原發(fā)替莫唑胺及貝伐珠單抗耐藥的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系及其構(gòu)建方法和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了原發(fā)替莫唑胺及貝伐珠單抗耐藥的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系及其構(gòu)建方法和應(yīng)用。本發(fā)明通過臨床篩選，獲得原發(fā)替莫唑胺及貝伐珠單抗耐藥的膠質(zhì)母細(xì)胞患者的組織標(biāo)本，通過酶消化法，原代培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞，連續(xù)傳代至五十代，獲得一株原發(fā)替莫唑胺及貝伐珠單抗耐藥的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系，其微生物保藏編號為：CGMCC?No.8205。本發(fā)明膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系性狀穩(wěn)定，能夠穩(wěn)定遺傳，對于替莫唑胺和貝伐珠單抗均具有較高的耐受性，其細(xì)胞增殖周期為48h左右，具有較強(qiáng)的侵襲性和致瘤性。本發(fā)明所建立的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系在篩選治療膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的藥物以及研究膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的致病機(jī)理等方面具有重要的應(yīng)用前景。
【專利說明】原發(fā)替莫唑胺及貝伐珠單抗耐藥的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系及其構(gòu)建方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一株膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系，尤其涉及一株原發(fā)替莫唑胺及貝伐珠單抗耐藥的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系及其構(gòu)建方法，本發(fā)明進(jìn)一步涉及該膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系在篩選治療替莫唑胺及貝伐珠單抗耐藥的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的候選藥物、制備人膠質(zhì)母細(xì)胞瘤模型等方面的應(yīng)用，屬于膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系的構(gòu)建領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]腦膠質(zhì)瘤是顱內(nèi)最常見的惡性腫瘤，約占顱內(nèi)腫瘤的35% 61%。因其血管豐富，浸潤性生長，缺乏凋亡等異常的生物學(xué)特性導(dǎo)致腦膠質(zhì)瘤富有高度的侵襲性，外加上血腦屏障的存在為膠質(zhì)瘤的治療帶來諸多困境。美國每年有超過15000例新發(fā)惡性膠質(zhì)瘤病例。國內(nèi)目前尚缺乏大型的流行病學(xué)數(shù)據(jù)。惡性膠質(zhì)瘤中又以是膠質(zhì)母細(xì)胞瘤最為常見，起病隱匿，侵襲性強(qiáng)，血液供應(yīng)極其豐富，因而患者的中位生存時間較短，且復(fù)發(fā)后患者的生存時間不超過9個月。
[0003]目前針對膠質(zhì)瘤的治療主要基于WHO的膠質(zhì)瘤分級劃分方法，1、11級膠質(zhì)瘤以手術(shù)治療為主，放療的選擇可根據(jù)手術(shù)切除程度酌情選擇，II1、IV級膠質(zhì)瘤治療以手術(shù)切除聯(lián)合術(shù)后的放、化療。2005年Stupp等報道了一項替莫唑胺聯(lián)合放療后輔以6周期替莫唑胺單藥治療新診斷膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的III期臨床試驗，結(jié)果顯示替莫唑胺聯(lián)合放療再輔以替莫唑胺的輔助化療患者中位生存時間獲得改善，中位生存時間提高到了 14.6個月，且替莫唑胺的不良事件發(fā)生率低于亞硝脲類抗腫瘤藥物。正是基于這一研究，使得替莫唑胺成為膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的一線治療藥物。