本發(fā)明屬于水產(chǎn)養(yǎng)殖領(lǐng)域，具體涉及一種用于靈芝鱉養(yǎng)殖的飼料及其養(yǎng)殖方法。
背景技術(shù)：
甲魚含有豐富的蛋白質(zhì)、脂肪、維生素和礦物質(zhì)，營養(yǎng)豐富，味道鮮美，是滋陰補陽、破結(jié)軟堅的民間常用藥物。鱉的肉味鮮美，是一種高級水產(chǎn)品，中醫(yī)藥認為它有活血化淤、滋補強身的功效，通常將它作為病后或手術(shù)后身體虛弱的滋補保健食品。但是過度開發(fā)以及自然生存環(huán)境的不斷破壞，使得野生中華鱉資源減少，人工養(yǎng)鱉產(chǎn)業(yè)迅速發(fā)展。然而高密度集約化的養(yǎng)殖，使得商品鱉的品質(zhì)下降，口感降低。隨著我國農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)的進一步深入調(diào)整和人們生活水平、消費觀念的進一步提升，安全質(zhì)優(yōu)的養(yǎng)殖產(chǎn)品已成為主要的發(fā)展方向。
隨著甲魚養(yǎng)殖業(yè)快速發(fā)展和集約規(guī)?；潭忍岣撸瑢ε浜巷暳系囊蕾囈搽S之增強。目前我國的甲魚配合飼料普遍存在著蛋白質(zhì)含量過高現(xiàn)象，如中國專利申請cn102511694b公開了一種生態(tài)鱉配合飼料，飼料的組分及各組分的重量份數(shù)為魚粉50-56份、α-淀粉20-24份、發(fā)酵豆粕3-5份、膨化大豆1-3份、液體魚油1-2份、啤酒酵母粉1-3份、蛋氨酸1-2份、賴氨酸1-2份、脫脂奶粉1-2份、蛋黃粉1-2份、復合礦物質(zhì)0.5份、復合維生素0.4份、磷酸二氫鈣1.5份，植酸酶0.1份，中草藥添加劑0.2份，海藻粉1份，卵磷脂1份，β-葡聚糖0.1份，保肝寧0.1份。中國專利申請cn102217749a公開了一種生物保健型甲魚配合飼料，其原料組分為：按質(zhì)量百分比計，白魚粉30-40％、紅魚粉10-20％；膨化豆粕4-10％；酵母粉6-12％；a-淀粉19-22％；發(fā)酵豆粕5-8％；谷朊粉2-5％；磷酸二氫鈣2-5％；酶制劑0.05-0.3％；微生物制劑0.1-0.3％；復合多維0.1-0.5％；復合多礦1-3％；50％氯化膽堿0.2-0.8％；保肝護膽添加劑0.1-0.5％，腸道黏膜修復添加劑0.3-0.6％。但是上述飼料中蛋白質(zhì)含量過高，飼料容易發(fā)霉，保存期縮短，同時又加重了甲魚的肝臟負擔，引起一系列代謝性疾病，長期投喂后引起甲魚生長緩慢、免疫力下降，降低養(yǎng)殖過程中甲魚的健康水平。
因此，有必要提供一種質(zhì)量穩(wěn)定，同時兼具促生長和提高免疫力作用的飼料。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明旨在提供一種用于靈芝鱉養(yǎng)殖的飼料及其養(yǎng)殖方法，該飼料添加了靈芝孢子粉，用該飼料喂養(yǎng)得到的甲魚口感好，具有活血補氣的功效。
為了達到上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：一種用于靈芝鱉養(yǎng)殖的飼料，包括以下重量份數(shù)的制備原料：靈芝孢子粉10～25份、紅薯粉10～20份、芋頭粉10～20份、馬鈴薯粉10～20份、α-淀粉15～22份、白魚粉6～12份、紅魚粉6～12份和防霉劑0.5～2份。
進一步地，所述飼料包括以下重量份數(shù)的制備原料：靈芝孢子粉20份、紅薯粉15份、芋頭粉15份、馬鈴薯粉12份、α-淀粉18份、白魚粉9份、紅魚粉9份和防霉劑1.5份。
