專利名稱：：重組病毒載體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及重組病毒載體，特別是涉及為克服同源核苷酸序列之間重組問題而設(shè)計(jì)的重組病毒載體。本發(fā)明還涉及編碼人乳頭狀瘤病毒蛋白的重組病毒載體;對HPV感染所引起的癥狀的免疫治療劑和疫苗;為表達(dá)由16型和18型人乳頭狀瘤病毒編碼的抗原而操縱的病毒(例如牛痘苗病毒)的產(chǎn)生以及對宮頸癌的免疫治療劑和疫苗。近年來，對宮頸癌與某些類型人乳頭狀瘤病毒(HPV)，特別是16，18，31，33和35型之間的聯(lián)系已提出強(qiáng)有力的證據(jù)(Gissmanetal.CancerCells5，275，1987)。這是基于雜交研究，研究結(jié)果表明取自宮頸瘤的活組織有85-90%以上含有乳頭狀瘤病毒DNA。HPV16DNA是最常見的(見于大約60%的腫瘤)，其次常見的是HPV18(大約20%)，其它類型占另外的5-10%。但在許多情況下，取自活組織的腫瘤細(xì)胞不含完整的基因組，而是一種缺失的形式。缺失的信息在病毒基因組內(nèi)的程度和位置是可變的，但一般特征是保留一部分編碼E7蛋白的基因組(Schwarzetal.，Nature314，111，1985)。另外，相鄰的E6編碼區(qū)通常是存在的。E7編碼區(qū)在腫瘤細(xì)胞中的普遍存在表明該基因的蛋白產(chǎn)物可在誘導(dǎo)或維持轉(zhuǎn)化的表型方面起作用。事實(shí)上，在由腫瘤活組織所建立的大多數(shù)細(xì)胞系中能夠檢測到E7基因的表達(dá)(Smotkin&Wettsein，PNAS83，4680，1986)。此外，已證明E7基因產(chǎn)物可與成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤(Rb)基因產(chǎn)物(正常人細(xì)胞中的一種公認(rèn)的“抗致癌基因”)結(jié)合(Mungeretal.，EMBOJ.8，4099，1989)。這印證了E7直接參與細(xì)胞轉(zhuǎn)化。E7和E6基因在得自宮頸癌活組織的腫瘤細(xì)胞中的存在和表達(dá)表明這些蛋白可成為用于腫瘤細(xì)胞的免疫識別的潛在靶的可能性。眾所周知，哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)部所產(chǎn)生的病毒蛋白可通過宿主細(xì)胞途徑加工成短肽，然后與宿主主要組織相容性復(fù)合物(MHC)1類分子形成一種復(fù)合物并運(yùn)送到細(xì)胞表面。這些復(fù)合物可提供供宿主免疫系統(tǒng)識別的靶。該復(fù)合物與胞毒T細(xì)胞表面上受體分子(T細(xì)胞受體)的相互作用會(huì)導(dǎo)致T細(xì)胞的活化以使識別的細(xì)胞增殖或破壞。因此，能夠識別表達(dá)HPVE6和/或E7蛋白的細(xì)胞的胞毒T淋巴細(xì)胞(CTLs)群體在體內(nèi)的存在可對機(jī)體提供保護(hù)以防宮頸腫瘤的發(fā)展和增殖。確實(shí)已報(bào)道了為表達(dá)HPVE7蛋白而操縱的致癌小鼠細(xì)胞一般不能在預(yù)先用非致癌E7表達(dá)細(xì)胞免疫過的小鼠中形成腫瘤，這種排斥作用是由CD8+淋巴細(xì)胞(CTLs)介導(dǎo)的(Chenetal.，PNAS88，110，1991)。此外，繼腫瘤發(fā)生之后這類細(xì)胞活性群體的產(chǎn)生會(huì)導(dǎo)致腫瘤退化。有許多關(guān)于構(gòu)建含有并表達(dá)外來基因的重組病毒，例如牛痘苗病毒的報(bào)道(Mackett&Smith，J.gen.Virol.67，2067，1986)，還有幾種利用這些重組病毒對所表達(dá)的外來抗原產(chǎn)生有效免疫應(yīng)答的報(bào)道。這種為接種而提供抗原的途徑的一個(gè)突出優(yōu)點(diǎn)在于它可導(dǎo)致細(xì)胞免疫以及體液免疫的發(fā)生。這是因?yàn)樵谑芨腥镜膫€(gè)體的細(xì)胞內(nèi)將以與在自然感染過程中出現(xiàn)的相似的方式產(chǎn)生外來蛋白。這意味著它們應(yīng)通過正確的途徑加工以便產(chǎn)生CTL應(yīng)答。在幾種情況下，已直接證實(shí)了用重組病毒免疫能夠產(chǎn)生外來抗原特異性CTLs形式的細(xì)胞免疫應(yīng)答(Moss&Flexner，Ann.Rev.Immunol.，5，305，1987)。此外，已經(jīng)證實(shí)用表達(dá)某些腫瘤特異性抗原，例如人骨髓瘤相關(guān)抗原P97(Estinetal.，PNAS，85，1052，1988)，牛乳頭狀瘤病毒E7蛋白(Meneguzzietal.，Vaccine，8，199，1990)和人乳腺癌相關(guān)抗原ETA(Hareuvenietal.，PNAS，87，9498，1990)的重組牛痘苗病毒接種動(dòng)物可誘導(dǎo)對腫瘤發(fā)生和發(fā)展的免疫性。本申請人已認(rèn)識到生產(chǎn)可用作對HPV感染所引起的癥狀，例如宮頸癌的免疫治療劑或疫苗的重組病毒載體的必要性。關(guān)于宮頸癌，在申請人進(jìn)行本發(fā)明時(shí)的先有技術(shù)公認(rèn)E7基因具有使細(xì)胞不滅的潛力。因此，會(huì)認(rèn)為不宜將E7基因摻加到免疫治療劑中。然而，本申請人已認(rèn)識到E7基因包含在免疫治療劑中的令人驚奇的適用性。本申請人還認(rèn)識到通過用含有E7基因的免疫治療劑治療所獲得的有益效果可能遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過與E7基因的致癌活性相關(guān)的任何危險(xiǎn)。因此，本發(fā)明的一個(gè)方面涉及表達(dá)E7基因的重組病毒載體作為免疫治療劑或疫苗的應(yīng)用。此外，本申請人提供了其發(fā)明的實(shí)施方案，其中這些危險(xiǎn)還可通過基因序列的特異性改變而進(jìn)一步減小，以便降低E7基因的致癌潛力而又不會(huì)損害E7基因激發(fā)適當(dāng)免疫應(yīng)答的能力。申請人還認(rèn)識到一旦可能是由不同的HPV株編碼的許多HPV蛋白因與某一特定的HPV相關(guān)癥狀(例如，宮頸癌，HPV16和HPV18;生殖器瘤，尖銳濕疣，呼吸道乳頭狀瘤病，HPV6和HPV11;免疫抑制的個(gè)體中鱗狀上皮細(xì)胞癌，HPV5和HPV8)相關(guān)聯(lián)而受到影響，而不是產(chǎn)生眾多的為表達(dá)每種受影響的蛋白而單獨(dú)操縱的重組病毒，它就會(huì)有利于產(chǎn)生能夠表達(dá)不止一種蛋白的部分或全部序列的單個(gè)病毒重組體。因此，就宮頸癌而言，不是產(chǎn)生四種表達(dá)每個(gè)用于宮頸腫瘤細(xì)胞識別的靶而單獨(dú)操縱的重組病毒，即HPV16E6，HPV16E7，HPV18E6和HPV18E7蛋白，而是它會(huì)特別有利于產(chǎn)生能夠表達(dá)一種以上蛋白，較好是至少兩種蛋白，最好是所有四種蛋白的部分或全部序列的單個(gè)病毒重組體。本申請人能做到這一點(diǎn)是特別驚人的。這是因?yàn)?，許多HPV蛋白的編碼序列是與其它相同的HPV蛋白(例如來自其它病毒株的蛋白)高度同源的。因此，HPV16E6和HPV18E6蛋白顯示出62%的總同源性并包括具有極高同源性的區(qū)域。同樣，HPV16E7和HPV18E7顯示出57%的總同源性，并具有同源性極高的特殊區(qū)域。這意味著人們可預(yù)期造成問題的重組，例如基因序列的喪失。