隨著分子生物學(xué)的進(jìn)步，靶向治療已成為腫瘤治療的重要治療方式之一。2009年5月美國FDA快速審批了貝伐珠單抗在復(fù)發(fā)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中的應(yīng)用，延長了復(fù)發(fā)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者的生存時間。盡管顯微神經(jīng)外科技術(shù)的應(yīng)用以及三維適形、調(diào)強(qiáng)放療技術(shù)的 應(yīng)用，特別是2005年以來替莫唑胺的問世以及貝伐珠單抗在臨床上的應(yīng)用，使得膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的中位生存時間提高到了 14.6個月，但其遠(yuǎn)期效果仍很差，兩年生存率為26.5%、五年生存率不到9%。腫瘤細(xì)胞耐藥成為目前腫瘤治療的主要瓶頸，也是腫瘤患者死亡的主要原因。
[0004]國內(nèi)外現(xiàn)有的膠質(zhì)瘤細(xì)胞系大多不存在原發(fā)耐藥的特性，化療藥物誘導(dǎo)建立的一些耐藥細(xì)胞系在建立過程中也同樣存在著腫瘤生物學(xué)行為的改變，不能夠很好的指導(dǎo)應(yīng)用。因此通過篩選臨床病例，建立一株原發(fā)替莫唑胺及貝伐珠單抗耐藥的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系，對于篩選治療替莫唑胺及貝伐珠單抗耐藥的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的候選藥物、研究膠質(zhì)瘤的病因病理等方面均具有深遠(yuǎn)意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的之一是提供一株原發(fā)替莫唑胺及貝伐珠單抗耐藥的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系；[0006]本發(fā)明的目的之二是提供一種構(gòu)建所述原發(fā)替莫唑胺及貝伐珠單抗耐藥的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系的方法；
[0007]本發(fā)明的目的之三是將所構(gòu)建的原發(fā)替莫唑胺及貝伐珠單抗耐藥的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系應(yīng)用于篩選治療替莫唑胺及貝伐珠單抗耐藥的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的候選藥物、制備人膠質(zhì)母細(xì)胞瘤模型等方面。
[0008]本發(fā)明的上述目的是通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)的:
[0009]本發(fā)明通過臨床篩選，選擇原發(fā)替莫唑胺及貝伐珠單抗耐藥的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者，手術(shù)獲得患者的腫瘤組織標(biāo)本，運用酶消化法原代培養(yǎng)獲得穩(wěn)定傳代的傳代細(xì)胞，續(xù)傳至50代，獲得一株原發(fā)替莫唑胺及貝伐珠單抗耐藥的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系(LC-11)，將其保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號:CGMCC N0.8205;分類命名為:一種原發(fā)替莫唑胺及貝伐珠單抗耐藥的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系；保藏日期:2013年9月27日；保藏單位:中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏地址:北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所。
[0010]本發(fā)明還提供了一種構(gòu)建所述原發(fā)替莫唑胺及貝伐珠單抗耐藥的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系(LC-1l)的方法，該方法包括以下步驟:
[0011](I)通過臨床病例篩選，選擇異位復(fù)發(fā)的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者，給予替莫唑胺膠囊及貝伐珠單抗治療，選擇腫瘤未見明顯縮小并進(jìn)一步增長的膠質(zhì)瘤患者，通過二次手術(shù)獲得膠質(zhì)母細(xì)胞瘤組織標(biāo)本；
