一種區(qū)分水椰八角鐵甲與椰心葉甲的引物對(duì)、試劑盒以及pcr檢測(cè)方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了PCR檢測(cè)技術(shù)快速區(qū)分水椰八角鐵甲與椰心葉甲的方法，通過利用水椰八角鐵甲的COI和ITS兩個(gè)基因片段的特異引物與水椰八角鐵甲和椰心葉甲的DNA模板進(jìn)行PCR反應(yīng)，把反應(yīng)產(chǎn)物在電泳儀上進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，通過電泳條帶來區(qū)分水椰八角鐵甲與椰心葉甲，該方法簡(jiǎn)單快速，且準(zhǔn)確性高，對(duì)水椰八角鐵甲與椰心葉甲的深入研究具有重要意義。
【專利說明】—種區(qū)分水椰八角鐵甲與椰心葉甲的引物對(duì)、試劑盒以及PCR檢測(cè)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及昆蟲領(lǐng)域，尤其涉及一種區(qū)分水椰八角鐵甲與椰心葉甲的引物對(duì)、試劑盒以及PCR檢測(cè)方法。
【背景技術(shù)】
[0002]水椰八角鐵甲與椰心葉甲兩種害蟲均能嚴(yán)重危害棕櫚科植物，使得近年來棕櫚科植物遭受嚴(yán)重侵害，造成了上億元的經(jīng)濟(jì)損失。
[0003]水椰八角鐵甲為鞘翅目，鐵甲科害蟲，主要隨苗木運(yùn)輸傳播，原產(chǎn)地為馬來西亞，在2001年在中國海南省發(fā)現(xiàn)，水椰八角鐵甲取食植株的嫩梢、幼莖和未完全展開的幼葉，使葉片呈現(xiàn)褐色或灰褐色條斑、皺縮、卷曲等，受害嫩梢逐漸枯萎死亡，嚴(yán)重時(shí)整株枯死，可嚴(yán)重危害椰子、西密棕、加拿利海棗等棕櫚科植物，是一種危險(xiǎn)的有害入侵生物。
[0004]椰心葉甲是一種重大危險(xiǎn)性外來有害生物，屬毀滅性害蟲，它在寄主上的危害部位為最幼嫩的心葉，葉片受害后出現(xiàn)枯死被害狀，嚴(yán)重時(shí)植株死亡。具有繁殖快、破壞性強(qiáng)和防治難度大的特點(diǎn)。國家禁止進(jìn)境的國際二類植物檢疫對(duì)象，危害以椰子為主的棕?cái)R科植物。椰心葉甲的入侵和造成的嚴(yán)重危害，已給海南省獨(dú)特的森林經(jīng)濟(jì)資源造成了巨大的破壞，并對(duì)海南省自然生態(tài)環(huán)境構(gòu)成了嚴(yán)重的威脅。從而引發(fā)了全社會(huì)的積極關(guān)注和廣泛重視。堅(jiān)決遏制疫情擴(kuò)大蔓延的兇猛趨勢(shì)，盡快實(shí)現(xiàn)持續(xù)防控的目標(biāo)，是當(dāng)前一項(xiàng)十分重要而緊迫的工作任務(wù)。
[0005]因此，對(duì)水椰八角鐵甲與椰心葉甲的研究具有重要意義，預(yù)防它們的傳播是對(duì)其有效的防控方法之一。但是，水椰八角鐵甲與椰心葉甲具有許多相同的寄主以及生活習(xí)性，外形特征存在很多相似點(diǎn)，難以區(qū)分，尤其在進(jìn)口檢疫和害蟲普查時(shí)，準(zhǔn)確區(qū)分兩種害蟲，采取相應(yīng)的檢疫措施和應(yīng)急處理極為重要，所以要對(duì)其進(jìn)行正確及時(shí)的預(yù)防和控制，最首要的工作就是準(zhǔn)確的區(qū)分二者。
[0006]現(xiàn)有利用PCR-RFLP方法，通過線粒體細(xì)胞色素氧化酶I基因(C0I )，快速區(qū)分椰心葉甲的兩個(gè)亞種，以及用水椰八角鐵甲和椰心葉甲成蟲體形大小的觀察、比較，這些方法均未涉及水椰八角鐵甲和椰心葉甲種間精確的區(qū)分，而傳統(tǒng)的分類學(xué)方法專業(yè)性太強(qiáng)，且要求以成蟲區(qū)分，從幼蟲，為害狀上較難區(qū)分，要求蟲體結(jié)構(gòu)完整，各個(gè)部位特征發(fā)育完全，在蟲體破壞和腐敗情況下，難以進(jìn)行鑒別，易出錯(cuò)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明的目的在于提供一種區(qū)分水椰八角鐵甲與椰心葉甲的特異引物對(duì)、試劑盒以及PCR檢測(cè)方法，這種方法能夠快速準(zhǔn)確的區(qū)分這兩種昆蟲。
[0008]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下的技術(shù)方案:
一種PCR檢測(cè)方法快速區(qū)分水椰八角鐵甲與椰心葉甲的引物對(duì)，采用水椰八角鐵甲的COI基因片段設(shè)計(jì) 的特異引物對(duì)，所述特異引物對(duì)為:上游:5' -CTTGAGCTGTTATATCACCG-3'，
下游:5' -TTCATAAAGTAAAGGAGTCCG-3'。