然而，本申請人為了減小發(fā)生這種重組的可能性和為了在這種重組真的出現(xiàn)時(shí)防止其產(chǎn)生有害影響，構(gòu)思出一種新的解決方案。因此，令人驚奇的是，本發(fā)明提供了重組病毒載體，它包括至少一對具有足夠的序列同源性以致于可以預(yù)期它們之間的重組的核苷酸序列。該至少一對核苷酸序列可編碼部分或全部人乳頭狀瘤病毒(HPV)野生型蛋白或與之具有交叉免疫反應(yīng)性的突變蛋白。特別是，本發(fā)明提供了一種能夠穩(wěn)定保持和表達(dá)四種來自HPV16和HPV18的所需基因序列的部分或全部的重組載體。因此，本發(fā)明提供了一種用作免疫治療劑或疫苗的重組病毒載體，它包括至少一對異源于所述病毒的核苷酸序列，這對核苷酸序列具有足夠的序列同源性以致于可以預(yù)期它們之間的重組，其中這對核苷酸序列在所說的病毒載體中彼此反向排列以減小導(dǎo)致部分或全部的所述序列喪失的重組可能性并且所說的病毒載體能夠感染哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞和在所說的宿主細(xì)胞中將異源核苷酸序列表達(dá)為多肽。該至少一對核苷酸序列可編碼部分或全部人乳頭狀瘤病毒(HPV)野生型蛋白或與之具有交叉免疫反應(yīng)性的突變蛋白。這對核苷酸序列可編碼來自HPV16和HPV18二者的部分或全部E7蛋白，或它們的功能上的等同物。這對核苷酸序列可編碼來自HPV16和HPV18二者的部分或全部E6蛋白或它們的功能上的等同物。這種重組病毒載體還可包括另外一對異源于所述病毒的核苷酸序列，它們具有足夠的序列同源性以致于可以預(yù)期它們之間的重組，其中所說的另外一對核苷酸序列在所述的病毒載體中彼此反向排列并且所說的病毒載體能夠感染哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞和在所說的宿主細(xì)胞中將這另外一對異源核苷酸序列表達(dá)為載體。這另外一對核苷酸序列可編碼部分或全部HPV野生型蛋白或與之具有交叉免疫反應(yīng)性的突變蛋白。例如，本發(fā)明還提供一種重組病毒載體，它除了E7編碼序列之外還包括并適合于表達(dá)編碼來自HPV16和HPV18二者的部分或全部E6蛋白或它們的功能上的等同物的遺傳序列。該遺傳序列可包括如圖1(a)和1(b)所示的編碼HPV16E6/E7和HPV18E6/E7的序列。該遺傳序列可編碼所述蛋白的抗原部分?？筛淖円粚塑账嵝蛄兄械娜我粭l或兩條核苷酸序列以使之比一對等同的編碼野生型HPV蛋白的核苷酸序列同源性少。核苷酸序列的改變可以是在具有高度序列同源性的某一區(qū)域。最好是核苷酸序列的改變不會(huì)導(dǎo)致所編碼的氨基酸序列改變?？墒垢髯跃幋a各種蛋白的兩個(gè)或多個(gè)核苷酸序列融合起來形成單個(gè)的開放讀碼。因此，可使編碼來自HPV16的部分或全部E6和E7蛋白的遺傳序列融合起來形成單個(gè)的開放讀碼?？墒咕幋a來自HPV18的部分或全部E6和E7蛋白的遺傳序列融合起來形成單個(gè)的開放讀碼?？墒咕幋a來自HPV16和HPV18二者的部分或全部E6和E7蛋白的遺傳序列融合起來形成單個(gè)的開放讀碼。這樣，重組病毒載體可具有按照圖26所示的任一種方式排列的核苷酸序列對。在重組病毒載體包括一個(gè)具有編碼來自HPV16的部分或全部E6和E7蛋白的融合遺傳序列的開放讀碼和一個(gè)具有編碼來自HPV18的部分或全部E6和E7蛋白的融合遺傳序列的單獨(dú)的開放讀碼時(shí)，這兩個(gè)開放讀碼可互為反向。例如，這兩個(gè)開放讀碼可在重組病毒載體中相鄰排列。可這樣反向排列，即HPV16和HPV18的E6編碼序列都位于HPV16和HPV18的E7編碼序列之間。也可這樣反向排列，即HPV16和HPV18的E7編碼序列都位于HPV16和HPV18的E6編碼序列之間。具體地說，各自有各自的啟動(dòng)子的這兩個(gè)開放讀碼在重組載體中可彼此相鄰排列。這樣啟動(dòng)子可位于基因之間，它向外轉(zhuǎn)錄，啟動(dòng)子也可位于基因之外，它向內(nèi)轉(zhuǎn)錄。同樣，可使編碼來自HPV16的部分或全部E7蛋白和來自HPV18的部分或全部E7蛋白的遺傳序列融合起來形成單個(gè)開放讀碼?？墒咕幋a得自HPV的部分或全部E6蛋白和來自HPV18的部分或全部E6蛋白的遺傳序列融合起來形成單個(gè)開放讀碼。這將導(dǎo)致另一種與圖26所示的相似的排列。這些融合可通過編碼較小的中性氨基酸，例如甘氨酸的單個(gè)密碼子來完成。因此，本發(fā)明還提供了一種重組病毒載體，它包括具有編碼得自HPV16的部分或全部野生型E6和E7蛋白的融合遺傳序列的第一開放讀碼;和具有編碼來自HPV18的部分或全部野生型E6和E7蛋白的融合遺傳序列的單獨(dú)的第二開放讀碼;其中第一和第二開放讀碼可以互為反向排列，從而或者ⅰ)HPV16和HPV18的E6編碼序列都位于HPV16和HPV18的E7編碼序列之間;或者ⅱ)HPV16和HPV18的E7編碼序列都位于HPV16和HPV18的E6編碼序列之間;并且其中所說的野生型蛋白的任一種可被與之具有交叉免疫反應(yīng)性的突變蛋白所代替。第一和第二開放讀碼各自都有相應(yīng)的啟動(dòng)子并且這兩個(gè)帶有各自啟動(dòng)子的開放讀碼在病毒中彼此相鄰排列。本發(fā)明還提供一種重組病毒載體，其中或者ⅰ)啟動(dòng)子位于第一和第二讀碼之間，從而使得開放讀碼向外進(jìn)行轉(zhuǎn)錄;或者ⅱ)啟動(dòng)子位于第一和第二開放讀碼之外，從而使得開放讀碼向內(nèi)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄。本發(fā)明還提供一種重組病毒載體，它包括具有編碼來自HPV16的部分或全部野生型E6和E7蛋白的融合遺傳序列的第一開放讀碼;和具有編碼來自HPV18的部分或全部野生型E6和E7蛋白的融合遺傳序列的第二開放讀碼，其中HPV16和HPV18的E6編碼序列都位于HPV16和HPV18的E7編碼序列之間;并且每個(gè)開放讀碼都有一個(gè)相應(yīng)的啟動(dòng)子，該啟動(dòng)子位于第一和第二開放讀碼之間，從而使得開放讀碼向外進(jìn)行轉(zhuǎn)錄;其中所說的野生型蛋白的任一種可被與之具有交叉免疫反應(yīng)性的突變蛋白所代替。野生型蛋白HPV16E7和HPV18E7可用突變蛋白替代，該突變蛋白與所說的野生型蛋白是基本上同源的，且其中野生型蛋白HPV16E7的24位半胱氨酸殘基和26位谷氨酸殘基及野生型蛋白HPV18E7的27位半胱氨酸殘基和29位谷氨酸殘基均被甘氨酸殘基替代。重組病毒載體可衍生于牛痘苗病毒。本申請人還認(rèn)識到對于作為一種免疫治療劑的有效功能，要求重組病毒應(yīng)保持其復(fù)制能力，以便產(chǎn)生有效的感染，目的是發(fā)動(dòng)對編碼病毒的蛋白的細(xì)胞免疫應(yīng)答。因此，本申請人提出應(yīng)將外來基因序列插入載體病毒的某些位點(diǎn)，由于異源基因序列的插入而對這些位點(diǎn)的破壞基本上不會(huì)干擾病毒的功能，因此對與病毒在受感染的宿主動(dòng)物體內(nèi)的復(fù)制能力有關(guān)的任何功能基本上不會(huì)有不利的影響。申請人已將這些位點(diǎn)稱為“中性位點(diǎn)”(盡管“中性”一詞不應(yīng)被精確地理解為所公認(rèn)的那樣，即這些位點(diǎn)的破壞可能對復(fù)制能力具有小的，但相對來說是微不足道的不利影響)。影響病毒復(fù)制的DNA序列可分為幾種ⅰ)蛋白編碼序列;ⅱ)參與基因表達(dá)控制的成分;和ⅲ)參與病毒DNA復(fù)制的成分;因此，非必需的中性插入位點(diǎn)必須避開這樣的區(qū)域;而且，已根據(jù)核苷酸序列分析的研究鑒定了這樣的位點(diǎn)。