進一步地，所述飼料包括以下重量份數(shù)的制備原料：靈芝孢子粉10份、紅薯粉10份、芋頭粉10份、馬鈴薯粉10份、α-淀粉15份、白魚粉6份、紅魚粉6份和防霉劑0.5份。
進一步地，所述飼料包括以下重量份數(shù)的制備原料：靈芝孢子粉25份、紅薯粉20份、芋頭粉20份、馬鈴薯粉20份、α-淀粉22份、白魚粉12份、紅魚粉12份和防霉劑2份。
進一步地，所述防霉劑為產(chǎn)酸菌發(fā)酵干粉。
進一步地，所述產(chǎn)酸菌發(fā)酵干粉由以下步驟制得：
挑取產(chǎn)酸菌一環(huán)接種于盛有20～30ml發(fā)酵培養(yǎng)基的250ml三角瓶中，32℃搖床震蕩培養(yǎng)12～18h，轉(zhuǎn)速100～150r/min；取發(fā)酵液，3500r/min離心10～15min，取上清液，凍干，即得；其中，所述發(fā)酵培養(yǎng)基ph為6.0，含葡萄糖15～20％、酵母膏0.1～0.5％和水80～85％。
進一步地，所述產(chǎn)酸菌選自丙酸桿菌、乳酸菌和醋酸桿菌中的一種。
進一步地，所述產(chǎn)酸菌選自丙酸桿菌。
進一步地，所述飼料還包括人胎盤間充質(zhì)干細胞提取物凍干粉0.05～1份。
進一步地，所述人胎盤間充質(zhì)干細胞提取物凍干粉由以下步驟制得：
s1、使用ph6.5～7.0、含血清的dmem培養(yǎng)基培養(yǎng)人胎盤間充質(zhì)干細胞至70～80％融合時，棄其原含血清培養(yǎng)液，用d-hank′s平衡鹽溶液洗滌細胞；
s2、去除平衡鹽溶液，使用含血清的dmem培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)人胎盤間充質(zhì)干細胞，培養(yǎng)至細胞培養(yǎng)基變色，收集上清液；
s3、過濾上清液，濃縮，除菌，加入凍干賦形劑和水，凍干，即得。
相應地，本發(fā)明還提供了一種制備上述的飼料的方法，包括以下步驟：
取靈芝孢子粉，粉碎，加入紅薯粉、芋頭粉、馬鈴薯粉、α-淀粉、白魚粉、紅魚粉和防霉劑，混合均勻，過篩，分裝，即得。
本發(fā)明另一目的在于提供一種靈芝鱉養(yǎng)殖方法，包括于每月前10～15天給鱉飼喂上述飼料或上述方法制備得到的飼料，每月后15～20天給鱉飼喂甲魚粉，日投料量占鱉體重的2～4％，經(jīng)24～36個月喂養(yǎng)，出塘。
本發(fā)明飼料中蛋白質(zhì)含量相比中國專利申請cn102511694b以及中國專利申請cn102217749a較低，但飼料的保存期仍然還有提升的空間。本發(fā)明發(fā)明人偶然發(fā)現(xiàn)產(chǎn)酸菌的發(fā)酵液具有一定的抑菌、防霉作用，經(jīng)過大量實驗以及資料調(diào)研，終于優(yōu)選出最佳的產(chǎn)酸菌，丙酸桿菌、乳酸菌以及醋酸桿菌，更優(yōu)選為丙酸桿菌。試驗證明，添加了丙酸桿菌發(fā)酵干粉的飼料，在貯藏第55天后，霉菌總數(shù)為6521×104，而不含有丙酸桿菌發(fā)酵干粉的飼料，在貯藏相同的天數(shù)后，飼料中霉菌總數(shù)達到18952×104。上述特殊效果的產(chǎn)生機制，尚不明確，發(fā)明人認為，可能是產(chǎn)酸菌發(fā)酵液含有有機酸，而有機酸具有腐蝕作用，加上發(fā)酵液中的一些其他成分的相互作用，因而使得其具有優(yōu)異的防霉的作用。需要說明的是，與有機酸相比，其所達到的防霉效果更優(yōu)異，這可能是與發(fā)酵液中存在的一些其他成分有關(guān)。