[0009]所述特異引物對(duì)存放于試劑盒中，所述試劑盒包含，
TaqDNA 聚合酶 5u/μ 1，10XPCR 緩沖液，25 mM MgC12, 2 mM dNTPs，滅菌雙蒸水，10μ MCOI特異引物對(duì)。
[0010]采用權(quán)利要求1所述引物對(duì)和權(quán)利要求2所述試劑盒快速區(qū)分水椰八角鐵甲與椰心葉甲的PCR檢測(cè)方法，所述PCR檢測(cè)方法包括以下步驟:
1)提取水椰八角鐵甲與椰心葉甲的總DNA作為DNA模板；
2)DNA模板的完整性檢測(cè)，將所述水椰八角鐵甲和椰心葉甲的DNA模板使用COI通用引物對(duì)和權(quán)利要求2所述試劑盒包含的試劑配制成PCR體系，將配置好的PCR體系放入PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增，用于檢驗(yàn)水椰八角鐵甲和椰心葉甲的DNA模板的完整性；
3)將所述水椰八角鐵甲和椰心葉甲的DNA模板使用所述COI特異引物對(duì)和所述試劑盒包含的試劑配制成PCR體系，將配置好的PCR體系放入PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增；
4)將步驟2)和步驟3)得到的水椰八角鐵甲和椰心葉甲的COI片段，在電泳儀上進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，通過凝膠成像系統(tǒng)采集電泳圖，觀察電泳條帶發(fā)現(xiàn)，水椰八角鐵甲和椰心葉甲在COI通用引物反應(yīng)下，都出現(xiàn)條帶，與COI特異引物反應(yīng)下，只有水椰八角鐵甲出現(xiàn)條帶，其位置在75(T850bp，其為SEQ ID N0.9所示的COI序列，而椰心葉甲沒出現(xiàn)條帶，說明該引物對(duì)水椰八角鐵甲具有特異性，從而可以區(qū)分兩個(gè)物種。
[0011]所述步驟2)和步驟3)中，PCR反應(yīng)體系中，PCR反應(yīng)程序?yàn)?
94°C預(yù)變性4分鐘；94°C變性30秒，53°C退火I分鐘，72°C延伸I分鐘，30個(gè)循環(huán)；最后72°C延伸5分鐘，4°C保存。
[0012]采用COI基因片段檢驗(yàn)DNA模板的完整性時(shí)，所用通用引物對(duì)為:
上游:5' -TTGATTTTTTGGTCATCCAGAAGT-3'，
下游:5' -TCCAATGCACTAATCTGCCATATTA-3'。
[0013]一種PCR檢測(cè)方法快速區(qū)分水椰八角鐵甲與椰心葉甲的引物對(duì)，采用水椰八角鐵甲的ITS-1基因片段設(shè)計(jì)的特異引物對(duì)，所述特異引物對(duì)為:
上游:5' -CGCACAAAATCATAAGGGT-3'，
下游:5' -CCTATATGCCGTTTCGCAA-3'。
[0014]所述特異引物對(duì)存放于試劑盒中，所述試劑盒包含，
TaqDNA 聚合酶 5u/μ 1，10XPCR 緩沖液，25 mM MgC12, 2 mM dNTPs，滅菌雙蒸水，10μ MITS-1特異引物對(duì)。
[0015]采用權(quán)利要求6所述的引物對(duì)和權(quán)利要求7所述試劑盒快速區(qū)分水椰八角鐵甲與椰心葉甲的PCR檢測(cè)方法，其特征在于:所述PCR檢測(cè)方法包括以下步驟:
1)提取水椰八角鐵甲與椰心葉甲的總DNA作為DNA模板；
2)DNA模板的完整性檢測(cè)，將所述水椰八角鐵甲和椰心葉甲的DNA模板使用ITS通用引物對(duì)和權(quán)利要求2所述試劑盒包含的試劑配制成PCR體系，將配置好的PCR體系放入PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增，用于檢驗(yàn)水椰八角鐵甲和椰心葉甲的DNA模板的完整性；
3)將所述水椰八角鐵甲和椰心葉甲的DNA模板使用所述ITS-1特異引物對(duì)和所述試劑盒包含的試劑配制成PCR體系，將配置好的PCR體系放入PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增；4)將步驟2)和步驟3)得到的水椰八角鐵甲和椰心葉甲的ITS片段，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，采集電泳圖，水椰八角鐵甲和椰心葉甲與ITS通用引物反應(yīng)下，水椰八角鐵甲和椰心葉甲都出現(xiàn)條帶，與ITS-1特異引物反應(yīng)下，只有水椰八角鐵甲出現(xiàn)條帶，其位置在450~550bp，其為SEQ ID N0.10所示的ITS-1序列，而椰心葉甲沒出現(xiàn)條帶，說明該引物對(duì)水椰八角鐵甲具有特異性，從而可以區(qū)分兩個(gè)物種。
[0016]所述步驟2)和步驟3)中，PCR反應(yīng)體系中，PCR反應(yīng)程序?yàn)?