這樣可將遺傳序列插入到病毒基因組中性位點(diǎn)中。可將一個(gè)或多個(gè)遺傳序列插入到相同的中性位點(diǎn)中。中性位點(diǎn)可按照本領(lǐng)域熟知的技術(shù)容易地檢驗(yàn)。例如，可用標(biāo)準(zhǔn)的方法選擇、阻斷或刪除某一位點(diǎn)并將生成的重組病毒置于在正常情況下可維持野生型病毒載體生長的條件下，估價(jià)操作的效果，在動(dòng)物模型中進(jìn)一步比較該病毒的致病性與未修飾的病毒載體株的致病性，以便估價(jià)其減毒水平。在本發(fā)明中，病毒載體可以是牛痘苗病毒。可將牛痘苗病毒減毒或失活，以使它不能充分復(fù)制和對宿主細(xì)胞產(chǎn)生廣泛的感染。過去，牛痘苗病毒已廣泛用于接種以預(yù)防天花，它的普通使用已完全消滅了這種疾病(Bhebehami，Microbiol.Rev.47，455，1983)。在世界衛(wèi)生組織(WHO)消滅天花運(yùn)動(dòng)期間，將牛痘苗病毒的幾個(gè)不同毒株用作疫苗。1984年，WHO主辦了一個(gè)討論用牛痘苗病毒作為活病毒載體的會(huì)議(BulletinoftheWHO63(3)471-477)。在這篇報(bào)告中的數(shù)據(jù)表明對于牛痘苗病毒的Wyeth毒株，與接種相關(guān)的并發(fā)癥數(shù)目最低，因此按照本發(fā)明的實(shí)施例方案已選擇這一毒株作為構(gòu)建重組病毒的基礎(chǔ)。眾所周知，在某些優(yōu)選的位點(diǎn)，例如胸苷激酶基因座位，將外來DNA插入到牛痘苗病毒的基因組中可顯著降低病毒在體內(nèi)的復(fù)制能力，如上所述，這里所述的治療方法的目的是在體內(nèi)產(chǎn)生有效的感染，以發(fā)動(dòng)對編碼病毒的蛋白的細(xì)胞免疫應(yīng)答，本發(fā)明提供一種將外來基因插入病毒基因組內(nèi)的中性位點(diǎn)的方法，由于插入而對這些位點(diǎn)的破壞不會(huì)干擾病毒的復(fù)制，因此對病毒復(fù)制基本上沒有不利影響。當(dāng)病毒是牛痘苗病毒時(shí)，在牛痘苗病毒的Wyeth毒株內(nèi)根據(jù)有關(guān)的WR毒株核苷酸序列可鑒定出中性位點(diǎn)。另外，當(dāng)使用其它牛痘苗病毒株時(shí)，可使用與以上所鑒定的位點(diǎn)相同的位點(diǎn)。中性位點(diǎn)可以是下文中所鑒定的A，B，C和D中的任一個(gè)，或是其功能上的等同物。為了由重組病毒載體成功地表達(dá)外來蛋白，可將外來基因置于可由病毒操縱的啟動(dòng)子序列控制之下。因此，重組病毒載體可包括單個(gè)的啟動(dòng)子，它可控制單個(gè)開放讀碼內(nèi)全部異源遺傳序列的表達(dá)。另外，當(dāng)重組病毒載體編碼一個(gè)以上含有異源遺傳序列的開放讀碼時(shí)，該病毒可包括一個(gè)控制第一開放讀碼的遺傳序列表達(dá)的第一啟動(dòng)子，和控制一個(gè)或多個(gè)其它開放讀碼的遺傳序列表達(dá)的一個(gè)或多個(gè)其它啟動(dòng)子。啟動(dòng)子序列可以是病毒特異性的，有幾種啟動(dòng)子序列已有過敘述(Davison&Moss，J.Mol.Biol.，210，749，1989;Davison&Moss，J.Mol.Biol.，210，771，1987)。單個(gè)啟動(dòng)子以及第一和一個(gè)或多個(gè)其它的啟動(dòng)子可以是P7.5啟動(dòng)子。已報(bào)道了外來抗原特異性CTLs的誘導(dǎo)需要早在病毒復(fù)制循環(huán)中抗原的表達(dá)(Couparetal.，Eur.J.Immunol.，16，1479，1986)。因此，如本發(fā)明所提供的重組病毒可包括P7.5啟動(dòng)子(Venkatesanetal.，Cell，125，805，1981)和/或H6啟動(dòng)子(Roseletal.，J.Virol，60，436，1988)的使用，這兩種啟動(dòng)子在感染的早期和晚期都是有效的。如前所述，已報(bào)道了E7基因本身具有使細(xì)胞不滅的潛力(Phelpsetal.，Cell53，539，1988)。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，蛋白表達(dá)的對策包括E7作為與E6的融合蛋白的產(chǎn)生，它不可能保持生物學(xué)功能。本發(fā)明的實(shí)施方案提供了通過在E7基因內(nèi)進(jìn)行已知的改變以破壞它的致癌能力(Chestrsetal，J.Gen.Virol.71，449，1990)來更進(jìn)一步減小這種危險(xiǎn)的方法。因此，在本發(fā)明的重組病毒載體中，可由相同的野生型序列改變編碼部分或全部E7蛋白的遺傳序列，以使用于重組病毒載體的序列比其等同的野生型序列致癌性低。本發(fā)明也提供了包括本文所定義的重組病毒載體的藥物。該藥物可用于抵抗由HPV感染所引起的癥狀，它包括免疫治療有效量的重組病毒載體。該藥物可用于抵抗宮頸癌。該藥物可以是一種對由HPV感染所引起的癥狀有免疫力的疫苗，它包括一定量的本發(fā)明所提供的重組病毒載體，當(dāng)給予接受者時(shí)可特異性地使免疫系統(tǒng)的細(xì)胞活化以對付HPV蛋白。該疫苗可用于對宮頸癌的免疫。該藥物可包括一種或多種賦形劑。本發(fā)明也提供了用本文所定義的重組病毒載體制造用作抵抗認(rèn)為是由HPV感染引起的癥狀的免疫治療劑或疫苗的藥物的方法。例如預(yù)防和治療宮頸癌。本發(fā)明也提供了用本文所提供的重組病毒載體和藥物治療哺乳動(dòng)物患者的方法。本發(fā)明也提供了一種確定病毒載體中的中性位點(diǎn)的方法，由于插入異源基因序列而對中性位點(diǎn)的破壞不會(huì)干擾病毒的功能，因此對與病毒的復(fù)制能力有關(guān)的病毒功能基本上沒有不利的影響。該方法包括(a)分析病毒的基因組以通過尋找隔開的起始與終止密碼子之間預(yù)期密碼子使用鑒定可能編碼功能性基因的開放讀碼;和(b)選擇不在這類開放讀碼內(nèi)但可能編碼如(a)所鑒定的功能性基因的位點(diǎn)這種選擇可包括選擇在功能性基因序列的開放讀碼之間的位點(diǎn)和選擇在具有某些功能性基因特點(diǎn)，如預(yù)期密碼子使用，但喪失了其它必要特征如起始密碼子的開放讀碼內(nèi)的位點(diǎn)。該方法還可包括從病毒的基因組中阻斷或刪除所選的位點(diǎn)并將產(chǎn)生的病毒置于通?？删S持野生型病毒生長的條件下。本發(fā)明也提供了用上述方法鑒定的中性位點(diǎn)。本發(fā)明提供了一個(gè)說明通過產(chǎn)生重組牛痘苗病毒誘導(dǎo)對通常在宮頸腫瘤細(xì)胞中表達(dá)的乳狀狀瘤病毒蛋白的細(xì)胞免疫應(yīng)答的實(shí)施方案，該重組牛痘苗病毒在復(fù)制循環(huán)中已被操縱產(chǎn)生HPVE6和E7蛋白，或含有HPVE6和E7序列的蛋白。這種治療用牛痘苗病毒含有來自HPV16和HPV18的E6和E7基因，這種病毒最常見的是與宮頸癌相關(guān)。因此用這種單個(gè)病毒接種可刺激對與80%以上宮頸腫瘤相關(guān)的HPV型E6和E7蛋白的免疫力。然而在單個(gè)病毒中全部四種基因序列(例如，HPV16E6和E7;HPV18E6和E7)的表達(dá)出現(xiàn)一個(gè)問題，因?yàn)橥ㄟ^重組可能喪失遺傳序列。本發(fā)明提供了一種避開這一困難的方法，首先是通過特異性序列改變，目的是減少序列同源性，其次是通過將基因序列插入牛痘苗病毒基因組，插入的方式應(yīng)使得一旦發(fā)生這樣的重組，不會(huì)導(dǎo)致序列的喪失(即，彼此反向插入)，所需要的四種基因序列在牛痘苗病毒基因組中的表達(dá)也可能難于(盡管不是不可能)以獨(dú)立的表達(dá)單位實(shí)現(xiàn)，因此本發(fā)明提供了另一種方法，可將E6和E7開放讀碼融合起來。