本發(fā)明涉及一種發(fā)芽糙米蛋白-葡聚糖接枝復(fù)合物及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

糙米是稻谷(oryzastatival.)除去果皮后的一種形態(tài)，與白米相比，它是一種保留了胚芽、糠層等的全谷米粒。糙米的糠層和胚芽中富含多種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，如維生素e、γ-氨基丁酸、谷胱甘肽、谷維素、米胚蛋白、米糠蛋白、膳食纖維等，而僅有胚乳部分的精米，主要營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)為90％的淀粉和9％的蛋白質(zhì)。糙米在我國(guó)有很長(zhǎng)的食用歷史，古代的多部古書都對(duì)糙米的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值做出了描述，如《名醫(yī)別錄》中稱糙米能“益氣止渴止泄”；唐代著名中藥學(xué)家孟詵在他的《食療本草》中說，糙米有“止痢、補(bǔ)中益氣、堅(jiān)筋骨、和血脈”的功效之功；在《本草綱目》中，李時(shí)珍稱糙米具有“和五臟、好顏色”的妙用?？梢姴诿撞粌H具有很高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，而且還具有醫(yī)療保健、養(yǎng)生延年的效用。

米蛋白是營(yíng)養(yǎng)界所公認(rèn)的優(yōu)質(zhì)植物蛋白，按照osborne的分類方法，米蛋白主要由清蛋白(albumin)、球蛋白(globulin)、醇溶蛋白(prolamin)和谷蛋白(glutelin)組成。其中谷蛋白是大米中含量最高的蛋白質(zhì)，達(dá)到米蛋白含量的70～90％。相對(duì)于其他禾谷類糧食，米蛋白是質(zhì)量最好的一種蛋白質(zhì)，具有氨基酸組成合理、高生物價(jià)和低敏性等特性^[24]。米蛋白的必需氨基酸模式與fao/who所推薦的氨基酸模式極為相近，它的必需氨基酸被機(jī)體利用的程度就越高，米蛋白的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值也相對(duì)越高。米蛋白的生物價(jià)為77，高于其它糧食品種，并且可以與動(dòng)物蛋白相媲美。更重要的是，米蛋白是低過敏性蛋白，而傳統(tǒng)的大豆蛋白、花生蛋白都存在致敏因子。美國(guó)的臨床研究發(fā)現(xiàn)，在700個(gè)遺傳性過敏癥的病例中，對(duì)大米過敏的高度過敏性病人不到1％，甚至兒科中也很少有病例對(duì)米蛋白過敏。因此，米蛋白是一種優(yōu)質(zhì)的植物蛋白資源，特別適合作為嬰幼兒的食品基料。

正是由于米蛋白這些營(yíng)養(yǎng)特性，其市場(chǎng)需要量日趨增加，對(duì)米蛋白的研究也比較多，米蛋白在食品工業(yè)中的應(yīng)用也越來越廣泛，如大米蛋白粉、大米改性蛋白、高附加值肽、有特殊功能的生物活性肽等；米蛋白還可以作為多種食品的輔料，如混合飲料、嬰兒食品等。盡管米蛋白的用量和需求日趨增加，但它在食品行業(yè)的應(yīng)用卻十分有限，主要的原因是由于米蛋白的溶解性較低，尤其是占米蛋白約70％～90％的谷蛋白，因其中大量的疏水性氨基酸(如谷氨酰胺)通過疏水作用相互靠近，同時(shí)生成大量的二硫鍵，導(dǎo)致谷蛋白分子聚集沉淀，造成米蛋白不易溶解，其價(jià)值無法得到充分利用。長(zhǎng)期以來，用于改善疏水性，提高蛋白功能性質(zhì)的研究受到廣泛的關(guān)注。蛋白質(zhì)的溶解性能夠影響蛋白質(zhì)的乳化、增稠、起泡和凝膠作用，因此，米蛋白由于其溶解性較差，不能在水中與其他物料形成均勻的體系，從而影響了米蛋白在溶液體系中的應(yīng)用。如何降低米蛋白的疏水性從而提高其溶解性，擴(kuò)大米蛋白的應(yīng)用領(lǐng)域，必須對(duì)米蛋白進(jìn)行科學(xué)的改性研究。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明所解決的現(xiàn)有技術(shù)的問題是：現(xiàn)有的為了提高米蛋白的溶解性的方法，多集中在酶法、物理法和化學(xué)法，但是酶法用到的蛋白酶的價(jià)格較高，化學(xué)改性可能會(huì)造成蛋白質(zhì)中的氨基酸產(chǎn)生消旋作用，生物效價(jià)降低，產(chǎn)生有毒物質(zhì)，化學(xué)試劑修飾有試劑殘留。而且常用的?；⑼榛?、磷酸化、脫酰胺等植物蛋白化學(xué)改性方法，始終受到改性效果及安全性的質(zhì)疑。而采用冷凍、加壓、加熱、電場(chǎng)、磁場(chǎng)、輻射等物理作用的改性，改性的效果又不顯著。而且對(duì)于改善疏水性植物蛋白功能性領(lǐng)域的研究大多集中在大豆蛋白，有關(guān)米蛋白的研究還比較少。

為了解決如上問題，本發(fā)明通過葡聚糖與發(fā)芽糙米蛋白進(jìn)行接枝，提供了一種發(fā)芽糙米蛋白-葡聚糖接枝復(fù)合物及制備方法和應(yīng)用。糙米經(jīng)過發(fā)芽后能夠生成各種營(yíng)養(yǎng)物，包括γ-氨基酸和谷胱甘肽等，糙米的特性相較于未發(fā)芽的糙米蛋白也發(fā)生了很多改變，尤其是糙米的蛋白質(zhì)含量及溶解性都得到了顯著的提高。