94°C預(yù)變性4分鐘-M0C變性30秒，58°C退火，50秒，72°C延伸I分鐘，30個(gè)循環(huán)；最后72°C延伸5分鐘，4°C保存。
[0017]采用ITS基因片段檢驗(yàn)DNA模板的完整性時(shí)，所用通用引物對(duì)為:
上游:5' -TCCGTAGGTGAACCTGCG-3'，
下游:5' -GTAGTCTCACCTGCTCTG-3'。
[0018]本發(fā)明利用軟件Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)引物,經(jīng)過多輪篩選,發(fā)現(xiàn)水椰八角鐵甲的COI和ITS-1基因片段設(shè)計(jì)的特異引物對(duì)能夠快速、準(zhǔn)確地對(duì)水椰八角鐵甲進(jìn)行定性檢測(cè)。
[0019]本發(fā)明采用COI和ITS兩種基因片段作為水椰八角鐵甲的特異引物來區(qū)別兩種害蟲，在實(shí)際應(yīng)用中，兩種基因片段可同時(shí)采用，其準(zhǔn)確性更高。
[0020]本發(fā)明所用試劑均為常規(guī)市售試劑。
[0021]本發(fā)明利用水椰八角鐵甲與椰心葉甲兩種害蟲在COI和ITS兩個(gè)基因片段上的不同，所設(shè)計(jì)的引物及其PCR反應(yīng)程序?qū)λ私氰F甲有特異性，利用其特異性區(qū)分兩種害蟲。該方法準(zhǔn)確性高，且其效率高于形態(tài)學(xué)分類學(xué)區(qū)分方法，且不受蟲體發(fā)育形態(tài)限制，無論在成蟲或是幼蟲階段，均可使用該方法區(qū)分水椰八角鐵甲和椰心葉甲兩種相似的入侵害蟲。另外，在區(qū)別兩種害蟲時(shí)，只需取用活體的一部分即可。
[0022]說明書附圖
下面結(jié)合附圖和【具體實(shí)施方式】對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的說明:
圖1為本發(fā)明采用COI作為目標(biāo)片段設(shè)計(jì)引物，其PCR產(chǎn)物的凝膠電泳圖；
圖2為本發(fā)明采用ITS作為目標(biāo)片段設(shè)計(jì)引物，其PCR產(chǎn)物的凝膠電泳圖。
[0023]圖1中，M為標(biāo)記(marker);l-水椰八角鐵甲與COI通用引物反應(yīng)后的條帶；2-椰心葉甲與COI通用引物反應(yīng)后的條帶；3_水椰八角鐵甲與COI特異引物反應(yīng)后的條帶；4-椰心葉甲與COI特異引物反應(yīng)后的條帶；
圖2中，M為標(biāo)記(marker);l-水椰八角鐵甲與ITS通用引物反應(yīng)后的條帶；2_椰心葉甲與ITS通用引物反應(yīng)后的條帶；3_水椰八角鐵甲與ITS-1特異引物反應(yīng)后的條帶；4-椰心葉甲與ITS-1特異引物反應(yīng)后的條帶。
【具體實(shí)施方式】
[0024]本發(fā)明一種PCR檢測(cè)方法快速區(qū)分水椰八角鐵甲與椰心葉甲的引物對(duì)，采用水椰八角鐵甲的COI基因片段設(shè)計(jì)的特異引物對(duì)，所述特異引物對(duì)為:
上游:5' -CTTGAGCTGTTATATCACCG-3'，
下游:5' -TTCATAAAGTAAAGGAGTCCG-3'。
[0025]所述特異引物對(duì)存放于試劑盒中，所述試劑盒包含，TaqDNA 聚合酶 5u/μ 1，IOXPCR 緩沖液，25 mM MgC12, 2 mM dNTPs，滅菌雙蒸水，10μ MCOI特異引物對(duì)。
[0026]采用權(quán)利要求1所述引物對(duì)和權(quán)利要求2所述試劑盒快速區(qū)分水椰八角鐵甲與椰心葉甲的PCR檢測(cè)方法，所述PCR檢測(cè)方法包括以下步驟:
1)提取水椰八角鐵甲與椰心葉甲的總DNA作為DNA模板；
2)DNA模板的完整性檢測(cè)，將所述水椰八角鐵甲和椰心葉甲的DNA模板使用COI通用引物對(duì)和權(quán)利要求2所述試劑盒包含的試劑配制成PCR體系，將配置好的PCR體系放入PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增，用于檢驗(yàn)水椰八角鐵甲和椰心葉甲的DNA模板的完整性；
