粒pLOI308衍生質(zhì)粒的菌株TC4表現(xiàn)出同等的最大生長速度，傳代時間為26至30分鐘。菌株TC4(pLOI295)在同樣的條件下生長情況不佳(傳代時間71分鐘)，并伴有部分溶菌。菌株TC4(pLOI291)和TC4(pLOI292)生長速率中等，傳代時間為46分鐘。
表2有氧和厭氧培養(yǎng)條件下的最大代時、最終菌體濃度和培養(yǎng)液的最終pH值生長質(zhì)粒菌體濃度a代時最終條件(毫克蛋白/毫升)(分)pH值有氧無0.7294.4pLOI2910.7465.3pLOI2921.3465.1pLOI2951.1715.7pLOI308-21.7275.5pLOI308-50.8305.0pLOI308-102.5265.0厭氧無0.3324.4pLOI2910.4404.5pLOI2921.0485.0pLOI2952.1394.7pLOI308-20.8425.7pLOI308-50.4384.9pLOI3082.2415.2a.測定在培養(yǎng)24小時后進行。
在厭氧培養(yǎng)條件下(見圖3B和表2)，不含質(zhì)粒的菌株TC4的傳代時間為32分鐘，比含有產(chǎn)乙醇酶類的重組菌株要短得多。所有的重組菌株都表現(xiàn)相近的最大生長速率，傳代時間都在38到41分鐘之間，只有菌株TC4(pLOI292)的生長速率略微慢一些，傳代時間為48分鐘。
除菌株TC4(pLOI295)外，所有的重組菌株，無論是好氧培養(yǎng)還是厭氧培養(yǎng)，在生長12小時后，菌體濃度都達到與不含質(zhì)粒的菌株TC4相等的水平或甚至更高(見圖3A和B)。表2總結(jié)了菌株TC4和重組菌株在生長24小時后最終菌體濃度的數(shù)據(jù)。在好氧條件下，含質(zhì)粒pLOI308-10的TC4菌株有最大的細菌濃度，其次分別是含質(zhì)粒pLOI308-2的TC4菌株、含pLOI292菌株、含pLOI295菌株(菌體呈部分裂解)，和含pLOI308-5的TC4菌。
在厭氧條件下，含pLOI308-10的TC4菌和含pLOI295的TC4菌的最終菌體濃度大致相同，其次分別是含pLOI292、pLOI308-2、pLOI308-5和pLOI291的TC4菌株。
圖4顯示了菌體細胞的丙酮酸脫羧酶活性水平與細菌生長24小時后最終菌體濃度之間的關系。由于在重組菌株中丙酮酸脫羧酶的合成與乙醇脫氫酶Ⅱ的合成相偶聯(lián)，因而此曲線也代表運動發(fā)酵單胞菌Z.mobilisNAD+再生系統(tǒng)對最終菌體濃度的影響。這些數(shù)據(jù)清楚地表明，無論是好氧條件還是厭氧條件，運動發(fā)酵單胞菌乙醇合成途徑的表達都提高了最終菌體濃度。在菌株TC4(pLOI308-10)中，丙酮酸脫羧酶和乙醇脫氫酶Ⅱ的表達水平(分別為6.5IU和2.5IU)在好氧和厭氧條件下都接近最佳水平。菌株TC4(pLOI295)中產(chǎn)乙醇基因的表達水平甚至過量，導致在好氧條件下細胞生長受阻，并有部分的裂解;在厭氧條件下生長速度則略為下降。
菌株TC4(pLOI295)在厭氧條件下生長加快，并有輕微的表觀裂解;而在快速振蕩的培養(yǎng)瓶中生長不良同時發(fā)生裂解，這說明對于此人工構(gòu)建菌株，高度通氣的生長環(huán)境對細菌有害。如振蕩速度降低到原來的三分之一，可大幅度降低重組菌株的裂解程度并提高細菌的最終濃度。
實施例6.產(chǎn)乙醇酶系在生長過程中的培養(yǎng)液的酸化效應圖3C顯示了在厭氧培養(yǎng)條件下培養(yǎng)液酸酸度變化曲線。對于不含質(zhì)粒的TC4菌株，在培養(yǎng)的最初6小時中，溶液的pH值迅速下降;而對于含有產(chǎn)乙醇基因的衍生菌株，此下降趨勢大為減緩。最初12小時的酸化作用在含pLOI295的TC4菌中減緩最多，以下依次分別是含pLOI308-10、pLOI308-2和pLOI308-5質(zhì)粒的TC4衍生菌。TC4(pLOI291)和TC4(pLOI292)菌的測示結(jié)果未在圖中顯示，但分別位于TC4(pLOI308-5)的下方和上方。盡管重組菌有較高的最終濃度，它們在厭氧和好氧條件下生長24小時后培養(yǎng)液的酸度都要比不含產(chǎn)乙醇基因的TC4菌的培養(yǎng)液為低(見表2)。
重組菌株在酸化速度和程度下降的同時，其細胞生長有所提高，這說明即使在高度通氣的條件下，pH值下降也是限制生長的主要因子。下述實驗的結(jié)果支持這種看法。不含質(zhì)粒子的TC4菌在加有1/10體積比的1M磷酸鈉緩沖液(pH7.0)的培養(yǎng)液中生長，其最終細胞濃度可增加85%。減少緩沖液的添加量則細菌的生長水平介于上述兩者之間。
實施例7.產(chǎn)乙醇酶系對發(fā)酵產(chǎn)物的影響表3總結(jié)了TC4菌和重組菌在好氧和厭氧條件下培養(yǎng)24小時后發(fā)酵產(chǎn)物的分析結(jié)果。在好氧條件下，乙酸是不含質(zhì)粒的TC4菌在豐富培養(yǎng)液中的主要發(fā)酵產(chǎn)物并在生長過程中不斷積累，乙醇的生成則檢測不到。對含有運動發(fā)酵單胞菌產(chǎn)乙醇基因的菌株，乙酸的生成量大為降低，而乙醇則成為主要的發(fā)酵產(chǎn)物。含pLOI308-10的TC4菌所產(chǎn)的乙醇量最高，以下依次分別是含pLOI295、pLOI308-2、pLOI292、pLOI308-5和pLOI291的TC4菌。在好氧條件下，所有的菌株還生成少量的乳酸(0.6至1.2mM)。僅含質(zhì)粒pLOI308-10的TC4菌累積一定量的琥珀酸，但只占全部發(fā)酵產(chǎn)物的1%，而94%的發(fā)酵產(chǎn)物為乙醇。
表3有氧和無氧生長條件下發(fā)酵產(chǎn)物的比較發(fā)酵產(chǎn)物[mM(標準差)]生長條件質(zhì)粒琥珀酸乳酸乙酸乙醇有氧無0.2(0.1)0.6(0.2)55(2)TrpLOI308-2Tr1.2(0.3)22(2)98(3)pLOI308-5Tr0.9(0.2)43(3)15(2)pLOI308-104.9(0.5)1.0(0.2)17(2)337(21)
pLOI295Tr1.1(0.4)13(1)114(10)pLOI291Tr0.6(0.2)34(3)7(1)pLOI292Tr1.3(0.2)30(1.5)24(1)無氧無0.9(0.1)22(1)7(0.3)0.4(0.2)pLOI308-20.8(0.1)7(0.5)4(0.3)71(5)pLOI308-50.3(0.1)18(2)6(1)16(2)pLOI308-105.0(0.4)10(1)1.2(0.2)482(23)pLOI2952.2(0.20)6(1)3(0.3)90(2)pLOI2911.1(0.1)15(0.5)7(0.2)4(0.5)pLOI2922.3(0.2)9(0.7)7.2(0.3)21(1)在厭氧條件下，乳酸是不含質(zhì)粒的TC4菌在添加葡萄糖的豐富培養(yǎng)液中的主要發(fā)酵產(chǎn)物，并在生長的24小時中不斷積累，而乙酸、琥珀酸和乙醇的生成有所減少。在含有產(chǎn)乙醇酶系的重組菌中，乳酸的產(chǎn)量顯著降低，同時有相當大量的乙醇生成。TC4(pLOI308-10)生成的乙醇量最大，占可溶性發(fā)酵產(chǎn)物總量的97%。測試各個菌株發(fā)現(xiàn)乙醇生成的趨勢與好氧生長條件下的結(jié)果一致。實際上，除TC4(pLOI308-10)以外，所有的菌株在厭氧條件下培養(yǎng)24小時生成的乙醇量比好氧培養(yǎng)時的生成量要低，這可能是由于厭氧培養(yǎng)形成的菌體總細胞量較少，導致乙醇產(chǎn)量的體積比減少，因而降低了乙醇的積累水平。
在厭氧和好氧條件下乙醇的生成量(見表3)直接關系到運動發(fā)酵單胞菌產(chǎn)乙醇基因的表達水平(見表1)。在菌株TC4(pLOI308-10)中，乙醇合成的表達似乎達到最適水平，丙酮酸脫羧酶的活性為6IU，乙醇脫氫酶Ⅱ的活性為2.5IU。
含有表達運動發(fā)酵單胞菌產(chǎn)乙醇基因的大腸桿菌TC4衍生菌可培養(yǎng)生長到比不含質(zhì)粒的親本菌更高的菌體細胞濃度水平。最終菌體濃度的提高、培養(yǎng)液中乙醇的累積量及生長過程中培養(yǎng)液的酸化作用減緩率都同運動發(fā)酵單胞菌產(chǎn)乙醇基因的表達水平有關。為減少任何與轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)有關的問題產(chǎn)生，除質(zhì)粒pLOI295(lac)外，都利用了異源啟動子來控制構(gòu)造菌株中基因的表達。表達水平在生長和乙醇生成兩方面都達到最佳狀態(tài)的是質(zhì)粒pLOI308-10(丙酮酸脫羧酶活性和乙醇脫氫酶Ⅱ活性分別為每毫克細胞蛋白6.5IU和2.5IU)大腸桿菌中該表達水平顯著高于運動發(fā)酵單胞菌CP4，后者只包含乙醇途徑再生NAD+。
產(chǎn)乙醇基因在菌株TC4(pLOI295)中的表達水平似乎過高(約占可溶性細胞蛋白的17%)。在好氧條件下，這種高水平基因表達的同時伴隨著菌體的部分裂解、生長緩慢和乙醇產(chǎn)量的降低。此效應在減慢振蕩和轉(zhuǎn)為厭氧培養(yǎng)后得到緩解。在高度通氣的條件下發(fā)生的表觀損害和部分裂解可能與表現(xiàn)高度活性的運動發(fā)酵單胞菌乙n醇脫氫酶Ⅱ和內(nèi)源NADH氧化酶(與電子傳遞系統(tǒng)相偶聯(lián))的共同作用導致NADH的耗盡有關系。
作為主要的發(fā)酵產(chǎn)物，乙醇的生成似乎并不會反向影響大腸桿菌TC4的生長速率。攜帶pLOI308(含ColEI復制子)衍生質(zhì)粒的菌株能表達pet操縱子和生成乙醇，其在好氧添加葡萄糖的生長條件下有和親本菌相同的生長速率，并能達到比親本菌還要高的最終菌體濃度。在好氧條件下，攜帶含RSF1010復制子的質(zhì)粒pLOI291或pLOI292的菌株生長要慢得多。由于這兩個構(gòu)造菌株表達的產(chǎn)乙醇基因和產(chǎn)生的乙醇量都比質(zhì)粒pLOI308-10要低，這種生長緩慢可歸因于載體的特性而非pet-操縱子的表達水平。
實施例8.附加菌株的制備測試其他的大腸桿菌菌株，以選出性狀優(yōu)良的產(chǎn)乙醇菌株。經(jīng)過測試的大腸桿菌菌株包括ATCC8677，ATCC8739，ATCC9637，ATCC11303，ATCC11775，ATCC14948，ATCC15244和ATCC23227。所有菌株都在30℃的振蕩水浴中進行培養(yǎng)，培養(yǎng)液為含有牛肉膏(10克/升)、酵母提取物(5克/升)、Nacl(5克/升)和可發(fā)酵糖的LB培養(yǎng)液(Luria，S.E.和M.DelbruekGenetics28491-511)。在不作特別說明的情況下，葡萄糖和乳糖以100克/升的濃度加入培養(yǎng)液，木糖的使用濃度則為80克/升。各種糖以兩倍于使用濃度配制于蒸餾水中單獨消毒(121℃下15分鐘)。木糖(SigmaChemicalCo.，St.Louis，MO)溶液呈酸性，因而在消毒之前要用NaOH溶液調(diào)至中性，否則在消毒后溶液會變成棕色糖成分分解。使用各種經(jīng)高壓消毒或過濾滅菌的糖分都獲得相同的發(fā)酵結(jié)果。在培養(yǎng)液中或固體平板上攜帶編碼乙醇途徑有關酶的基因的重組菌株的存活要求培養(yǎng)基中含有可發(fā)酵糖組分。如所示，四環(huán)素的最終使用濃度為10毫克/升。
實施例9.附加菌株對環(huán)境的耐受性在將控制乙醇合成的質(zhì)粒導入上述的八個不同的大腸桿菌株之前，先比較了它們對惡劣環(huán)境的耐受能力。檢查了這些菌株對NaCl、糖、低pH和乙醇的抵抗能力。表4列出了所用的NaCl和糖的不同濃度，其中也包括原始培養(yǎng)基中兩者的濃度。原始培養(yǎng)基的pH值為6.8，實驗時以HCl調(diào)節(jié)到所需的酸度。酸性培養(yǎng)基過濾滅菌。乙醇在經(jīng)高壓滅菌的培養(yǎng)基冷卻后加入。糖組分須單獨消毒。菌體先在不含測試組分的各種糖培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)，然后稀釋60倍在有3ml測試培養(yǎng)基的13×75mm試管中進行培養(yǎng)。48小時后測定培養(yǎng)液在550mm處的O.D.值。O.D.等于1.0即相當于0.25毫克/毫升的菌體蛋白和0.33毫克的細胞干重。在環(huán)境耐受性測試中，最終0.D.值低于0.2即反映了細菌倍增不到二次，其生長可忽略。
表4總結(jié)了在含葡萄糖的培養(yǎng)液中進行上述實驗的結(jié)果。在含乳糖或木糖的培養(yǎng)液中進行的實驗結(jié)果相同。菌株ATCC8677、ATCC8739和ATCC11775對低濃度的乙醇的抑制作用特別敏感。除菌株ATCC23227外，其它菌株在pH4.0酸度下都仍然能夠倍增至少2至4次，其中又以ATCC9637和ATCC11775對低pH值的耐受性最強。所有的菌株在45℃下培養(yǎng)長成后在更高的溫度中都只有有限的生長。所有的菌株在45℃以上的溫度環(huán)境中傳代級培養(yǎng)都未能成功。所有的菌株在含有20%葡蔥糖、或20%乳糖、或12%木糖的培養(yǎng)液中都能生長。
表4.化學和物理脅迫下大腸桿菌在含100克/升葡萄糖的LB培養(yǎng)液中的生長情況脅迫條件大腸桿菌菌(ATCC編號)的生長情況8677873996371130311775149481522423227NaCl(克/升)50+++++++++++++++600+++++++++++7000++0+++乙醇(%體積比)3.8++++++++++++++++5.0++++++++++6.30+++++++07.50++00+008.800000000酸度pH4.50++++++++++++++++pH4.25++++++++++++++pH4.00+++++++++0pH3.7500+0+000溫度℃45+++++++++++++++47++++++++4900++00++0＝O.D.550nm測定值低于兩次菌體增倍
