一種具有抗氧化活性的金耳發(fā)酵液多糖的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明屬生物工程技術(shù)應(yīng)用領(lǐng)域，具體涉及一種具有抗氧化活性的金耳發(fā)酵液多糖的制備方法。該多糖為白色或淡黃色粉末，是金耳斜面菌種通過活化，搖瓶液體發(fā)酵，乙醇沉淀，脫蛋白，葡聚糖凝膠柱G-100層析、透析后冷凍干燥得到的。產(chǎn)量為6.6mg/100mL發(fā)酵液，用苯酚-硫酸法測得多糖含量為85.85％，可應(yīng)用于制備具有抗氧化，防衰老功能的保健品。
【專利說明】一種具有抗氧化活性的金耳發(fā)酵液多糖的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種具有抗氧化活性的金耳發(fā)酵液多糖的制備方法。屬生物工程技術(shù)應(yīng)用領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]金耳為擔(dān)子菌綱，銀耳目，銀耳科，銀耳屬的干燥子實體，主要分布于我國西藏云南等地，野生資源稀有，古籍文獻記載用于肺熱、痰多、咳嗽、氣喘等癥的治療，具有較高的藥用價值。研究表明，金耳深層發(fā)酵液中含有人體必需的氨基酸，并且有鉀、鈉、鈣、鎂、鐵、鋅等礦質(zhì)元素。是一種集營養(yǎng)、保健、理療于一身的綠色食品。通過熱水浸提獲得的多糖，具有一定的抗氧化活性，可應(yīng)用于保健品行業(yè)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明的目的是提供一種具有抗氧化活性的金耳發(fā)酵液多糖的制備方法
[0004]本發(fā)明的技術(shù)方案為:將金耳斜面保藏菌種活化，接種至搖瓶種子液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，待菌絲體分散后將培養(yǎng)好的種子液接入搖瓶發(fā)酵液體培養(yǎng)基培養(yǎng)。發(fā)酵結(jié)束后，抽濾收集發(fā)酵液，濃縮后乙醇沉淀，脫蛋白、葡聚糖凝膠柱G-200層析、透析后冷凍干燥得到金耳發(fā)酵液多糖，最后進行體外抗氧化實驗。
[0005]本發(fā)明發(fā)明的金耳發(fā)酵液多糖具有一定的抗氧化活性。可以作為原料應(yīng)用于保健食品等領(lǐng)域。
[0006]上述技術(shù)方案中，搖瓶種子培養(yǎng)基為PDAlL加磷酸二氫鉀3g，硫酸鎂1.5g，牛肉膏2g，蛋白胨lg，VBl 10-20mg,pH6.0，發(fā)酵培養(yǎng)基為葡萄糖4g/100mL、酵母粉lg/100mL、磷酸二氫鉀 0.3g/100mL、硫酸鎂 0.15g/100mL、VBl l-2mg/100mL, pH6.0，250mL 三角瓶裝培養(yǎng)基IOOmL于28°C，220r / min，振蕩培養(yǎng)10_14d。多糖提取方法為發(fā)酵結(jié)束后抽濾取發(fā)酵液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至原體積的I / 5，加入4倍體積95%乙醇在4°C醇析，沉淀物用蒸餾水復(fù)溶后用Sevage法去除游離蛋白，葡聚糖凝膠G-100層析柱純化，蒸餾水透析，冷凍干燥后得到金耳發(fā)酵液多糖。抗氧化試驗將總還原能力，清除羥基自由基、DPPH的能力作為指標(biāo)。
【具體實施方式】
[0007]下面的實例將具體說明本發(fā)明的操作方法，但不能作為對本發(fā)明的限定。
[0008]實例一
[0009]1.發(fā)酵液制備
[0010]出發(fā)菌種為本實驗室金耳斜面保藏菌種；
[0011](I)搖瓶種子培養(yǎng)