[0012](2)將手術(shù)獲取 的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤病理標(biāo)本運用胰蛋白酶消化成單細(xì)胞懸液；
[0013](3)將胰蛋白酶消化后的細(xì)胞離心，加入培養(yǎng)基接種至培養(yǎng)瓶內(nèi)傳代培養(yǎng)，續(xù)傳至16代，獲得細(xì)胞生長趨于穩(wěn)定的細(xì)胞；
[0014](4)將穩(wěn)定傳代的細(xì)胞每代凍存，傳代至50余代，篩選獲得原發(fā)替莫唑胺及貝伐珠單抗耐藥的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系。
[0015]本發(fā)明在構(gòu)建原發(fā)替莫唑胺及貝伐珠單抗耐藥的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系(LC-1l)的過程中，所選患者為顱內(nèi)原發(fā)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤，手術(shù)后給予替莫唑胺聯(lián)合放療的同步治療，異位腫瘤種植復(fù)發(fā)，給予替莫唑胺膠囊及貝伐珠單抗治療后異位播散腫瘤無明顯改善。進(jìn)行二次手術(shù)，獲得的異位耐藥腫瘤組織的手術(shù)標(biāo)本并進(jìn)行原代細(xì)胞培養(yǎng)。
[0016]本發(fā)明將篩選的原發(fā)替莫唑胺及貝伐珠單抗耐藥的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系(LC-1l)進(jìn)行了形態(tài)學(xué)、染色體核型、藥物敏感性、侵襲性以及致瘤性等方面的鑒定:
[0017]本發(fā)明將培養(yǎng)的LC-1l細(xì)胞在倒置顯微鏡下進(jìn)行觀察，觀察發(fā)現(xiàn)LC-1l細(xì)胞貼壁生長，形態(tài)多樣，大多數(shù)細(xì)胞呈梭形，部分為三角形，多邊形。細(xì)胞間失去接觸抑制，呈惡性生長，具有重疊生長的特點。
[0018]顯微鏡下觀察LC-1l細(xì)胞染色體數(shù)目，連續(xù)傳代的LC-1l細(xì)胞仍保持人源性腫瘤細(xì)胞染色體的特征，表現(xiàn)為多倍體，染色體數(shù)集中在81-88條之間，存在多數(shù)中央級亞中央著絲粒染色體。
[0019]本發(fā)明采用MTT法檢測LC-1l細(xì)胞的生長活性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)本發(fā)明LC-1l細(xì)胞系增殖周期為48h左右。
[0020]本發(fā)明還采用劃痕實驗檢測LC-1l細(xì)胞的侵襲性，劃痕實驗結(jié)果表明，LC-1l細(xì)胞系具有較強(qiáng)的遷移能力。[0021]細(xì)胞耐藥性實驗表明，LC-1l細(xì)胞系對于藥物替莫唑胺和貝伐珠單抗具有較高的耐受性。
[0022]異體成瘤動物實驗結(jié)果表明，LC-1l細(xì)胞系具有較強(qiáng)的致瘤性。
[0023]本發(fā)明所建立的原發(fā)替莫唑胺及貝伐珠單抗耐藥的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系(LC-1l)性狀穩(wěn)定，能夠穩(wěn)定遺傳，體外傳代自16代至50代性狀保持穩(wěn)定，具有一般在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤所具備的的一般生物學(xué)特性，同時具備現(xiàn)有膠質(zhì)母細(xì)胞瘤不具備的原發(fā)替莫唑胺及貝伐珠單抗耐藥的特性，為膠質(zhì)母細(xì)胞瘤研究提供新的更接近于臨床腫瘤生物學(xué)特性的實驗材料；通過哺乳動物模型的建立，可用于篩選治療替莫唑胺及貝伐珠單抗耐藥的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的候選藥物，為進(jìn)一步探索替莫唑胺及貝伐珠單抗耐藥機(jī)制提供重要試驗工具；還可用于在哺乳動物中產(chǎn)生膠質(zhì)母細(xì)胞瘤，制備人膠質(zhì)母細(xì)胞瘤模型，通過哺乳動物膠質(zhì)母細(xì)胞瘤模型的建立，在研究膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的致病機(jī)理以及篩選治療膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的治療藥物等方面具有重要的應(yīng)用前景?！緦＠綀D】

【附圖說明】
[0024]圖1為患者腫瘤的影像學(xué)資料；A:患者首次術(shù)前及術(shù)后的影像學(xué)資料；B:為患者第一次術(shù)后放化療后腫瘤異位復(fù)發(fā)的影像學(xué)資料。