+＝二至四次菌體增倍++＝四次以上菌體增倍實施例10.附加菌株的糖分利用糖分的利用通過兩種方法進行檢測。對于在添加2%糖成分的MacConkey瓊脂上長成紅色單菌落的菌株，其糖利用能力可直接進行測定(Silhavy，T.J.和J.R.BeckwithMicrobiol.Rev.49398-418)。也可以根據(jù)產(chǎn)品說明書上的介紹用Biolog EC plates法(Biolog，Inc.，Hayward，CA)檢測菌體細胞。Biolog plates法快捷而可靠，以測定NADH的產(chǎn)量(即由某四唑鹽到不溶性甲
的轉(zhuǎn)化，作為底物利用的指標。對測試的13種糖，兩種方法的結(jié)果完全一致。
所有測試的菌株都能利用葡萄糖、半乳糖、甘露糖、阿拉伯糖、乳糖、葡糖醛酸和半乳糖醛酸。菌株11775不能利用木糖。麥芽糖和麥芽三糖則不能為菌株ATCC11303和ATCC23227所利用。所有菌株對纖維素二糖都有微弱的正反應能力。蔗糖僅為菌株ATCC9637所利用。糖分利用為研究結(jié)果匯總?cè)绫?。
表5攜質(zhì)粒pLOI297和pLOI308-11的大腸桿菌生長情況糖質(zhì)粒E.coli菌株(ATCC編號)0.D.550nm的最終值8677873996371130311775149481522423227葡萄糖無4.03.76.16.04.75.67.06.6葡萄糖pLOI29710.010.510.510.09.5-9.510.2葡萄糖pLOI308-119.89.511.411.2-9.310.811.4乳糖無4.33.87.56.04.56.17.06.4乳糖pLOI129713.06.811.610.87.6-10.57.0乳糖pLOI308-1110.010.011.511.0-7.310.010.0木糖無4.13.77.77.34.95.97.27.0木糖pLOI2978.110.610.810.64.7-11.011.0木糖pLOI308-1110.06.811.48.5-11.410.612.0橫線示數(shù)據(jù)暫缺實施例11附加菌株的遺傳改造通過常規(guī)方法構(gòu)建了兩個新質(zhì)粒(Maniatis，T.，E.F.Fritsch，和J.SambrookMolecularCloningaLaboratoryManual.ColdSpringHarborLaboratory，ColdSpringHarbor，NY)，它們都含有對抗氨芐青霉素和四環(huán)素的抗性基因作為篩選標記。從質(zhì)粒pLOI308-10(Ingram與Conway，Supra)上將一個5.2Kb的含有乙醇合成操縱子(pet-operon，包括一個內(nèi)源運動發(fā)酵單胞菌啟動子，丙酮酸脫羧酶、乙醇脫氫酶和轉(zhuǎn)錄終止子)的EcoRI酶切片段分離并插入pBR322的EcoRI酶切位點上構(gòu)建成pLOI308-11。質(zhì)粒pLOI297則是通過將來自質(zhì)粒pCOS2EMBL(Poustka，A.，H.R.RackwitzA.-M.Firschauf，和H.LehrachProc.Natl.acad.Sci.USA814129-4133)的含四環(huán)素抗性基因的2.6KbEcoRI酶切片段插入pLOI295(Ingrametal.，supra)的SalI酶切位點上而構(gòu)建。在連接前將樣品用E.coliDNA聚合酶的Klenow片段處理即可填平粘性末端(Maniatisetal.，supra)。
根據(jù)Mandel和Higa所述的氯化鈣轉(zhuǎn)化法(Mandel，M.和A.HigaJ.Mol.Biol.53159-162)，將質(zhì)粒轉(zhuǎn)入各個E.coli菌株，在含有2%葡萄糖和四環(huán)素的固體培養(yǎng)基上進行選擇。質(zhì)粒的穩(wěn)定性以無抗菌素選擇的條件下繼代25代后仍保留抗藥性標記的菌體百分數(shù)來表示。
重組的菌株獲得了帶乙醇合成基因的質(zhì)粒，在含有添加糖分的固體培養(yǎng)基上生長24到48小時后，形成特別大的、呈黃色的菌落。在液體培養(yǎng)液中，重組菌的最終細胞濃度比不含質(zhì)粒的對照菌要高出二至三倍。質(zhì)粒pLOI297對菌株ATCC14948的轉(zhuǎn)化子，以及質(zhì)粒pLOI308-11對菌株ATCC11775的轉(zhuǎn)化子則始終無法獲得。不能利用木糖作的菌株11775。其重組子在以木糖作為富加糖分的培養(yǎng)條件時生長濃度不高于對照菌，但在添加乳糖和葡萄糖時其生長速度加快。
質(zhì)粒穩(wěn)定性的檢測在含葡萄糖的培養(yǎng)基上傳代25代后進行(見表6)。兩個質(zhì)粒具有相同的復制子，在除ATCC8677和ATCC8739以外的所有其它菌株中都能很穩(wěn)定地保留下來。
表6質(zhì)粒pLOI297和pLOI308-11在沒有抗菌素選擇，含葡萄糖的條件下生長25代后的穩(wěn)定性ATCC菌株保留質(zhì)粒的細胞數(shù)(%)pLOI297pLOI308-11867775858739444796371009011303989811775100---14948---9715224991002322791100虛線表示數(shù)據(jù)缺。
實施例12丙酮酸脫羧酶在遺傳改變的菌株中的表達丙酮酸脫羧酶活性的測定依前述(Conwayetal.見前，Nealeetal.見前)，但在O.D.4.0時收集細胞，此時生長量約為最高值的一半。
對運動發(fā)酵單胞菌丙酮酸脫羧酶活性表達的檢測在含四環(huán)素的培養(yǎng)條件下生長后進行(見表7)。對質(zhì)粒pLOI297，運動發(fā)酵單胞菌基因的表達受大腸桿菌乳糖合成啟動子的控制;質(zhì)粒pLOI308-11則利用內(nèi)源的運動發(fā)酵單胞菌啟動子來調(diào)節(jié)pet-操縱子的表達。菌株ATCC11303(pLOI297)、ATCC11775(pLOI297)和ATCC15224(pLOI297)表現(xiàn)活性最高。
表7在含葡萄糖的生長條件下運動發(fā)酵單胞菌丙酮酸脫羧酶基因在攜質(zhì)粒pLOI297和pLOI308-11的大腸桿菌菌株中表達ATCC菌株丙酮酸脫羧酶活性pLOI297pLOI308-1186775.76.087390.81.496371.11.41130316.72.111775 17.1 ---b14948 ---b2.51522416.31.8232272.31.7a酶活性以每毫克菌體蛋白的國際單位值表示b虛線表示數(shù)據(jù)暫缺實施例13遺傳改造菌株的乙醇產(chǎn)量在Luria培養(yǎng)液中另加pH7.0的磷酸鉀緩沖液至0.2M終濃度以適用于發(fā)酵試驗。磷酸緩沖液、復合培養(yǎng)液成分和糖分分別消毒并冷卻后再予混合。四環(huán)素的使用濃度為10毫克/升。接種物為新鮮分離的菌落，生長24小時后，以待測發(fā)酵培養(yǎng)基洗滌，加入發(fā)酵液中，使其濃度為O.D.550nm約1.0。發(fā)酵溫度為30℃或37℃。在100毫升三角燒瓶中裝80毫升發(fā)酵溶液，以橡皮塞塞口，塞子上插一只25號針頭導出發(fā)酵產(chǎn)生的氣體。發(fā)酵燒瓶要浸入溫控水浴器中，以磁力攪拌子以100rpm速度攪拌。
乙醇濃度依前述以氣相色譜法進行測定。(Dombek，K，M.和L.O.IngramAppl，Environ.Microbiol.51197-200)，測定值以體積百分比表示。轉(zhuǎn)化率根據(jù)所加糖分計算，設定每20克葡萄糖或木糖生成12.75毫升(10.2克)乙醇或每20克乳糖生成13.5毫升(10.8克)乙醇的轉(zhuǎn)化率為100%。
所有的經(jīng)遺傳改造的大腸桿菌菌株在添加葡萄時都產(chǎn)生大量的乙醇(見表8)。以菌株ATCC15244(pLOI297)進行的預備實驗表明，含有0.2M，pH7.0磷酸鉀緩沖液的培養(yǎng)液可使菌株生成更多的乙醇。預計如使用自動酸度調(diào)節(jié)系統(tǒng)以取代此磷酸鉀緩沖液可獲得類似或更佳的結(jié)果。當葡萄糖濃度為15%時，生長48小時后，30℃生長的細菌的乙醇產(chǎn)量比37℃下生長的菌要多。乳糖和木糖的發(fā)酵試驗只在較低的溫度即30℃下進行。總的來看，帶質(zhì)粒pLOI297的菌體乙醇產(chǎn)量要高出帶質(zhì)粒pLOI308-11的菌。在15%的葡萄糖中生長48小時后，菌株ATCC11303(pLOI297)、ATCC11775(pLOI297)和ATCC15224(pLOI297)產(chǎn)生乙醇的量最多，占總體積的5.8-6.9%。在最初實驗中，大多數(shù)菌株對木糖的耐受性較差，因而發(fā)酵實驗的比較即在8%的木糖中進行。在8%的木糖中生長72小時后，菌株ATCC9637(pLOI297)、ATCC11303(pLOI297)和ATCC15224(pLOI297)產(chǎn)生的乙醇量最多。所有的菌株在15%乳糖中都能很好地生長。在乳糖中生長48小后，菌株ATCC11303(pLOI297)和ATCC15224(pLOI297)產(chǎn)生的乙醇量最多，分別為6.1%和5.6%體積比。
表8攜質(zhì)粒pLOI297和pLOI308-11的大腸桿菌菌株在含葡萄糖(48小時)、木糖(72小時)和乳糖(48小時)的生長條件下經(jīng)液體發(fā)酵的乙醇產(chǎn)量糖質(zhì)粒大腸桿菌(ATCC編號)的乙醇產(chǎn)量(%,V/V)867787399637113031177514948152242322715%葡萄糖 pLOI297a2.4 4.7 4.2 4.3 4.8 - 4.8 0.915%葡萄糖 pLOI308-11a3.6 1.4 2.1 1.3 - 3.4 2.8 1.315%葡萄糖 pLOI297b3.2 4.7 4.1 5.8 6.9 - 6.1 3.1
15%葡萄糖 pLOI308-11b5.8 5.0 3.5 1.5 - 3.8 3.0 3.215%乳糖 pLOI297b2.3 4.4 5.3 6.1 4.5 - 5.6 3.715%乳糖 pLOI308-11b2.3 2.1 3.4 0.9 - 2.9 2.7 3.08%木糖 pLOI297b0.9 4.1 4.8 5.2 - - 4.8 1.28%木糖 pLOI308-11b2.0 2.8 2.8 1.2 - 2.0 3.5 1.0虛線表示數(shù)據(jù)暫缺a.保溫在37℃b.保溫在30℃比較這些研究結(jié)果，可以發(fā)現(xiàn)菌株ATCC11303(pLOI297)和ATCC15224(pLOI297)為乙醇生產(chǎn)的最佳構(gòu)建菌株。經(jīng)過測定建立了這兩個菌株在12%葡萄糖、12%乳糖和8%木糖中的生長時間一乙醇產(chǎn)量關系圖(見圖1)。菌體量增加了近十倍。終濃度達到每升3.6克干重。菌體量在木糖中的增長率只有在葡萄糖或乳糖中的一半。在這三種糖中，乙醇產(chǎn)量和菌體生長的關系在乙醇濃度達到5%以前大致呈線性相關。
將三組細菌生長120小時后，乙醇終濃度加以平均，以計算由糖生成乙醇的轉(zhuǎn)化率(見表6)。在12%葡萄糖中生長的培養(yǎng)物最終乙醇濃度為7.2%(體積化)，為葡萄糖發(fā)酵理論得率的94%。對于12%的乳糖，乙醇的終濃度為6.5%，為理論得率的80%。對于8%木糖，其產(chǎn)量總能達到理論值的100%甚至更高。這種在木糖中生長緩慢而又有高產(chǎn)率的現(xiàn)象可能反映了菌體中除由葡萄糖向丙酮酸的轉(zhuǎn)化生成乙醇外，尚有來源于復合營養(yǎng)成分分解代謝的丙酮酸向乙醇的轉(zhuǎn)化。
通過圖1所示，計算出乙醇生成率并匯總為表9。乙醇的體積比生成率各有差異，從葡萄糖中的每小時1.4克/升，到木糖中的每小時0.64克/升。在三種糖中，乙醇的生成率在培養(yǎng)的最初階段均表現(xiàn)為最大，其中最大值在葡萄糖中發(fā)現(xiàn)，為每小時2.1克乙醇/克細胞干重。利用木糖可以取得相對每克糖分的最大乙醇得率，超過了僅僅相對糖分的最大理論得率。
表9菌株ATCC11303(pLOI297)和ATCC15224(pLOI297)產(chǎn)生乙醇的動力學參數(shù)平均值糖體積比產(chǎn)量a比生成率b得率c生成效率d乙醇量e12%glucoee1.42.10.48955812%lactoee1.32.00.4380528%xyloee0.61.30.5210242a克乙醇/升/小時b克乙醇/克菌體干重·/小時c克乙醇/克糖d (生成的乙醇)/(由糖底物轉(zhuǎn)化的理論最大值) ×100e最終乙醇濃度(單位為克/升)對ATCC11303(pLOI297)進行了有關實驗，以檢查利用阿拉伯糖、半乳糖和甘露糖生成乙醇的情況。在30℃中培養(yǎng)48小時后乙醇濃度在3%到4%之間，但末能進行進一步的實驗。這三種糖類的代謝途徑與葡萄糖和木糖的代謝途徑相似，估計能取得相近的乙醇得率(Lin，E.CC.“Dissimilatorypathwaysforsugars，polyols，andcarboxylates”，InF.C.Neidhardt，J.L.Ingraham，K.B.Low，B.Magasanik，andM.Schaechter[eds]，EscherichiacoliandSalmonellatyphimurium，Vol1，pp244-284頁AmericanSocietyforMicrobiology，Washington，D.C.)實施例14非大腸桿菌宿主的乙醇生產(chǎn)由于不同菌種間代謝途徑的高度相似性，預計有很多宿生菌可以接受轉(zhuǎn)化，獲得外源基因，從而產(chǎn)生乙醇作為其發(fā)醇產(chǎn)物。如文中所述，當宿主要用adh和pdc基因的轉(zhuǎn)化時，完全可以預計，能夠利用合適載體達到表達。一旦表達成功，就可以基于不同宿主間代謝途徑的一致性而對乙醇的產(chǎn)量作出相當接近的估計。