3)將所述水椰八角鐵甲和椰心葉甲的DNA模板使用所述COI特異引物對(duì)和所述試劑盒包含的試劑配制成PCR體系，將配置好的PCR體系放入PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增； 4)將步驟2)和步驟3)得到的水椰八角鐵甲和椰心葉甲的COI片段，在電泳儀上進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，通過凝膠成像系統(tǒng)采集電泳圖，觀察電泳條帶發(fā)現(xiàn)，水椰八角鐵甲和椰心葉甲在COI通用引物反應(yīng)下，都出現(xiàn)條帶，與COI特異引物反應(yīng)下，只有水椰八角鐵甲出現(xiàn)條帶，其位置在75(T850bp，其為SEQ ID N0.9所示的COI序列，而椰心葉甲沒出現(xiàn)條帶，說明該引物對(duì)水椰八角鐵甲具有特異性，從而可以區(qū)分兩個(gè)物種。
[0027]所述步驟2)和步驟3)中，PCR反應(yīng)體系中，PCR反應(yīng)程序?yàn)?
94°C預(yù)變性4分鐘-M0C變性30秒，53°C退火I分鐘，72°C延伸I分鐘，30個(gè)循環(huán)；最后72°C延伸5分鐘，4°C保存。
[0028]采用COI基因片段檢驗(yàn)DNA模板的完整性時(shí)，所用通用引物對(duì)為:
上游:5' -TTGATTTTTTGGTCATCCAGAAGT-3'，
下游:5' -TCCAATGCACTAATCTGCCATATTA-3'。
[0029]一種PCR檢測(cè)方法快速區(qū)分水椰八角鐵甲與椰心葉甲的引物對(duì)，采用水椰八角鐵甲的ITS-1基因片段設(shè)計(jì)的特異引物對(duì)，所述特異引物對(duì)為:
上游:5' -CGCACAAAATCATAAGGGT-3'，
下游:5' -CCTATATGCCGTTTCGCAA-3'。
[0030]所述特異引物對(duì)存放于試劑盒中，所述試劑盒包含，
TaqDNA 聚合酶 5u/μ 1，10XPCR 緩沖液，25 mM MgC12, 2 mM dNTPs，滅菌雙蒸水，10μ MITS-1特異引物對(duì)。
[0031]采用權(quán)利要求6所述的引物對(duì)和權(quán)利要求7所述試劑盒快速區(qū)分水椰八角鐵甲與椰心葉甲的PCR檢測(cè)方法，其特征在于:所述PCR檢測(cè)方法包括以下步驟:
1)提取水椰八角鐵甲與椰心葉甲的總DNA作為DNA模板；
2)DNA模板的完整性檢測(cè)，將所述水椰八角鐵甲和椰心葉甲的DNA模板使用ITS通用引物對(duì)和權(quán)利要求2所述試劑盒包含的試劑配制成PCR體系，將配置好的PCR體系放入PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增，用于檢驗(yàn)水椰八角鐵甲和椰心葉甲的DNA模板的完整性；
3)將所述水椰八角鐵甲和椰心葉甲的DNA模板使用所述ITS-1特異引物對(duì)和所述試劑盒包含的試劑配制成PCR體系，將配置好的PCR體系放入PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增；
4)將步驟2)和步驟3)得到的水椰八角鐵甲和椰心葉甲的ITS片段，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，采集電泳圖，水椰八角鐵甲和椰心葉甲與ITS通用引物反應(yīng)下，水椰八角鐵甲和椰心葉甲都出現(xiàn)條帶，與ITS-1特異引物反應(yīng)下，只有水椰八角鐵甲出現(xiàn)條帶，其位置在450~550bp，其為SEQ ID N0.10所示的ITS-1序列，而椰心葉甲沒出現(xiàn)條帶，說明該引物對(duì)水椰八角鐵甲具有特異性，從而可以區(qū)分兩個(gè)物種。
[0032]所述步驟2)和步驟3)中，PCR反應(yīng)體系中，PCR反應(yīng)程序?yàn)?
