專利名稱：一種具有抗氧化活性的茶樹菇發(fā)酵液多糖的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種具有抗氧化活性的茶樹菇發(fā)酵液多糖的制備方法。屬生物工程技術(shù)應用領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
茶樹菇屬擔子菌綱，糞銹傘科，田菇屬，又名茶菇、油茶菇、神菇。是近年來發(fā)展起來的一種食用菌新品種。茶樹菇營養(yǎng)豐富，蛋白質(zhì)含量高，含有人體必需的氨基酸，并且有豐富的B族維生素和鉀、鈉、鈣、鎂、鐵、鋅等礦質(zhì)元素。中醫(yī)認為該菇性平、甘溫、無毒，具有較高的藥用價值，有清熱、平肝、明目、健脾的功效。是一種集營養(yǎng)、保健、理療于一身的綠色食品。目前，人們獲得真菌多糖的途徑主要是從真菌子實體提取而得，但隨著需求量的增大，野生資源有限，人工栽培周期長且容易污染雜菌，受病蟲害侵蝕，而菌絲體培養(yǎng)周期短， 染菌少，故應該探索在生物反應器內(nèi)進行液體深層發(fā)酵以獲取多糖的途徑，為開辟工業(yè)化液體深層發(fā)酵生產(chǎn)真菌多糖提供可靠依據(jù)。通過深層發(fā)酵獲得的多糖，具有一定的抗氧化活性，可應用于保健品行業(yè)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種具有抗氧化活性的茶樹菇發(fā)酵液多糖的制備方法本發(fā)明的技術(shù)方案為將茶樹菇子實體通過組織分離法接入固體斜面培養(yǎng)基上培養(yǎng)，待長好后移至搖瓶種子液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，將培養(yǎng)好的種子液接入搖瓶發(fā)酵液體培養(yǎng)基培養(yǎng)。發(fā)酵結(jié)束后，離心取上清液濃縮，乙醇沉淀，脫蛋白，脫色，凝膠層析柱純化，透析后冷凍干燥得到茶樹菇發(fā)酵液多糖。最后進行體外抗氧化實驗。本發(fā)明發(fā)明的茶樹菇發(fā)酵液多糖具有一定的抗氧化活性。可以作為原料應用于保健食品等領(lǐng)域。上述技術(shù)方案中，斜面培養(yǎng)基為PDA培養(yǎng)基，搖瓶種子培養(yǎng)基為PDAlL加磷酸二氫鉀lg，硫酸鎂0. 5g，牛肉膏2g，蛋白胨lg，pH6.0，發(fā)酵培養(yǎng)基為玉米粉2g/100mL、酵母粉 0. 3g/100mL、磷酸二氫鉀 0. 2g/100mL、硫酸鎂 0. 05g/100mL,培養(yǎng)條件為起始 pH6. 0，250mL 三角瓶裝培養(yǎng)基IOOmL于25°C，150r/min，振蕩培養(yǎng)7d。多糖提取方法為發(fā)酵結(jié)束后離心取上清液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至原體積的1/5，加入3倍體積95%乙醇在4°C醇析，沉淀物用蒸餾水復溶后用木瓜蛋白酶和kvage法聯(lián)合去除游離蛋白，H2O2脫色、葡聚糖凝膠G-200 層析柱純化，蒸餾水透析，冷凍干燥后得到茶樹菇發(fā)酵液多糖?？寡趸囼瀸⒖傔€原能力， 清除羥基自由基、超氧陰離子、DPPH的能力作為指標。
具體實施例方式下面的實例將具體說明本發(fā)明的操作方法，但不能作為對本發(fā)明的限定。實例一1.發(fā)酵液制備
出發(fā)菌種為市售茶樹菇(Agrocybe aegirit)；
(1)組織分離法
斜面培養(yǎng)基PDA培養(yǎng)基，含1. 5% 2. 0%瓊脂，pH自然；
組織分離方法將子實體外表用酒精進行表面消毒后，放入超凈工作臺上，用消毒過的刀片與鑷子切取菌柄與菌蓋交界處組織塊接入斜面培養(yǎng)基上，PH自然，置于25°C溫度下暗培養(yǎng)，5d后菌絲開始萌發(fā)，每隔2d檢查1次，除去污染，選擇菌絲生長速度快和長勢強的試管作為純母種；
(2)搖瓶種子培養(yǎng)
搖瓶種子培養(yǎng)基PDA1L加磷酸二氫鉀lg，硫酸鎂0. 5g，牛肉膏2g，蛋白胨lg， ρΗ6· 0 ；