插入外來信息到牛痘苗病毒基因組中的標(biāo)準(zhǔn)方法存在的問題是用可選擇的標(biāo)記物提高重組的效率會(huì)使最終在重組病毒中也存在可選擇的標(biāo)記基因本身。然而，已發(fā)展了可隨后刪除這些外來序列的插入方法(Falkner&MossJ.Virol.，64，3108，1990)，在本發(fā)明的實(shí)施方案中使用了這些方法以確保最終的重組牛痘苗病毒只有那些對其所需功能是必不可少的附加序列。為了更全面地理解本發(fā)明，現(xiàn)參照附圖更詳細(xì)地描述一個(gè)實(shí)施方案。圖1(a)顯示了HPV16E6/E7聚合酶鏈反應(yīng)產(chǎn)物的核苷酸序列和三碼轉(zhuǎn)譯(下面劃線的區(qū)域表示E6和E7編碼序列);圖1(b)顯示了HPV18E6/E7聚合酶鏈反應(yīng)產(chǎn)物的核苷酸序列和三碼轉(zhuǎn)譯(下面劃線的區(qū)域表明E6和E7編碼序列);圖2顯示了HPV16和HPV18E6和E7基因的克隆和修飾;圖3顯示了被四個(gè)片段SalF，G，H和I所覆蓋的17201-18450位區(qū)域中牛痘苗病毒的開放讀碼圖;短垂線表示終止密碼子，頂端有方框的線表示起始密碼子，長方形表明相應(yīng)的開放讀碼，箭頭表明上方和下方DNA鏈的方向;圖4顯示了被四個(gè)片段SalF，G，H和I所覆蓋的21001-22000位區(qū)域中牛痘苗病毒的開放讀碼圖;短垂線表示終止密碼子，頂端有方框的線表示起始密碼子，長方形表明相應(yīng)的開放讀碼，箭頭表明上方和下方DNA鏈的方向;圖5顯示了被四個(gè)片段SalF，G，H和I所覆蓋的23501-25000位區(qū)域中牛痘苗病毒的開放讀碼圖;短垂線表示終止密碼子，頂端有方框的線表示起始密碼子，長方形表明相應(yīng)的開放讀碼，箭頭表明上方和下方DNA鏈的方向;圖6顯示了被四個(gè)片段SalF，G，H和I所覆蓋的17201-18450位區(qū)域中牛痘苗病毒的密碼子使用標(biāo)繪圖，箭頭表明每個(gè)DNA鏈的方向;圖7顯示了被四個(gè)片段SalF，G，H和I所覆蓋的21001-22000位區(qū)域中牛痘苗病毒的密碼子使用標(biāo)繪圖，箭頭表明每個(gè)DNA鏈的方向;圖8顯示了被四個(gè)片段SalF，G，H，I所覆蓋的23501-25000位區(qū)域中牛痘苗病毒的密碼子使用標(biāo)繪圖，箭頭表明每個(gè)DNA鏈的方向;圖9顯示了位點(diǎn)A周圍的DNA序列，表明SalF17R和SalF19R基因的單字母氨基酸代碼的轉(zhuǎn)譯;圖10顯示了位點(diǎn)B周圍的DNA序列，表明SalF20R和SalF20.5R基因的單字母氨基酸代碼的轉(zhuǎn)譯;圖11顯示了SalF2R開放讀碼與酵母鳥苷酸激酶基因序列的比較;圖12顯示了位點(diǎn)D周圍的DNA序列，表明HindB3R和HindB4R基因的單字母氨基酸代碼的轉(zhuǎn)譯;圖13顯示了牛痘苗病毒(Wyeth毒株)中性位點(diǎn)的克隆;圖14顯示了牛痘苗病毒啟動(dòng)子序列的克隆;圖15顯示了牛痘苗啟動(dòng)子操縱的E6-7暗盒的構(gòu)建;圖16顯示了E6-7暗盒克隆到牛痘苗病毒(Wyeth毒株)中性位點(diǎn)中;圖17是表明產(chǎn)生最終的治療用牛痘苗病毒-HPV重組病毒所需的重組的圖解;圖18顯示了用于構(gòu)建治療用牛痘苗病毒HPV重組體的合成寡核苷酸;圖19顯示了牛痘苗病毒(WR毒株)中四個(gè)片段SalF，G，H和I所覆蓋的17201-18450位區(qū)域中的核苷酸序列;圖20顯示了牛痘苗病毒(WR毒株)中被四個(gè)片段SalF，G，H和I所覆蓋的21001-22000位的區(qū)域中的核苷酸序列;圖21顯示了牛痘苗病毒(WR毒株)中被四個(gè)片段SalF，G，H和I所覆蓋的23501-25000位區(qū)域中的核苷酸序列;圖25顯示了重組病毒載體中HPV16E6和E7及HPV18E6和E7的各種排列選擇性。所有克隆方法均按“分子克隆”(“MolecularCloning”，ALaboratoryManual，eds.Sambrook，F(xiàn)ritschandManiatis，ColdSpringHarborLaboratoryPress，1989)中所述的方案進(jìn)行。用于進(jìn)行定點(diǎn)誘變的所有質(zhì)粒均為“噬菌體質(zhì)?！?Phagemid)型，它們可通過用噬菌體f1進(jìn)行起數(shù)感染而轉(zhuǎn)變?yōu)閱喂蒁NA。單股DNA的制備和定點(diǎn)誘變按Brierley等人所述的方法進(jìn)行(Brierleyetal.，Cell，57，537，1989)。圖18提供了所用的全部合成寡核苷酸的序列。為將其插入牛痘病毒而從HPV16和HPV18制備出E6和E7基因HPV16和HPV18E6和E7的克隆利用寡核苷酸SO5和SO6通過聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增質(zhì)粒pBR322/HPV16(DurstetalPNAS，80，3812，1983)可制備出含有HPV16E6/E7編碼區(qū)的DNA片段。而按照同樣的方法，利用寡核苷酸SO1和SO2，可從質(zhì)粒pBR322/HPV18(Boshartetal.EMBOJ.3，1151)制備出含有HPV18E6/E7編碼區(qū)的DNA片段。質(zhì)粒pBR322/HPV16和pBR322/HPV18均可得自BehringwerkeAG，P.O.Box1140D-3550，Marburg，Germany(或者根據(jù)本發(fā)明所提供的序列信息人工合成所需的序列)。在這兩種情況下均產(chǎn)生約800bp的DNA片段，且正好在E6基因的起點(diǎn)處有一限制酶Ncol的切割位點(diǎn)(CCATGG)，在E7基因的終止密碼子的正下游有一Smal位點(diǎn)(圖1(a)和(b))。然后用Ncol和Smal消化產(chǎn)物，并克隆至經(jīng)Ncol-Smal消化的質(zhì)粒pUC118NS〔經(jīng)過消化的“噬菌體質(zhì)?！眕UC118(Viera&Messing，MethodsEnzymol.，153，3，1987)，其中Ncol和Smal位點(diǎn)是在多聚連接子區(qū)域內(nèi)通過定點(diǎn)誘變而產(chǎn)生的〕中以產(chǎn)生含有HPV16序列的質(zhì)粒pIMS7以及含有HPV18序列的pIMS8(圖2)。由于能夠進(jìn)行定點(diǎn)誘變的任何質(zhì)粒均可被成功地應(yīng)用于該方法中，所以利用pUC118并不是該方法的關(guān)鍵。E6和E7ORF的融合為便于插入牛痘病毒，首先將得自每一HPV型的E6和E7基因融合在一起，形成單一、連續(xù)的ORF。這一目的是通過如下的定點(diǎn)誘變達(dá)到的(ⅰ)利用寡核苷酸S20將PIMS7中HPV16E6的終止密碼子TAA轉(zhuǎn)變?yōu)镚GAA序列。其目的是將正常情況下分開的HPV16E6和E7的ORF轉(zhuǎn)化為單一的ORF(pIMS7.1-圖2)。(ⅱ)利用寡核苷酸S21將pIMS8中HPV18E6的終止密碼子TAA轉(zhuǎn)變?yōu)镚GAA序列。其目的是將正常情況下分開的HPV18E6和E7的ORF轉(zhuǎn)化為單一的ORF(pIMS8.1-圖2)。