本發(fā)明涉及醫(yī)藥保健領域，具體地說，涉及一種增強免疫力的海參西洋參枸杞子口服液及其制備方法。
背景技術：
在當今社會，老齡化趨勢顯著，并且由于生活節(jié)奏加快，工作繁重生活壓力大,很多人長期處于生活壓力下，或者因年齡、生活習慣、飲食營養(yǎng)等眾多原因使身體物質代謝處于不協(xié)調的內環(huán)境下，處于易疲勞、免疫力低下狀態(tài)，危害自身健康。
海參具有滋陰補腎、養(yǎng)血益精、增強免疫力和預防心血管疾病等功效，有很高的滋補和藥用價值,但是海參中特有的膠原蛋白能夠包裹一些蛋白質類營養(yǎng)成分，導致其中的蛋白質有效利用率僅約為20％。海參肽是以鮮活海參為原料，經(jīng)蛋白酶水解分離純化后制得的小分子肽為主，多種功效成分共存的蛋白質水解產(chǎn)物，具有溶解性好、吸收率高、生物效價高、食用安全等多種優(yōu)點。近些年來研究結果表明，海參肽幾乎可以被100％吸收利用，且具有抗氧化、降血壓、抗腫瘤和提高機體免疫力等功效。傳統(tǒng)海參肽制備工藝酶成分單一、制備的肽分子量范圍太寬，往往存在大分子、小分子共存，肽段不均一的情況，研究工藝可控、制備高純度、相對均一的海參肽提取技術具有重要現(xiàn)實意義。
傳統(tǒng)海參加工時需要高溫煮泡，水煮液富含海參多肽、多糖、脂肪酸、皂苷等高附加值的物質，但是一般都被當成廢棄物排放掉，這不僅造成環(huán)境污染，也是對海參資源的一種極大浪費。
西洋參含有人參皂苷、揮發(fā)油、糖類及多種微量元素等，其中主要有效成分為人參皂苷，具有顯著的增強免疫力，抗癌，抗衰老等作用。
枸杞子，又名枸杞，性味甘，平，歸肝、腎經(jīng)，具有滋補肝腎，益精明目的功效，用于虛勞精虧，醫(yī)膝酸痛，眩暈耳鳴，內熱消渴，血虛萎黃，目昏不明。
西洋參性味苦、微甘，寒；有補氣養(yǎng)陰，清火生津的功效。海參性味甘咸，微溫，有補腎益精，養(yǎng)血潤燥的功效。兩藥合用，可補氣養(yǎng)血，益腎潤燥，是很好的滋補品。本發(fā)明旨在將水生海參和陸生西洋參相結合，并復配枸杞子等主要功能性物質，制備一種增強免疫力的口服液，該口服液吸收利用率高，效果顯著，同時考慮了海參加工時廢水的循環(huán)利用問題。
技術實現(xiàn)要素：
本發(fā)明所要解決的技術問題是提供一種將海參肽、皂苷(海參皂苷和西洋參皂苷)、枸杞多糖工程化提取和海參水煮液回收利用的方法，提取物經(jīng)復配、滅菌等工藝制備保健口服液。制得的口服液具有易吸收、減輕腸胃負擔的特點，同時科學配伍肽、皂苷、多糖成分，可增強免疫力，特別適合老年人、慢性病康復期人群和術后恢復者食用。
本發(fā)明的技術方案：
本發(fā)明涉及一種海參西洋參雙參口服液，其含有海參、西洋參、枸杞子、木糖醇、山梨酸鉀、水，其特征在于按照以下重量配制原料：海參40-50g、西洋參8-13g、枸杞子9-15g、木糖醇8-18g、山梨酸鉀0.1-0.4g、水總量1000ml。
一種增強免疫力的雙參口服液的制備方法，按照以下步驟制備進行：
1、海參肽提純
1)前處理：將驗收合格的鮮活海參，沿腹部從頭至尾全剖開，去除內臟，清洗干凈，在水中煮沸5min-45min，蒸煮用水收集留用；
2)脫鹽：用粉碎機將海參打成海參糜，用10-20倍體積的純化水泡發(fā)12-18小時脫鹽，每3-5小時換水一次，離心分離；
3)均質：向肉糜中加蒸餾水，使海參肉糜與水以1∶3-5的質量比混合，然后利用均質機使海參肉糜與水充分混合；