具體來說，本發(fā)明提供了如下技術(shù)方案：

一方面，本發(fā)明提供了一種發(fā)芽糙米蛋白-葡聚糖接枝復(fù)合物的制備方法，包括如下步驟：

(1)將糙米進(jìn)行發(fā)芽處理，然后提取得到發(fā)芽糙米蛋白；

(2)將步驟(1)得到的發(fā)芽糙米蛋白和葡聚糖混合反應(yīng)，制備得到發(fā)芽糙米蛋白-葡聚糖接枝復(fù)合物。

優(yōu)選的，根據(jù)以上所述的制備方法，步驟(1)中糙米在發(fā)芽處理之前進(jìn)行浸泡，浸泡的溫度為25-35℃，浸泡時(shí)間為8-24h；糙米發(fā)芽處理的溫度為25-35℃，發(fā)芽處理的時(shí)間為20-40h。

優(yōu)選的，根據(jù)以上所述的制備方法，步驟(1)中糙米在浸泡發(fā)芽之前進(jìn)行消毒處理，優(yōu)選采用0.2mol/l-0.4mol/l的次氯酸鈉溶液浸泡消毒。

優(yōu)選的，根據(jù)以上所述的制備方法，步驟(2)中所述葡聚糖的相對(duì)分子質(zhì)量為20kd-100kd。

優(yōu)選的，根據(jù)以上所述的制備方法，步驟(2)中發(fā)芽糙米蛋白和葡聚糖的反應(yīng)的溫度為80-100℃。

優(yōu)選的，根據(jù)以上所述的制備方法，步驟(2)中發(fā)芽糙米蛋白和葡聚糖的反應(yīng)的ph值為9-11。

優(yōu)選的，根據(jù)以上所述的制備方法，步驟(2)中發(fā)芽糙米蛋白和葡聚糖的質(zhì)量比為1:1-1:4。

第二方面，本發(fā)明還提供了以上任一項(xiàng)所述的制備方法制備得到的發(fā)芽糙米蛋白-葡聚糖接枝復(fù)合物。

優(yōu)選的，根據(jù)以上所述的發(fā)芽糙米蛋白-葡聚糖接枝復(fù)合物，所述發(fā)芽糙米蛋白-葡聚糖接枝復(fù)合物的乳化活性為0.9-1.2，放置10min后的乳化穩(wěn)定性在55％以上。

第三方面，本發(fā)明提供了以上所述的發(fā)芽糙米蛋白-葡聚糖接枝復(fù)合物在食品領(lǐng)域中的應(yīng)用。

本發(fā)明所取得的有益效果是：本發(fā)明將糙米進(jìn)行適度發(fā)芽后，提高了糙米蛋白的溶解度；然后再以發(fā)芽糙米蛋白和葡聚糖為原料進(jìn)行接枝偶聯(lián)的濕法反應(yīng)，克服了干法工藝中原料混合不均一，反應(yīng)時(shí)間太長(zhǎng)的缺點(diǎn)。相比于發(fā)芽糙米蛋白，發(fā)芽糙米蛋白-葡聚糖共價(jià)復(fù)合物的乳化性、乳化穩(wěn)定性、溶解性、抗氧化活性都得到了明顯的提高。

附圖說明

圖1為發(fā)芽糙米蛋白的掃描電鏡圖。

圖2為發(fā)芽糙米蛋白-葡聚糖共價(jià)復(fù)合物的掃描電鏡圖。

圖3為發(fā)芽糙米蛋白和發(fā)芽糙米蛋白-葡聚糖共價(jià)復(fù)合物的傅立葉紅外(ftir)光譜圖，其中標(biāo)號(hào)1為發(fā)芽糙米蛋白，標(biāo)號(hào)2為發(fā)芽糙米蛋白-葡聚糖共價(jià)復(fù)合物。

圖4為葡聚糖、發(fā)芽糙米蛋白-葡聚糖物理混合物、發(fā)芽糙米蛋白-葡聚糖共價(jià)復(fù)合物的x射線衍射圖，其中標(biāo)號(hào)1為葡聚糖，標(biāo)號(hào)2為發(fā)芽糙米蛋白-葡聚糖物理混合物，標(biāo)號(hào)3為發(fā)芽糙米蛋白-葡聚糖共價(jià)復(fù)合物。

具體實(shí)施方式

如上所述，本發(fā)明提供了一種發(fā)芽糙米蛋白-葡聚糖接枝復(fù)合物的制備方法，其特征在于，包括如下步驟：

(1)將糙米進(jìn)行發(fā)芽處理，然后提取發(fā)芽糙米蛋白；

(2)將步驟(1)得到的發(fā)芽糙米蛋白和葡聚糖混合反應(yīng)，制備得到發(fā)芽糙米蛋白-葡聚糖接枝復(fù)合物。

其中，在一種優(yōu)選實(shí)施方式中，所述制備方法包括如下步驟：

(1)將糙米進(jìn)行發(fā)芽處理，然后提取糙米蛋白；

(2)將步驟(1)得到的發(fā)芽糙米蛋白和葡聚糖混合反應(yīng)，制備得到發(fā)芽糙米蛋白-葡聚糖接枝復(fù)合物，其中，步驟(2)中，發(fā)芽糙米蛋白和葡聚糖的質(zhì)量比為1:1-1:4，發(fā)芽糙米蛋白和葡聚糖的反應(yīng)的溫度為80-100℃，反應(yīng)ph值為9-11。

其中，在一種更優(yōu)選實(shí)施方式中，所述葡聚糖的相對(duì)分子質(zhì)量為20kd-100kd。

同時(shí)，本發(fā)明還提供了一種根據(jù)以上制備方法制備得到的發(fā)芽糙米蛋白-葡聚糖接枝復(fù)合物，實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，發(fā)芽糙米蛋白與葡聚糖發(fā)生共價(jià)結(jié)合，因此也可以稱為發(fā)芽糙米蛋白-葡聚糖共價(jià)復(fù)合物或者發(fā)芽糙米蛋白-葡聚糖共價(jià)接枝復(fù)合物。

下面結(jié)合實(shí)施實(shí)例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)描述，需要指出的是，以下所述實(shí)施實(shí)例旨在便于對(duì)本發(fā)明的理解，而對(duì)其不起任何限制作用。