消除E7的不滅能力為了破壞每一E7蛋白的不滅性質(zhì)，通過如下的定點(diǎn)誘變將HPV16E7編碼序列內(nèi)的兩個(gè)關(guān)鍵密碼子(Cys24和glu26-圖1(a))以及HPV18E7中的等價(jià)密碼子(Cys27和glu29-圖1(b))轉(zhuǎn)變?yōu)楦拾彼釟埢?ⅰ)利用寡核苷酸S22改變pIMS7的E7基因序列，使在正常情況下分別編碼半胱氨酸和谷氨酸的24和26密碼子編碼甘氨酸(pIMS7.2-圖2)。(ⅱ)利用寡核苷酸S23改變pIMS8中的E7基因序列，使在正常情況下分別編碼半胱氨酸和谷氨酸的27和29密碼子編碼甘氨酸(pIMS8.1B-圖2)。降低HPV16和HPV18E6和E7序列的內(nèi)部重組能力并消除潛在的牛痘病毒轉(zhuǎn)錄終止信號將HPV16和HPV18兩種E6和E7專一DNA加到單個(gè)病毒基因組中的一個(gè)潛在困難即兩套相關(guān)序列的重組可能導(dǎo)致信息的喪失或重排，從而破壞所需蛋白質(zhì)的表達(dá)。本發(fā)明提供了減少這一危險(xiǎn)的方法。首先是將這兩套遺傳信息以反方向插入至牛痘基因組中(從而使重組將不會(huì)導(dǎo)致序列信息的喪失，而是導(dǎo)致其逆轉(zhuǎn))。其次是在每一HPV病毒株的E6/7序列中存在最大同源性的位點(diǎn)產(chǎn)生特定的變化。但是所產(chǎn)生的這些變化并不改變基因編碼氨基酸的能力。因此，可通過如下的定點(diǎn)誘變改變HPV18E6序列利用寡核苷酸S24將序列TTTTTATTCTAGAATTAGAG(它從E6起點(diǎn)(圖1(b)劃線部分)的210位核苷酸處開始)突變?yōu)樾蛄蠺TTCTACAGTAGAATCAGAG(pIMS8.2-圖2)(所改變的核苷酸以黑體表示)。進(jìn)行這一改變的第二個(gè)目的是從HPV18E6序列中除去序列TTTTTAT，該序列是早期牛痘病毒轉(zhuǎn)錄酶的潛在終止信號(Rohrmannetal.，Cell，46，1029，1986)。牛痘病毒的來源及其繁殖用牛痘病毒W(wǎng)yeth毒株構(gòu)建治療病毒。為了進(jìn)行遺傳操作而將其在Vero細(xì)胞中繁殖，并在人二倍體成纖維細(xì)胞系MRC5中生產(chǎn)最終的治療病毒原種。這兩種細(xì)胞系均得自NationalInstituteofBiologicalStandarclsandControl，SouthMims，U.K.牛痘病毒W(wǎng)yeth株、Vero細(xì)胞以及MRC5細(xì)胞系也可得自AmericanTypeCultureCollection，12301.ParklawnDrive，Rockville，Maryland20852，USA。鑒定和克隆來自牛痘病毒的中性位點(diǎn)中性位點(diǎn)的敘述為了將乳頭狀瘤病毒基因插入牛痘病毒基因組，選擇具有兩種特性的位點(diǎn)。首先，它們應(yīng)該是非必要區(qū)，即將外源基因插入這些位點(diǎn)后對牛痘病毒任何功能的破壞并未超過使病毒不能在組織培養(yǎng)液中生長的程度。其次，它們應(yīng)該是中性位點(diǎn)，即將外源基因插入這些位點(diǎn)后并不導(dǎo)致牛痘病毒減毒水平的提高或降低。通過觀察牛痘病毒胸苷激酶(TK)基因可看出這兩個(gè)因素之間的差別。它為一非必要區(qū)，因此，帶有插入在TK基因中的基因的病毒能夠在組織培養(yǎng)中良好生長(Mackettetal，J.Virol，49，857，1984)。但是，已發(fā)現(xiàn)這類病毒在體內(nèi)則大大減毒(Bulleretal.，Nature317，813，1985)。為了進(jìn)行預(yù)防接種，這種減毒的增強(qiáng)可能是需要的。但是，在所要治療的疾病的危險(xiǎn)明顯地超過與疫苗相關(guān)的并發(fā)癥所帶來的危險(xiǎn)的免疫治療方法中，往往并不希望使用減毒病毒，因?yàn)闇p毒病毒可能會(huì)損害對乳頭狀瘤病毒抗原的免疫應(yīng)答。因此，申請人已鑒定出他們認(rèn)為不會(huì)使病毒進(jìn)一步減毒的位點(diǎn)，并將其命名為“中性位點(diǎn)”。通過仔細(xì)分析WR株的DNA序列而在病毒基因組中鑒定出這些位點(diǎn)。最初是通過在鼠腦中傳代Wyeth株而得到WR株。因此，這兩種病毒株是密切相關(guān)的。圖19、20和21顯示了含有所選擇的中性位點(diǎn)的WR基因組的三個(gè)區(qū)的核苷酸序列。根據(jù)以上所討論的標(biāo)準(zhǔn)已選擇出如下的四個(gè)中性位點(diǎn)(A-D)位點(diǎn)ASalF17R和SalF19R之間的缺口。位點(diǎn)BSalF19R和SalF20.5R之間的缺口。位點(diǎn)C在SalG2R中，為潛在的非功能性基因。位點(diǎn)D在HindB3.5R中，為潛在的非功能性基因?？衫萌缦抡归_的DNA序列鑒定這些位點(diǎn)(A-D)，所有這些序列的長度均為40個(gè)核苷酸ACTATCTACCAGATTATTATGTGTTATAAGGTACTTTTTCTBTATTGTGCTACTGATTCTTCACAGACTGAAGATTGTTGAACTCTCTTAAAATGGTTGAGACCAAGCTTCGTTGTAGAAACADTGAGGCTACCTCGACATACGTGTGCGCTATCAAAGTGGAA在其它病毒株中這些序列可能有一些變化，但仍與上述序列高度同源。具體地說，位點(diǎn)與上述序列可能至少有90%、最好是95%的同源性。圖3～5顯示了起始密碼子和開放讀碼(ORF)在圖19、20和21所示的牛痘病毒基因組的區(qū)域中的分布。圖6～8顯示的是同樣的區(qū)域，它顯示了每一讀碼與所期望的牛痘基因密碼子使用圖的符合程度。在每一方向?yàn)樗腥N可能的讀碼繪制密碼子使用圖(StadenR.，NuclAcidsRes.12，521，1984;Staden，R.，NuclAcidsRes.12，551，1984)。在這些密碼子使用圖中，自橫軸延伸的短垂直線代表起始密碼子。位于橫軸上方的較長的垂直線代表終止密碼子。這種圖在幫助測定某一特定ORF是否為真正的牛痘基因方面非常有用。在很可能存在一真正基因時(shí)，密碼子使用圖將在起始密碼子與終止密碼子之間升高。例如，從圖7中可以看出，密碼子使用圖升高至SalG2RORF區(qū)之上(虛線說明該讀碼與大部分預(yù)期密碼子使用一致)。對于另外兩個(gè)讀碼，該圖顯示它們不與牛痘密碼子使用相符。用“gk部分”表示并以破折線標(biāo)記的峰也與牛痘密碼子用法非常一致?？傊嬲幕虮仨毱鹗加谄鹗济艽a子，終止于終止密碼子，并在其長度上應(yīng)與牛痘密碼子用法一致。在大多數(shù)情況下，在該基因之外顯著喪失了與牛痘密碼子用法的一致性。下面進(jìn)一步敘述中性位點(diǎn)。位點(diǎn)ASalF17R和SalF19R之間的缺口位點(diǎn)A已在圖3和6中標(biāo)出。圖9顯示了實(shí)際的DNA序列及該位點(diǎn)任一側(cè)上ORF的翻譯產(chǎn)物，從中可以看出位點(diǎn)A位于SalF17R和SalF19R之間的基因間區(qū)域內(nèi)。它被置于SalF19R上游約195堿基處以避開與該基因相關(guān)的任何啟動(dòng)子成分，如果SalF17R基因?yàn)橐辉缙诨?，則序列TTTTTCT(以斜體字表示)將作為該基因的早期RNA轉(zhuǎn)錄的終止子。但是，該位點(diǎn)位于它們中第一個(gè)的下游，因此當(dāng)它存在時(shí)并不影響轉(zhuǎn)錄的早期終止。觀察圖6可發(fā)現(xiàn)，在該點(diǎn)的相反鏈上不存在可識別的基因，因此，該序列的位置適于作為中性插入位點(diǎn)。