[0025]圖2患者腫瘤異位復(fù)發(fā)的影像學(xué)資料；A:為患者異位復(fù)發(fā)腫瘤給予替莫唑胺膠囊及貝伐珠單抗治療后的影像學(xué)資料:為患者異位復(fù)發(fā)腫瘤二次術(shù)后影像學(xué)資料。
[0026]圖3細(xì)胞傳代培養(yǎng)狀況;A:為原代培養(yǎng)至第五代細(xì)胞狀況；B:為原代培養(yǎng)至第五十代細(xì)胞狀況。
[0027]圖4倒置顯微鏡下觀察的原發(fā)耐藥膠質(zhì)母細(xì)胞瘤LC-1l細(xì)胞系的形態(tài)。
[0028]圖5顯微鏡下觀察LC-1l細(xì)胞系的染色體數(shù)目。
[0029]圖6LC-11細(xì)胞的生長曲線。
[0030]圖7細(xì)胞侵襲性實驗結(jié)果；A:是劃痕后細(xì)胞形態(tài)，可見清晰的劃痕；B:是劃痕后無血清培養(yǎng)24h后的細(xì)胞狀態(tài)。
[0031]圖8細(xì)胞對替莫唑胺的耐受性實驗;A:為LC-1l細(xì)胞系對替莫唑胺的耐受性實驗；B:為U87細(xì)胞系對替莫唑胺的耐受性實驗。
[0032]圖9細(xì)胞對貝伐珠單抗的耐受性實驗;A:為LC-1l細(xì)胞系對貝伐珠單抗的耐受性實驗；B:為U87細(xì)胞系對貝伐珠單抗的耐受性實驗。
[0033]圖10LC-11細(xì)胞系異體成瘤實驗結(jié)果。
【具體實施方式】
[0034]下面結(jié)合具體實施方案來進(jìn)一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點和特點將會隨著描述而更為清楚。但這些實施例僅是范例性的，并不對本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對本發(fā)明技術(shù)方案的細(xì)節(jié)和形式進(jìn)行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。
[0035]實驗材料
[0036]1.細(xì)胞培養(yǎng)液的配制方法
[0037]1.1培養(yǎng)液DMEM/F12組成如下:[0038]2%胎牛血清(美國GIBCO公司)，10ng/ml重組人表皮生長因子(美國SIGMA)，IOug/ml重組人胰島素(美國GIBCO公司)，6.7ng/ml亞硒酸鈉(美國GIBCO公司)，5.5ug/ml轉(zhuǎn)鐵蛋白(美國GIBCO公司)，100U/ml青霉素G、100ug/ml硫酸鏈霉素(美國GIBCO公司)。
[0039]1.2胰蛋白酶消化液:0.25% (w/v)胰酶+0.02 (w/v) EDTA溶液(美國GIBCO公司)。
[0040]2其它培養(yǎng)材料
[0041]細(xì)胞篩；細(xì)胞凍存液(FBS:DMS0=9:1);PBS緩沖液；培養(yǎng)箱；超凈工作臺；倒置顯微 鏡。
[0042]3標(biāo)本來源
[0043]首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京世紀(jì)壇醫(yī)院腦膠質(zhì)瘤病區(qū)患者謝某某(住院號316900)，男性，43歲，術(shù)前征得本人同意，簽署知情同意書，術(shù)中切除右側(cè)顳葉異位復(fù)發(fā)的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤組織標(biāo)本。術(shù)后病理診斷為膠質(zhì)母細(xì)胞瘤，WHO分級為IV級(三博腦科醫(yī)院病理號:005171)。
[0044]4實驗動物
[0045]BALB/c裸鼠，由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心提供。
[0046]實施例1原發(fā)耐藥膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系的構(gòu)建
[0047]一、實驗方法
[0048]手術(shù)獲得人膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者的手術(shù)標(biāo)本，采用酶消化法獲得分散的腫瘤細(xì)胞，置于含有培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶內(nèi)，連續(xù)傳代培養(yǎng)至50代，獲得體外穩(wěn)定傳代的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系。具體實施步驟如下:
[0049]1.手術(shù)獲得腫瘤組織的處理