其中，實(shí)施例中所用到的原料的廠家及參數(shù)如下所示。

糙米(稻花香2號(hào))，北大荒農(nóng)業(yè)股份有限公司；

考馬斯亮藍(lán)g-250，北京博奧拓達(dá)科技有限公司；

牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)品，百靈威科技有限公司；

十二烷基硫酸鈉(sds)，北京博奧拓達(dá)科技有限公司；

葡聚糖，百靈威科技有限公司；

tnbs試劑，上海士鋒生物科技有限公司；其他試劑均為分析純。

實(shí)驗(yàn)過程中用到的實(shí)驗(yàn)設(shè)備如下：

sha-b水浴恒溫振蕩器，精達(dá)機(jī)械有限公司

dk-8d三溫三控水槽，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司

hc-3018r高速冷凍離心機(jī)，安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司

精密ph計(jì)，梅特勒-托利多公司

烘箱，豪貝烘箱廠

myp11-2a磁力攪拌器，上海梅穎浦儀器儀表制造有限公司

kdy-9820凱氏定氮儀，北京科拓有限公司

lgj-18真空冷凍干燥機(jī)，北京松源華興科技發(fā)展有限公司

795-紫外可見光分光光度計(jì)，上海菁華科技儀器有限公司

wqf520aft-ir光譜儀，北京北分瑞利分析儀器有限公司

d-8x射線衍射儀，德國(guó)布魯克axs有限公司

q2000dsc系統(tǒng)，美國(guó)ta儀器公司

飛納pro-x型臺(tái)式掃描電鏡儀，復(fù)納科學(xué)儀器(上海)有限公司

多用分散機(jī)，江陰精細(xì)化工機(jī)械有限公司

t25basicultra-turrax分散機(jī)，德國(guó)ika公司

高壓均質(zhì)機(jī)，意大利fbf公司

s3500激光粒度儀，美國(guó)麥奇克有限公司

實(shí)施例1

分別采用如下方法制備發(fā)芽糙米，具體的方法分別如制備例1-制備例7所示。

制備例1

(1)糙米消毒

稱取100g糙米放置于燒杯中，先用自來水沖洗3遍，洗去表面的糠粉和灰塵，用紗布瀝干后，用0.2mol/l的次氯酸鈉溶液浸泡消毒25min，再用去離子水沖洗3遍。

(2)糙米的浸泡

經(jīng)消毒后的糙米放于規(guī)格為150mm的培養(yǎng)皿中，并添加適量的去離子水，水面覆蓋糙米，置于28±1℃的恒溫水浴鍋中浸泡12h，每隔4h更換浸泡的去離子水。

(3)糙米發(fā)芽

將浸泡好的糙米置于30±1℃恒溫水浴鍋中進(jìn)行發(fā)芽，用濕潤(rùn)的雙層紗布覆蓋培養(yǎng)皿。每隔4h用去離子水沖洗糙米，發(fā)芽時(shí)間為35h。

(4)發(fā)芽糙米的干燥

將發(fā)芽后的糙米，置于50±1℃烘箱中干燥5h，干燥后的發(fā)芽糙米用粉碎機(jī)粉碎，過60目篩，獲得發(fā)芽糙米粉。

制備例2

(1)糙米消毒：同制備例1

(2)糙米的浸泡

經(jīng)消毒后的糙米放于規(guī)格為150mm的培養(yǎng)皿中，并添加適量的去離子水，水面覆蓋糙米，置于25±1℃的恒溫水浴鍋中浸泡24h，每隔6h更換浸泡的去離子水。

(3)糙米發(fā)芽

將浸泡好的糙米置于25±1℃恒溫水浴鍋中進(jìn)行發(fā)芽，用濕潤(rùn)的雙層紗布覆蓋培養(yǎng)皿。每隔8h用去離子水沖洗糙米，發(fā)芽時(shí)間為40h。

(4)發(fā)芽糙米的干燥：同制備例1

制備例3

(1)糙米消毒：同制備例1

(2)糙米的浸泡

經(jīng)消毒后的糙米放于規(guī)格為150mm的培養(yǎng)皿中，并添加適量的去離子水，水面覆蓋糙米，置于35±1℃的恒溫水浴鍋中浸泡8h，每隔2h更換浸泡的去離子水。

(3)糙米發(fā)芽

將浸泡好的糙米置于35±1℃恒溫水浴鍋中進(jìn)行發(fā)芽，用濕潤(rùn)的雙層紗布覆蓋培養(yǎng)皿。每隔5h用去離子水沖洗糙米，發(fā)芽時(shí)間為20h。

(4)發(fā)芽糙米的干燥：同制備例1

制備例4

(1)糙米消毒：同制備例1

(2)糙米的浸泡

經(jīng)消毒后的糙米放于規(guī)格為150mm的培養(yǎng)皿中，并添加適量的去離子水，水面覆蓋糙米，置于30±1℃的恒溫水浴鍋中浸泡16h，每隔4h更換浸泡的去離子水。

(3)糙米發(fā)芽

將浸泡好的糙米置于28±1℃恒溫水浴鍋中進(jìn)行發(fā)芽，用濕潤(rùn)的雙層紗布覆蓋培養(yǎng)皿。每隔6h用去離子水沖洗糙米，發(fā)芽時(shí)間為30h。

(4)發(fā)芽糙米的干燥：同制備例1

制備例5

(1)糙米消毒：同制備例1

(2)糙米的浸泡：同制備例1

(3)糙米發(fā)芽

將浸泡好的糙米置于30±1℃恒溫水浴鍋中進(jìn)行發(fā)芽，用濕潤(rùn)的雙層紗布覆蓋培養(yǎng)皿。每隔5h用去離子水沖洗糙米，發(fā)芽時(shí)間為10h。