位點(diǎn)BSalF19R和SalF20.5R之間的缺口位點(diǎn)B已在圖3和6中標(biāo)出。圖10顯示了實(shí)際的DNA序列及該位點(diǎn)任一側(cè)上ORF的翻譯產(chǎn)物?？梢钥闯觯稽c(diǎn)B位于SalF19R和SalF20.5R之間的基因間區(qū)域內(nèi)。圖6顯示它位于具有很高的牛痘密碼子使用區(qū)域內(nèi)，但該區(qū)域并不形成真正基因(無起始密碼子)。另外，圖6表明Sal20.5R不是一完整基因，因?yàn)樵谠摶虻钠瘘c(diǎn)處顯著地喪失了與牛痘密碼子用法的一致性。在SalF20.5R為一真正基因的情況下，將位點(diǎn)B置于SalF20.5R上游約70堿基處，能夠很好地避開與該基因相關(guān)的任何啟動(dòng)子成分(注許多牛痘啟動(dòng)子成分位于該基因起始子上游約35堿基處)。另外，SalF20R無受位點(diǎn)B影響的TTTTTNT(N＝任何核苷酸)轉(zhuǎn)錄終止信號。因此，該序列位置適于作為中性插入位點(diǎn)。位點(diǎn)CSalG2R內(nèi)的一潛在非功能性基因位點(diǎn)C已在圖4中標(biāo)出。ORFSalG2R與酵母鳥苷酸激酶(GK)基因具有顯著的相似性。這一相似性示于圖11中。已將SalG2RORF上游的序列(但在不同的讀碼中)加至SalG2R中以觀察它與GK的配對是否延伸到原始開放讀碼邊界之外。配對似乎延伸到SalG2RORF的5′末端之外。尤其是，酵母GK基因中一個(gè)重要的位點(diǎn)，即ATP/GTP結(jié)合位點(diǎn)(劃線表示)僅在SalG2RORF上游的讀碼序列中配對。因此，SalG2R基因很可能不是一種具有活性的鳥苷酸激酶，并可被稱作“假基因”。如果該基因正如申請人所推測的那樣不具有活性，那么它可被用作中性插入位點(diǎn)。位點(diǎn)D位于HindB3.5R內(nèi)的一潛在非功能性基因圖5顯示位點(diǎn)D位于被稱作HindB3.5R的區(qū)域內(nèi)。盡管該區(qū)域與牛痘密碼子的用法一致，但由于缺少起始密碼子，因此它并不是一真正基因。圖8所示的密碼子用法圖說明它可能曾經(jīng)是一功能性基因，并很可能與HindB3R相連(在這里密碼子用法發(fā)生了遠(yuǎn)離HindB3RORF終止密碼子的移動(dòng)，這表明HindB3R的最后部分嚴(yán)格地講不是該基因的一部分)。因此，HindB3.5R很可能不是一活性基因，可用作中性插入位點(diǎn)。圖12顯示了實(shí)際的DNA序列以及該位點(diǎn)任一側(cè)上的ORF的翻譯產(chǎn)物。從中可以看出，位點(diǎn)D位于HindB3R和HindB4R之間的基因間區(qū)域內(nèi)，并且也位于非功能性的HindB3.5R內(nèi)。制備用于克隆中性位點(diǎn)的載體為了將外源遺傳信息插入如上所述的中性位點(diǎn)，必須首先將中性位點(diǎn)的DNA拷貝以及得自牛痘基因組的適當(dāng)數(shù)量的側(cè)翼DNA(每側(cè)約500個(gè)堿基)克隆至質(zhì)粒載體中。然后利用這些質(zhì)粒將外源DNA引入牛痘病毒基因組中;插入基因周圍的牛痘病毒“側(cè)翼序列”的作用是在質(zhì)粒DNA和病毒DNA之間產(chǎn)生同源重組，從而將外源基因插入到所需的位置上?？寺≈行晕稽c(diǎn)序列按如下方法構(gòu)建含有中性位點(diǎn)的側(cè)翼區(qū)的質(zhì)粒。按照Esposito等人的方法(J.VirolMeth，2，175，1981)由牛痘病毒W(wǎng)yeth株制備出DNA，利用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)從牛痘病毒W(wǎng)yeth株的DNA中取出約1000堿基對的片段。在所選擇的中性位點(diǎn)的任一側(cè)選擇約500bp的寡核苷酸對，這些寡核苷酸是根據(jù)WR株的序列在WR株中與Copenhagen株(Goebeletal.，Virology179247，1990)有著相同序列的區(qū)域內(nèi)選擇的。該寡核苷酸中整合了限制酶識別序列，從而能夠被很容易地克隆至質(zhì)粒中。對于中性位點(diǎn)A、B和D，限制性酶切位點(diǎn)為ECORI和HindIII。對于中性位點(diǎn)C，由于在所選擇的側(cè)翼序列中有一個(gè)內(nèi)部HindIII位點(diǎn)，所以用Sphl位點(diǎn)代替了HindIII位點(diǎn)。下面列出了用于PCR的寡核苷酸位點(diǎn)A左MB16位點(diǎn)A右MB17位點(diǎn)B左MB24位點(diǎn)B右MB25位點(diǎn)C左MB18位點(diǎn)C右MB19位點(diǎn)D左MB22位點(diǎn)D右MB23然后利用這些寡核苷酸對，通過PCR擴(kuò)增制備出約1kb的DNA片段，經(jīng)用ECORI和HindIII(對位點(diǎn)A、B和D)消化或用ECORI和Sphl(對位點(diǎn)C)消化并克隆至經(jīng)HindIII和ECORI消化的pUC118(圖13)中就產(chǎn)生了質(zhì)粒pIMMC7a、pIMMC7b、pIMMC7c和pIMMC7d。為在中性位點(diǎn)進(jìn)行插入而產(chǎn)生特定的限制性酶切位點(diǎn)在每一質(zhì)粒中所選定的位置加進(jìn)合適的限制性酶切位點(diǎn)。這一目的是利用含有所需的新的特定位點(diǎn)及通過15堿基序列與任一側(cè)側(cè)連的寡核苷酸(見下)通過定點(diǎn)誘變達(dá)到的。以此方式修飾的質(zhì)粒稱為pIMMC8a-d(圖13)。原始質(zhì)粒加進(jìn)了寡核苷酸位點(diǎn)的新質(zhì)粒pIMMC7aMB35SnaBlpIMMC8apIMMC7bMB36HpalpIMMCbpIMMC7cMB37StulpIMMC8cpIMMC7dMB38SnaBlpIMMC8d牛痘病毒早期/晚期啟動(dòng)子序列的克隆按照下面所述的方法通過PCR擴(kuò)增，由牛痘病毒基因組DNA制備出P7.5和H6啟動(dòng)子。人工合成含有如下的限制酶切割位點(diǎn)的一對互補(bǔ)寡核苷酸(S7和S8)HindIII、SnaB1、Hpal、HindIII、SalI、Ncol、Smal、SnaBl和EcoRI，從而使得退火后在該寡核苷酸對的一端出現(xiàn)HindIII相容性的懸垂端，在另一端出現(xiàn)ECORI相容性的懸垂端。使這兩種寡核苷酸退火并插入到經(jīng)ECOR1和HindIII切割的pUC118(圖14)中。所產(chǎn)生的載體稱為pIMMC3。利用寡核苷酸MB15(上游退火并包括了5′-Sal1位點(diǎn))和MB7(下游退火并包括了5′-HindIII位點(diǎn))通過PCR擴(kuò)增從牛痘病毒W(wǎng)R株中取出含有H6啟動(dòng)子的約180bp的DNA分子。將該分子克隆至經(jīng)HindIII和SalI切割的pIMMC3中以產(chǎn)生pIMMC4a(圖14)。然后利用寡核苷酸MB32(上游退火并包括5′-Sal1位點(diǎn))和MB33(下游退火并包括5′Ncol位點(diǎn))通過PCR擴(kuò)增從牛痘病毒W(wǎng)R株中取出含有P7.5啟動(dòng)子的約200bp的DNA分子，將該分子克隆至經(jīng)Ncol和Sal1切割的pIMMC3中，產(chǎn)生出pIMMC14b。構(gòu)建治療病毒根據(jù)如上所述的成分產(chǎn)生含有和表達(dá)來自HPV16和HPV18的E6-E7蛋白的重組牛痘病毒所需的方法涉及如下所述的5個(gè)主要步驟ⅰ)將經(jīng)過修飾的E6-7基因克隆至牛痘早期啟動(dòng)子序列的下游通過HindIII和Smal消化從pIMS7.2切下含有經(jīng)過修飾的HPV16E6-7序列的DNA片段，并克隆至經(jīng)HindIII和Hpal消化的pIMMC4a中，產(chǎn)生出pIMS12(圖15)。