實施例15轉(zhuǎn)化的克氏桿菌中乙醇的產(chǎn)生本發(fā)明所應用的克氏菌菌株原先命名為肺炎克氏桿菌M5A1菌株(KlebsiellapneumoniaeM5A1，MahL，M.C.，P.W.Wilson，M.A.Fife，W.H.EwingJ.Bacteriol.891482-1487)。該菌株是一種固氮生物，最初曾鑒定為產(chǎn)氣桿菌，以后根據(jù)其抗原特性重新命名。自第8版《伯杰氏手冊》對肺炎克氏桿菌的新分類學標準加以明確說明后，該菌株的物種形成得到了進一步的研究。菌株M5A1在10℃時可在含葡萄糖的基本培養(yǎng)基上生長，但在44.5℃時不能從乳糖產(chǎn)生氣體。該菌株吲哚反應陽性，并能利用間羥基苯甲酸鹽或二羥苯甲酸鹽作為唯一的碳源，在30℃或37℃的溫度中生長?；谶@些試驗結(jié)果，M5A1被定名為催娩克氏桿菌(K.oxytoca)。除帶有含運動發(fā)酵單胞菌(Z.mobilis)基因的質(zhì)粒的重組細菌外，菌株都在不加糖分的Luria瓊脂平板上進行傳代培養(yǎng)。含有adhB和pdc基因的重組細菌要求培養(yǎng)基中含某種可發(fā)酵糖分才能存活，其菌種在含2%葡萄糖或木糖的平板上傳代。所用的抗菌素濃度如下氨芐青霉素50微克/毫升，氯霉素40微克/毫升，四環(huán)素12.5微克/毫升。運動發(fā)酵單胞菌adhⅡ基因在重組菌體中的表達通過乙醛指示平板加以篩選。大腸桿菌(Escherichiacoli)菌株TC4作為所有質(zhì)粒構(gòu)建體的宿主。
由于M5A1對于青霉素及其衍生物有相當高的抗性，我們構(gòu)建了帶有cat(Cmr)或tet(Tcr)基因的大腸桿菌穿梭載體。通過在質(zhì)粒pLOI276的SalⅠ位點上插入一段來自pcos2EMBL(Poustka，A.，H.R.Rackwitz，A.-M.Frischauf，B.Hohn，H.LehrachProc.Natl.Acad.Sci.USA 814129-4133)的2.6Kb的EcoRI酶切片段，即可向含運動發(fā)酵單胞菌pdc基因的pLOI276再插入一個tet基因。粘性末端可在連接反應前經(jīng)大腸桿菌DNA聚合酶的Klenow片段處理而去除。所得構(gòu)建體經(jīng)限制性酶切分析加以確證，并編號為pLOI560。
以往的研究表明大腸桿菌B(ATCC11303)帶有內(nèi)源的低拷貝數(shù)質(zhì)粒。把運動發(fā)酵單胞菌pdc和adh B基因以及cat基因體整合到這些質(zhì)粒中，即可得到有用的新載體。這個質(zhì)粒的構(gòu)建要求先從pLOI510中分離一段不含有啟動子而攜帶pdc、adh B和cat基因的4.6Kb的PstⅠ酶片段。這個片段不具備復制功能。經(jīng)自連接環(huán)化后，這些片段可轉(zhuǎn)化到大腸桿菌B中，在含有2%葡萄糖的Luria瓊脂平板上篩選Cmr抗性標記。轉(zhuǎn)化子再在乙醛指示平板上加以鑒定，形成暗紅色菌落的即被選為有高水平adhB基因表達活性的轉(zhuǎn)化子。從這些菌株制備質(zhì)粒再通過轉(zhuǎn)化大腸TC4試驗其抗性標記和運動發(fā)酵單胞菌基因的共轉(zhuǎn)移能力。所有的轉(zhuǎn)化子都對氨芐青霉素敏感，表明不帶含有bla和Col E1復制子的pUC18片段。其中一個質(zhì)粒，pLOI555(8.4kb)，在含乙醛指示平板上形成的菌落紅色最深，賦予大腸桿菌極好的產(chǎn)乙醇能力，而根據(jù)小量質(zhì)粒制備所得產(chǎn)率看來，是以低拷貝數(shù)存在于菌中。該質(zhì)粒以及pLOI297和pLOI560可用于轉(zhuǎn)化催娩克氏桿菌M5A1，并以氯霉素抗性(Cmr)加以篩選。
三個含有編碼運動發(fā)酵單胞菌PDC的基因的質(zhì)粒構(gòu)建體轉(zhuǎn)化到M5A1中(見表10)。兩個puc構(gòu)建體(pLOI297和pLOI560)轉(zhuǎn)化子的PDC活性比pLOI555轉(zhuǎn)化子要高出8倍。假定純PDC的最大比活為100U，則此酶所占細胞質(zhì)蛋白比例在M5A1(pLOI297)和M5A1(pLOI560)中為25%，在M5A1(pLOI555)中為3.6%。
表10M5A1重組菌株中質(zhì)粒穩(wěn)定性和pdc表達24小時后PDC活性保留性狀百分比a,b質(zhì)粒U/毫克蛋白(傳代次數(shù))pLOI5553.6100(38.5)98(68.5)pLOI2972852(38.6)10(68.60)pLOI5602797(32.9)0(62.9)
a培養(yǎng)時兩次取樣b乙醛性狀和抗性同時消失運動發(fā)酵單胞菌(Z.mobilis)基因在M5A1中的表達可進一步通過SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳加以證實。通過與原始菌株比較，即可容易地辨別出代表PDC和ADHⅡ的樣品帶。基于pUC的重組子的PDC帶與M5A1(pLOI555)相比要寬得多，這一結(jié)果與酶活性測定結(jié)果相符合。雖然ADHⅡ比PDC含量少，該運動發(fā)酵單胞菌基因在M5A1(pLOI297)中的表達比在M5A1(pLOI555)中的也要高些。在只帶有運動發(fā)酵單胞菌pdc基因的M5A1(pLOI560)中，檢測不到相應于ADHⅡ的條帶。
根據(jù)小量質(zhì)粒制備實驗中的得率，推測pLOI555的拷貝數(shù)不到另兩個重組體拷貝數(shù)的十分之一。雖然這只是大致的推測，但有一點是清楚的，即在以作為載體的重組體中，PDC的高水平表達部分原因在于其拷貝數(shù)較高。
帶pLOI555，pLOI297，或pLOI560的菌體在30℃含10%葡萄糖而不含抗菌素的Luria培養(yǎng)基連續(xù)傳代60代以上。培養(yǎng)物經(jīng)適當稀釋后涂布于含2%葡萄糖但不含抗菌素的Luria平板上。使用乙醛指示平板檢測菌落是否保留運動發(fā)酵單胞菌的產(chǎn)乙醇基因和對適當抗菌素的抗性。
已有報道克隆在pBR322衍生的載體上的運動發(fā)酵單胞菌基因在植生克氏桿菌(Klebsiellaplanticola)中非常不穩(wěn)定(Tolan，J.S.，R.K.FinnAppl.Eviron.Microbiol.532039-2044)，不能用于工業(yè)生產(chǎn)。帶pLOI555的重組子則非常穩(wěn)定，菌群中98%保留了抗性基因和運動發(fā)酵單胞菌基因。雖然通過乙醛指示培養(yǎng)基只檢測了adhⅡ基因的表達，這些重組子仍保留了菌落大的表型，表明pdc和adhⅡ基因均已表達。
在含10%(w/v)葡萄糖或木糖的Luria培養(yǎng)基中，30℃，pH6.0，100rpm振蕩培養(yǎng)條件下進行發(fā)酵。將單菌落接種在靜止燒瓶中30℃培養(yǎng)過夜，獲取種子培養(yǎng)物。用種子培養(yǎng)物接種發(fā)酵溶液到初始濃度為OD5501.0(相當于330毫克細胞干重/升)。用BauschandLombSpectronic70分光光度計監(jiān)測菌體生長情況。
乙醇濃度用氣液層析法測定。計算轉(zhuǎn)化率時，假定所有糖都被代謝，并校正由于堿的加入而引起的體積變化。由木糖和葡萄糖產(chǎn)生乙醇量的最大理論值據(jù)計算為每克糖0.51克乙醇，不計入轉(zhuǎn)化為CO2的部分。以體積比表示的產(chǎn)率根據(jù)活性最高的階段來估算，代表最大活性值。圖表中所有發(fā)酵數(shù)據(jù)均為兩批以上發(fā)酵的平均值。
表11顯示了運動發(fā)酵單胞菌的PDC及ADHⅡ?qū)5A1菌株分別從葡萄糖和木糖產(chǎn)生乙醇的影響。顯而易見，M5A(pLOL555)是最佳的構(gòu)建菌株，它利用葡萄糖和木糖產(chǎn)生乙醇的最大產(chǎn)率均達到每小時2.1克/升。該重組子以這兩種糖中的任一種作為底物，在30小時后，可產(chǎn)生約37克/升乙醇，49小時后發(fā)酵基本結(jié)束，產(chǎn)率為45克乙醇/升。
表11通過M5A1重組菌株從葡萄糖和木糖生成乙醇a質(zhì)粒/基因b堿c時間d乙醇得率理論 VPe30小時細胞量(mmol(小時)(克/升)(克/克糖)得率(克/升乙醇(克/克/克糖)(%)/小時)(克/升)糖)葡萄糖無質(zhì)粒1.048150.16311.1150.044pLOI5600.872440.46901.1150.018/pdcpLOI2970.772500.521021.3240.020/pdc adhBpLOI5551.048480.50982.1430.040/pdc adhB木糖無質(zhì)粒1.996140.16310.570.044pLOI5600.796370.38750.550.025/pdcpLOI2970.996370.39761.0120.024/pdc adhB
pLOI5601.148460.48942.0370.054/pdc adhBa根據(jù)最初所加糖總量計算b所標基因來自運動發(fā)酵單抱菌(Z.mobilis)c發(fā)酵時維持pH6.0所耗堿量d最大乙醇濃度的時間eVP，批量發(fā)酵時最大容積產(chǎn)量就乙醇產(chǎn)生而言，M5A1(pLOI555)的生長具有明顯優(yōu)勢。該重組子的生長與其親本菌株幾乎相同。與親本株不同的是細胞密度在培養(yǎng)15小時時達到最大，然后持續(xù)下降。由于見不到菌體的裂解，這種下降可能反映了由于乙醇積累而造成的折射率下降。不需要添加堿以控制pH值，帶pdc和adhⅡ的重組子，由于減小了酸性產(chǎn)物(中性發(fā)酵產(chǎn)物比例較高)的產(chǎn)生，其菌體密度可達到親本株的兩倍以上，如在大腸桿菌中觀察的結(jié)果一樣。
在保持同樣高的效率和乙醇終濃度情況下，其最大乙醇產(chǎn)率(每小時2.1克/升)幾乎是大腸桿菌重組子的兩倍。與大腸桿菌不同的是，M5A1(pLOI555)以同樣速率發(fā)酵木糖和葡萄糖。在無抗性選擇情況下，質(zhì)粒pLOI555可以在M5A1中穩(wěn)定存在。就乙醇產(chǎn)生而言，由于M5A1的底物范圍與大腸桿菌的相同，M5A1重組子具有明顯而始料未及的優(yōu)勢。
實施例16利用歐文菌屬及克氏桿菌屬產(chǎn)乙醇重組子發(fā)酵纖維二糖產(chǎn)生乙醇本例描述了利用歐文氏菌屬和克氏桿菌屬產(chǎn)乙醇重組子發(fā)酵一種寡糖(纖維二糖)。本例所用的歐文氏菌是一典型的胡蘿卜軟腐歐文氏菌菌株(Erwiniacarotevara)。用實施例15中所述的pLOI555轉(zhuǎn)化歐文氏菌。該轉(zhuǎn)化按Ho等Ag.andBiolChem.52(1)293-4的方法，使用Biorad電穿孔器將pLOI555轉(zhuǎn)入歐文氏菌(電壓2.0kv，電容25μF，電阻100Ω)。得到大量轉(zhuǎn)化子，轉(zhuǎn)化率大于100，000個轉(zhuǎn)化子/μg質(zhì)粒DNA。
本例所用的克氏桿菌為催娩克氏桿菌M5A1菌株P2，該菌株由實施例18中所述方法獲得。
按實施例5中方法，在含10%纖維二糖的Luira培養(yǎng)基(pH6，30℃)，100rpm振蕩條件下進行發(fā)酵。歐文氏菌和克氏桿菌產(chǎn)生的乙醇濃度分別為1.113molar和1.065molar。該實驗結(jié)果見圖6，乙醇濃度以g/L表示。符號■代表歐文氏菌，□代表克氏桿菌。
實施例17利用單一的遺傳工程改造的微生物發(fā)酵多聚體原料生成乙醇本例描述了用兩步法將多聚體底物發(fā)酵成乙醇，所用的單一微生物經(jīng)過遺傳工程改造后，可以產(chǎn)生胞內(nèi)木聚糖酶并產(chǎn)生乙醇作為初級發(fā)酵產(chǎn)物。具體過程是，將嗜熱細菌熱纖維梭狀芽孢桿菌木聚糖酶基因切除上游部分與lacZ基因N-末端融合以去除分泌信號。該重組基因在前述的大腸桿菌和催娩克氏桿菌(pLOI555)中能夠高水平表達，乙醇發(fā)酵時胞內(nèi)積累大量木聚糖酶。發(fā)酵結(jié)束時收集含木聚糖酶的菌體，加到較高溫度的木聚糖溶液中以釋放其具糖化作用的木聚糖酶。冷卻后，利用同種微生物將水解產(chǎn)物發(fā)酵生成乙醇，同時產(chǎn)生隨后的糖化作用所需的木聚糖酶。
微生物及其生長本例所用細菌菌株和質(zhì)粒列于表12中。
表12細菌苗株和質(zhì)粒細菌/質(zhì)粒性狀來源或參考文獻大腸桿菌DH5alacZM15,recABethesda研究實驗室大腸桿菌KO11 frd,Cmr,IpetaOhta等催娩克氏桿菌M5A1 Cmr,petb實施例15,同上(pLOI1555)pCT1202 Apr,xynZ+Grepinet等pLOI1001 Apr,xyIB+Utt等
pLOI2000 Apr,xyIB+本實施例pLOI2001 Apr,lacZ,xynZ+本實施例pLOI2002 Apr,lacZ::xynZ+本實施例pLOI2003 Apr,lacZ::xynZ+,Xy- 本實施例IB+aIpet表示Z.mobilis pdc和adhB基因整合在染色體上。
bpet表示Z.mobilis pdc和adhB基因存在于質(zhì)粒pLOI555上。
cOhta等Appl.Environ.Microbiol.57893-900.
dGerpinet等J.Bacteriol.1704582-4588.
eUtt等Appl.Environ.Microbiol.571227-1234.