(4)發(fā)芽糙米的干燥：同制備例1

制備例6

(1)糙米消毒：同制備例1

(2)糙米的浸泡：同制備例1

(3)糙米發(fā)芽

將浸泡好的糙米置于30±1℃恒溫水浴鍋中進(jìn)行發(fā)芽，用濕潤(rùn)的雙層紗布覆蓋培養(yǎng)皿。每隔5h用去離子水沖洗糙米，發(fā)芽時(shí)間為15h。

(4)發(fā)芽糙米的干燥：同制備例1

制備例7

(1)糙米消毒：同制備例1

(2)糙米的浸泡：同制備例1

(3)糙米發(fā)芽

將浸泡好的糙米置于30±1℃恒溫水浴鍋中進(jìn)行發(fā)芽，用濕潤(rùn)的雙層紗布覆蓋培養(yǎng)皿。每隔5h用去離子水沖洗糙米，發(fā)芽時(shí)間為45h。

(4)發(fā)芽糙米的干燥：同制備例1

然后采用堿溶酸沉的方法對(duì)制備例1-制備例7制備得到的發(fā)芽糙米粉提取發(fā)芽糙米蛋白，具體操作如下：

稱取一定重量上述制備好的發(fā)芽糙米粉，加入0.1mol/lnaoh溶液(固液比為1:6)在40℃恒溫水浴鍋中浸泡，并進(jìn)行磁力攪拌2h。然后在8000g離心力的條件下離心15min，收集蛋白上清液。在蛋白上清液中緩慢加入0.1mol/l鹽酸，直到ph值降到糙米蛋白的等電點(diǎn)5.0時(shí)終止，然后在8000g離心力的條件下離心15min，得到蛋白沉淀。酸沉后的蛋白沉淀用0.1mol/lnaoh溶液調(diào)至中性，并用去離子水清洗3次，獲得發(fā)芽糙米蛋白沉淀，然后將蛋白沉淀進(jìn)行真空冷凍干燥，得到糙米蛋白粉，即為發(fā)芽糙米蛋白粗提物(用mi表示)。

然后分別對(duì)制備得到的發(fā)芽糙米蛋白粉中蛋白質(zhì)含量，糙米蛋白得率，溶解度，以及常規(guī)成分包括脂肪、水分和灰分進(jìn)行測(cè)定。具體的測(cè)定方法如下：

(1)蛋白含量的測(cè)定：利用凱氏定氮法gb5511-85(n％×5.95)測(cè)定蛋白含量，通過凱式定氮法測(cè)定發(fā)芽糙米蛋白粗提物中蛋白質(zhì)的含量，用純度p表示；通過凱式定氮法測(cè)定發(fā)芽糙米(即不經(jīng)過堿溶酸沉的方法提取)中蛋白質(zhì)的含量，測(cè)定結(jié)果用mj表示。

然后按照如下公式計(jì)算得到發(fā)芽糙米蛋白得率及提取率。

發(fā)芽糙米蛋白得率：g(％)＝(mi/mo)×100

式中：g——發(fā)芽糙米蛋白得率；mo——發(fā)芽糙米原料的量；mi——發(fā)芽糙米蛋白粗提物的量。

發(fā)芽糙米蛋白提取率：r(％)＝{(mi×p)/mj}×100

式中：r——發(fā)芽糙米蛋白的提取率；p——發(fā)芽糙米蛋白的純度；mj——發(fā)芽糙米中蛋白質(zhì)的量。

(2)常規(guī)成分的測(cè)定

脂肪的測(cè)定：索氏抽提法gb5497-85

水分的測(cè)定：105℃恒重法gb5512-85

灰分的測(cè)定：干法灰化法gb5505-85

其中，具體的測(cè)定結(jié)果如表1所示。

表1發(fā)芽糙米蛋白的主要成分表

實(shí)驗(yàn)結(jié)果：

從表1中的制備例1-4可以看出，雖然發(fā)芽糙米蛋白的得率和提取率較低，但是蛋白含量大于80％(干基)，可以認(rèn)為是純的發(fā)芽糙米蛋白，能到達(dá)到實(shí)驗(yàn)要求，因此，該蛋白可以作為本實(shí)驗(yàn)中發(fā)芽糙米蛋白的來源。另外，制備例5-制備例7中，對(duì)于發(fā)芽時(shí)間作了改變，可以看出，當(dāng)發(fā)芽時(shí)間過短時(shí)，表現(xiàn)為發(fā)芽10h和15h時(shí)，蛋白純度稍有下降，但是蛋白含量變化不大，當(dāng)發(fā)芽時(shí)間過長(zhǎng)，蛋白質(zhì)含量開始降低。

實(shí)施例二發(fā)芽糙米蛋白-葡聚糖接枝復(fù)合物的制備

以實(shí)施例一中制備例1制備得到的發(fā)芽糙米蛋白為例，與葡聚糖制備發(fā)芽糙米蛋白-葡聚糖接枝復(fù)合物。具體的制備過程分別如下：

制備例8

稱取100mg的糙米蛋白，加去離子水，用0.1mol/lnaoh調(diào)ph值至12，在50±1℃水浴條件下，震蕩攪拌30min，于室溫下冷卻。再以糙米蛋白與葡聚糖的質(zhì)量比為1:1的比例，加入100mg相對(duì)分子質(zhì)量為20kd的葡聚糖，攪拌使蛋白/糖充分混合，然后用0.1mol/lhcl調(diào)節(jié)ph值至11，在90±1℃水浴下反應(yīng)60min，反應(yīng)結(jié)束，密封于4℃冰箱中備用。

制備例9

稱取100mg的糙米蛋白，加去離子水，用0.1mol/lnaoh調(diào)ph值至12，在50±1℃水浴條件下，震蕩攪拌30min，于室溫下冷卻。再以糙米蛋白與葡聚糖的質(zhì)量比為1:2的比例，加入200mg相對(duì)分子質(zhì)量為50kd的葡聚糖，攪拌使蛋白和糖充分混合，然后用0.1mol/lhcl調(diào)節(jié)ph值至10，在80±1℃水浴下反應(yīng)40min，反應(yīng)結(jié)束，密封于4℃冰箱中備用。