通過用Ncol和Smal消化從pIMS8.2中切割出含有經(jīng)過修飾的HPV18E6-7序列的DNA片段，并克隆至經(jīng)Ncol和Smal消化的pIMMC14b中，產(chǎn)生出pIMS14(圖15)。ⅱ)制備含有HPV16和HPV18E6-7序列及其上游牛痘啟動(dòng)子的質(zhì)粒載體用Sal1和Sma1從pIMS14切下含有HPV18E6-7以及上游P7.5啟動(dòng)子的DNA片段，并將其插入至經(jīng)Sal1和Sma1消化的pIMS12中以產(chǎn)生pIMS15(圖15)。ⅲ)將HPVE6-7/啟動(dòng)子“二元彈”插入至含有中性位點(diǎn)的質(zhì)粒利用SnaB1從pIMS15切下含有HPV16和HPV18E6-7編碼區(qū)及其上游啟動(dòng)子成分的DNA片段，并將其插入至適當(dāng)切割的含有中性位點(diǎn)的質(zhì)粒pIMMC7a-d中。圖16顯示了這一步驟，且將所產(chǎn)生的質(zhì)粒稱為pIMMC9a-d。ⅳ)通過同源重組將中性位點(diǎn)DNA及介入的HPV序列加進(jìn)牛痘病毒基因組中以產(chǎn)生表達(dá)兩種修飾HPVE6-7序列的重組病毒純化重組質(zhì)粒pIMMC9a-d，并按照常規(guī)方法(Mackettetal.，inD.M.Glover(ed)DNACloningaPracticalApproach，OxfordandWashingtonDCIRLPress，1985)將其重組至牛痘中(圖17)。利用放射性標(biāo)記的HPV特異性序列作為探針鑒定已獲得了HPV序列的病毒。將病毒噬斑留在硝酸纖維素上(VillarealandBerg，Science196，183，1977)，并用來自含有HPV18E6-7基因的pIMS14的放射性標(biāo)記Ncol-Smal片段進(jìn)行探測。然后從瓊脂糖涂層上分離重組病毒，并純化噬斑三次。利用得自HPVE6和E7基因的DNA探針通過對純化的病毒DNA進(jìn)行Southern吸印而檢測出合適的DNA序列，并利用對HPVE6和E7蛋白特異性的抗血清通過Western吸印而檢測合適序列的表達(dá)。在MRC5細(xì)胞中克隆治療病毒通過在Vero細(xì)胞中培養(yǎng)制備出最終重組病毒的原種，并用它感染MRC5細(xì)胞，該細(xì)胞被認(rèn)為是適用于制備適用作人疫苗的材料。利用常規(guī)方法對該病毒進(jìn)行噬斑純化三次，并最終制備出用于臨床的原種。證實(shí)正確的HPVDNA插入子的存在對該原種病毒樣品再次進(jìn)行檢測，以證實(shí)具有正確構(gòu)型的病毒DNA的存在以及正確的病毒蛋白的表達(dá)。圖22顯示了對重組牛痘病毒(V9a.1)所進(jìn)行的PCR分析，其中HPVDNA盒插入在位點(diǎn)A。(a)組所示的圖形說明了所預(yù)期的DNA片段中是否已插入了正確的DNA。從(b)組可以看出，所產(chǎn)生的PCR產(chǎn)物的實(shí)際圖形與所預(yù)期的一致。證實(shí)HPVDNA插入子的表達(dá)然后對重組病毒進(jìn)行檢測，以證實(shí)預(yù)期HPV蛋白的表達(dá)。圖23顯示了這一分析的一個(gè)實(shí)例。用重組病毒V9a.1(在位點(diǎn)A插入的HPVDNA)感染Vero細(xì)胞，并利用對HPV16E7蛋白(Camvir3)和對HPV18E7蛋白(7E10)特異性的單克隆抗體通過Western吸印檢測細(xì)胞，以證實(shí)HPVE67融合蛋白的存在?？梢钥闯觯@兩種單克隆抗體均能夠特異性地識別被重組病毒V9a.1感染的細(xì)胞中具有預(yù)期大小的蛋白質(zhì)，而不能識別被對照親代病毒W(wǎng)yeth菌株感染的細(xì)胞中的蛋白質(zhì)。這些被識別的蛋白質(zhì)與通過編碼預(yù)期的HPV融合蛋白(HPV16E67和HPV18E67)的mRNA的體外轉(zhuǎn)譯合成的蛋白質(zhì)一起共同遷移。這一實(shí)驗(yàn)說明了來自重組病毒的異源基因序列的成功表達(dá)。HPVDNA插入子的穩(wěn)定性對于臨床應(yīng)用的重組病毒，很重要的一點(diǎn)就是在經(jīng)過多次病毒傳代后插入序列仍具有遺傳穩(wěn)定性，并精心設(shè)計(jì)DNA插入子以促進(jìn)這種遺傳穩(wěn)定性。為了證實(shí)重組病毒基因組中HPV信息的穩(wěn)定性，將病毒在Vero細(xì)胞中連續(xù)傳代9次(感染復(fù)數(shù)＝10pfu/細(xì)胞)。然后挑出20個(gè)噬斑分離物，按圖22所述的PCR分析法對正確的HPVDNA插入子的存在進(jìn)行分析。圖24顯示了得自重組病毒A的數(shù)據(jù)。所有20個(gè)病毒分離物均保留了在預(yù)期的遺傳排列中的HPV信息，這說明它具有很高程度的遺傳穩(wěn)定性。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)將重組病毒的毒力與親代Wyeth株的毒力在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中進(jìn)行比較。對每組20只小鼠中的每一只鼻內(nèi)接種總體積為20μl的107pfuWyeth株或重組病毒。于接種后第1、3和5天各處死兩只小鼠，并解剖取出其肺。然后通過研磨組織并通過標(biāo)準(zhǔn)的牛痘病毒噬斑檢測法檢測勻漿而測定出肺內(nèi)存在的病毒量。下表顯示了對重組病毒V9a.1(在位點(diǎn)A插入的HPV信息)進(jìn)行這一實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。從中可以看出，重組病毒保留了在小鼠中復(fù)制的能力，且在感染動(dòng)物肺中所產(chǎn)生的病毒水平與在親代Wyeth株中所觀察到的水平相似。表</tables>治療應(yīng)用通過感染MRC5細(xì)胞制備出重組病毒的原種，并將其調(diào)至不小于108pfu/ml的濃度。將20μl該材料施用于患者臂上，然后按照為預(yù)防天花而種入牛痘疫苗所用的標(biāo)準(zhǔn)方法，用分叉針頭劃破患者的臂滴入病毒。權(quán)利要求1.用作免疫治療劑或疫苗的重組病毒載體，它包括至少一對與該病毒異源的核苷酸序列，且該序列含有足以使得它們之間發(fā)生預(yù)期重組的同源序列；其中所說的核苷酸序列對以一定的方式排列在病毒載體中，使它們按彼此相反的方向插入以減少導(dǎo)致該序列部分喪失或完全喪失的重組行為的可能性，且該病毒載體能夠感染哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞并在該宿主細(xì)胞中將異源核苷酸序列表達(dá)為多肽。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組病毒載體，其中至少一對核苷酸序列編碼部分或全部的人乳頭狀瘤病毒(HPV)野生型蛋白或與該野生型蛋白發(fā)生免疫交叉反應(yīng)的突變蛋白。3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的重組病毒載體，其中核苷酸序列對編碼部分或全部的HPV野生型蛋白HPV16E7和HPV18E7或與其發(fā)生免疫交叉反應(yīng)的突變蛋白。