菌株在添加了50克木糖/升的Luria培養(yǎng)基中培養(yǎng)。大腸桿菌轉(zhuǎn)化子在含50毫克氨芐青霉素/升或40毫克氯霉素/升的Luria瓊指平板上篩選。催娩克氏桿菌M5A1轉(zhuǎn)化子在含1000毫克氨芐青霉素/升或40毫克氯霉素/升的Luria瓊脂平板上選擇。
用含4-甲基傘形糖基-β-D呋喃纖維二糖苷(100毫克/升)的微滴定平板(MilletFEMSMicrobiol.Lett.29145-149)篩選有木聚糖酶活性的重組子。同樣，用含4-甲基傘形糖基-α-L-呋喃阿拉伯糖苷(20毫克/升)的固體培養(yǎng)基(UttetalAppl.EnvironMicrobiol571227-1234)篩選表達木糖酶和阿拉伯糖苷酶的XylB基因的重組子。陽性克隆水解這些底物后產(chǎn)生一種340nm紫外光下易于檢測的熒光產(chǎn)物(傘形酮)。
遺傳操作和重組技術質(zhì)粒制備、限制性內(nèi)切酶酶切、連接、轉(zhuǎn)化以及凝膠電泳均使用標準方法。在所有質(zhì)粒構(gòu)建過程中，均用大腸桿菌DH5α菌株作為宿主。多聚酶鏈式反應在TempCyclerModle50(Coy實驗產(chǎn)品公司，AnnAbor，密執(zhí)安州.，AnnArborMI)和含Taq多聚酶的GeneAmpKit(試劑盒)(PerkinElmerCetus，Norwalk，CT)中進行。擴增反應液為100μl，其中dNTP各含2mM，每種引物為100pmol，模板20mg以及2.5UTaq多聚酶。產(chǎn)物在擴增循環(huán)30次(94℃1分鐘，47℃2分鐘及72℃1分鐘;最后一次72℃3分鐘)后分離。
酶活性的測定木聚糖、吡喃木糖苷酶和呋喃阿拉伯糖苷酶活性在30℃過夜培養(yǎng)的重組子中測定。離心(7000g，10分鐘)收集菌體，洗滌兩次。測定木聚糖酶活性所用洗液為磷酸一檸檬酸緩沖劑(50mM磷酸鉀和12.5mM檸檬酸，pH6.3)，測定木糖苷酶和阿拉伯糖苷酶活性則選用磷酸緩沖液(5mM磷酸鈉緩沖液，含100mM2-巰基乙醇，pH6.8)。菌體在法式壓力容器中(20，000psi)破碎兩次，得到的裂解物離心(13，000g，30分鐘，4℃)以除去菌體碎片。
木糖苷酶和呋喃阿拉伯糖苷酶活性按前述方法測定(Utt，見前)。木聚糖酶活性用同樣方法測定，但底物使用對硝基-β-D-纖維二糖苷。木聚糖酶活性也通過測定水解樺木木聚糖(SigmaChemicalCompanySt，Louis，Mo)產(chǎn)生的還原糖量(Bergmeyer編MethodsofemzymaticanalysisVol.Ⅱ，3rdedition，P151-2，VerlayChemie，Weinheim.Germany)來估算。所有活性均以每分種產(chǎn)生產(chǎn)物的mmole數(shù)表示。蛋白質(zhì)濃度用Bradford(BradfordAnal.Biochem，72248-254)方法測定。
薄層層析法分離寡糖木糖用三氟乙酸部分水解0.5%樺木木聚糖(DomerMethEnzymol160176-180)制備寡聚木糖混合液。然后在室溫下真空濃縮10倍，并取1μl作為標準。寡聚木糖Whatman150A硅膠板(WhatmanInc.，Clifton，NewJersey)上用由丙酮、乙酸乙酯和乙酸(2∶1∶1)組成的溶劑于室溫層析分離。干燥后，如Bounias(BounoasAnalBiochem106291-295)所述，用萘乙二胺試劑使寡聚糖顯色。
發(fā)酵試驗發(fā)酵液接種物由新鮮的單菌落接種后在30℃靜止培養(yǎng)過夜而制備的。發(fā)酵液中初始接種量使O.D.550為0.1或0.3，然后在攪拌的pH恒定器(350ml體積，pH6.0)(BealletalBiotechnolBioengin38296-303;OhtaetalAppl.EnvironMicnosiol57893-900;和OhtaetalAppl.GwironMicrobiol572810-2815)30℃保溫，發(fā)酵液中含氯霉素或同時含氯霉素和氨芐青霉素。
木聚糖用兩步法來發(fā)酵，先在高溫下降解木聚糖，然后在30℃發(fā)酵。為降解木聚糖，菌體從培養(yǎng)48小時的350ml發(fā)酵液中離心(7，000g，10分鐘)收集細胞，懸浮于等體積含4%木聚糖(pH6.0)的新鮮Luria培養(yǎng)液中，60℃保溫65小時。發(fā)酵液冷卻到30℃后，用重組微生物接種使接種后的O.D.550為0.3。
在不同時間取樣以檢測寡聚木糖苷(薄層層析法)、菌體生長(O.D.550)和乙醇。乙醇用氣液層析法(Dombeketal.Appl.EnvionMicrobiol51197-200)測定。
用于水解木聚糖重組質(zhì)粒的構(gòu)建水解天然木聚糖至少需要兩種酶的活性，即內(nèi)切木聚糖酶和木糖苷酶。構(gòu)建了三個質(zhì)粒應用于木聚糖發(fā)酵，在這些質(zhì)粒中，源于嗜熱菌熱纖維梭狀芽孢桿菌(GrepinetetalJ.Bacteriol.1704582-4588)的xynZ(木聚糖酶)基因和源于溶纖維丁酸弧菌(Utt，見前)的xylB(木糖苷酶和阿拉伯糖苷酶)基因，或單獨表達或組成一個操縱子中表達(圖7A、7B和7C)。
圖7A、7B和7C闡述了載有xynZ和xylB的重組質(zhì)粒的構(gòu)建。編碼區(qū)被框出。熱纖維梭狀芽孢桿菌和溶纖維丁酸弧菌DNA用細線表示，粗線代表載體DNA。平頭連接位點用“X”表示?！癋”標明未改變閱讀框架的lacZ∷xynZ融合基因的編碼區(qū)。
將xyIB基因亞克隆到pUC18中。具體做法是，切下pLOI1001中帶核糖結(jié)合位點和xyIB基因氨基末端0.3kbpXbal-Pst1片段和帶其余xylB基因編碼區(qū)及翻譯終止子的2.4kbpPst1片段，將其插入到pUC18多克隆位點中Xbal到Pst切點之間。得到的質(zhì)粒pLOI2000中l(wèi)ac啟動子控制xylB基因的表達。
以前的研究(Grepinetetal.，見前)已表明缺失了一個編碼分泌信號和木聚糖酶氨基末端大片段的xylB基因與lacZ基因融合，木聚糖酶的表達可被提高。通過將帶有切去氨基端xynZ基因的pCT1202的2.4kbpStyI片段經(jīng)Klenow處理平頭連接到pUC18經(jīng)Klenow處理的Pst1位點上，構(gòu)建了類似的lacZ∷xynZ基因融合體。得到的質(zhì)粒pLOI2001中，兩個基因的閱讀框架互相匹配。
在構(gòu)建木聚糖酶和木糖苷酶編碼基因同時共表達的質(zhì)粒前，有必要除去lacZ∷zynZ編碼區(qū)下游30pb處的轉(zhuǎn)錄終止子并在融合基因3′末端加進一個新的SstI位點。這些修飾利用多聚酶鏈式反應進行。pLOI2001質(zhì)粒為模板，5′-GAATTCGAGCTCGGTAC-3′為5′端引物，5′-GGGAGCTCCGGCATCATTATATCTG-3′為3′端引物(包含一個新SstI位點)。經(jīng)SstI酶切后，該片段分別插入pUC18和pLOI2000的多克隆位點中的SstI位點，分別構(gòu)成質(zhì)粒pLOI2001和pLOI2003。
有關木聚糖降解的酶的表達先測定作為質(zhì)粒構(gòu)建宿主的DH5α菌株在穩(wěn)定生長期菌株中表達的木聚糖酶、木糖苷酶和阿拉伯糖苷酶的活性(表13)。與帶pLOI2001(只攜帶xynZ基因)的菌株相比，帶pLOI2003(在xynZ下游還攜帶xyIB基因)的菌株中木聚糖酶活性下降60%。然而，在分別帶有pLO2000(只攜帶xyIB基因)和帶pLOI2003(xyIB上游還攜帶XynZ基因)的菌株中，木糖苷酶及阿拉伯糖苷酶活性相近。
表13降解木聚糖的重組酶的比活性菌株和質(zhì)粒比活(mU/mg)木糖苷酶阿拉糖苷酶木聚糖木聚糖酶b大腸桿菌DH5a0000pLOI12001.22.200pLOI2001001.4124pLOI20031.52.50.548大腸桿菌KO110000pLOI2001000.438pLOI20031.32.40.325pLOI2003c1.1 1.9 0.3 47pLOI2003c,dnd nd 0.8 93催娩克氏桿菌M5A153000(pLOI555)和pLOI20014900.439pLOI2003562.60.224pLOI2001c30 0 0.7 0pLOI2001c,dnd nd 1.8 144pLOI2003c38 2.9 0.4 58pLOI2003c,dnd nd 0.8 144除特別指明外，細胞在含5%木糖的Luria培養(yǎng)基的擺瓶中生長，20小時后收集(靜止期);木糖苷酶和阿拉伯糖苷酶的活性在30℃測定，木聚糖酶活性在45℃測定。
a木聚糖酶活性以對硝基苯基-β-D-纖維二糖苷作底物而測定b木聚糖酶活性以0.5%樺木聚糖作底物而測定c發(fā)酵結(jié)束后從pH恒定器(8%木糖的Luria培養(yǎng)基pH6.0)中收集細胞。
d木聚糖酶活性在60℃測定將質(zhì)粒pLOI2001和pLOI2003轉(zhuǎn)化到產(chǎn)乙醇基因整合到染色體上的產(chǎn)乙醇菌株E.coliKO11中。比較在振蕩培養(yǎng)穩(wěn)定生長期菌體中以及在發(fā)酵結(jié)束后pH恒定器中的菌體中的表達活性(表13)。木糖苷酶、阿拉伯糖苷和木聚糖酶活性與在DH5α中觀察到的相近，并且在帶pLOI2003(下游攜帶xyIB基因)的菌株中，木聚糖酶活性下降。
同時測定帶pLOI555(攜帶Z.mobilis中產(chǎn)生乙醇基因)的K.oxytocaM5A1菌株中的表達活性。雖然不知道pLOI555的復制子類型，但在衍生自pUC18的另一個質(zhì)粒存在的情況下，pLO555似乎十分穩(wěn)定。其阿拉伯糖苷酶和木糖苷酶活性與在E.coli中觀察到的大致相同。在M5A1中發(fā)現(xiàn)豐富的內(nèi)源木糖苷酶。與pH恒定發(fā)酵液中菌體相比，在振蕩培養(yǎng)的菌體中木糖苷酶活性高一些，而木聚糖酶活性變化正相反。
在所用的測試條件下，阿拉伯苷酶活性比木糖苷酶活性高1.5倍到1.7倍，與已所道(Uttetal，見前)的結(jié)果相同。測定內(nèi)源木聚糖酶的最佳溫度為60℃(Gerpinetetal.，見前)，47℃下測得的活性僅為60℃的一半。從現(xiàn)有數(shù)據(jù)來看，從還原性糖測試算出的融合木聚糖酶比活性比根據(jù)水解對硝基苯基-β-D-纖維二糖苷測得的比活高大約100倍，這表明該酶優(yōu)選利用內(nèi)源底物。
重組菌株在高溫下對木聚糖的水解KO11(pLOI2003)菌株在含8%木糖的pH恒定培養(yǎng)液中進行培養(yǎng)，然后測定其木聚糖水解酶活性。菌體懸浮于等體積含4%木聚糖的新鮮Luria培養(yǎng)液中，在45℃或65℃下培養(yǎng)，前者是溶纖維丁酸弧菌木聚糖酶可穩(wěn)定存在的最高溫度，后者是熱纖維梭狀芽孢桿菌木聚糖酶的最佳溫度。雖然木聚糖酶和木糖苷酶為胞產(chǎn)物，最初的實驗表明它們在45℃和60℃下保溫時易于釋放到培養(yǎng)基中。在不同時間取樣用薄層層析分析水解產(chǎn)物(圖8A和8B)。
圖8A和8B顯示對在45℃(圖8A)或60℃(圖8B)含4%樺木木聚糖的Luria培養(yǎng)基(pH6.0)中培養(yǎng)的E.coliKO11(pLOI2003)菌株水解木聚糖后得到的產(chǎn)物進行的薄層層析分析結(jié)果。每點樣孔加樣1μl，各孔下方是培養(yǎng)的時間(以小時表示)。木聚糖的酸性水解產(chǎn)物做為標準加在第一孔(S)中。
發(fā)酵產(chǎn)物中可鑒定地出木糖、木二糖、木三糖和木四糖，其中木二糖為主要發(fā)酵產(chǎn)物。單體木糖緩慢地積累。對24小時和48小時后水解程度的比較表明，45℃時的水解程度不如60℃，盡管60℃時木糖苷酶不穩(wěn)定。
盡管60℃65小時后木聚糖水解不完全，此時木聚糖酶仍保持較高的活力，用4-甲基傘形糖基β-D-纖維二糖苷作為底物很容易檢測出來。在此溫度下木糖苷酶迅速失活。加入含這兩種酶的細菌裂解液在60℃繼續(xù)保溫24小時，薄層層析結(jié)果表明，木聚糖水解情況不變。因此該寡糖木糖產(chǎn)物是水解Sigma樺木聚糖終極水解產(chǎn)物，可能是氧化型產(chǎn)物或取代成分阻礙其徹底水解。
大腸桿菌和催娩克氏桿菌重組菌株對木聚糖水解產(chǎn)物的利用進行了小規(guī)模試驗，以評估E.coliKO11(pLOI2003)菌株和K.oxytocaM5A1菌株代謝寡糖木糖的程度。將菌株接入1毫升木聚糖水解液(60℃，65小時;離心除去菌體，留取上清)30℃靜止培養(yǎng)48小時。用薄層層析分析樣品(圖9A和9B)。
圖9A和9B顯示了大腸桿菌KO11(圖9A)及K.oxytocaM5A1(圖9B)重組菌株分別利用寡糖木聚生長的情況。木聚糖(4%)與大腸桿菌KO11菌株(攜帶pLOI2003)在LB(pH6.0)共保溫，65小時后，水解液經(jīng)離心后過濾除菌，然后接入細菌，30℃培養(yǎng)。每隔24小時取樣進行薄層層析分析(各取樣時間標于相應點樣孔下方)。在第一孔(S)中加入一種寡糖木聚糖混合物作為標準對照。
盡管有活性溶纖維丁酸弧菌木糖苷酶存在，重組大腸桿菌只代謝木糖。而木糖、木二糖和木三糖均可被產(chǎn)乙醇催娩克氏桿菌完全利用。因此選用催娩克氏桿菌衍生菌進行由木聚糖轉(zhuǎn)變?yōu)橐掖嫉倪M一步研究。
催娩克氏桿菌M5A1衍生菌株對木糖和木聚糖的發(fā)酵木聚糖的發(fā)酵采用兩步法，預先發(fā)酵的菌體被收集后懸浮于含4%木聚酶的Luria培養(yǎng)基進行糖化作用(60℃，65小時)。糖化的木聚糖液接種后在30℃發(fā)酵(pH6.0)。同時進行用作對照的平行試驗，接種前離心除去菌體碎片，發(fā)酵在4.47%的木糖中進行(相當于4%木聚糖中的木糖濃度。這些發(fā)酵的數(shù)據(jù)見表14。
圖10A和10B顯示了催娩克氏桿菌M5A1將木糖和木聚糖轉(zhuǎn)換為乙醇的情況。預先發(fā)酵得到的菌體作為酶源，60℃下水解木聚糖65小時。圖10A顯示菌體的生長，圖10B顯示乙醇的產(chǎn)量。符號▲，M5A1(pLOI555)對4.47%木糖的發(fā)酵;○，M5A1(pLOI555和pLI2001)對4.4%木糖的發(fā)酵;●，M5A1(pLOI555和PlOI2001)對糖化后未除去菌體碎片的4%木聚糖水解液的發(fā)酵;□離心除去菌體碎片后M5A1(pLOI555和pLOI2001)對4%木聚糖水解液的發(fā)酵。
表14重組菌株K.oxytoca M5A1(pLOI555)發(fā)酵木糖和木寡糖的乙醇得率a底物和第二質(zhì)粒堿量時間乙醇得率理論得率VP細胞得率mM/g糖 h g/l g/g底物 (%)d(g/l/h)e(g/g糖)木糖(4.47%)1.23622.60.51991.290.07單獨pLOI555帶pLOI20011.54821.70.49951.020.08帶pLOI20031.33620.60.47910.830.07木聚糖(40%)帶pLOI2001f0.7 24 7.7 0.19 34 0.37 0.04帶pLOI2003f1.3 36 7.7 0.19 34 0.31 0.04帶pLOI2001g1.3 60 7.8 0.20 34 0.28 nd帶pLOI2003g1.1 60 7.9 0.20 35 0.30 nda根據(jù)所加總底物計算