制備例10

稱取100mg的糙米蛋白，加去離子水，用0.1mol/lnaoh調(diào)ph值至12，在50±1℃水浴條件下，震蕩攪拌30min，于室溫下冷卻。再以糙米蛋白與葡聚糖的質(zhì)量比為1:4的比例，加入400mg的相對(duì)分子質(zhì)量為100kd的葡聚糖，攪拌使蛋白和糖充分混合，然后用0.1mol/lhcl調(diào)節(jié)ph值至9，在100±1℃水浴下反應(yīng)20min，反應(yīng)結(jié)束，密封于4℃冰箱中備用。取一定量的樣品液然后按照制備例8的方法測(cè)定復(fù)合產(chǎn)物的特性。

制備例11

稱取100mg的糙米蛋白，加去離子水，用0.1mol/lnaoh調(diào)ph值至12，在50±1℃水浴條件下，震蕩攪拌30min，于室溫下冷卻。再以糙米蛋白與葡聚糖的質(zhì)量比為1:1的比例，加入100mg的相對(duì)分子質(zhì)量為20kd的葡聚糖，攪拌使蛋白和糖充分混合，然后用0.1mol/lhcl調(diào)節(jié)ph值至8，在70±1℃水浴下反應(yīng)60min，反應(yīng)結(jié)束，密封于4℃冰箱中備用。

制備例12

稱取100mg的糙米蛋白，加去離子水，用0.1mol/lnaoh調(diào)ph值至12，在50±1℃水浴條件下，震蕩攪拌30min，于室溫下冷卻。再以糙米蛋白與葡聚糖的質(zhì)量比為2:1的比例，加入50mg的相對(duì)分子質(zhì)量為250kd的葡聚糖，攪拌使蛋白和糖充分混合，然后用0.1mol/lhcl調(diào)節(jié)ph值至7，在80±1℃水浴下反應(yīng)50min，反應(yīng)結(jié)束，密封于4℃冰箱中備用。

然后分別按照如下方法測(cè)定復(fù)合物的接枝度，乳化活性以及乳化穩(wěn)定性等。

(1)復(fù)合物接枝度的測(cè)定

采用tnbs法，具體操作如下：

取0.4ml樣品液加入到盛有2ml磷酸鹽緩沖溶液(ph＝8.2，1/15mol/l)的帶蓋試管中，再加入1ml0.1％tnbs試劑，震蕩混勻，在50±1℃下水浴中，試管外壁包上鋁箔避光反應(yīng)1h，然后取出試管加入2ml0.1mol/lhcl終止反應(yīng)，室溫下放置30min，在420nm下測(cè)定吸光值。

接枝度dg％＝(a0－at)/a0×100％

式中，a0－未反應(yīng)時(shí)樣品吸光值；at－反應(yīng)t分鐘后樣品吸光值

(2)復(fù)合物乳化活性的測(cè)定

采用濁度法并稍作改進(jìn)，具體操作如下：

取上述制備的蛋白懸浮液于室溫下攪拌，邊攪拌邊緩緩加入5ml美藤果油，在9500r/min轉(zhuǎn)速下分散1min，制備得到的乳狀液在30±1℃水浴下放置，分別于不同時(shí)間(0，10min)從溶液底部吸取50μl乳濁液，加到5ml0.1％sds溶液中，于500nm處測(cè)定吸光值。每次取樣取三次。0min時(shí)測(cè)得的吸光值a0即乳化活性ea。乳化穩(wěn)定性用es(％)＝a0×100/(a0－a10)表示，其中a10為將乳狀液放置10min后測(cè)得的乳化活性值。

表2發(fā)芽糙米蛋白-葡聚糖接枝復(fù)合物的測(cè)定結(jié)果

從表2可以看出，制備例8-制備例10所制備得到的發(fā)芽糙米蛋白-葡聚糖接枝復(fù)合物其接枝度均在30％以上，乳化穩(wěn)定性均在55％以上。而制備例11將接枝反應(yīng)的溫度調(diào)到70℃，將ph值調(diào)節(jié)到8時(shí)，制備得到的發(fā)芽糙米蛋白-葡聚糖接枝復(fù)合物接枝度稍低，乳化穩(wěn)定性值也在55％以下。同樣，制備例12所采用的葡聚糖的相對(duì)分子質(zhì)量為250kd，發(fā)芽糙米蛋白與葡聚糖的質(zhì)量比為2:1時(shí)，反應(yīng)ph值調(diào)節(jié)為7，所制備得到的發(fā)芽糙米蛋白-葡聚糖接枝復(fù)合物的接枝度僅在26％左右，乳化穩(wěn)定性也僅為42％。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，通過控制發(fā)芽糙米蛋白與葡聚糖的重量比，所采用的葡聚糖的相對(duì)分子質(zhì)量，以及反應(yīng)的溫度和反應(yīng)的ph值，能夠得到接枝度在30％以上的發(fā)芽糙米蛋白-葡聚糖接枝復(fù)合物，而且所制備得到的發(fā)芽糙米蛋白-葡聚糖接枝復(fù)合物的乳化液放置10min后的乳化穩(wěn)定性在55％以上。

實(shí)施例三

分別以實(shí)施例一中制備例1制備得到的發(fā)芽糙米蛋白、實(shí)施例二中制備例8制備得到的發(fā)芽糙米蛋白-葡聚糖接枝復(fù)合物為例

(1)掃描電子顯微鏡(sem)觀察

使用飛納pro-x型臺(tái)式掃描電鏡觀察樣品的微觀結(jié)構(gòu)。將樣品平鋪在粘有導(dǎo)電膠的載物臺(tái)上，用氮?dú)獯蹈刹⒅糜跇悠繁?，采?0kv加速電壓，用掃描電鏡觀察樣品的微觀結(jié)構(gòu)，放大倍數(shù)為5000倍。