[0012]搖瓶種子培養(yǎng)基=PDAlL加磷酸二氫鉀3g，硫酸鎂1.5g，牛肉膏2g，蛋白胨lg，VBl10_20mg，pH6.0 ；
[0013]培養(yǎng)方法:從斜面菌種中取3~4塊黃豆大小相同的菌塊，接種于搖瓶種子培養(yǎng)基中，250mL三角瓶裝培養(yǎng)基IOOmL于28°C，220r / min，振蕩培養(yǎng)IOd ;搖瓶中預(yù)先裝有經(jīng)過消毒滅菌的玻璃珠，用于打散菌絲體。
[0014](2)搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)
[0015]發(fā)酵培養(yǎng)基:葡萄糖4g/100mL、酵母粉lg/100mL、磷酸二氫鉀0.3g/100mL、硫酸鎂0.15g/100mL、VBl l_2mg/100mL，ρΗ6.0 ；
[0016]培養(yǎng)方法:將培養(yǎng)好的種子以15%的接種量接入搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基中28°C，220r /min，振蕩培養(yǎng)14d ；
[0017](3)發(fā)酵液濃縮，醇沉，脫蛋白，凝膠柱層析，透析
[0018]培養(yǎng)后抽濾，取發(fā)酵液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至原體積的I / 5，加入4倍體積95%乙醇在4°C醇析過夜，離心收集沉淀物，用95%乙醇、無水乙醇、丙酮洗滌數(shù)次。待有機溶劑揮發(fā)完畢，將沉淀物用蒸餾水完全溶解，用Sevage法去除游離蛋白，具體為按發(fā)酵液I / 5的體積加入氯仿，然后加入氯仿體積I / 5的正丁醇，混合后振蕩20min。蛋白質(zhì)與氯仿-正丁醇生成凝膠，4000rpm離心20min,收集上清液,反復(fù)操作8次至氯仿-正丁醇層不渾池為止。收集上清液用S^hadexG-1OO凝膠層析對多糖進行純化，流動相為0.1MNaCl,流速
0.5mL / min,每管3mL。以苯酹-硫酸法在490nm處檢測每管的糖濃度,測定該多糖的純度。多糖復(fù)溶后裝入透析袋中，扎緊袋口，懸浮于蒸餾水中，透析48h，中間每隔12小時換水一次，然后冷凍干燥，得多糖樣品，采用苯酚-硫酸法測總糖含量，為85.85%。
[0019]實例二
[0020]將制備得到的金耳發(fā)酵液多糖進行抗氧化活性實驗，以蒸餾水為空白對照，以抗壞血酸為陽性對照，數(shù)據(jù)經(jīng)SPSS13.0軟件分析。
[0021]1.實驗方法
[0022](I)還原力測定:
[0023]在具塞試管中加入1.0mL不同濃度的金耳發(fā)酵液多糖樣品(50_1000ug/mL)、0.2mLPBS(2.0M, pH6.6)和0.25mLl%鐵氰化鉀溶液。置50°C恒溫水浴中反應(yīng)20min，迅速冷去卩，再加入0.5mL的10% (w / V)三氯乙酸溶液,3000g離心IOmin,取上清液1.5mL,加入0.1mLl %三氯化鐵溶液和3.0mL去離子水，振蕩均勻，靜置5min，在700nm處以蒸餾水為空白測定其吸光值，吸光值越大，說明其還原力越高。
[0024](2)對羥自由基的清除:
[0025]在試管中依次加入1.0mL不同濃度的金耳菌絲體多糖(發(fā)酵液多糖)樣品(50-1000ug/mL)，0.9mL 的 FeSO4 (0.15mM)，0.5mL 水楊酸(9mM) 0.5mLH202 (8.8mM)，37°C 反應(yīng)60min,于51Onm處測得不同多糖濃度下的吸光值A(chǔ)i ,用水替代多糖樣品時的吸光值A(chǔ)j,用水代替多糖和H2O2時測得空白對照吸光值A(chǔ)tl.按下式計算羥自由基(.0H)的清除率:.0H清除率(％ ) = [ (A1-Aj) / (A0-Aj) ] X 100