b發(fā)酵中維持pH6.0所消耗的堿量c達到最大乙醇濃度所需時間d理論得率(按重量計算)對木糖是0.51，對木聚糖是0.56e批量發(fā)酵中的最大體積比產(chǎn)量f離心除去糖化碎片的水解液g包含糖化碎片的水解液。
可以看到，M5A1(pLOI555)高效率地生成乙醇。24小時木糖發(fā)酵基本完全，可獲得為理論最大值93%的產(chǎn)量。在pLOI2001或pLOI2003同時存在時，該菌株在木糖中的生長和乙醇產(chǎn)量均會下降。該菌株在攜帶pLOI2001后，所需發(fā)酵時間延長到約36小時，乙醇產(chǎn)量為理論值的91%。這種由單糖生成乙醇產(chǎn)率的下降反映了表達外源酶對重組菌株是額外負擔。
用攜帶質(zhì)粒pLOI2001(含本苷酶基因和重組木聚糖酶基因的M5A1(pLOI555)水解木聚酶(60℃，65小時)。其水解產(chǎn)物的薄層層析結(jié)果表明，水解液成分與KO11(pLOI2003)的(見圖9A和9B)相同。這兩個M5A1衍生的菌對木聚糖水解的程度相同。
水解產(chǎn)物中接入糖化作用時各自的微生物后，測定菌體的生長和乙醇的產(chǎn)量(圖10A和10B)。在澄清水解液中，生長量僅為在同等水平木糖中的一半，而其發(fā)酵速度稍快些，24小時后發(fā)酵基本完全。由木聚糖產(chǎn)生乙醇的得率約為理論最大值的1/3，為7.7到7.9g/l。
發(fā)酵液中的寡聚木糖用薄層層析監(jiān)測，發(fā)酵結(jié)束時各成分的情況與圖9B(48小時)所示的相同，其中木糖、木二糖和木三糖被完成代謝，木四糖和更長的寡糖體仍然存在。
討論由此可見，經(jīng)高度改造的K.oxytocaM5A1菌株既可作為酶源用于多聚體的水解又可用于發(fā)酵木聚糖生成乙醇。該菌體內(nèi)源的胞內(nèi)木糖苷酶的存在及其運輸和代謝寡糖木糖能力，以前從未報道。據(jù)報道，野生型大腸桿菌有纖維二糖磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)和一種胞內(nèi)磷酸纖維二糖酶(Halletal.J.Bacteriol1692713-2717;Krickeretal.Genetics115419-429)。K.oxytocaM5A1在代謝木二糖和木三糖的過程中可能存在類似系統(tǒng)。K.oxytocaM5A1中存在的轉(zhuǎn)運系統(tǒng)和代謝單體、二聚體和三聚體木糖酶，使之在進一步利用乙醇產(chǎn)生所需的生物量方面較大腸桿菌或啤酒酵母系統(tǒng)有很大優(yōu)勢。
以前用遺傳工程手段改造單微生物使之能降解多聚體并產(chǎn)生乙醇時所出現(xiàn)的問題，在使用細胞內(nèi)熱穩(wěn)定蛋白質(zhì)的兩步法發(fā)酵過程中得到了解決。高水平合成分泌蛋白常常會影響正常細胞生理過程，切除N端分泌信號，使酶在細胞內(nèi)表達，這樣，可以緩解這個問題。由于在轉(zhuǎn)換中水解時間是限制因素，高水平的水解酶將最利于在轉(zhuǎn)換過程中最初就最大量地為快速發(fā)酵提供糖分。在需要酶分泌的過程中，起始時酶量水平很低，接近發(fā)酵結(jié)束時，積累達到最高。但是如果用預先發(fā)酵菌體作為酶源，一開始就可以達到最大酶量水平。使用熱穩(wěn)定酶水解除有利于減少污染并提高水解速率外，最大好處在于可從收集菌體中方便地釋放胞內(nèi)酶。
乙醇耐性在降解纖維素和木聚糖的天然微生物中往往是個問題。這些微生物產(chǎn)生的乙醇一般少于20克/升(見TaillezetalApplEnviron.Microbiol.55203-06)。盡管由木聚糖生成乙醇的水平還不高，M5A1(pLOI555)至少能夠從100克/升木糖產(chǎn)生48克/升乙醇(約為理論最大得率的95%)。
從樺木木聚糖產(chǎn)生乙醇的總量比預期低，主要歸因于木聚糖水解不完全。糖化65小時后，似有未降解的寡聚木糖。雖然我們的重組體表達的木聚糖酶水平比Grepinetetal.，(見前)所述的最佳木聚糖酶融合重組體表達的水平低些，但它仍有足夠的表達水平。以105μmoles/分鐘的水解速率，24小時后木聚糖(40克/升;約0.3moles的脫水木糖)應被完全降解為木聚二糖。發(fā)酵所得菌體約4.5g細胞蛋白/升，木聚糖比活性為144μmoles/分鐘/克細胞蛋白，總活性為648umoles/分鐘。65小時后盡管木聚糖酶尚有活性，仍有未降解的寡聚木糖存在，在加入新酶繼續(xù)保溫24小時后，寡聚木糖水平不變。水解不完全可能歸因于寡聚木糖對水解的競爭性抑制。在45℃水解反應中檢測這種競爭性抑制情況，該溫度下木聚糖酶和M5A1中內(nèi)源的代謝木糖、木聚二糖及木聚三糖的酶均保持活性。該條件下的寡糖成分與M5A1發(fā)酵后的寡糖成分相同都還有同樣水平的未降解的木聚四糖和更長的寡糖存在(數(shù)據(jù)未列出)。這些寡糖看來限制水解，但限制水解的基因的實質(zhì)尚屬未知。據(jù)制造商的指標，其樺木聚糖含99%木糖。本發(fā)明的研究者推測此產(chǎn)品含有在貯藏和取代過程中產(chǎn)生經(jīng)堿提取和純化處理后仍然存在的氧化性殘基，(Chesson等J.Sci.Food.Agric341330-1340)。
在美國乙醇發(fā)酵產(chǎn)量約為每年十億加侖(38億立升)(Lynd等Science2511318-1323)。許多細菌，如經(jīng)遺傳改造的催娩克氏桿菌、大腸桿菌、啤酒酵母或運動發(fā)酵單胞菌等，均可用于生產(chǎn)一系列酶蛋白，作為乙醇發(fā)酵的共產(chǎn)物。以每升啤酒2克蛋白的最低細胞得率計算，只要有5%的細胞蛋白獲得轉(zhuǎn)化，就可獲得至少3，800，000千克的酶蛋白共產(chǎn)物。這些酶并不僅限于催化底物解聚以供發(fā)酵用的酶類，也可以包括一些需求量很大的其他酶類，如應用于去污劑工業(yè)、食品工業(yè)、木材制漿業(yè)、或用生物催化劑生產(chǎn)化學藥品的新興工業(yè)等行業(yè)的各種酶。如果這些市場能夠得到發(fā)展，則這些酶的應用價值才會遠遠超過目前用于生產(chǎn)乙醇的價值。
實施例18通過重組催娩克氏桿菌(Klebsiellaoxytoca)，其攜帶有整合在染色體上的運動發(fā)酵單胞菌(Z.mobilis)產(chǎn)乙醇基因和表達熱纖維梭狀芽孢桿菌(Clostridiumthermocellum)熱穩(wěn)定纖維素酶基因的質(zhì)粒，發(fā)酵纖維二糖、無定形纖維素和晶狀纖維素生產(chǎn)乙醇在本實驗中，運動發(fā)酵單胞菌(Z.mobilis)產(chǎn)乙醇基因被整合到催娩克氏桿菌(Klebsiellapneumonia)M5A1菌株染色體上。菌株P2是其中最佳構(gòu)建體，它除了從單體糖還從纖維二糖有效地產(chǎn)生乙醇。該菌株對纖維二糖和纖維三糖的利用，免去了對外源β-葡萄糖苷酶的需要，降低了發(fā)酵SOLKAFLOCSW40(主要為晶狀纖維素)所需商品纖維素酶的用量。加入帶有編碼熱纖維梭狀芽胞桿菌(Clostridiumthermocellum)內(nèi)切葡聚糖酶的基因的質(zhì)粒，導致在發(fā)酵過程中細胞內(nèi)熱穩(wěn)定酶類作為乙醇共產(chǎn)物而積累。最佳構(gòu)建體P2(pCT603T)包含celD基因，它被用來將無定形纖維素水解成纖維二糖，在二步發(fā)酵過程中產(chǎn)生乙醇。也對P2(pCT603T)與商品纖維素酶聯(lián)合應用進行了試驗。在60℃用內(nèi)切葡聚糖酶D對SOLKAFLOCSW40進行預處理，能降低發(fā)酵SOLKAFLOCSW40所需的商品纖維素酶用量，幅度可達80%。內(nèi)切葡聚糖酶預處理產(chǎn)生的促進作用，可能是由于無定形區(qū)域的水解所致，由此暴露出更多的位點而受到真菌纖維素酶的作用。內(nèi)切葡聚糖酶D在熱纖維梭狀芽孢桿菌中作為一復合體的組分行使功能，因此很可能該酶與真菌酶形成復合體，或者與纖維素結(jié)合產(chǎn)生更多的開放結(jié)構(gòu)，進行水解。
實施例17說明了在催娩克氏桿菌M5A1，作為乙醇的共同產(chǎn)物，積累熱纖維梭狀芽孢桿菌木聚糖酶的優(yōu)越性。在本例中，本發(fā)明者將產(chǎn)乙醇基因整合進催娩克氏桿菌M5A1中，并說明產(chǎn)生的細菌能有效地將纖維二糖轉(zhuǎn)化成乙醇。該菌看來能夠轉(zhuǎn)運和代謝纖維二糖和纖維三糖，免去對異源β-葡萄糖苷酶的需要。在該整合體中加入質(zhì)粒，使得與乙醇一起產(chǎn)生熱穩(wěn)定內(nèi)切葡聚糖酶，從而在纖維素發(fā)酵過程中降低對商品纖維素酶的需要。
菌種及生長條件表15列出了本研究所用的新菌種和質(zhì)粒。帶有產(chǎn)乙醇基因的菌種長在含2%葡萄糖的Luria瓊脂板上(3);其他菌株長在不加糖的Luria瓊脂板上。除特地說明外，選擇時使用氯霉素(50μg/ml)，四環(huán)素(6μg/ml)，和氨芐青霉素(50μg/ml)。按常規(guī)，大腸桿菌(E.coli)在37℃培養(yǎng)，催娩克氏桿菌在30℃培養(yǎng)。運動發(fā)酵單胞菌產(chǎn)乙醇操縱子的表達根據(jù)乙醛指示平板顏色出現(xiàn)的快慢來檢測(Conway等J.Bacteriol.1692591-2597)。篩選具纖維素酶活性的菌落，先在含羧甲基纖維素的Luria瓊脂板上，55℃培養(yǎng)1至2小時，然后用剛果紅染色(Wood等Meth.Enzymol.16059-74)。
表15本研究所用菌株和質(zhì)粒細菌菌株/質(zhì)粒特性來源或參考文獻菌株催娩克氏桿菌M5A1 Cmr,petb實施例15(pLOI555)S1 Cmr,Ipeta本實施例S2 Cmr,Ipeta本實施例S3 Cmr,Ipeta本實施例P1 Cmr,Ipeta本實施例P1 Cmr,Ipeta本實施例P2 Cmr,Ipeta本實施例B1 Cmr,Ipeta本實施例質(zhì)粒pCOS2EMBL TcrPoustka et al.cpLOI510 CmrpetbOhta et al.dpCT105 AprcelA+Cornet et al.epCT207 AprcelB+JeffriesfpCT301 AprTcrcelC+Petre et al.gpCT603 AprTcrcelD+Joliff et al.hpCT105T AprTcrcelA+本實施例pCT207T AprTcrcelB+本實施例pCT603T AprTcrcelD+本實施例aIpet表示Z.mobilis pdc和adhB基因整合在染色體上。
bpet表示Z.mobilis pdc和adhB基因在質(zhì)粒pLOI555上。
cPoustka等(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 814129-4133.
dOhta等(1991)Appl.Environ.Microbiol.572810-2815.
eCornet等(1983)Bio/Technology 1589-594.
fJeffries;載于J.F.Kennedy等編《木材與纖維素研究工業(yè)利用，生物工藝學，結(jié)構(gòu)和性質(zhì)》John Wiley & Sons，New York(1988).
gPetre等(1986)Biochimie 68687-695.
hJoliff等(1986)Bio/Technology 4896-900.
遺傳學技術和質(zhì)粒構(gòu)建按照標準方法進行操作。用缺少所有復制功能的環(huán)化DNA轉(zhuǎn)化菌體細胞，從而將pet基因整合進入菌株M5A1，其中所用的環(huán)化DNA包括三個基本組分1)大腸桿菌的pfl基因或M5A1的DNA;2)Z.mobilis的pet基因;3)用于選擇的cat基因。重組子先用20μg/ml氯霉素的培養(yǎng)基選擇，并表達低水平的Z.mobilis酶蛋白。在大腸桿菌的轉(zhuǎn)化子中(Ohta等Appl.Environ.Microbiol.57893-900)，用600μg/ml的氯霉素直接選擇出抗性變種，其外源基因的表達大為增強。保留每一獨立整合一個表現(xiàn)高水平抗性的單菌落。
將四環(huán)素抗性分別加到含celA基因(pCT105)、celB基因(pCT207)和celD基因(pCT603)的質(zhì)粒中。質(zhì)粒pCT105和pCT207以BamHI酶切后，用大腸桿菌DNA聚合酶的Klenow片段處理以獲得平頭末端。質(zhì)粒pBR322經(jīng)EcoRI酶切后以用同樣方法形成平頭末端。這三種質(zhì)粒再以SalI酶切，將得到的pBR322含tet基因5r-末端的小片段連接到由pCT105和pCT207得到的大片段上，形成有功能的tet基因(先因插入熱纖維梭狀芽胞桿菌DNA而失活)，構(gòu)建的質(zhì)粒分別稱為pCT105T和pCT207T。將質(zhì)粒pCOS2EMBL(Poustka等，見前)的一個含完整tet基因的2.5kb EcoRI酶切片段，插入到質(zhì)粒pCT 603中唯一的EcoRI位點上形成質(zhì)粒pCT603T。質(zhì)粒pCT301同時帶有celC基因和功能tet基因，因而無需改造。所有含纖維素酶基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入催娩克氏桿菌重組子，都用四環(huán)素抗性選擇。
纖維素酶活性含菌培養(yǎng)液和無菌培養(yǎng)液的內(nèi)切葡聚糖活性，以對硝基苯-β-D-纖維二糖苷為底物，在60℃測定(Petre等，見前)。內(nèi)切葡聚糖酶D的活性也根據(jù)由無定形纖維素產(chǎn)生還原糖的量來測算。無定形纖維素(酸漲和堿漲)依以前的方法(WoodMeth.Enzymol.16019-25)從SOLKAFLOCSW40制備。還原糖依Nelson-Somogyi方法進行測定(Bergmeyer等pp.151-152，載于BergmeyerH.U.(編)Methodsofenzymaticanalysis(酶學分析方法)VolⅡ.3rdedition(第二卷第三版)，VerlagChemie，Weinheim，Germany.無定形纖維素的起始濃度作為總糖依酚-硫酸法測定(Wood.MethEnzymol.16087-116)。
在含乙醇酶系基因并表達cel基因活性的重組子之間內(nèi)切葡聚糖酶活性的比較依下述方法進行在18mm×150mm培養(yǎng)試管中，先放入約15毫升的用10%低粘度羧甲基纖維素(SigmaChemicalCompany，St.Louis，Mo.)固化的LB培養(yǎng)基，再鋪以2ml的靜止期培養(yǎng)液。在55℃培養(yǎng)48小時后，通過倒轉(zhuǎn)試管來確定液化程度。