結(jié)果分析：

將發(fā)芽糙米蛋白、發(fā)芽糙米蛋白-葡聚糖共價(jià)復(fù)合物分別冷凍干燥后，用臺(tái)式掃描電子顯微鏡觀察其顆粒特性。從圖1中可以看出，發(fā)芽糙米蛋白呈現(xiàn)聚集狀態(tài)，顆粒比較大并且不均與，結(jié)構(gòu)不規(guī)則。從圖2中可以看出，發(fā)芽糙米蛋白經(jīng)過接枝偶聯(lián)反應(yīng)后，生成的共價(jià)復(fù)合物的蛋白顆粒均勻細(xì)膩，并分散地附著在多糖分子的片層結(jié)構(gòu)上。由此可見，發(fā)芽糙米蛋白與葡聚糖共價(jià)結(jié)合后，因?yàn)槎嗵欠肿拥目臻g阻礙作用，使得蛋白質(zhì)分子發(fā)生擴(kuò)散，并降低了蛋白質(zhì)分子之間因疏水相互作用而發(fā)生的團(tuán)聚，最終形成均勻細(xì)小的顆粒，從而改變了發(fā)芽糙米蛋白的空間結(jié)構(gòu)。

(2)傅立葉紅外(ftir)光譜測(cè)定

將樣品與一定量的kbr混合，仔細(xì)研磨成均勻的粉末，壓成薄片，然后使用ft-ir光譜儀在4000-400cm^-1范圍內(nèi)以4cm^-1的分辨率進(jìn)行全波段掃描24次，獲得平均值。

ft-ir光譜法主要用于化合物的定性鑒定和分子結(jié)構(gòu)的表征，因此，ft-ir光譜是蛋白質(zhì)-多糖體系研究的有效方法。如圖3所示，在發(fā)芽糙米蛋白中鑒定了兩個(gè)典型的酰胺和氫鍵結(jié)合峰，分別為1700～1500cm^-1和3392cm^-1。在美拉德反應(yīng)過程中，葡聚糖的羰基被添加到發(fā)芽糙米蛋白的多肽鏈中，從而消耗官能團(tuán)并引起羥基和羰基振動(dòng)。這些變化對(duì)應(yīng)于蛋白-聚糖共價(jià)復(fù)合物在3650-3200cm^-1(-oh拉伸)和1100-1000cm^-1(-oh彎曲)的特征峰。與發(fā)芽糙米蛋白相比，發(fā)芽糙米蛋白-葡聚糖共價(jià)復(fù)合物在1536cm^-1和1460-1240cm^-1處峰的強(qiáng)度由于nh2基團(tuán)的改變而降低。

(3)x射線衍射儀測(cè)定

x射線衍射儀在室溫下以40kv的電壓運(yùn)行，將樣品在10^°-80^°的2θ角范圍內(nèi)進(jìn)行測(cè)試，掃描速率為5^°/min。

x射線衍射儀(xrd)技術(shù)是分析晶體結(jié)構(gòu)的主要方法，具有信息量大、快速、不損傷樣品、測(cè)量精度高等優(yōu)點(diǎn)，因此被廣泛應(yīng)用于各個(gè)科目的研究和生產(chǎn)。x射線衍射分析的原理是對(duì)不同的材料進(jìn)行x射線照射后，會(huì)產(chǎn)生不同程度的衍射，并且與晶體的類型、分子的構(gòu)象、材料的組成和分子的鍵合模式相關(guān)。圖4為葡聚糖(標(biāo)號(hào)1，相對(duì)分子質(zhì)量為20kd)、發(fā)芽糙米蛋白和葡聚糖物理混合物(標(biāo)號(hào)2，其中發(fā)芽糙米蛋白為實(shí)施例一中制備例1制備得到的，葡聚糖的相對(duì)分子質(zhì)量為20kd，發(fā)芽糙米蛋白和葡聚糖的質(zhì)量比為1：1)和發(fā)芽糙米蛋白-葡聚糖共價(jià)復(fù)合物(標(biāo)號(hào)3)的xrd圖譜，從圖中可以看到，葡聚糖、發(fā)芽糙米蛋白和葡聚糖物理混合物的衍射圖由位于10°和20°附近的兩個(gè)主要晶體峰組成。與葡聚糖、發(fā)芽糙米蛋白和葡聚糖物理混合物相比，發(fā)芽糙米蛋白-葡聚糖共價(jià)復(fù)合物的衍射圖在衍射角和峰強(qiáng)度方面發(fā)生了很大的變化，兩個(gè)主要晶體峰都遷移到了15°和25°，同時(shí)在40°左右出現(xiàn)了一個(gè)新峰。這些研究結(jié)果表明葡聚糖與發(fā)芽糙米蛋白之間的共價(jià)結(jié)合改變了葡聚糖的晶體形態(tài)。因此，基于ft-ir光譜和xrd的結(jié)果可以得出以下結(jié)論：葡聚糖與發(fā)芽糙米蛋白發(fā)生接枝反應(yīng)后生成了蛋白-多糖共價(jià)復(fù)合物。

(4)差示掃描量熱儀(dsc)測(cè)定

采用差示掃描量熱法(dsc)測(cè)定樣品的變性溫度和變性焓值。將樣品(5.0mg)精確稱重到鋁盤中，溫度掃描范圍為40-180℃，升溫速率10℃/min，以空鋁盤為對(duì)照，變性溫度(td)和焓變(δh)由設(shè)備軟件計(jì)算。