培養(yǎng)方法從斜面菌種中取3 4塊黃豆大小相同的菌塊，接種于搖瓶種子培養(yǎng)基中，250mL三角瓶裝培養(yǎng)基IOOmL于25°C，150r/min，振蕩培養(yǎng)7d ；
(3)搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)
發(fā)酵培養(yǎng)基玉米粉2g/100mL、酵母粉0. 3g/100mL、磷酸二氫鉀0. 2g/100mL、硫酸鎂 0.05g/100mL ；
培養(yǎng)方法將培養(yǎng)好的種子以15%的接種量接入搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基中25°C，150r/ min,振蕩培養(yǎng)7d ；
(4)發(fā)酵液濃縮，脫蛋白，脫色，凝膠柱層析，透析
培養(yǎng)后離心，取上清液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮后用木瓜蛋白酶和kvage法聯(lián)合去除游離蛋白，先在5%的糖溶液中加入(w/v)的木瓜蛋白酶于58士2°C，pH6.5條件下反應4h，然后按發(fā)酵液1/5的體積加入氯仿，然后加入氯仿體積1/5的正丁醇，混合后振蕩 20min。蛋白質(zhì)與氯仿-正丁醇生成凝膠，4000rpm離心20min，收集上清液，反復操作8次至氯仿-正丁醇層不渾濁為止。往脫蛋白后的溶液中加入氫氧化鈉溶液，調(diào)至pH值8. 0左右，50°C以下滴加20%過氧化氫，至淺黃色，保溫2h。將多糖溶液逐滴加入4°C無水乙醇中， 至乙醇濃度達到80 %，出現(xiàn)白色沉淀，4 °C條件下靜置過夜，離心，用95 %乙醇、無水乙醇、 丙酮洗滌數(shù)次。待有機溶劑揮發(fā)完畢，將沉淀物用蒸餾水完全溶解，用kphadex G-200凝膠層析對多糖進行純化，流動相為0. IM NaCl，流速0. 5mL/min,每管3mL。以苯酚-硫酸法在490nm處檢測每管的糖濃度，測定該多糖的純度。多糖復溶后裝入透析袋中，扎緊袋口， 懸浮于蒸餾水中，透析48h，中間每隔12小時換水一次，左后冷凍干燥，得多糖樣品，采用苯酚-硫酸法測總糖含量，為98. 4%。
實例二
將制備得到的茶樹菇發(fā)酵液多糖進行抗氧化活性實驗，以蒸餾水為空白對照，以抗壞血酸為陽性對照，數(shù)據(jù)經(jīng)SPSS13. 0軟件分析。
1.實驗方法
(1)還原力測定
在具塞試管中加入適量不同濃度的茶樹菇多糖樣品(0. 10-1.0mg/mL)、0.2mL PBS (2. 0M, pH 6. 6)和0. 5mL 鐵氰化鉀溶液。置50°C恒溫水浴中反應20min，迅速冷卻，再加入適量的10% (w/v)三氯乙酸溶液，3000*g離心lOmin，取上清液1. 5mL，加入 0. 2mLl%三氯化鐵溶液和3. OmL去離子水，振蕩均勻，靜置5min，在λ 700處以蒸餾水為空白測定其吸光值。鐵氰化鉀[Kfe(CN)6]可被還原試劑還原成亞鐵氰化鉀[K/e(CN)6]，亞鐵氰化鉀再和鐵離子作用生成普魯士藍，在OD7tltlnm處有最大吸收值，以檢測其還原力。吸光值越大，說明其還原力越高。
(2)對羥自由基的清除
在試管中依次加入0. 2mL不同濃度的茶樹菇多糖樣品(0. 10-1. Omg/mL)，2. OmL的 EDTA-Fe (0. 15mM)，0. 8mL 水楊酸鈉(2. OmM)，2. OmLH2O2 (6. OmM)，0. 8mL 去離子水。37°C反應 60min,于λ 510處測得不同茶樹菇多糖濃度下的吸光值A(chǔ)i,用水替代茶樹菇多糖時的吸光值~，用水代替多糖和H2O2時測得空白對照吸光值A(chǔ)tl.按下式計算羥自由基(· OH)的清除率· OH 清除率(％ ) = [ (Ai-Aj) / (A0-Aj) ] X 100
(3)對超氧陰離子的清除
ImL的不同濃度(0. 10-1. Omg/mL)的茶樹菇多糖樣品以及2mL的Tris-HCl (16mM, pH 8. 0)溶解的76 μ M的NBT和394 μ M的NADH，加0. 4mL的56 μ M PMS，振蕩均勻，室溫反應5min，用Tris-HCl代替樣品反應作為空白對照，測定A560nm值。
(4)對DPPH ·自由基的清除