纖維素水解產(chǎn)物依前述測定木糖苷和木聚糖水解物的方法，用薄層層析法分析(Domer等Meth.Enzymol.160355-362)。葡萄糖、纖維二糖和纖維三糖可與寡糖分開。用纖維二糖和葡萄糖作標準。
發(fā)酵實驗發(fā)酵在帶pH恒定器的500mlFleaker中進行，發(fā)酵體積350ml，基本按照以前所述進行(Beall等，見前)。用含10%葡萄糖或10%纖維二糖的Luria培養(yǎng)基在30℃、pH6.0、100rpm轉(zhuǎn)速條件下進行試驗。發(fā)酵種子培養(yǎng)物生長在含50mlLuria培養(yǎng)基(含4%葡萄糖)的250ml燒瓶中，30℃靜止培養(yǎng)過夜?；旌虾?，在550nm下測菌體濃度，以計算所需體積，使起始菌濃度為0.32mg細菌干重/ml(O.D.550nm＝1.0)。離心收集這部分體積的菌體，以各pH恒定培養(yǎng)器中的少量培養(yǎng)液懸浮開始發(fā)酵。
糖溶液通過過濾單獨進行滅菌。纖維素發(fā)酵包含50克/升SOL-KAFLOCSW40(購自JamesRiverCorporation，SaddleBrook，NJ)，在35℃進行。纖維素以干粉形式高壓滅菌。為考察商品酶類在纖維素發(fā)酵中的效用，在接種時另加了CYTOLASE或MULTIPECT。
取樣后測定其中的菌體數(shù)(O.D.550nm)和乙醇量(氣相液相層析;依Beall等，見前)。乙醇濃度以克/升表示。由于發(fā)酵過程中加堿增大了發(fā)酵的體積因此乙醇得率要作校正并參照總糖或纖維素的起始濃度進行計算。糖殘基無需校正。經(jīng)糖酵解和發(fā)酵的乙醇最大理論得率為0.51克/克葡萄糖、0.536克/克纖維二糖、0.56克/克纖維素。除特別指出的以外，結(jié)果均為兩次或更多次發(fā)酵的平均值。
商品纖維素酶檢測了兩種商品纖維素酶，即CYTOLASEM104和MULTIFECTCL(GenencorInternational，RollingMeadows，IL)。兩種酶都以溶液狀態(tài)提供，估計為來自經(jīng)適當修改的Trichodermalongibranchiatum變種培養(yǎng)液。按說明書，兩種酶皆為包括果膠酶、纖維素酶、半纖維素酶的混合物。這些酶制劑目前經(jīng)改造用于食品加工。
運動發(fā)酵單胞菌(Z.mobilis)pet基因整合到M5A1染色體上有三種途徑可將pet基因整合到M5A1的染色體中(OrsdovP461-465，載于N.R.Kreig和J.G.Holt編《伯杰氏手冊》第一卷。由于催娩克氏桿菌的大腸桿菌和親緣性很近，可將大腸桿菌的pfl基因作為潛在的同源DNA，以促進類似用于大腸桿菌的方法中的重組過程(Ohta等，Appl.Environ.Microbiol.57893-900)。從質(zhì)粒pLOI510中，分離出攜帶位于大腸桿菌(E.coli)pfl基因中的pet基因和cat基因的8.6kbSalI酶切片段。此片段(不含與復制有關的基因)經(jīng)連接環(huán)化后，轉(zhuǎn)入M5A1并直接選擇獲得整合的重組子。也可以分離僅包括大腸桿菌pfl基因兩側(cè)較短序列的一個5kb的PstI酶切片段用同樣方法整合。第三種方法是將催娩克氏桿菌M5A1的同源DNA(2kb長Sau3A隨機酶切片段)連接到一個4.6kb長的只含有pet基因和cat基因(非大腸桿菌DNA)的BamHI酶切片段用于細菌轉(zhuǎn)化。在三種方法中，都用含2%葡萄糖和20μg/ml氯霉素的LB固體平板來選擇已整合的菌株。經(jīng)SalI酶切的片段獲得3個整合菌株，Pst片段處理的得到2個整合菌株，BamHI片段的整合菌株只挑到一個。
在液體培養(yǎng)液中過夜培養(yǎng)后，取0.1ml的靜止期細菌在含600μg/ml氯霉素和2%葡萄糖的固體平板上涂布，以挑選高表達的菌株。保留來自各個獨立的整合形態(tài)較大的單菌落，并根據(jù)構(gòu)建時所用的內(nèi)切酶而進行編號，即S1、S2、S3、P1、P2和B1。對這些單菌落再進行小量制備DNA的轉(zhuǎn)化試驗以確定質(zhì)粒的存在，并進行乙醛指示劑平板上的pet基因表達實驗(表16)。抽取重組菌落DNA，若經(jīng)酶切后證實了存在pLOI510(估計凝膠電泳純化片段中有少量污染)，則棄去該帶攜帶cat基因的質(zhì)粒的假整合菌株。出發(fā)菌株和M5A1(pLOI555)(后者為理想的產(chǎn)乙醇菌)在實驗中分別作為負、正對照菌株。菌株B1和P2表達的產(chǎn)乙醇基因活性水平接近M5A1(pLOI555)。
表16含整合的pet基因的M5A1菌株在10%葡萄糖環(huán)境中(48小時)的發(fā)酵反應菌株a堿菌體量b乙醇量乙醛平板反應c質(zhì)粒d(mM/L)(g/L)(g/L)M5A11083.215--M5A1915.145+++++(pLOI555)S11202.937+-S21713.244++-S3972.437++-
P11202.038++-P2913.744+++-B1634.047++++-a提供的數(shù)據(jù)多為一次實驗得到的結(jié)果。其中某些數(shù)據(jù)在后繼試驗中經(jīng)過重復和平均處理。
b菌體量根據(jù)O.D.550nm處的最大值計算(干重約0.32克/升/O.D.單位。
c以30℃中乙醛指示劑平板上顏色形成的相對速度作為pet操縱子表達的相對測定值。
d在瓊脂糖凝膠上測定DNA的小量制備，并檢測其在轉(zhuǎn)化過程中將對抗生素的耐藥性轉(zhuǎn)移給大腸桿菌DH5α的能力整合菌株與M5A1(pLOI555)菌株葡萄糖發(fā)酵的比較培養(yǎng)48小時后，有四株整合了pet基因的菌株產(chǎn)生與M5A1(pLOI555)同樣高水平的乙醇(見表16)。其中兩株菌長到最大密度，產(chǎn)生的酸性共產(chǎn)物最少，這兩株命名為P2和B1的菌被挑選出來作進一步考察。
菌株P2和B1的葡萄糖發(fā)酵和纖維二糖發(fā)酵檢查了菌株P2和B1發(fā)酵10%葡萄糖和10%纖維二糖的能力(見表17)。在葡萄糖發(fā)酵過程中(見表17A)，這兩株整合菌株都能產(chǎn)生比出發(fā)菌M5A1高3倍的乙醇量，但在乙醇的得率和體積比產(chǎn)量方面都略低于菌株M5A1(PLOI555)(含質(zhì)粒攜帶的pet基因)。出乎意料的是，菌株B1中pet基因的整合及高水平表達，卻伴隨著發(fā)酵纖維二糖的能力的喪失。而菌株P2在纖維二糖存在時生長良好并生成乙醇(見圖11B)，其得率達到理論最大值的96%。
圖11A和圖11B說明了各個催娩克氏桿菌M5A1的重組菌株產(chǎn)生乙醇的情況。圖11A顯示了由葡萄糖(100克/升)獲得的乙醇量。圖例說明●，菌株M5A1(pLOI555);▲，整合了pet基因的P2菌株;■，整合了pet基因的B1菌株;○，對照菌M5A1。圖11B顯示了P2菌株經(jīng)纖維二糖發(fā)酵的乙醇產(chǎn)生。圖例說明▲，乙醇量;△，細胞量。

a葡萄糖和纖維素二糖的發(fā)酵在30℃進行;其它的發(fā)酵過程在35℃進行;
b酶在接種的同時加入。
c在6至24小時之間計算。
d對發(fā)酵中用于稀釋的堿液進行校正。S(底物)代表葡萄糖、纖維素二糖或SOLKA FLOC SW40。
e計算時以最大理論得率為51克乙醇/100克葡萄糖，53.5克乙醇/100克纖維素二糖，28克乙醇/50克纖維素。未對底物殘基進行數(shù)據(jù)校正。
fSOLKA FLOC SW40經(jīng)由預發(fā)酵收集的細胞在60℃預處理12個小時。預發(fā)酵可獲得熱纖維梭狀芽孢桿菌celD產(chǎn)物。冷卻至35℃后在培養(yǎng)液接入菌液并加入1%體積比的商業(yè)纖維素酶開始發(fā)酵。
在不同濃度的商品纖維素酶存在下，催娩克氏桿菌M5A1重組菌株與大腸桿菌對結(jié)晶態(tài)纖維素(SOLKAFLOCSW40)發(fā)酵的比較含產(chǎn)乙醇基因的大腸桿菌只能利用葡萄糖。催娩克氏桿菌的重組子P2與此不同，它還能發(fā)酵纖維二糖，并不需外源β-葡萄糖苷酶。為測定利用纖維二糖對從用商品酶由纖維素生產(chǎn)乙醇的產(chǎn)量提高程度，發(fā)酵以50克SOLKAFLOCSW40為底物，在含有0-10%的CYTOLASE或MULTIFECT溶液中進行(見圖12和表17)。這兩種酶制劑都含有一套包括內(nèi)切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶在內(nèi)的真菌酶混合物。
圖12顯示發(fā)酵120小時后添加了商品纖維素對酶由每升發(fā)酵液中50克SOLKAFLOCSW40轉(zhuǎn)化的乙醇得率的影響。虛線表示僅由添加的纖維素轉(zhuǎn)化的乙醇最大產(chǎn)量。較高水平的乙醇生成主要是由于加入了適當改進后的MULTIFECTCL制劑作為額外底物。圖例說明▲，催娩克氏桿菌與MULTIFECT的發(fā)酵;■，大腸桿菌KO11菌株MULTIPECT的發(fā)酵;△，催娩克氏桿菌與CYTOLASE的發(fā)酵;□，大腸桿菌KO11菌株與CYTOLASE的發(fā)酵。
在低濃度時，CYTOLASE的作用似更為有效，但高濃度的制劑，對細菌有某種毒害作用。在所有實驗中，催娩克氏桿菌整合菌株表現(xiàn)的性質(zhì)要比大腸桿菌KO11菌株為佳，盡管有β-葡萄糖苷酶的商品纖維素酶制劑存在。綜合上述結(jié)果，說明市購纖維素酶制劑中的β-葡萄糖苷酶相對于其它的纖維素酶活性而言，其活性并未達至飽和狀態(tài)。
在最大濃度的MULTIFECT存在時，觀察到由纖維素(50g/L)取得的乙醇得率超過了理論最大值。為研究這部分額外乙醇的代謝來源，發(fā)酵作用在不加糖或酶的LB培養(yǎng)液及加10%CYTOLASE或10%MULTIFECT但不加糖的LB培養(yǎng)液中分別進行。在單獨LB培養(yǎng)條件下均產(chǎn)生1克/升乙醇，而在添加10%纖維素酶的培養(yǎng)條件下產(chǎn)生的乙醇量約為5克/升。因而在含10%MULTIFECT的發(fā)酵作用中，產(chǎn)生的乙醇中有大約4克/升的量來源于對商品添加劑或酶穩(wěn)定劑的利用。還可能由低濃度纖維素酶產(chǎn)生一定比例的乙醇。扣除可能由LB組分和10%MULTIFECT轉(zhuǎn)化成的乙醇，纖維素發(fā)酵的乙醇得率約為理論最大值的94%。
熱纖維梭狀芽孢桿菌的纖維素基因在P2菌株中的表達纖維二糖能被菌株P2段利用，也是內(nèi)切葡聚糖酶和外切葡聚糖酶催化的纖維素酶解反應的主要產(chǎn)物。雖然本發(fā)明中所用的菌株都不能合成這兩種酶。但在把pet基因整合到染色體上后，有利于引入包含編碼這些酶的異源基因的質(zhì)粒，從而在發(fā)酵過程以共產(chǎn)物形式合成這兩種酶。在進行了四環(huán)素抗性選擇之后，又對嗜熱菌熱纖維梭狀芽孢桿菌的四種內(nèi)切葡聚糖酶的表達進行了檢測。celD基因在大腸桿菌中的表達水平非常高，在P2菌株的表達也較強。菌體細胞保持了大部分由這些基因產(chǎn)生的內(nèi)切葡聚糖酶活力，盡管已知克氏細菌菌株具有蛋白質(zhì)分泌系統(tǒng)而不排除有部分酶分泌到胞外。
對CMC液化效應的定性比較在55℃生長48小時內(nèi)的試管培養(yǎng)物中進行，其結(jié)果與活性檢測定的結(jié)果一致，即帶celD基因(pCT603T)的重組菌株最為有效，其次是帶celC基因(PCT301)的重組菌株。帶celB基因(pCT207T)的P2菌株生長情況很差，未作進一步的測試。celA(pCT105T)重組子只有輕微的液化效應。
對異源基因產(chǎn)物的合成對發(fā)酵作用的影響也作了研究。在獲得了可表達任何cel基因的質(zhì)粒后，菌體在10%葡萄糖發(fā)酵中最終細胞濃度下降10-30%，乙醇產(chǎn)量也有所下降(見表18)。celD基因的表達對細胞損害最小，此時產(chǎn)率為每克葡萄糖0.32克乙醇，是理論最大值的62%。測定在60℃中以對-硝基苯-β-D-纖維二糖苷為底物進行，單位為每分鐘里每毫升含菌培養(yǎng)液或經(jīng)離心除菌的培養(yǎng)液中生成水解物的微摩爾數(shù)。
表18熱纖維梭狀芽孢桿菌內(nèi)切葡聚糖酶基因在P2菌株中的表達基因質(zhì)?；钚?單位/毫升)菌體+培養(yǎng)液培養(yǎng)液相關細胞百分比對照無0.2celApCT105T2.30.483celBpCT207T170.895celCpCT301416.285celDpCT603T491373表達celD基因的P2菌株對無定形纖維素的水解和發(fā)酵利用celD基因的產(chǎn)物不能水解結(jié)晶形纖維素，但已知此酶能水解無定形纖維素(Beguin等，Joliff等，前述)。測試了表達該基因的菌株P2(pCT603T)轉(zhuǎn)化無定形纖維素生成乙醇的能力。通過兩步法批量發(fā)酵，檢測了經(jīng)磷酸或堿液(氫氧化鈉)漲泡處理的SOLKAFLOCSW40生成乙醇的情況，在此實驗中預先葡萄糖發(fā)酵，獲得P2(pCT603T)菌體，以提供內(nèi)切葡聚糖酶D，再用該菌體發(fā)酵產(chǎn)生乙醇。
反應的第一步是將細菌在3ml含76mg/ml酸漲纖維素或32mg/ml堿漲纖維素的LB培養(yǎng)液中，在60℃(pH6.0)培養(yǎng)72小時，所用細菌先經(jīng)等體積的葡萄糖發(fā)酵后收集獲得。加熱到60℃，使細胞失活，釋放內(nèi)切葡聚糖酶D，同時也為酶作用提供近似最適溫度。水解過程中檢測還原性糖的釋放量。雖然底物濃度不同一樣，但酸漲纖維素的水解是堿漲纖維素的兩倍，在培養(yǎng)24小時后分別產(chǎn)生240μmolar當量的60μmolor當量的纖維二糖。纖維素經(jīng)堿漲后十分粘稠，使取樣比較困難。對堿漲纖維素酶解72小時后，可產(chǎn)生110μmolar當量的纖維二糖。上述結(jié)果都表明經(jīng)酸漲或堿漲處理的纖維素，其水解都比較完全。
圖13A、B、C為纖維素經(jīng)菌株P2(pCT603T)水解和發(fā)酵利用后的薄層層析分析結(jié)果。對酸漲纖維素(圖13A)、堿漲纖維素(圖13B)和結(jié)晶形纖維素(圖13C;SOLKAFLOCSW40)都做了檢查。每張圖中的第一條道為纖維二糖和葡萄糖的標準樣品。圖13A和B中，由第二至第六條道分別為水解無定形纖維素過程中同時間取的樣(分別為0、6、12、24、48和72小時);第七條道為第六條道好樣品培養(yǎng)液與菌株P2(pCT603T)在30℃發(fā)酵24小時后的獲取的樣品。
圖13C為結(jié)晶形纖維素(SOLKAFLOCSW40)經(jīng)1%MULTIFECT和表達熱纖維梭狀芽孢桿菌celD基因活性的PZ(pCT603T)菌共同發(fā)酵后的薄層層析結(jié)果。每條道樣品分別為2，酶解前新配的SOLKAFLOC懸液;3，經(jīng)內(nèi)切葡聚糖酶D60℃酶解24小時的培養(yǎng)液;酶由經(jīng)預發(fā)酵的P2(pCT603T)提供;4，第三條道樣品再經(jīng)P2(pCT603T)菌發(fā)酵24小時;5，再經(jīng)P2(pCT603T)菌35℃35℃發(fā)酵24小時(總發(fā)酵時間48小時)后的樣品。