94°C預(yù)變性4分鐘-M0C變性30秒，58°C退火，50秒，72°C延伸I分鐘，30個(gè)循環(huán)；最后72°C延伸5分鐘，4°C保存。
[0033]采用ITS基因片段檢驗(yàn)DNA模板的完整性時(shí)，所用通用引物對(duì)為:
上游:5' -TCCGTAGGTGAACCTGCG-3'，
下游:5' -GTAGTCTCACCTGCTCTG-3'。
[0034]實(shí)施例:利用COI特異引物對(duì)區(qū)分水椰八角鐵甲與椰心葉甲
采用權(quán)利要求1所述引物對(duì)和權(quán)利要求2所述試劑盒快速區(qū)分水椰八角鐵甲與椰心葉甲的PCR檢測(cè)方法，所述PCR檢測(cè)方法包括以下步驟:
1)提取水椰八角鐵甲與椰心葉甲的總DNA作為DNA模板；
2)DNA模板的完整性檢測(cè)，將所述水椰八角鐵甲和椰心葉甲的DNA模板使用COI通用引物對(duì)和權(quán)利要求2所述試劑盒包含的試劑配制成PCR體系，將配置好的PCR體系放入PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增，用于檢驗(yàn)水椰 八角鐵甲和椰心葉甲的DNA模板的完整性；
3)將所述水椰八角鐵甲和椰心葉甲的DNA模板使用所述COI特異引物對(duì)和所述試劑盒包含的試劑配制成PCR體系，將配置好的PCR體系放入PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增；
步驟2)和步驟3) PCR反應(yīng)程序?yàn)?
94°C預(yù)變性4分鐘-M0C變性30秒，53°C退火I分鐘，72°C延伸I分鐘，30個(gè)循環(huán)；最后72°C延伸5分鐘，4°C保存。
[0035]4)將步驟2)和步驟3)得到的水椰八角鐵甲和椰心葉甲的COI片段在電泳儀上進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，通過凝膠成像系統(tǒng)采集電泳圖，觀察電泳條帶發(fā)現(xiàn)，如圖1所示，水椰八角鐵甲和椰心葉甲在COI通用引物反應(yīng)下，I泳道水椰八角鐵甲和2泳道椰心葉甲都有條帶，與COI特異引物反應(yīng)下，只有3泳道水椰八角鐵甲出現(xiàn)條帶，其位置在75(T850bp，其為SEQ ID N0.9所示的COI序列，而4泳道椰心葉甲沒出現(xiàn)條帶，說明該引物對(duì)水椰八角鐵甲的特異性，從而可以區(qū)分兩個(gè)物種。
[0036]利用ITS-1特異引物對(duì)區(qū)分水椰八角鐵甲與椰心葉甲
采用權(quán)利要求6所述的引物對(duì)和權(quán)利要求7所述試劑盒快速區(qū)分水椰八角鐵甲與椰心葉甲的PCR檢測(cè)方法，其特征在于:所述PCR檢測(cè)方法包括以下步驟:
1)提取水椰八角鐵甲與椰心葉甲的總DNA作為DNA模板；
2)DNA模板的完整性檢測(cè)，將所述水椰八角鐵甲和椰心葉甲的DNA模板使用ITS通用引物對(duì)和權(quán)利要求2所述試劑盒包含的試劑配制成PCR體系，將配置好的PCR體系放入PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增，用于檢驗(yàn)水椰八角鐵甲和椰心葉甲的DNA模板的完整性；
3)將所述水椰八角鐵甲和椰心葉甲的DNA模板使用所述ITS-1特異引物對(duì)和所述試劑盒包含的試劑配制成PCR體系，將配置好的PCR體系放入PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增；
步驟2)和步驟3) PCR反應(yīng)程序?yàn)?