4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的重組病毒載體，其中核苷酸序列對編碼部分或全部HPV野生型蛋白質(zhì)HPV16E6和HPV18E6或與其發(fā)生免疫交叉反應(yīng)的突變蛋白。5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的重組病毒載體，它另外還包括一對編碼部分或全部HPV野生型蛋白HPV16E6和HPV18E6或與其發(fā)生免疫交叉反應(yīng)的突變蛋白的核苷酸序列。6.根據(jù)前面所述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的重組病毒載體，其中不同對的兩個(gè)或多個(gè)核苷酸序列可被融合在一起以形成單一的開放讀碼。7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的重組病毒載體，其中融合是通過編碼小的中性氨基酸的單一密碼子完成的。8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的重組病毒載體，其中氨基酸為甘氨酸。9.根據(jù)權(quán)利要求5所述的重組病毒載體，其中核苷酸序列對按圖26所示的任何一種方式排列在病毒載體中。10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的重組病毒載體，它包括具有編碼得自HPV16的部分或全部野生型蛋白E6和E7的融合遺傳序列的第一開放讀碼;以及具有編碼得自HPV18的部分或全部野生型蛋白E6和E7的融合遺傳序列的單獨(dú)的第二開放讀碼;其中第一和第二開放讀碼以相反方向插入，從而使得ⅰ)HPV16和HPV18的E6編碼序列均位于HPV16和HPV18的E7編碼序列之間;或ⅱ)HPV16和HPV18的E7編碼序列均位于HPV16和HPV18的E6編碼序列之間;且其中任何所說的野生型蛋白均可被與其發(fā)生免疫交叉反應(yīng)的突變蛋白所取代。11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的重組病毒載體，其中第一和第二開放讀碼各自具有相應(yīng)的啟動(dòng)子，且?guī)в懈髯詥?dòng)子的兩個(gè)開放讀碼在病毒中的排列彼此相連。12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的重組病毒載體，其中ⅰ)啟動(dòng)子位于第一和第二開放讀碼之間，從而使得開放讀碼向外轉(zhuǎn)錄;或ⅱ)啟動(dòng)子位于第一和第二開放讀碼之外，從而使得開放讀碼向內(nèi)轉(zhuǎn)錄。13.根據(jù)權(quán)利要求9-12中任一項(xiàng)所述的重組病毒載體，它包括具有編碼部分或全部得自HPV16的野生型蛋白E6和E7的融合遺傳序列的第一開放讀碼;和具有編碼部分或全部得自HPV18的野生型蛋白E6和E7的融合遺傳序列的單獨(dú)的第二開放讀碼;其中HPV16和HPV18的E6編碼序列均位于HPV16和HPV18的E7編碼序列之間;且每一開放讀碼均有其相應(yīng)的啟動(dòng)子，該啟動(dòng)子位于第一和第二開放讀碼之間，因此開放讀碼是向外轉(zhuǎn)錄的;且其中任何所說的野生型蛋白均可被與其發(fā)生免疫交叉反應(yīng)的突變蛋白所取代。14.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的重組病毒載體，其中所說的核苷酸序列對中的一個(gè)或兩個(gè)核苷酸序列發(fā)生改變，使得它們與編碼野生型HPV蛋白的核苷酸序列等價(jià)對相比同源性減少。15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的重組病毒載體，其中核苷酸序列的改變并不導(dǎo)致所編碼的氨基酸序列的改變。16.根據(jù)權(quán)利要求3所述的重組病毒載體，其中野生型蛋白HPV16E7和HPV18E7均被與該野生型蛋白高度同源的突變蛋白所取代，且其中野生型蛋白HPV16E7的cys24和glu26殘基以及野生型蛋白HPV18E7的cys27和glu29殘基均被甘氨酸殘基所取代。17.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的重組病毒載體，其中所說的異源核苷酸序列可包括圖1(a)和1(b)所示的部分或全部序列。18.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的重組病毒載體，它得自牛痘病毒。19.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的重組病毒載體，其中核苷酸序列被插入在病毒載體的一個(gè)或多個(gè)中性位點(diǎn)，核苷酸序列的插入對中性位點(diǎn)的破壞對與病毒在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的復(fù)制能力相關(guān)的病毒功能幾乎不產(chǎn)生不良影響。20.根據(jù)權(quán)利要求19所述的重組病毒載體，它得自牛痘病毒，且其中的中性位點(diǎn)為下列的一個(gè)或多個(gè)A)至少包括部分如下序列的WR株的SalIF17R和SalIF19R之間的缺口CTATCTACCAGATTATTATGTGTTATAAGGTACTTTTTCT；B)至少包括部分如下序列的WR株SalIF19R和SalIF20.5R之間的缺口TATTGTGCTACTGATTCTTCACAGACTGAAGATTGTTGAA；C)WR株的SalIG2R中至少包括部分如下序列的區(qū)域TCTCTTAAAATGGTTGAGACCAAGCTTCGTTGTAGAAACA；D)WR株的HindB3.5R中至少包括部分如下序列的區(qū)域TGAGGCTACCTCGACATACGTGTGCGCTATCAAAGTGGAA；E)與上面所鑒定的序列A)-D)至少同源90%的序列。21.制備權(quán)利要求19或20所述的重組病毒載體的方法，它包括將所說的異源核苷酸序列插入至病毒載體的一個(gè)或多個(gè)中性位點(diǎn)，這一插入對中性位點(diǎn)的破壞基本上對病毒的復(fù)制能力無不利影響，且其中中性位點(diǎn)已通過如下方法被預(yù)先鑒定(a)分析病毒基因組以鑒定出很可能編碼功能性基因的開放讀碼;和(b)在開放讀碼之間選擇功能性基因的位點(diǎn)，或在序列中選擇非功能性基因的位點(diǎn)。22.利用權(quán)利要求21的方法可獲得的重組病毒載體。23.一種方法，它包括利用權(quán)利要求1-20或22中任一項(xiàng)的重組病毒載體生產(chǎn)用作免疫治療劑或疫苗的藥物，用以治療由HPV感染所引起的疾病，如子宮頸癌。24.一種方法，它包括利用權(quán)利要求1-20或22中任一項(xiàng)的重組病毒載體特異性地活化免疫系統(tǒng)中針對HPV蛋白的細(xì)胞。全文摘要本發(fā)明提供了一種用作免疫治療劑或疫苗的重組病毒載體。該重組病毒載體包括至少一對異源于病毒的核苷酸序列且含有足以在它們之間產(chǎn)生重組的同源序列。該核苷酸序列對在病毒載體中彼此反向排列。該病毒載體能夠感染哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞并在宿主細(xì)胞中將異源核苷酸序列表達(dá)為多肽。文檔編號C12P41/00GK1064892SQ9210174公開日1992年9月30日申請日期1992年3月14日優(yōu)先權(quán)日1991年3月14日發(fā)明者M(jìn)·E·G·伯瑟爾,S·C·伊格斯,A·J·穆諾申請人:免疫有限公司