總之，圖13A和13B中第二至第六條道分別顯示了經(jīng)酸漲和堿漲處理的纖維素在不同時間的酶解產(chǎn)物情況。纖維二糖在兩種情況下都是主要的產(chǎn)物，同時還產(chǎn)生少量的葡萄糖。對酸漲纖維素酶解后還有少量的纖維三糖形成。將這些培養(yǎng)液冷卻至35℃后，接入50微升的P2(pCT603T)菌，在靜止和pH不控制的條件下發(fā)酵24小時。在此期間葡萄糖、纖維二糖和纖維三糖(見圖13A和B中的第7孔帶)，得到約5克/升的乙醇產(chǎn)物。在堿漲纖維素中，乙醇產(chǎn)量為0.16克/克纖維素。pH的下降可能會抑制乙醇的生成，但乙醇得率達到了理論最大值的27%。
以熱纖維梭狀芽孢桿菌內(nèi)源的內(nèi)切葡聚糖酶部分替代商品纖維素酶P2(pCT603T)菌株并不需要另加β-葡萄糖苷酶，其本身即能形成內(nèi)切葡聚糖酶D來水解無定形纖維素，但當水解結(jié)晶態(tài)纖維素時則要求其它酶活性。在兩步法發(fā)酵中，測試了此菌株部分替代商品纖維素酶的能力。預經(jīng)葡萄糖發(fā)酵的菌體細胞經(jīng)收集后懸浮在等體積含50克/升SOLKAFLOCSW40的LB培養(yǎng)液中，在60℃培養(yǎng)24小時后冷卻至35℃，再接入同一菌株，并加入1%商品纖維素酶。對CYTOLASE和MULTIFECT都得到相近的結(jié)果，乙醇得率為17.4克/升，為理論最大值的65%(見表17)。
如圖14所示，使用CYTOLASE情形下，以celD基因產(chǎn)物進行預處理可大大提高利用1%纖維素酶產(chǎn)乙醇量，所得乙醇得率相當于5%CYTOLASE的乙醇得率。圖14中，纖維素(50克/升的SOLKAFLOCSW40)經(jīng)CYTOLASE和內(nèi)切葡聚糖酶D不完全糖化作用后，由P2菌株和P2(pCT603T)菌株發(fā)酵。圖例說明△，在接種時每100毫升培養(yǎng)液加入5毫升CYTOLASE，P2菌進行發(fā)酵;□，在接種時每100毫升培養(yǎng)液加入1毫升CYTOLASE，P2菌進行發(fā)酵;○，在接種時每100毫升培養(yǎng)液加入0.1毫升CYTOLASE，P2菌進行發(fā)酵;□，SOLKAFLOCSW40經(jīng)P2(pCT603T)菌株60℃預處理12小時后進行發(fā)酵，菌株經(jīng)預發(fā)酵作用以提供熱纖維梭狀芽孢桿菌內(nèi)切葡聚糖酶D。冷卻至35℃后，加入P2(pCT603T)菌株和每100ml發(fā)酵液含1ml的商品纖維素酶，開始發(fā)酵。
圖13C顯示了用MULTIFECT在兩步法發(fā)酵的不同階段中取樣的薄層層析結(jié)果。葡萄糖、纖維二糖和纖維三糖同樣被完全代謝。因而經(jīng)由第一步發(fā)酵中以乙醇共產(chǎn)物產(chǎn)生了內(nèi)切葡聚糖酶D的重組菌株預處理后，糖化作用所需的商品素酶用量可最多可減少80%。
討論已知由β-葡萄糖苷酶催化的從纖維二糖到單糖的水解反應通常會限制真菌培養(yǎng)液對纖維素的水解。在有效水解纖維素所需的關鍵酶中，β-葡萄糖苷酶活性通常最少，同時也最不穩(wěn)定。纖維素酶水解產(chǎn)物纖維二糖的積累是寡聚糖進一步水解的競爭性抑制物(Eriksson等Microbiolandenzymaticdegradationofwoodandwoodcomponents.Springer-Verlag，NewYork;Jeffries，見前)。催娩克氏桿菌P2菌株是最先報道的能快速有效地轉(zhuǎn)化纖維二糖生成高水平乙醇的細菌。
這種細菌似乎能夠主動轉(zhuǎn)運纖維二糖和纖維三糖，從而降低了纖維二糖的積累，不需再加入外源酶進一步解聚。對催娩克氏桿菌中的纖維素二糖轉(zhuǎn)運系統(tǒng)未作研究(AlJ.Biotechnol.1279-86)，但與其親緣關系很近的大腸桿菌攜有編碼磷酸轉(zhuǎn)移酶組分和磷酸葡萄糖苷酶的基因，這兩種酶在纖維二糖的代謝中發(fā)揮作用，大多數(shù)實驗用菌株中該代謝是隱性的，但在自然界的微生物中發(fā)揮作用(Hall等J.Bacteriol1692713-2717;Kricker等。Geneties115419-429)，在催娩克氏桿菌中可能是相似的基因在起作用(Al，同前述)。
乙醇產(chǎn)生有關因整合到染色體后，有利于乙醇發(fā)酵的同時合成由質(zhì)粒編碼的重組蛋白。熱纖維梭狀芽孢桿菌纖維素酶基因的應用只是一個例子，其它更多的有價值的重組蛋白，如脂酶、蛋白酶、糖水解酶、動物激素和生物醫(yī)學產(chǎn)物等均可通過同樣的方法生產(chǎn)。用P2菌株生成熱纖維梭狀芽孢桿菌纖維素酶作為共產(chǎn)物的同時，發(fā)酵效率意外地出現(xiàn)下降。這種現(xiàn)象的原因尚不清楚，盡管本發(fā)明在帶熱厭氧細菌(Thermoanaerobiumbrockii)支鏈淀粉酶基因的產(chǎn)乙醇大腸桿菌和表達熱纖維梭狀芽孢桿菌木聚糖酶基因的多質(zhì)粒產(chǎn)乙醇催娩克氏桿菌改造菌株中，也觀察到同樣的現(xiàn)象。
由此，以前述實施例中的催娩克氏桿菌為基礎，改進由纖維素轉(zhuǎn)換生成乙醇的途徑。已知纖維二糖和纖維三糖是內(nèi)切葡聚糖酶和外切葡聚糖酶的抑制物，而β-葡萄糖苷酶催化這些寡糖向葡萄糖單體的轉(zhuǎn)變。但產(chǎn)乙醇重組菌株，如P2菌株，代謝時不需糖的解聚過程，因而不需β-葡萄糖苷酶，同時也減少了纖維二糖和纖維三糖對纖維素酶的末端產(chǎn)物抑制作用。使用該菌株的另一個優(yōu)點是減少了污染的可能性，因為相對而言能利用纖維二糖或纖維三糖的細菌比能利用單體葡萄糖的菌種要少得多。比起不能利用纖維二糖的大腸桿菌KO11，催產(chǎn)克氏桿菌所表現(xiàn)的轉(zhuǎn)運和分解纖維二糖及纖維三糖的功能減少了在纖維素發(fā)酵過程中對商品酶類的需求量。
通過利用補充的發(fā)酵共產(chǎn)物內(nèi)切葡聚糖酶，商品纖維素酶的用量可以進一步減少。從這個角度出發(fā)，熱穩(wěn)定酶顯然特別有用，因為該酶在發(fā)酵后的菌體中大量存在，只須升高溫度便可以活性形式從菌體釋放出來，并在該溫度下活性最大。將SOLKAFLOCSW40經(jīng)預發(fā)酵合成的內(nèi)切葡聚糖酶的預處理，可以大大提高Genencor纖維素酶的效率。由于內(nèi)切葡聚糖酶D只對纖維素的無定形區(qū)域有催化活性(Beguin等，同前述)，因此上述預處理有利于形成商品纖維素酶作用新位點。在熱纖維梭狀芽孢桿菌中，內(nèi)切葡聚糖酶D為纖維素酶復合體的組份(Beguin等，見前)。該酶也有可能與真菌性酶復合在一起或結(jié)合了纖維素，因而有利于打開纖維素的結(jié)構(gòu)，進行水解。
P2(pCT603T)菌株為所構(gòu)建的由纖維素發(fā)酵生成乙醇的最佳菌株，但其效率不如出發(fā)菌株熱纖維梭狀芽孢桿菌(Tailliez等Appl.Environ.Microbiol.55203-211)。催娩克氏桿菌的P2(pCT603T)菌株不象熱纖維梭狀芽孢桿菌，它沒有完整的纖維素酶系統(tǒng)，但在與1%的商品CYTOLASE或MULTIFECT共同發(fā)酵后，P2(pCT603)在35℃發(fā)酵所產(chǎn)生的乙醇得率和最終濃度都比熱纖維梭狀芽孢桿菌耐乙醇突變株在65℃發(fā)酵的高。該菌株在遺傳性和工藝方面還可做進一步的改進。
實施例19利用染色體上整合有運動發(fā)酵單胞菌(Z.mobilis)的產(chǎn)乙醇基因和質(zhì)粒上攜帶有能表達熱穩(wěn)定糖化蛋白的基因的大腸桿菌重組子從淀粉發(fā)酵生產(chǎn)乙醇產(chǎn)乙醇的大腸桿菌菌株經(jīng)改造后能在細胞內(nèi)表達可糖化淀粉的熱穩(wěn)定酶。發(fā)酵結(jié)束后，將收集的含這些酶細胞加熱至酶呈最大活性的溫度(60-70℃)，以釋放出糖化酶。這些微生物可作為酵母發(fā)酵中酶的來源，而只產(chǎn)生少量乙醇共產(chǎn)品。
本例中，利用大腸桿菌中缺乏蛋白質(zhì)分泌系統(tǒng)這個優(yōu)勢從而發(fā)展出了能在細胞內(nèi)表達熱穩(wěn)定的α-淀粉酶和幾丁質(zhì)酶的產(chǎn)乙醇菌株。發(fā)酵結(jié)束后收集這些細胞并加熱至酶呈最大活性的溫度，以釋放熱穩(wěn)定的酶來糖化淀粉。
菌株和生長條件所有乙醇發(fā)酵都用大腸桿菌KO11(Ohta等，1991，見前)在含糖的Luria培養(yǎng)基中進行。菌株中所帶質(zhì)粒均標出。
質(zhì)粒構(gòu)建用標準方法構(gòu)建了兩個質(zhì)粒pLOI140和pLOI141(圖15A和B)，它們帶有嗜熱脂肪芽孢桿菌的α-淀粉酶基因[Mielenz等(1985)，美國專利號4，493，893]和熱厭氧細菌(Thermoanaerobium brockii)的支鏈淀粉酶基因[Coleman等(1986)美國專利號4，612，287;Coleman等(1987)J.Bacteriol 1694302-7]。質(zhì)粒pWL625Amy(ATCC31，791)上帶有淀粉酶基因的一段長5.4kb的Hind Ⅲr酶切片段被插入經(jīng)部分酶切后的pCPC90Z[Cole，an等(1986)見上]的Hind Ⅲ位點。在含淀粉和支鏈淀粉的Luria平板上比較后得知，只有在一個位點插入后得到的質(zhì)粒能夠同時高水平表達兩個基因，這個質(zhì)粒命名為pLOI568。用EcoRI酶部分酶切pLOI568后，將質(zhì)粒pCOS2EMBL[Poustka等(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 814129-33]上一段帶四環(huán)素抗性基因的長2.5kb的EcoRI酶切片段插入形成質(zhì)粒pLOI140和pLOI141。最后的質(zhì)粒帶有pBR322的復利子，在菌株KO11中非常穩(wěn)定，在不加抗菌素的條件下生長48代后仍有96%的細胞帶有該質(zhì)粒。
圖15A和B所用的縮寫是amy，編碼嗜熱脂肪芽胞桿菌(Bacillusstearothermophilus)α-淀粉酶的基因;pul，編碼熱厭氧細菌(Thermoanaerobiumbrockii)支鏈淀粉酶的基因;tet，四環(huán)素抗性基因;amp，氨芐青霉素抗性基因;ori，colE1復制子。
發(fā)酵和分析發(fā)酵基本按照以前所述方法(Beall等，見上)在500ml搖瓶中進行，搖瓶作為pH恒定器(工作體積350ml)。培養(yǎng)基包含Luria培養(yǎng)基，分別加上10%葡萄糖、5%葡萄糖、10%麥芽糖、5%麥芽糖或4.5%淀粉(30℃發(fā)酵，pH6.0，100rpm)。發(fā)酵所接種的細胞濃度是0.03毫克干重/毫升。糖另外用過濾法滅菌。淀粉不滅菌。
細胞量測定其O.D.550值(1O.D.相當于0.32克細胞干重/升)?？偺腔钚杂迷?0℃發(fā)酵測定還原的糖量來決定(Bergmeyor等，見前)。乙醇用氣液層析測定(Dombek等，見前)。乙醇濃度用克/升來表示。乙醇得率通過在發(fā)酵過程中加入堿來校正稀釋，并按總糖量或總淀粉量來計算，而不計沒有使用的糖量。理論上發(fā)酵的最大得率約是0.51克乙醇/克葡萄糖、0.53克乙醇/克麥芽糖和0.56克乙醇/克淀粉。結(jié)果由兩次或多次發(fā)酵的平均值而得到。
淀粉發(fā)酵為了發(fā)酵淀粉，收集預先在10%葡萄糖中發(fā)酵了72小時的KO11(pLOI140)和KO11(pLOI141)細胞并冰凍保存。把這些細胞懸浮在25毫升pH值為6.0的Luria培養(yǎng)基中，15.75克淀粉懸浮于325mlpH值為6.0的Luria培養(yǎng)基中。加一半細胞懸浮液到淀粉懸浮液，在沸水中攪拌保溫至70℃并在70℃保溫5分鐘。混合物冷卻至60℃，加入其余的細胞并在60℃繼續(xù)保溫24小時。加熱可使重組大腸桿菌失活并釋放出熱穩(wěn)定的酶水解淀粉。糖化后的淀粉冷卻至30℃并用無菌蒸餾水調(diào)節(jié)體積到350ml。
接種物在5%葡萄糖中過夜生長后離心收集，并用來起始發(fā)酵(0.03克活細胞干重/升)。取樣以檢查乙醇的發(fā)酵并用薄層層析分析。
使用未活化的Whatman150A硅膠板(Whatman公司，Clifton，NewJersey)分離葡萄糖、麥芽糖和麥芽三糖。分離在室溫進行，用1微升樣品，其中含糖5-50微克。分離在丙酮、乙酸乙酯和乙酸的混合物(2∶1∶1)中進行，該混合物使用前加入2%的水。干板染色見Bounias(1980)Anal.Biochem.106291-5。淀粉和糖來自Sigma化學公司(St.Louis，Mo)。
用重組大腸桿菌菌株發(fā)酵葡萄糖和麥芽糖觀察菌株KO11發(fā)酵葡萄糖和麥芽糖的情況，結(jié)果見圖16A和B，其分別反映乙醇產(chǎn)量和細胞量。圖中所用符號為●，在10%葡萄糖中的菌株KO11;△在10%葡萄糖中的菌株KO11(pLOI140);□，在10%葡萄糖中的菌株KO11(pLOI141);○，在5%麥芽糖中的菌株KO11(5%和10%麥芽糖結(jié)果相同)。
雖然有氧培養(yǎng)時大腸桿菌利用麥芽糖的情況研究得很清楚，在麥芽糖中菌的生長和乙醇產(chǎn)量都較在葡萄糖中慢。在10%麥芽糖中的得率少于最大理論得率(53.5克乙醇/升)的25%，在5%的麥芽糖中得率少于最大理論得率(26.8克乙醇/升)的50%。因為在兩種麥芽糖濃度中獲得的結(jié)果相似，所以不可能是由于麥芽糖的直接毒性導致較慢地生長和發(fā)酵。麥芽糖與葡萄糖相比發(fā)酵較慢，可能是由于其它限制如糖運輸和葡萄糖磷酸化等。
如圖16A和B，加入編碼α-淀粉酶和支鏈淀粉酶的質(zhì)粒pLOI140和pLOI141后，菌株KO11在葡萄糖中的生長速率和乙醇產(chǎn)量都有降低。72小時后的細胞得率和乙醇得率均降低約1/3。
糖化酶的表達用在Luria培養(yǎng)基(pH6.0)中的土豆淀粉懸浮液作底物(70℃)，發(fā)酵結(jié)束后(72小時)還原多糖的釋放量可用于測定菌株KO11(pLOI140)和KO11(pLOI141)的總糖化活性。兩個菌的活性相似，為30微摩爾還原糖/毫升培養(yǎng)液/分鐘。其中90%以上是細胞內(nèi)活性，但加熱到70℃后，這些活性很容易被釋放出來。
淀粉發(fā)酵在兩步法中試驗菌株KO11(pLOI140)和KO11(pLOI141)，其中的微生物既能產(chǎn)生糖化酶又能表達產(chǎn)乙醇酶。收集在10%葡萄糖中預發(fā)酵細胞，懸浮后作為酶源來水解等體積4.5%淀粉的冷懸浮液(Luria培養(yǎng)基，pH6.0)。加入一半收集的細胞，混合物很快加熱到70℃并在水浴中70℃保溫約5分鐘?；旌衔镆频?0℃，加入另一半細胞以利于水解，分別測試了玉米、土豆、水稻和小麥的淀粉，其結(jié)果相似。在加熱和水解過程中淀粉懸浮液保持液體狀。與此相對，使用不帶淀粉基因的KO11菌株，加熱后三分鐘內(nèi)淀粉懸浮液完全固化。