94°C預(yù)變性4分鐘-M0C變性30秒，58°C退火，50秒，72°C延伸I分鐘，30個(gè)循環(huán)；最后72°C延伸5分鐘，4°C保存。
[0037]4)將步驟2)和步驟3)得到的水椰八角鐵甲和椰心葉甲的ITS片段進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，采集電泳圖，如圖2所示，水椰八角鐵甲和椰心葉甲與ITS通用引物反應(yīng)下，I泳道水椰八角鐵甲和2泳道椰心葉甲都有條帶，與ITS-1特異引物反應(yīng)下，只有3泳道水椰八角鐵甲出現(xiàn)條帶，其位置在45(T550bp，其為SEQ ID N0.10所示的ITS-1序列，而4泳道椰心葉甲沒出現(xiàn)條帶，說明該引物對(duì)水椰八角鐵甲的特異性，從而可以區(qū)分兩個(gè)物種。
[0038]通過觀察兩種引物對(duì)，即COI特異引物對(duì)和ITS-1特異引物對(duì)對(duì)水椰八角鐵甲和椰心葉甲的區(qū)分結(jié)果，如圖1和圖2所示，這兩種引物對(duì)均對(duì)水椰八角鐵甲具有特異性，SP兩種引物對(duì)的區(qū)分結(jié)果一致，且準(zhǔn)確性高。
[0039]序列表
<110>福建農(nóng)林大學(xué) 〈120〉一種區(qū)分水椰八角鐵甲與椰心葉甲的引物對(duì)、試劑盒以及PCR檢測(cè)方法 〈160〉 10 〈210〉 I 〈211〉 20 〈212〉 DNA 〈213〉人工序列 〈400〉 I
CTTGAGCTGT TATATCACCG 20
〈210〉 2
〈211〉 21
〈212〉 DNA
〈213〉人工序列
〈400〉 2
TTCATAAAGT AAAGGAGTCC G 21
〈210〉 3
〈211〉 24
〈212〉 DNA
〈213〉人工序列
〈400〉 3
TTGATTTTTT GGTCATCCAG AAGT 24
〈210〉 4
〈211〉 25
〈212〉 DNA
〈213〉人工序列
〈400〉 4
TCCAATGCAC TAATCTGCCA TATTA 25
〈210〉 5
〈211〉 19
〈212〉 DNA
〈213〉人工序列〈400〉 5
CCGCACAAAAT CATAAGGGT 19〈210〉 6〈211〉 19〈212〉 DNA〈213〉人工序列〈400〉 6
CCTATATGCC GTTTCGCAA 19
〈210〉 7
〈211〉 18
〈212〉 DNA
〈213〉人工序列
〈400〉 7
TCCGTAGGTG AACCTGCG 18〈210〉 8〈211〉 18〈212〉 DNA〈213〉人工序列〈400〉 8
GTAGTCTCAC CTGCTCTG 18〈210〉 9〈211〉 797〈212〉 DNA〈213〉水椰八角鐵甲〈400〉 9
CTTGAGCTGT TATATCACCG CTATCCTCCT ACTCCTTTCT CTCCCCGTTT TAGCAGGAGC 60TATTACCATA CTATTAACTG ACCGAAACAT CAACACATCA TTTTTTGACC CAGCTGGGGG 120AGGAGATCCC ATTCTTTACC AACACTTATT TTGATTTTTT GGACATCCGG AAGTTTATAT 180TTTGATTCTC CCAGGATTTG GGATAATCTC CCACATCATT AGCCAAGAAA GTGGAAAAAA 240AGAAACCTTT GGAGTCCTAG GAATAATTTA TGCAATAATA GCTATTGGAT TATTAGGATT 300TGTAGTTTGA GCACATCACA TATTTACTGT AGGAATAGAT GTAGACACAC GAGCTTATTT 360CACTTCAGCC ACAATAATCA TCGCAGTACC TACTGGTATC AAAATCTTCA GATGAATAGC 420AACTTACCAT GGTGTAAAAC TACAATTCAA CCCTCTAACT TTATGATCTC TGGGATTTGT 480ATTCCTTTTC ACAGTAGGAG GACTAACTGG AATTGTTCTA GCCAATTCAT CAATTGATAT 540TATTCTCCAC GATACATACT ATGTTGTAGC CCATTTTCAT TATGTATTGT CAATAGGTGC 600AGTATTCGCA ATTATAGGAG GATTTAGACA ATGATTCCCC CTAATTACAG GAACAACCCT 660TAATGAAAAA TTTATAAAAA TTCAATTCAT TGTTATATTC ATTGGAGTTA ATTTAACTTT 720TTTCCCACAA CATTTCTTAG GATTAAGAGG CATGCCTCGG CGATACTCAG ATTATCCGGA 780CTCCTTTACT TTATGAA 791〈210〉 10〈211〉 510〈212〉 DNA〈213〉水椰八角鐵甲〈400〉 10