蛋白質(zhì)的功能特性和結(jié)構(gòu)受熱處理的影響，導(dǎo)致熱變性不可逆變化。發(fā)芽糙米蛋白，發(fā)芽糙米蛋白和葡聚糖物理混合物(其中發(fā)芽糙米蛋白為實(shí)施例一中制備例1制備得到的，葡聚糖的相對(duì)分子質(zhì)量為20kd，發(fā)芽糙米蛋白和葡聚糖的質(zhì)量比為1：1)、發(fā)芽糙米蛋白-葡聚糖共價(jià)復(fù)合物的dsc特征變化如表3所示，發(fā)芽糙米蛋白-葡聚糖共價(jià)復(fù)合物(122.15℃)的變性溫度(td)明顯高于發(fā)芽糙米蛋白(107.46℃)和發(fā)芽糙米蛋白和葡聚糖物理混合物(112.96℃)(p<0.05)，表明蛋白質(zhì)和葡聚糖共價(jià)結(jié)合后，蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)發(fā)生了一些變化。通常來說，td越高，表示蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性越好。因此，當(dāng)葡聚糖與發(fā)芽糙米蛋白發(fā)生結(jié)合時(shí)，gbrp的熱穩(wěn)定性顯著提高。此外，發(fā)芽糙米蛋白-葡聚糖共價(jià)復(fù)合物的焓變(δh)明顯小于發(fā)芽糙米蛋白和發(fā)芽糙米蛋白和葡聚糖物理混合物，這可能是由于放熱反應(yīng)降低了gbrp與葡聚糖交聯(lián)過程中的δh。另一方面，發(fā)芽糙米蛋白和葡聚糖物理混合物的變性溫度(td)和焓變(δh)高于發(fā)芽糙米蛋白。這可能是葡聚糖分子提高了蛋白質(zhì)分子之間的空間間隔，并通過降低水合物結(jié)合位點(diǎn)的相關(guān)作用來阻止發(fā)芽糙米蛋白分子的聚集。

表3發(fā)芽糙米蛋白、發(fā)芽糙米蛋白-葡聚糖物理混合物及發(fā)芽糙米蛋白-葡聚糖共價(jià)復(fù)合物的熱變形溫度(td)和熵變(δh)^a

^a所有值都是平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差(n＝3)。同一列中不同的上標(biāo)字母表示顯著性差異(p<0.05)，其中差異顯著，為不同的字母，差異不顯著，為相同的字母。

從以上各個(gè)結(jié)果不難看出，通過掃描電子顯微鏡、傅立葉紅外光譜、x射線衍射儀、差示掃描量熱儀等手段研究發(fā)芽糙米蛋白-葡聚糖接枝偶聯(lián)復(fù)合物的理化性質(zhì)和分子結(jié)構(gòu)，證實(shí)了發(fā)芽糙米蛋白與葡聚糖發(fā)生了共價(jià)結(jié)合。

實(shí)施例四

分別對(duì)實(shí)施例一中制備例1到制備例7制備得到的發(fā)芽糙米蛋白、實(shí)施例二中制備例8到制備例12制備得到的發(fā)芽糙米蛋白-葡聚糖接枝復(fù)合物的性質(zhì)進(jìn)行研究，同時(shí)以糙米蛋白為對(duì)照，測(cè)定了各個(gè)樣品的溶解性和抗氧化活性。

其中，糙米蛋白的具體的制備方法如下：

1)糙米消毒

稱取100g糙米放置于燒杯中，先用自來水沖洗3遍，洗去表面的糠粉和灰塵，用紗布瀝干后，用0.2mol/l的次氯酸鈉溶液浸泡消毒25min，再用去離子水沖洗3遍。

2)糙米的浸泡

經(jīng)消毒后的糙米放于規(guī)格為150mm的培養(yǎng)皿中，并添加適量的去離子水，水面覆蓋糙米，置于28±1℃的恒溫水浴鍋中浸泡12h，每隔4h更換浸泡的去離子水。

3)糙米的干燥

將發(fā)芽后的糙米，置于50±1℃烘箱中干燥5h，干燥后的發(fā)芽糙米用粉碎機(jī)粉碎，過60目篩，獲得糙米粉。

然后按照與實(shí)施例一相同的方法，即采用堿溶酸沉的方法利用糙米粉提取糙米蛋白，得到糙米蛋白。

(1)溶解度測(cè)定

稱取10mg糙米蛋白、發(fā)芽糙米蛋白及發(fā)芽糙米蛋白-葡聚糖共價(jià)復(fù)合物，加入1/15mol/lph值為11的緩沖液在30℃水浴下攪拌分散2h，然后在10000g離心力條件下離心20min，通過凱氏定氮法測(cè)定上清液中的蛋白質(zhì)含量(n％×5.95)。

溶解度計(jì)算為上清液中蛋白質(zhì)與總蛋白質(zhì)含量的百分比。

(2)dpph自由基清除活性的測(cè)定

將1.0ml濃度為4％(wt)的樣品與1.0ml20μmdpph的95％乙醇充分混合，并在25℃的黑暗條件下放置30分鐘。然后將混合物以750g離心力離心5分鐘，然后在517nm處測(cè)定上清液的吸光度。每次處理做三個(gè)平行，結(jié)果是三次測(cè)量的平均值。樣品的較低吸光度表現(xiàn)出更高的自由基清除活性。

dpph自由基清除活性(％)計(jì)算為：

清除率/％＝[1－(asample－acontrol)/ablank]×100

其中asample是樣品的吸光度，acontrol是對(duì)照的吸光度(乙醇替代dpph)，ablank是空白的吸光度(乙醇替代樣品)。

(3)總還原能力的測(cè)定

將1.0ml濃度分別為4％(wt)的樣品與1.0ml1％(w/v)鐵氰化鉀溶液、2.5ml0.2μm磷酸鹽緩沖液(ph6.6)混合，將混合溶液在50℃下加熱30分鐘，待冷卻后加入10％(w/v)三氯乙酸2.5ml并搖勻，接著將混合物在3000g離心力下離心10分鐘。取2.0ml上清液與1.0ml1％(w/v)三氯化鐵和5.0ml蒸餾水混合，靜置10分鐘后，在700nm測(cè)量反應(yīng)體系的od值，樣品的較高吸光度表示較高的還原能力。