另一方面，由于甲魚食用含較高蛋白含量的飼料后，排泄物質(zhì)含氮、磷，高密度的養(yǎng)殖致使水體氮、磷嚴重超標，氨氣等有害物質(zhì)濃度過大，水質(zhì)惡化，污染嚴重，甲魚長期生活在這樣的環(huán)境中，體質(zhì)嚴重下降，免疫功能出現(xiàn)問題，病害經(jīng)常發(fā)生，藥物頻繁使用，形成了甲魚養(yǎng)殖過程的惡性循環(huán)。在這樣的一個循環(huán)中，飼料是主要的影響原因。因此，如果在飼料中添加一種免疫增強劑，即有可能解決上述問題。經(jīng)過了長時間的研究，本發(fā)明發(fā)明人研制出一種免疫增強劑，人胎盤間充質(zhì)干細胞提取物，其能夠顯著提高甲魚血清中g(shù)sh-px(谷胱甘肽過氧化酶)、t-sod(總超氧化物岐化酶)和lsz(溶菌酶)的活力，同時顯著降低甲魚血清中ast(谷草轉(zhuǎn)氨酶)和alp(堿性磷酸酶)的活力。同時，該免疫增強劑的存在還能降低甲魚肌原纖維直徑，提高甲魚肌肉中蛋白和脂肪的含量，提升甲魚肉質(zhì)性能。
另外，本發(fā)明首次往飼料中添加靈芝孢子粉，經(jīng)該飼料喂養(yǎng)得到的甲魚，保健價值高，營養(yǎng)豐富，口感好。甲魚一般養(yǎng)殖周期為2～4年，而飼喂本發(fā)明飼料可使甲魚的養(yǎng)殖周期縮短為2～3年。
本發(fā)明具有以下優(yōu)點：
1)本發(fā)明飼料配方搭配科學合理，營養(yǎng)全面，飼料轉(zhuǎn)化率高，甲魚的養(yǎng)殖周期短，經(jīng)該飼料喂養(yǎng)的甲魚，肉質(zhì)嫩滑，保健價值高。
2)本發(fā)明免疫增強劑的存在能夠提高甲魚的免疫功能，同時降低甲魚中肌原纖維的直徑，提高甲魚肌肉中蛋白和脂肪的含量。
3)本發(fā)明飼料質(zhì)量穩(wěn)定，防霉效果好，保存期長，顯著優(yōu)于普通飼料。
具體實施方式
以下通過實施例形式的具體實施方式，對本發(fā)明的上述內(nèi)容作進一步的詳細說明。但不應將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下實施例。
本發(fā)明靈芝孢子粉購自廣州市玉芝園生物科技有限公司；紅薯粉購自廣州金糧食品有限公司；芋頭粉購自江蘇振亞食品有限公司；馬鈴薯粉購自興化市綠寶食品有限公司；白魚粉、紅魚粉購自廣東中飼實業(yè)股份有限公司；甲魚粉購自西安萬滋生物科技有限公司。
實施例1、丙酸桿菌發(fā)酵干粉的制備
挑取丙酸桿菌一環(huán)接種于盛有30ml發(fā)酵培養(yǎng)基的250ml三角瓶中，32℃搖床震蕩培養(yǎng)12h，轉(zhuǎn)速150r/min；取發(fā)酵液，3500r/min離心10min，取上清液，凍干，即得；其中，所述發(fā)酵培養(yǎng)基ph為6.0，含葡萄糖15％、酵母膏0.5％和水84.5％。
實施例2、乳酸菌發(fā)酵干粉的制備
挑取乳酸菌一環(huán)接種于盛有30ml發(fā)酵培養(yǎng)基的250ml三角瓶中，32℃搖床震蕩培養(yǎng)12h，轉(zhuǎn)速150r/min；取發(fā)酵液，3500r/min離心10min，取上清液，凍干，即得；其中，所述發(fā)酵培養(yǎng)基ph為6.0，含葡萄糖15％、酵母膏0.5％和水84.5％。
實施例3、人胎盤間充質(zhì)干細胞提取物凍干粉的制備