CGCACAAAAT CATAGGGTGG ACAGCATATT AGATATCCAT GTGTGACGAA CAAATGGCAT 60TTCTGGTACC TAAGAGAGAG AAAATAAAGC CTCGCATGAG ATTTCTCTAT TTCTTTTGAG 120AAACAAACGA GACGTTTCCT TTCTGTAGGA TGCGATTTGT CGATTGTATG TCATTGAAAC 180GTACATATCG AAAGATCGGT CCGATGGTTT TTAAAGATTT TCGCCGTCAT GCCAAATGAG 240ATATTGATTA GAGAGACGAC AAGAGTTGTC GTTCTCTCCA TCAATTTCTC TTATTTGTTC 300TCATTAAGGA TGTAGATCTT TAGTGCGCAC GATAGTTCGT AAAGCACGCC CCGTATGTTA 360TACTCGAGCT CGTGCAATAA GTCACGATAT ATCGTTGAGC GCGCTTATTC ACAAACAAAT 420ATAAACTTTC CACATCAAAT AAAAGACACA CACGTTTTAC CGTAAGAAGC AAAACGTTCA 480TGAATGTATG TTTGCGAAAC GGCA TATAGG 510
【權(quán)利要求】
1.一種PCR檢測(cè)方法快速區(qū)分水椰八角鐵甲與椰心葉甲的引物對(duì)，其特征在于:采用水椰八角鐵甲的COI基因片段設(shè)計(jì)的特異引物對(duì)，所述特異引物對(duì)為: 上游:5' -CTTGAGCTGTTATATCACCG-3'， 下游:5' -TTCATAAAGTAAAGGAGTCCG-3'。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種PCR檢測(cè)方法快速區(qū)分水椰八角鐵甲與椰心葉甲的引物對(duì)， 其特征在于，所述特異引物對(duì)存放于試劑盒中，所述試劑盒包含， TaqDNA 聚合酶 5u/μ 1，10XPCR 緩沖液，25 mM MgC12, 2 mM dNTPs，滅菌雙蒸水，10μ MCOI特異引物對(duì)。
3.采用權(quán)利要求1所述引物對(duì)和權(quán)利要求2所述試劑盒快速區(qū)分水椰八角鐵甲與椰心葉甲的PCR檢測(cè)方法，其特征在于:所述PCR檢測(cè)方法包括以下步驟: 1)提取水椰八角鐵甲與椰心葉甲的總DNA作為DNA模板； 2)DNA模板的完整性檢測(cè)，將所述水椰八角鐵甲和椰心葉甲的DNA模板使用COI通用引物對(duì)和權(quán)利要求2 所述試劑盒包含的試劑配制成PCR體系，將配置好的PCR體系放入PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增，用于檢驗(yàn)水椰八角鐵甲和椰心葉甲的DNA模板的完整性； 3)將所述水椰八角鐵甲和椰心葉甲的DNA模板使用所述COI特異引物對(duì)和所述試劑盒包含的試劑配制成PCR體系，將配置好的PCR體系放入PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增； 4)將步驟2)和步驟3)得到的水椰八角鐵甲和椰心葉甲的COI片段，在電泳儀上進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，通過凝膠成像系統(tǒng)采集電泳圖，觀察電泳條帶發(fā)現(xiàn)，水椰八角鐵甲和椰心葉甲在COI通用引物反應(yīng)下，都出現(xiàn)條帶，與COI特異引物反應(yīng)下，只有水椰八角鐵甲出現(xiàn)條帶，其位置在75(T850bp，其為SEQ ID N0.9所示的COI序列，而椰心葉甲沒出現(xiàn)條帶，說明該引物對(duì)水椰八角鐵甲具有特異性，從而可以區(qū)分兩個(gè)物種。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的采用權(quán)利要求1所述引物對(duì)和權(quán)利要求2所述試劑盒快速區(qū)分水椰八角鐵甲與椰心葉甲的PCR檢測(cè)方法，其特征在于:所述步驟2)和步驟3)中，PCR反應(yīng)體系中，PCR反應(yīng)程序?yàn)?94°C預(yù)變性4分鐘；94°C變性30秒，53°C退火I分鐘，72°C延伸I分鐘，30個(gè)循環(huán)；最后72°C延伸5分鐘，4°C保存。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的采用權(quán)利要求1所述引物對(duì)和權(quán)利要求2所述試劑盒快速區(qū)分水椰八角鐵甲與椰心葉甲的PCR檢測(cè)方法，其特征在于:采用COI基因片段檢驗(yàn)DNA模板的完整性時(shí)，所用通用引物對(duì)為: 上游:5' -TTGATTTTTTGGTCATCCAGAAGT-3'， 下游:5' -TCCAATGCACTAATCTGCCATATTA-3'。