在60℃保溫24小時后，將含有水解淀粉的Luria培養(yǎng)基冷卻至30℃并接種以起始發(fā)酵(pH6.0，100rpm，接種量為0.03克細胞干重/升)，如前所述(Beall等，1991，同上)。最初24小時內(nèi)，乙醇產(chǎn)量為0.26-0.28克/升，所有類型的淀粉結(jié)果都相似，最后乙醇得率為0.35-0.37克/克淀粉，而理論上最大得率為0.56克/克淀粉。淀粉發(fā)酵的結(jié)果見圖17。
因為以菌株KO11(pLOI140)和KO11(pLOI141)獲得的數(shù)據(jù)本質(zhì)上相同，因此圖17中，只顯示了KO11(pLOI141)的數(shù)據(jù)。圖17中所用符號如下△，玉米淀粉(S-4126);□，土豆淀粉(-2004);○，水稻淀粉(S-7260);▲，小麥淀粉(S-5127);■，玉米淀粉加2mM CaCl2;●KO11，葡萄糖5%，作對照。
兩步法發(fā)酵玉米淀粉中，在不同階段取出樣品用薄層層析法分析(圖18)。24小時后，水解產(chǎn)物有葡萄糖、麥芽糖、麥芽三糖、麥芽四糖和較長的寡糖。葡萄糖、麥芽糖和麥芽三糖被KO11(pLOI141)用來發(fā)酵(72小時)。
圖18顯示玉米淀粉發(fā)酵的薄層層析分析結(jié)果。麥芽糖和葡萄糖作為標準物。葡萄糖到麥芽四糖分別標為G1到G4。第一條道為葡萄糖和麥芽糖作標準物;第二條道為使用在60℃糖化24小時后的培養(yǎng)液;第三條道為60℃糖化24小時后再發(fā)酵72小時的培養(yǎng)液。
鈣離子常常能穩(wěn)定淀粉降解酶。用含2mM CaCl2的Luria培養(yǎng)液中的玉米淀粉進行的發(fā)酵實驗表明發(fā)酵速率略為加快，得率也較高，分別為每小時0.29克乙醇/升和0.40克乙醇/克淀粉。同傳統(tǒng)的用酵母和酶發(fā)酵相比，重組大腸桿菌發(fā)酵較慢，最后的乙醇濃度較低。使用一種微生物通過兩步法發(fā)酵淀粉總的乙醇得率約為使用酵母和附加酶的當前的商業(yè)方法得率(約0.47克乙醇/克淀粉)的85%。
本例表明使用重組大腸桿菌產(chǎn)生乙醇的發(fā)酵可用來產(chǎn)生部分淀粉糖化所需要的酶，雖然還需進一步改進。因為不需要通氣條件，所以酶的產(chǎn)生非常簡單。熱穩(wěn)定的細菌酶作用的最適pH值與大腸桿菌發(fā)酵所需的pH值相同(約pH6.0)。利用這些生物，低價值原料(如玉米殼)中的殘留淀粉可用作底物，玉米莖汁可用作復合營養(yǎng)物的來源。類似這樣的工序可以降低糖化酶的價格并增加玉米發(fā)酵中的乙醇得率。
權利要求
1.一種有別于大腸桿菌(Escherichia coli)的重組宿主，帶有能編碼乙醇脫氫酶和丙酮酸脫羧酶的異源DNA，其特征在于所述宿主能在足夠的功能水平表達所述異源DNA以有利于所述宿主的主要發(fā)酵產(chǎn)物乙醇的產(chǎn)生。
2.根據(jù)權利要求1的重組宿主，其特征在于所述宿主選擇自細菌、真菌、酵母和真核細胞。
3.根據(jù)權利要求2的重組宿主，其特征在于所述宿主選擇自革蘭氏陰性細菌。
4.根據(jù)權利要求3的重組宿主，其特征在于所述宿主選擇自腸道細菌。
5.根據(jù)權利要求3的重組宿主，其特征在于所述宿主選擇自歐文氏菌屬(Erwinia)、克氏桿菌屬(Klebsiella)和黃單胞菌屬(Xanthomonas)。
6.根據(jù)權利要求5的重組宿主，其特征在于所述宿主選擇自歐文氏菌屬(Erwinia)和克氏桿菌屬(Klebsiella)。
7.根據(jù)權利要求6的重組宿主，其特征在于該宿主具有催娩克氏桿菌(Klebsiella Oxytoca)產(chǎn)生乙醇的特點。
8.一種帶有編碼乙醇脫氫酶和丙酮酸脫羧酶基團的質(zhì)粒，其特征在于所述質(zhì)粒能使宿主細胞在足夠的功能水平產(chǎn)生乙醇脫氫酶和丙酮酸脫羧酶，以利于所述宿主發(fā)酵的主要產(chǎn)物乙醇的產(chǎn)生。
9.根據(jù)權利要求8的質(zhì)粒，其特征在于所述質(zhì)粒帶有運動發(fā)酵單胞菌(Zymonas mokilis)中編碼乙醇脫氫酶和丙酮酸脫羧酶的基因。
10.根據(jù)權利要求8的質(zhì)粒，其特征在于所述質(zhì)粒進一步帶有控制所述編碼乙醇脫氫酶和丙酮酸脫羧酶的基因表達的lac啟動子。
11.根據(jù)權利要求8的質(zhì)粒，其特征在于已被命名為pLOI555。
12.根據(jù)權利要求1的重組宿主，其特征在于帶有權利要求8中的質(zhì)粒。
13.一種用編碼乙醇脫氫酶和丙酮酸脫羧酶的異源基因轉(zhuǎn)化有別于大腸桿菌的適當宿主產(chǎn)生乙醇的方法，其特征在于所述宿主在足夠功能水平表達所述基因，以利于所述宿主發(fā)酵的主要產(chǎn)物乙醇的產(chǎn)生。
14.根據(jù)權利要求13的方法，其特征在于所述宿主選擇自細菌，真菌、酵母和真核細胞。
15.根據(jù)權利要求13的方法，其特征在于所述宿主選擇自革蘭氏陰性細菌。
16.根據(jù)權利要求15的方法，其特征在于所述宿主選擇自歐文氏菌屬、克氏桿菌屬和黃單胞菌屬。
17.根據(jù)權利要求13的方法，其特征在于所述宿主選擇自腸道細菌。
18.根據(jù)權利要求13的方法，其特征在于所述宿主選擇自歐文氏菌屬和克氏桿菌屬。
19.根據(jù)權利要求17的方法，其特征在于所述重組宿主具有催娩克氏桿菌(Klebsiella Oxytoca)產(chǎn)生乙醇的特點。
20.一種還原細胞生長培養(yǎng)基中積累的酸性代謝產(chǎn)物的方法，所述方法是用編碼乙醇脫氫酶和丙酮酸脫羧酶的異源基因轉(zhuǎn)化所述細胞，其特征在于所述細胞在足夠功能水平表達所述基因，以利于所述宿主的主要發(fā)酵產(chǎn)物乙醇的產(chǎn)生。
21.一種帶有編碼乙醇脫氫酶和丙酮酸脫羧酶異源基因的重組宿主，其特征在于所述宿主(A)還帶有能使所述宿主轉(zhuǎn)運和代謝寡糖的蛋白質(zhì)的編碼基因，和(B)在一定水平表達所述基因和所述異源DNA，使所述宿主從所述寡糖的代謝中得到主要的發(fā)酵產(chǎn)物乙醇。
22.根據(jù)權利要求21的重組宿主，其特征在于所述宿主選擇自一種細菌和一種酶母。
23.根據(jù)權利要求22的重組宿主，其特征在于所述宿主選擇自革蘭氏陰性細菌。
24.根據(jù)權利要求22的重組宿主，其特征在于所述宿主選擇自腸道細菌。
25.根據(jù)權利要求24的重組宿主，其特征在于所述宿主選擇自歐文氏菌屬和克氏桿菌屬。
26.根據(jù)權利要求25的重組宿主，其特征在于具有催娩克氏桿菌(Klebsiella Oxytoca)產(chǎn)生乙醇的特點。
27.根據(jù)權利要求21的重組宿主，其特征在于所述寡糖包括選擇自C5和C6糖單體的糖單體。
28.根據(jù)權利要求27的重組宿主，其特征在于所述寡糖由選擇自葡萄糖和木糖的糖單體組成。
29.根據(jù)權利要求28的重組宿主，其特征在于所述寡糖選擇自兩體和三體。
30.根據(jù)權利要求21的重組宿主，其特征在于所述宿主也產(chǎn)生多糖酶。
31.根據(jù)權利要求30的重組宿主，其特征在于所述宿主還帶有第二個異源DNA片斷，其表達產(chǎn)物為所述多糖酶。
32.根據(jù)權利要求31的重組宿主，其特征在于所述多糖酶選擇自一種纖維素裂解酶、一種木聚糖裂解酶和一種淀粉降解酶。
33.根據(jù)權利要求32的重組宿主，其特征在于所述多糖酶選擇自一種內(nèi)葡聚糖酶、纖維二糖水解酶、β-葡糖苷酶、內(nèi)-1，4-木糖酶、β-木糖苷酶、α-葡糖苷酸酶、α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶、乙酰酯酶、乙酰木糖酯酶、α-淀粉酶、β-淀粉酶、葡糖淀粉酶、支鏈淀粉酶、β-葡聚糖酶、半纖維素酶、阿拉伯糖苷酶、甘露聚糖酶果膠水解酶和果膠酸裂解酶。
34.根據(jù)權利要求33的重組宿主，其特征在于所述多糖酶是下述基因中的一個基因的表達產(chǎn)物，這些基因包括celD、xynZ、xylB、一種α-淀粉酶基因和一種支鏈淀粉酶基因。
35.根據(jù)權利要求34的重組宿主，其特征在于所述的celD和xynZ基因來自熱纖梭狀芽胞桿菌(Clostridium thermocellum)，所述的xylB基因來自溶纖芽孢桿菌(B.fibrisolvens)，所述的α-淀粉酶基因來自嗜熱脂肪芽胞桿菌(B.stearothermophilas)，所述的支鏈淀粉酶基因來自熱厭氧細菌(T.brockii)。
36.根據(jù)權利要求32的重組宿主，其特征在于所述多糖酶是來自糞肥纖維單胞菌(Cellulomonas fimi)的一種纖維素酶基因的表達產(chǎn)物并且所述宿主至少能部分分泌所述多糖酶。
37.根據(jù)權利要求31-35任何一項的重組宿主，其特征在于所述宿主還帶有另外的異源DNA片段，其表達產(chǎn)物與轉(zhuǎn)運單糖和/或寡糖進入重組宿主有關。
38.根據(jù)權利要求31-35任何一項的重組宿主，其特征在于所述宿主至少能部分分泌所述多糖酶。
39.根據(jù)權利要求31-35任何一項的重組宿主，其特征在于所述多糖酶在所述宿主中有足夠量的積累。
40.根據(jù)權利要求39的重組宿主，其特征在于所述多糖酶是一種對熱穩(wěn)定的酶。
41.根據(jù)權利要求39的重組宿主，其特征在于所述宿主還帶有另外的異源DNA片段，其表達產(chǎn)物是所述宿主至少能部分分泌的另外的多糖酶。
42.根據(jù)權利要求41的重組宿主，其特征在于所述的不同的多糖酶包括糞肥纖維單胞菌的一種纖維素酶基因的表達產(chǎn)物。
43.根據(jù)權利要求1的重組宿主，其特征在于所述宿主也產(chǎn)生一種多糖酶。
44.根據(jù)權利要求43的重組宿主，其特征在于所述宿主還帶另一個異源DNA片段，其表達產(chǎn)物是所述多糖酶。
45.根據(jù)權利要求44的重組宿主，其特征在于所述多糖酶選擇自纖維素裂解酶、木糖裂解酶、半纖維素裂解酶和淀粉降解酶組成的一個組。
46.根據(jù)權利要求45的重組宿主，其特征在于所述的多糖酶選擇自內(nèi)葡聚糖酶、纖維二糖裂解酶、β-葡糖苷酶、內(nèi)-1，4-β木糖酶，β-木糖苷酶、α-葡糖苷酸酶、α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶、乙酰酯酶、乙酰木糖酯酶、α-淀粉酶、β-淀粉酶、葡糖淀粉酶、支鏈淀粉酶、β-葡聚糖酶、阿拉伯糖苷酶、甘露聚糖酶、果膠水解酶和果膠酸裂解酶。
47.根據(jù)權利要求46的重組宿主，其特征在于所述多糖酶是下述基因的表達產(chǎn)物，這些基因是celD、xynZ、xylB、α-淀粉酶基因和支鏈淀粉酶基因。
48.根據(jù)權利要求47的重組宿主，其特征在于，所述celD，xynZ，和xylB基因衍生自熱纖梭菌(clostridium thermocellum);所述α-淀粉酶基因衍生自嗜熱脂肪芽孢桿菌;以及所述支鏈淀粉酶基因衍生自熱厭氧細菌(T.brockii)。
49.根據(jù)權利要求46的重組宿主，其特征在于所述多糖酶至少能被所述宿主部分地分泌。
50.根據(jù)權利要求46的重組宿主，其特征在于所述多糖酶在所述宿主中大量地積累。
51.處理寡糖原料的方法，其特征在于包含以下步驟A.提供一種包含一種起始寡糖的原料，和B.將所述原料與一種酶接觸，該酶由根據(jù)權利要求21的重組宿主細胞放出，結(jié)果所述起始寡糖原料受到所述酶的作用。
52.一種根據(jù)權利要求51的方法，其特征在于所述起始寡糖被發(fā)酵生成乙醇。
53.一種根據(jù)權利要求52的方法，其特征在于所述起始寡糖包含一種雙糖或叁糖。
54.一種權利要求53的方法，其特征在于所述重組宿主由權利要求22-26中任何一條所定義。
55.一種根據(jù)權利要求51的方法，其特征在于，所述酶是一種多糖酶，而所述起始寡糖由所述多糖酶轉(zhuǎn)化成更簡單的寡糖和/或糖單體。
56.一種根據(jù)權利要求55的方法，其特征在于所述起始寡糖包含一種雙糖或叁糖。
57.一種根據(jù)權利要求55的方法，其特征在于所述起始寡糖是一種不溶性寡糖，其選自纖維素、半纖維素和淀粉。
58.一種根據(jù)權利要求57的方法，其特征在于所述重組宿主由權利要求30-36中任何一條所定義。
59.一種根據(jù)權利要求55的方法，其特征在于所述重組宿主由權利要求30-36中任何一條所定義。
60.一種根據(jù)權利要求55的方法，其特征在于步驟B包含加熱所述細胞來誘發(fā)裂解，釋放所述多糖酶。
61.一種根據(jù)權利要求60的方法，其特征在于所述起始寡糖和/或所述更簡單寡糖被發(fā)酵成乙醇。
62.一種在重組宿主細胞中促進功能蛋白生成的方法，其特征在于，在所述宿主中包含過量表達的adhB基因。
63.一種根據(jù)權利要求62的方法，其特征在于所述adhB基因衍生自運動發(fā)酵單胞菌。
64.一種從含寡糖生物量生產(chǎn)乙醇的方法，其特征在于，包含以下步驟A.在初級反應器中，將所述生物量與多糖酶接觸，以降解所述生物量中的寡糖成更簡單的寡糖和/或單糖，其中所述接觸在溫度大約為50℃至60℃，pH值大約為4.5至5.0下進行;B.從所述初級反應器獲得一種糖溶液，其包含所述更簡單寡糖和/或單糖;C.將所述糖溶液引入-發(fā)酵罐，其包含能夠使所述重簡單寡糖和/或單糖發(fā)酵生成乙醇的重組宿主微生物，及D.在溫度大約為30℃至35℃和pH值大約為6.0條件下使所述更簡單寡糖和/或單糖發(fā)酵生成乙醇。
65.一種根據(jù)權利要求64的方法，其特征在于，從所述發(fā)酵罐中取出初級液，并用來冷卻包含所述更簡單寡糖和/或單糖的次級液，將后者從所述初級反應器中取出。
66.一種根據(jù)權利要求65的方法，其特征在于，所述初級液在冷卻所述次級液之后被引入所述初級反應器。
全文摘要
本發(fā)明描述帶編碼乙醇脫氫酶和丙酮酸脫羧酶基因的質(zhì)粒及用此二種基因轉(zhuǎn)化的重組宿主。重組宿主由此能產(chǎn)生大量乙醇作為發(fā)酵產(chǎn)物。也揭示了增進重組宿主生長及降低培養(yǎng)基中不需要代謝產(chǎn)物積累的方法。構(gòu)建發(fā)酵寡糖產(chǎn)生大量乙醇的重組宿主和帶上述兩基因和多糖酶基因的質(zhì)粒。并描述用上述重組宿主從寡聚體原料生產(chǎn)乙醇。還提供在過量表達adhB重組宿主中促進功能蛋白質(zhì)產(chǎn)生的方法。并提供發(fā)酵寡糖生物量生產(chǎn)乙醇的工序設計。
文檔編號C12N15/63GK1070424SQ9210187
公開日1993年3月31日 申請日期1992年3月18日 優(yōu)先權日1991年3月18日
發(fā)明者朗尼·O·英格拉姆, 戴維·S·比爾, 格哈德·伯奇哈特, 沃爾特·V·吉姆賈雷斯, 太田一良, 布倫特·E·伍德, 基爾納塞姆·T·桑穆根, 戴維·A·福勒, 阿里·本-巴薩特, 蒂勒爾·康韋, 弗拉維奧·奧爾特塞姆 申請人:佛羅里達大學, 生物能國際有限公司