(1)胎盤標本處理：從廣東省廣州市三甲醫(yī)院婦產(chǎn)科手術(shù)臺獲得足月、剖宮產(chǎn)、健康母體胎盤，經(jīng)檢驗檢疫合格后(證實無hiv、hbv等傳染性疾病)，在無菌條件下剝除母體蛻膜，剪取小塊胚胎蛻膜側(cè)胎盤組織，放入含抗生素的d-hank′s液中，洗盡血液，剔除血管，并剪成1.0mm3小塊，用含質(zhì)量百分比0.25％的胰蛋白酶和質(zhì)量百分比0.02％edta的消化液消化，得細胞懸浮液；
(2)不連續(xù)percoll梯度密度分離：在50ml離心管中逐層鋪入7個密度的percoll分離液，每個密度5ml，再緩緩加入5ml細胞懸液，使用水平離心機室溫下1200g離心20min，小心棄除離心管20ml刻度以上的液體，收集12.5～20.0ml刻度的細胞層和12.5～7.5ml刻度的液體；在離心管15～20ml刻度處可見明顯的白色云霧狀細胞層，此處對應的percoll相對密度為1.046～1.059，是滋養(yǎng)細胞存在的區(qū)域；離心管10ml刻度附近可見不明顯的細胞層，此處密度為1.072，是淋巴細胞和胎盤間充質(zhì)干細胞存在的區(qū)域；分別放入不同離心管里，用d-hank’s液稀釋5倍后，室溫下1000g離心15min，離心管底可見白色細胞團；
(3)純化：用含體積分數(shù)為10％胎牛血清(fbs)的dmem/f12、丙酮酸鹽、10毫克/升亞硒酸鈉胰島素、2毫克/升乙醇胺和20毫微克/ml的bfgf配制成懸浮液，將密度梯度離心后的滋養(yǎng)細胞進行重懸，用差速貼壁法去除成纖維細胞后計數(shù)，獲得的滋養(yǎng)細胞量可達6.15×108個；
(4)傳代與鑒定：將上述滋養(yǎng)細胞接種于加入含有體積分數(shù)15％fbs的dmem/f12培養(yǎng)液放置于37℃、體積分數(shù)5％的co2飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，每3d補加新鮮培養(yǎng)液，按1×104cell/cm2傳代培養(yǎng)，培養(yǎng)液換為體積分數(shù)10％fbs的dmem/f12培養(yǎng)基，細胞代數(shù)記為p1代；待細胞達到70～90％融合后，消化，按1×104cell/cm2傳代培養(yǎng)，細胞代數(shù)記為p2代，收集p2代細胞；通過流式細胞儀鑒定細胞表面抗原，檢測結(jié)果顯示得到的細胞與人胎盤間充質(zhì)干細胞特征一致，說明分離培養(yǎng)細胞為人胎盤間充質(zhì)干細胞；
(5)使用ph7.0、含血清的dmem培養(yǎng)基培養(yǎng)人胎盤間充質(zhì)干細胞至80％融合時，棄其原含血清培養(yǎng)液，用d-hank′s平衡鹽溶液洗滌細胞；去除平衡鹽溶液，使用含血清的dmem培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)人胎盤間充質(zhì)干細胞，培養(yǎng)至細胞培養(yǎng)基變色，收集上清液；過濾上清液，濃縮，除菌，加入甘露醇和水，凍干，即得。
本發(fā)明實施例4～6所述飼料配方及其用量(重量份)
制備方法：
取靈芝孢子粉，粉碎，加入紅薯粉、芋頭粉、馬鈴薯粉、α-淀粉、白魚粉、紅魚粉、防霉劑和免疫增強劑，混合均勻，過100目篩，分裝，即得。
實施例7、一種養(yǎng)殖方法
每月前15天給鱉飼喂實施例4～6任一飼料，每月后15天給鱉飼喂甲魚粉，日投料量占鱉體重的3％，經(jīng)36個月喂養(yǎng)，出塘。
對比例1、一種用于靈芝鱉養(yǎng)殖的飼料
對比例1與實施例5的區(qū)別在于：用丙酸代替丙酸桿菌發(fā)酵干粉，其余參數(shù)及操作如實施例5。
試驗一、本發(fā)明飼料對甲魚生長、肉質(zhì)以及免疫力的影響