具體的測(cè)定結(jié)果見表4。

表4不同物質(zhì)性能特定結(jié)果

從表4可以看出，發(fā)芽可以增加顯著增加糙米蛋白質(zhì)的溶解度以及抗氧化活性；將發(fā)芽糙米蛋白與葡聚糖進(jìn)行接枝偶聯(lián)反應(yīng)后，其溶解度、dpph自由基清除活性、總還原能力都較發(fā)芽糙米蛋白有了明顯的提升。不受理論的限制，其中一個(gè)可能原因是蛋白質(zhì)發(fā)生美拉德反應(yīng)能夠生成雜環(huán)化合物，氨基還原酮和高分子黑色素，因而可以提高蛋白質(zhì)的抗氧化活性。

實(shí)施例五

將發(fā)芽糙米蛋白與葡聚糖通過接枝偶聯(lián)反應(yīng)生成共價(jià)復(fù)合物，實(shí)現(xiàn)了發(fā)芽糙米蛋白功能特性的有效改善，充分發(fā)揮糙米蛋白的低敏性和高營(yíng)養(yǎng)特性。此外，將該共價(jià)復(fù)合物作為乳化劑可以應(yīng)用到o/w型美藤果油乳狀液中，能夠有效改善乳狀液的粒徑特性。以實(shí)施例一中制備例1制備得到的發(fā)芽糙米蛋白為例，以實(shí)施例二中制備例8制備得到的發(fā)芽糙米蛋白-葡聚糖共價(jià)復(fù)合物為例，同時(shí)以制備例1制備得到發(fā)芽糙米蛋白和相對(duì)分子質(zhì)量為20kd的葡聚糖的物理混合物作為發(fā)芽糙米蛋白和葡聚糖的物理混合物(其中兩者質(zhì)量比為1：1)，研究了它們分別作為乳化劑對(duì)于最終制備得到的美藤果油乳液的粒徑的影響。

其中，美藤果油乳狀液的制備方法及粒徑測(cè)定方法如下：

(1)美藤果油乳狀液的制備

準(zhǔn)確稱取一定量的乳化劑(分別為發(fā)芽糙米蛋白、發(fā)芽糙米蛋白和相對(duì)分子質(zhì)量為20kd的葡聚糖的質(zhì)量比為1:1的物理混合物，以及發(fā)芽糙米蛋白-葡聚糖共價(jià)復(fù)合物)溶于50～60℃的蒸餾水中，使其質(zhì)量濃度分別為0.5％、1％、2％、4％、8％，高速攪拌使其充分溶解，在高速剪切過程中緩慢加入美藤果油(濃度為8％)形成粗乳液，粗乳液在40mpa/5mpa壓力下均質(zhì)3次，制得美藤果油乳液備用。

(2)美藤果油乳狀液的粒徑測(cè)定

采用激光粒度儀測(cè)定乳狀液的粒徑及粒度分布儀器基于動(dòng)態(tài)光散射理論，通過建立粒子大小與散射強(qiáng)度的相關(guān)函數(shù)，確定粒子的粒徑大小及粒度分布。粒徑大小以體積平均粒徑(d43)表示，按公式(1)計(jì)算，其中ni代表直徑為di的顆粒個(gè)數(shù)。

表5不同乳化劑穩(wěn)定的美藤果油乳液的粒徑(平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，μm)

同一列中不同的上標(biāo)字母表示顯著性差異(p<0.05)。

液滴尺寸和分布是測(cè)量乳化劑乳化性能的關(guān)鍵指標(biāo)之一，也是影響乳液的物理化學(xué)性質(zhì)和感官特性的重要因素。當(dāng)乳液制備過程中具有表面活性的乳化劑分子被吸附到油/水界面時(shí)，由于界面張力的降低，形成了小液滴。因此，乳化劑的結(jié)構(gòu)，溶解性及其它特性將對(duì)乳液的液滴尺寸產(chǎn)生影響。用0.5，1，2，4，8％質(zhì)量濃度的發(fā)芽糙米蛋白，發(fā)芽糙米蛋白-葡聚糖物理混合物，發(fā)芽糙米蛋白-葡聚糖共價(jià)復(fù)合物制備的美藤果油乳液的粒徑測(cè)量值見表5。

如表5所示，由發(fā)芽糙米蛋白和發(fā)芽糙米蛋白-葡聚糖物理混合物制備的乳液具有比其它乳液更大的粒徑。不受理論限制，對(duì)于發(fā)芽糙米蛋白，這種現(xiàn)象可以歸因于其相對(duì)較低的電荷從而引起的液滴絮凝的結(jié)果，這也意味著發(fā)芽糙米蛋白的靜電阻力不夠強(qiáng)大到足以克服任何疏水吸引力或范德華力。對(duì)于發(fā)芽糙米蛋白-葡聚糖物理混合物制備的乳液粒徑比其它乳液都要大，這種效應(yīng)可歸因于當(dāng)連續(xù)相中的游離葡聚糖分子出現(xiàn)時(shí)，通過耗盡機(jī)制誘導(dǎo)產(chǎn)生液滴絮凝。發(fā)芽糙米蛋白-葡聚糖共價(jià)復(fù)合物制備的乳液的粒徑小于其他乳液(p<0.05)，表明它是最有效的乳化劑。濃度為2％的發(fā)芽糙米蛋白-葡聚糖共價(jià)復(fù)合物的平均液滴直徑達(dá)到0.483μm，達(dá)到最小值。該結(jié)果表明，共價(jià)復(fù)合物在均質(zhì)過程中抑制液滴聚集并產(chǎn)生粒徑小的液滴方面具有很大的優(yōu)勢(shì)。由于液滴上的電荷量的改善，聚集穩(wěn)定性可能增加。另一方面，這可能是因?yàn)槠暇厶堑墓矁r(jià)結(jié)合能夠增加液滴之間的界面涂層的厚度，從而能夠提高空間排斥力。

最后說明的是，以上優(yōu)選實(shí)施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案而非限制，盡管通過上述優(yōu)選實(shí)施例已經(jīng)對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)的描述，但本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以在形式上和細(xì)節(jié)上對(duì)其作出各種各樣的改變，而不偏離本發(fā)明權(quán)利要求書所限定的范圍。