樣品管中加入0. 5mL不同濃度的多糖溶液(0. 10-1. Omg/mL)與3. OmL的0. 004% 溶于95%乙醇的DPPH溶液；對照管用95%乙醇代替DPPH溶液；空白管用蒸餾水代替多糖溶液。以上三組置于室溫靜置301^11后，用0.551^蒸餾水和3.01^ 95%的乙醇調(diào)零，于 517nm處測定吸光值。
結(jié)果顯示
(1)還原力測定試驗組和陰性對照組比較，P < 0.01，顯示在還原力方面兩者有高度顯著性差異，表明其具有一定的還原力；試驗組不同濃度的多糖之間進行比較時，P > 0. 05，表明試驗組不同濃度之間的還原力沒有顯著性差異；試驗組與陽性對照組相比，P < 0. 05，表明多糖的還原力不及抗壞血酸。
(2)對羥基自由基的清除試驗組和陰性對照組比較，P < 0.05，顯示兩者在對羥基自由基的清除方面有顯著性差異，表明茶樹菇多糖具有一定的清除羥基自由基能力；試驗組不同濃度的多糖之間進行比較時，當濃度小于0. 2mg/mL,P < 0. 05時，濃度大于0. 4mg/ mL時，P < 0. 05，表明多糖從0. 2mg/mL開始隨著濃度的升高，其清除羥基自由基的能力增強；試驗組與陽性對照組相比，P < 0. 05，表明多糖對羥基自由基的清除能力不及抗壞血酸。
(3)對超氧陰離子的清除能力試驗組和陰性對照組比較，P < 0. 05，顯示兩者對超氧陰離子的清除率有顯著性差異，前者清除超氧陰離子的能力高于后者；試驗組不同濃度的多糖之間進行比較時，P < 0. 05，表明隨著多糖濃度的增大，清除能力也相應增強，達到一定濃度時，趨于穩(wěn)定；試驗組與陽性對照組相比，P < 0. 05，表明多糖對超氧陰離子的清除能力不及抗壞血酸。
(4)對DPPH的清除能力試驗組和陰性對照組比較，P < 0. 01，顯示兩者在對DPPH 的清除能力方面有高度顯著性差異，表明多糖具有一定的清除DPPH能力；試驗組不同濃度的多糖之間進比較時，P > 0. 05，表明試驗組不同濃度之間對DPPH的清除能力沒有顯著性差異；試驗組與陽性對照組相比，P < 0. 05，表明多糖對DPPH的清除能力不及抗壞血酸。
權(quán)利要求
1.一種具有抗氧化活性的茶樹菇發(fā)酵液多糖的制備方法，其特征在于多糖外觀為白色或淡黃色粉末，是將茶樹菇子實體通過組織分離法接入固體斜面培養(yǎng)基上培養(yǎng)，待長好后移至搖瓶種子液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，將培養(yǎng)好的種子液接入搖瓶發(fā)酵液體培養(yǎng)基培養(yǎng)，發(fā)酵結(jié)束后，離心取上清液濃縮，乙醇沉淀，脫蛋白，脫色，凝膠層析柱純化，透析后冷凍干燥得到茶樹菇發(fā)酵液多糖，多糖含量為98. 4%，最后進行體外抗氧化實驗，顯示該多糖具有一定的抗氧化活性。
2.權(quán)利要求1所述的脫蛋白，其特征在于用木瓜蛋白酶和kvage法聯(lián)合去除游離蛋白，先在5%的糖溶液中加入(w/v)的木瓜蛋白酶于58士2°C，pH6.5條件下反應4h，然后按發(fā)酵液1/5的體積加入氯仿，然后加入氯仿體積1/5的正丁醇，混合后振蕩20min，蛋白質(zhì)與氯仿-正丁醇生成凝膠，4000rpm離心20min，收集上清液，反復操作8次至氯仿-正丁醇層不渾濁為止。
3.如權(quán)利要求1所述的凝膠層析柱純化，其特征在于用的是葡聚糖凝膠G-200填料。
全文摘要
本發(fā)明屬生物工程技術(shù)應用領(lǐng)域，具體涉及一種具有抗氧化活性的茶樹菇發(fā)酵液多糖的制備方法。該茶樹菇發(fā)酵液多糖為白色或淡黃色粉末，是茶樹菇通過深層發(fā)酵獲得的發(fā)酵液經(jīng)過濃縮、乙醇沉淀、脫蛋白、脫色、葡聚糖凝膠柱G-200層析、透析、冷凍干燥得到的。用苯酚-硫酸法測得多糖含量為98.4％，具有抗氧化活性，可應用于制備具有抗氧化，防衰老功能的保健品。
文檔編號C12R1/645GK102533903SQ20111041993
公開日2012年7月4日 申請日期2011年12月15日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月15日
發(fā)明者滕麗萍, 程詠梅, 鄧超, 陳敬華 申請人:江南大學