[0026](3)對DPPH.自由基的清除
[0027]樣品管中加入1.0mL不同濃度的多糖溶液(50_1000ug/mL)與3.0mL的0.004%溶于95%乙醇的DPPH溶液，對照管用95%乙醇代替DPPH溶液；空白管用蒸餾水代替多糖溶液。以上三組置于室溫靜置30min后，用0.55mL蒸餾水和3.0mL95%的乙醇調(diào)零，于517nm處測定吸光值。
[0028]結(jié)果顯示:[0029](I)還原力測定:試驗組和陰性對照組比較，P < 0.01，顯示在還原力方面兩者有高度顯著性差異，表明其具有一定的還原力；各多糖還原能力隨多糖濃度的增加呈現(xiàn)出穩(wěn)定增長趨勢；試驗組與陽性對照組相比，P < 0.05，表明多糖的還原力不及抗壞血酸。
[0030](2)對羥基自由基的清除:試驗組和陰性對照組比較，P < 0.05，顯示兩者在對羥基自由基的清除方面有顯著性差異，表明金耳發(fā)酵液多糖具有一定的清除羥基自由基能力；試驗組不同濃度的多糖之間進行比較時，隨著多糖濃度的增加，對DPPH自由基清除能力均呈現(xiàn)增長的趨勢；試驗組與陽性對照組相比，P < 0.05，表明多糖對羥基自由基的清除能力不及抗壞血酸。
[0031](3)對DPPH的清除能力:試驗組和陰性對照組比較，P < 0.01，顯示兩者在對DPPH的清除能力方面有高度顯著性差異，表明多糖具有一定的清除DPPH能力；試驗組不同濃度的多糖之間進行比較時，隨著多糖濃度的增加，各多糖對羥基自由基清除能力呈穩(wěn)定的增長；試驗組與陽性對照組相比，P < 0.05，表明多糖對DPPH的清除能力不及抗壞血酸。
【權(quán)利要求】
1.一種具有抗氧化活性的金耳發(fā)酵液多糖的制備方法，其特征在于多糖外觀為白色或淡黃色粉末，是將金耳斜面菌種，移至搖瓶種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)，將培養(yǎng)好的種子液接入搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)，發(fā)酵結(jié)束后，抽濾取發(fā)酵液濃縮，乙醇沉淀，脫蛋白，凝膠層析柱純化，透析后冷凍干燥得到金耳發(fā)酵液多糖，多糖含量為85.85 %，最后進行體外抗氧化實驗，顯示該多糖具有一定的抗氧化活性。
2.如權(quán)利要求1所述的搖瓶種子培養(yǎng)基和搖瓶發(fā)酵液體培養(yǎng)基，其特征在于兩者的組成分別為=PDAlL加磷酸二氫鉀3g，硫酸鎂1.5g，牛肉膏2g，蛋白胨lg, VBl 10-20mg,pH6.0和葡萄糖 4g/100mL、酵母粉 lg/100mL、磷酸二氫鉀 0.3g/100mL、硫酸鎂 0.15g/100mL、VBll-2mg/100mL, pH6.0。
3.如權(quán)利要求1所述的在搖瓶種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)的方法和在搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)的方法，其特征在于前者為28°C，220r / min，振蕩培養(yǎng)10d，后者為28°C，220r / min，振蕩培養(yǎng)14d。
4.如權(quán)利要求1所述的凝膠層析柱純化，其特征在于用的是葡聚糖凝膠G-100填料。
【文檔編號】C12P19/04GK103555787SQ201310491992
【公開日】2014年2月5日 申請日期:2013年10月16日 優(yōu)先權(quán)日:2013年10月16日
【發(fā)明者】鄧超, 付海田, 陳敬華 申請人:江南大學(xué)