[0050]將手術(shù)獲得的組織標(biāo)本放入含有青霉素和鏈霉素的培養(yǎng)基中，置于液氮罐內(nèi)；30分鐘內(nèi)帶入實驗室進(jìn)行處理；超凈工作臺內(nèi)反復(fù)沖洗組織塊，去除組織塊的血管及血凝塊；用眼科剪將組織塊剪成大小約3-5mm3大小的小塊；加入30倍于細(xì)胞體積的胰蛋白酶，放入恒溫水平震動箱內(nèi)震動消化40分鐘；將含有組織塊及細(xì)胞的消化液經(jīng)過濾網(wǎng)濾過；收集濾過液，移入離心管內(nèi)，高速離心(3000轉(zhuǎn)/分)離心10分鐘；去除上清，加入預(yù)先配制好的DMEM/F12培養(yǎng)基；吹打混勻細(xì)胞。
[0051]2.細(xì)胞計數(shù)及傳代培養(yǎng)
[0052]通過計數(shù)后，按5 X 105/ml數(shù)量將消化后的細(xì)胞混懸液接種至培養(yǎng)瓶內(nèi)傳代培養(yǎng)；觀察細(xì)胞生長情況，待細(xì)胞貼壁生長至80%-90%融合時進(jìn)行傳代；用移液槍頭輕輕吸掉瓶內(nèi)舊培養(yǎng)液，后加入3ml PBS液清洗細(xì)胞一次，吸出清洗液；向培養(yǎng)瓶中加Iml0.25%胰蛋白酶消化液，倒置熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞，待細(xì)胞開始逐漸變圓，吸出消化液，放入CO2培養(yǎng)箱中靜置30秒-1分鐘；加3ml培養(yǎng)基終止消化，用移液槍頭反復(fù)吹打，待細(xì)胞脫落并形成單個細(xì)胞懸液，轉(zhuǎn)移至15ml離心管中，800轉(zhuǎn)/分鐘，離心5分鐘；以5X105個每瓶分裝入新的培養(yǎng)瓶內(nèi)，繼續(xù)培養(yǎng)。傳代至16代細(xì)胞生長狀況穩(wěn)定。傳代比率為1:2 ;連續(xù)傳代培養(yǎng)至50代。
[0053]3.細(xì)胞的凍存
[0054]選取對數(shù)生長期細(xì)胞，去除培養(yǎng)基，加入5ml PBS液，漂洗細(xì)胞1_2分鐘；吸出PBS液，加入Iml胰蛋白酶/EDTA液，觀察培養(yǎng)瓶內(nèi)細(xì)胞，見細(xì)胞攣縮變圓，吸出消化酶，將細(xì)胞放入二氧化碳孵箱內(nèi)，約30-40秒后加入4ml培養(yǎng)基；加入4ml培養(yǎng)基后，吹打細(xì)胞，使之從內(nèi)壁脫落，制備成細(xì)胞懸液；將吹打均勻的細(xì)胞轉(zhuǎn)入離心管內(nèi)，離心機(jī)離心5分鐘，800轉(zhuǎn)/分鐘；將離心液上清去除，加入預(yù)先配置好的凍存液1.5ml，將細(xì)胞吹打均勻，移入凍存管內(nèi)。
[0055]4.細(xì)胞的復(fù)蘇
[0056]從液氮罐中取出凍存管，迅速放入37°C水浴箱內(nèi)，并不時搖動，使之盡快解凍；將細(xì)胞移入離心管內(nèi)，低速離心5分鐘，500轉(zhuǎn)/分鐘；吸出上清液，再重復(fù)用培養(yǎng)基漂洗、離心2次；加入培養(yǎng)基適量后,移入培養(yǎng)瓶內(nèi)，置于二氧化碳孵育箱內(nèi)培養(yǎng)，次日更換培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。
[0057]二、實驗結(jié)果
[0058]將手術(shù)獲取的原發(fā)替莫唑胺及貝伐珠單抗耐藥的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤組織經(jīng)過酶消化后，獲得單細(xì)胞懸液，在體外連續(xù)傳代半年多，傳代至50代(圖3A為原代培養(yǎng)至第五代細(xì)胞狀況；圖3B為原代培養(yǎng)至第五十代細(xì)胞狀況)，篩選獲得永生化的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系，命名為LC-1l細(xì)胞。
[0059]實驗例I原發(fā)耐藥膠質(zhì)母細(xì)胞瘤LC-1l細(xì)胞系的生物學(xué)特征鑒定實驗
[0060]1.形態(tài)學(xué)觀察
[0061]將培養(yǎng)的LC-1l細(xì)胞的培養(yǎng)瓶置于倒置顯微鏡下，在明視野下進(jìn)行拍照，細(xì)胞貼壁生長，可見該腫瘤細(xì)胞形態(tài)多樣，大多數(shù)細(xì)胞呈梭形，部分為三角形，多邊形。細(xì)胞間失去接觸抑制，呈惡性生長，具有重疊生長的特點(圖4)。
[0062]2.染色體 核型分析
[0063]將培養(yǎng)的LC-1l細(xì)胞置于4°C 12小時后，加入秋水仙素，使其終濃度為4 μ g/ml，再于37°C孵箱內(nèi)10小時。采集分裂中期的細(xì)胞，用固定液進(jìn)行固定，然后將細(xì)胞懸液低于預(yù)冷的載物片上，用Giemas染色液染色，顯微鏡下觀察染色體數(shù)目(圖5)，可見，連續(xù)傳代的LC-1l細(xì)胞仍保持人源性腫瘤細(xì)胞染色體的特征，表現(xiàn)為多倍體，染色體數(shù)集中在81-88條之間，存在多數(shù)中央級亞中央著絲粒染色體。