選取三棟溫室，分別設(shè)定為a組、b組和c組，a組按實施例7所述方法投喂市售常規(guī)飼料；b組按實施例7所述養(yǎng)殖方法投喂本發(fā)明實施例4飼料，c組按實施例7所述養(yǎng)殖方法投喂本發(fā)明實施例5飼料。每棟溫室共14個養(yǎng)殖池，規(guī)格10m×10m，水體深60cm，每個養(yǎng)殖池投放甲魚鱉，平均體重(226.96±32.21g)只，養(yǎng)殖密度為30只/m2，稚鱉在溫室養(yǎng)殖池馴養(yǎng)一周后正式開始試驗，養(yǎng)殖20周。
試驗過程中，每天投喂3次(7:00-8:00，12:00-14:00，20:00-21:00)，投餌量1.5-2kg/池/次，將飼料擠壓成顆粒狀，水下投喂，自由采食，并且在投飼后半小時巡塘檢查吃食情況，及時調(diào)整投飼量，及時清掃殘的飼料。養(yǎng)殖期間控制水溫(30±2)℃，ph7.0-7.8，水中亞硝酸鹽氮含量小于0.2mg/l，氨氮含量小于5mg/l，溶解氧在4-6mg/l。
試驗結(jié)果用spss軟件進行分析，試驗結(jié)果如下表1～3。
表1對甲魚生長性能的影響
注：與a組相比，**p＜0.01，*p＜0.05。
由上表1可知，添加了免疫增強劑(人胎盤間充質(zhì)干細胞提取物凍干粉)的飼料，能夠極顯著促進甲魚的生長，極顯著提高甲魚增重率和成活率，差異具有顯著性。
表2對甲魚肉質(zhì)的影響
注：與a組相比，**p＜0.01，*p＜0.05。
由上表2可知，添加了免疫增強劑(人胎盤間充質(zhì)干細胞提取物凍干粉)的飼料，能夠顯著提高甲魚的肌肉蛋白和脂肪的含量，顯著降低甲魚肌原纖維的直徑，差異具有顯著性。這說明，本發(fā)明飼料能夠提升甲魚的肉質(zhì)性能。
表3對甲魚血清中免疫指標的影響
注：與a組相比，**p＜0.01，*p＜0.05。
由表3可知，添加了免疫增強劑(人胎盤間充質(zhì)干細胞提取物凍干粉)的飼料，能夠顯著提高甲魚血清中g(shù)sh-px(谷胱甘肽過氧化酶)、t-sod(總超氧化物岐化酶)和lsz(溶菌酶)的活力，同時顯著降低甲魚血清中ast(谷草轉(zhuǎn)氨酶)和alp(堿性磷酸酶)的活力，這說明，在人胎盤間充質(zhì)干細胞提取物凍干粉的存在下，能夠顯著提高甲魚的免疫力。
試驗二、防霉效果試驗
取本發(fā)明實施例5、實施例6以及對比例1飼料200g，考察三組飼料在不同貯藏天數(shù)時飼料霉變情況，統(tǒng)計霉菌數(shù)，試驗結(jié)果如表4。
表4本發(fā)明實施例5～6以及對比例1飼料在不同貯藏天數(shù)時霉菌數(shù)統(tǒng)計(單位/104)
注：霉菌數(shù)計數(shù)方法按國標gb/t13092-1991飼料中霉菌的檢驗方法進行。
由表4可知，各組霉菌數(shù)由多到少排序為：對比例1＞實施例6＞實施例5，各組之間差異明顯，尤其是對比例1，在貯藏第35天，飼料霉菌數(shù)即已達到實施例5貯藏55天的霉菌總數(shù)的193.28％，，這說明，與現(xiàn)有的丙酸防霉劑相比，本發(fā)明防霉劑具有更優(yōu)異的防霉效果。
上述實施例僅例示性說明本發(fā)明的原理及其功效，而非用于限制本發(fā)明。任何熟悉此技術(shù)的人士皆可在不違背本發(fā)明的精神及范疇下，對上述實施例進行修飾或改變。因此，舉凡所屬技術(shù)領(lǐng)域中具有通常知識者在未脫離本發(fā)明所揭示的精神與技術(shù)思想下所完成的一切等效修飾或改變，仍應由本發(fā)明的權(quán)利要求所涵蓋。