6.一種PCR檢測(cè)方法快速區(qū)分水椰八角鐵甲與椰心葉甲的引物對(duì)，其特征在于:采用水椰八角鐵甲的ITS-1基因片段設(shè)計(jì)的特異引物對(duì)，所述特異引物對(duì)為: 上游:5' -CGCACAAAATCATAAGGGT-3'， 下游:5' -CCTATATGCCGTTTCGCAA-3'。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的一種PCR檢測(cè)方法快速區(qū)分水椰八角鐵甲與椰心葉甲的引物對(duì)， 其特征在于，所述特異引物對(duì)存放于試劑盒中，所述試劑盒包含， TaqDNA 聚合酶 5u/μ 1，10XPCR 緩沖液，25 mM MgC12, 2 mM dNTPs，滅菌雙蒸水，10μ MITS-1特異引物對(duì)。
8.采用權(quán)利要求6所述的引物對(duì)和權(quán)利要求7所述試劑盒快速區(qū)分水椰八角鐵甲與椰心葉甲的PCR檢測(cè)方法，其特征在于:所述PCR檢測(cè)方法包括以下步驟: 1)提取水椰八角鐵甲與椰心葉甲的總DNA作為DNA模板； 2)DNA模板的完整性檢測(cè)，將所述水椰八角鐵甲和椰心葉甲的DNA模板使用ITS通用引物對(duì)和權(quán)利要求2所述試劑盒包含的試劑配制成PCR體系，將配置好的PCR體系放入PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增，用于檢驗(yàn)水椰八角鐵甲和椰心葉甲的DNA模板的完整性； 3)將所述水椰八角鐵甲和椰心葉甲的DNA模板使用所述ITS-1特異引物對(duì)和所述試劑盒包含的試劑配制成PCR體系，將配置好的PCR體系放入PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增； 4)將步驟2)和步驟3)得到的水椰八角鐵甲和椰心葉甲的ITS片段，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，采集電泳圖，水椰八角鐵甲和椰心葉甲與ITS通用引物反應(yīng)下，水椰八角鐵甲和椰心葉甲都出現(xiàn)條帶，與ITS-1特異引物反應(yīng)下，只有水椰八角鐵甲出現(xiàn)條帶，其位置在450~550bp，其為SEQ ID N0.10所示的ITS-1序列，而椰心葉甲沒出現(xiàn)條帶，說明該引物對(duì)水椰八角鐵甲具有特異性，從而可以區(qū)分兩個(gè)物種。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的采用權(quán)利要求6所述的引物對(duì)和權(quán)利要求7所述試劑盒快速區(qū)分水椰八角鐵甲與椰心葉甲的PCR檢測(cè)方法，其特征在于:所述步驟2)和步驟3)中，PCR反應(yīng)體系中，PCR反應(yīng)程序?yàn)?94°C預(yù)變性4分鐘；94°C變性30秒，58°C退火，50秒，72°C延伸I分鐘，30個(gè)循環(huán)；最后72°C延伸5分鐘，4°C保存。
10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的采用權(quán)利要求6所述的引物對(duì)和權(quán)利要求7所述試劑盒快速區(qū)分水椰八角鐵甲與椰心葉甲的PCR檢測(cè)方法，其特征在于:采用ITS基因片段檢驗(yàn)DNA模板的完整性時(shí)，所用通用引物對(duì)為: 上游:5' -TCCGTAGGTGAACCTGCG-3'， 下游:5' -GTAGTCTCACCTGCTCTG-3'。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK103540664SQ201310491645
【公開日】2014年1月29日 申請(qǐng)日期:2013年10月21日 優(yōu)先權(quán)日:2013年10月21日
【發(fā)明者】張翔, 湯寶珍, 侯有明, 黃斌 申請(qǐng)人:福建農(nóng)林大學(xué)