[0064]3.細(xì)胞動力學(xué)分析
[0065]采用MTT法檢測LC-1I細(xì)胞的生長活性，經(jīng)過連續(xù)7天得MTT實驗，測得該LC-11細(xì)胞系增殖周期為48h左右(圖6)。
[0066]4.細(xì)胞侵襲性實驗
[0067]采用劃痕實驗檢測LC-1l細(xì)胞的侵襲性。劃痕實驗用來檢測貼壁腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力。圖7A是劃痕后LC-1l細(xì)胞形態(tài)，可見清晰的劃痕。圖7B是劃痕后無血清培養(yǎng)24h后的LC-1l細(xì)胞狀態(tài)，可見劃痕減小，在無血清刺激的前提下，排除細(xì)胞增殖的影響，可見LC-1l細(xì)胞系具有較強(qiáng)的遷移能力。
[0068]5.細(xì)胞耐藥性實驗
[0069]分別以替莫唑胺(temozolomide,購自羅氏公司)和貝伐珠單抗(Avastin,購自羅氏公司)的血藥峰濃度為參考對兩種藥物進(jìn)行倍比稀釋，不同濃度的兩種藥物作用LC-1l細(xì)胞24h后進(jìn)行MTT檢測，可見藥物濃度增加到約10倍血藥峰濃度的時候，LC-1l活細(xì)胞數(shù)目仍未減少。而同樣條件的另外一種膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U87mG (U87mG購自協(xié)和醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院細(xì)胞中心)則已經(jīng)藥物不耐受(圖8、圖9)。[0070]6.異體成瘤實驗
[0071]體外大規(guī)模培養(yǎng)和收集LC-1l細(xì)胞系，皮下接種BALB/C裸小鼠，細(xì)胞接種數(shù)約為5 X IO6個，2周后觀察可見有質(zhì)地硬的白色小結(jié)節(jié)形成，直徑在3-5_之間。繼續(xù)觀察發(fā)現(xiàn)3周后結(jié)節(jié) 消失(圖10)。
【權(quán)利要求】
1.一株原發(fā)替莫唑胺及貝伐珠單抗耐藥的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系，其特征在于，其微生物保藏編號是:CGMCC N0.8205。
2.—種構(gòu)建權(quán)利要求1所述的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系，其特征在于，包括以下步驟: (1)通過臨床病例篩選，選擇異位播散的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者，給予替莫唑胺膠囊及貝伐珠單抗治療，選擇腫瘤未見明顯縮小并進(jìn)一步增長的膠質(zhì)瘤患者，通過二次手術(shù)獲得膠質(zhì)母細(xì)胞瘤組織標(biāo)本； (2)將手術(shù)獲取的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤病理標(biāo)本運用胰蛋白酶消化成單細(xì)胞懸液； (3)將胰蛋白酶消化后的細(xì)胞離心，加入培養(yǎng)基接種至培養(yǎng)瓶內(nèi)傳代培養(yǎng)，續(xù)傳至16代，獲得細(xì)胞生長趨于穩(wěn)定的細(xì)胞； (4)將穩(wěn)定傳代的細(xì)胞每代凍存，傳代至50余代，篩選獲得原發(fā)替莫唑胺及貝伐珠單抗耐藥的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系。
3.權(quán)利要求1所述的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系在篩選治療膠質(zhì)瘤藥物中的應(yīng)用。
4.按照權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于:所述的膠質(zhì)瘤是腦膠質(zhì)瘤。
5.權(quán)利要求1所述的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系在構(gòu)建膠質(zhì)母細(xì)胞瘤動物模型中的應(yīng)用。
6.權(quán)利要求1所述的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系作為試驗工具研究膠質(zhì)瘤病因病理中的應(yīng)用?！?br> 【文檔編號】C12Q1/02GK103525765SQ201310491849
【公開日】2014年1月22日 申請日期:2013年10月18日 優(yōu)先權(quán)日:2013年10月18日
【發(fā)明者】李文斌, 江濤, 康勛, 丁衛(wèi), 邱曉光, 白雪佳, 陳靜, 石蕊 申請人:李文斌, 江濤, 康勛