4)酶解：準確稱量占海參肉糜重量3-5％的復合風味蛋白酶，加入海參肉糜水溶液中，在40-60℃的水浴中酶解反應1-4h，整個酶解過程中用攪拌器不斷的攪拌得到海參酶解液。
5)分子量截留：將海參酶解液通過5微米、0.22微米濾膜過濾，取濾液利用密理博切向流超濾系統(tǒng)截留分子量小于2000道爾頓的海參肽。
6)滅活：升溫至95-100℃，滅酶活10-12min。
2、將西洋參、枸杞子用粉碎機粉碎成100-300目后，加入6-10倍水浸泡4-6h，放入提取罐中水提2次，每次1-2h，藥渣棄去，將2次水煎液合并真空濃縮，得濃縮液。
3、海參蒸煮用水經(jīng)粗濾(200目篩網(wǎng))、精濾(0.22微米濾膜)、脫鹽脫色去重金屬(大孔樹脂)，煮沸蒸煮5-15min。將木糖醇、山梨酸鉀按量加入其中溶解，再將濃縮液、海參肽液加入混合，加入適量水定容，攪拌10-20min。
4、將攪拌均勻的料液通過灌裝機進行灌裝封口，再用壓力蒸汽滅菌柜滅菌，得成品。滅菌溫度為115-121℃，壓力為0.10-0.13mpa，時間15-20分鐘。
本發(fā)明的有益效果是：
1.采用復合風味蛋白酶，控制酶解溫度，酶解徹底，且酶解液口感好；
2.采用切向流截留技術，獲得分子量小于2000道爾頓的海參肽，提取液純度更高，分子量分布相對集中，療效更佳可控；
3.運用現(xiàn)代工藝對海參蒸煮用水進行去雜提純，高溫水解制備水解液，發(fā)明一種零排放、環(huán)境友好型的口服液制備方法。
具體實施方式
以下對本發(fā)明作進一步說明。
實施例1
本實施例各組分的重量以總量1000ml計，海參45g、西洋參12g、枸杞子9g、木糖醇12g、山梨酸鉀0.18、水余量。
制備步驟如下：
1、海參肽提純
1)前處理：將驗收合格的鮮活海參，沿腹部從頭至尾全剖開，去除內臟，清洗干凈，在水中煮沸10min，蒸煮用水收集留用；
2)脫鹽：用粉碎機將海參打成海參糜，用20倍體積的純化水泡發(fā)12小時脫鹽，每3小時換水一次，離心分離；
3)均質：向肉糜中加蒸餾水，使海參肉糜與水以1：3的質量比混合，然后利用均質機使海參肉糜與水充分混合；
4)酶解：準確稱量占海參肉糜重量5％的復合風味蛋白酶，加入海參肉糜水溶液中，在40-60℃的水浴中酶解反應1h，整個酶解過程中用攪拌器不斷的攪拌得到海參酶解液；
5)分子量截留：將海參酶解液通過5微米、0.22微米濾膜過濾，取濾液利用密理博切向流超濾系統(tǒng)截留分子量小于2000道爾頓的海參肽；
6)滅活：升溫至100℃，滅酶活10min。
2、將西洋參、枸杞子用粉碎機粉碎成100目后，加入6倍水浸泡4-6h，放入提取罐中水提2次，每次2h，藥渣棄去，將2次水煎液合并真空濃縮，得濃縮液。
3、海參蒸煮用水經(jīng)粗濾(200目篩網(wǎng))、精濾(0.22微米濾膜)、脫鹽脫色去重金屬(大孔樹脂)，煮沸蒸煮15min。將木糖醇、山梨酸鉀按量加入其中溶解，再將濃縮液、海參肽液加入混合，加入適量水定容，攪拌20min。
4、將攪拌均勻的料液通過灌裝機進行灌裝封口，再用壓力蒸汽滅菌柜滅菌，得成品。滅菌溫度為121℃，壓力為0.13mpa，時間15分鐘。
實施例2
本實施例各組分的重量以總量1000ml計，海參50g、西洋參8g、枸杞子15g、木糖醇8g、山梨酸鉀0.3g、水余量。
1、海參肽提純
1)前處理：將驗收合格的鮮活海參，沿腹部從頭至尾全剖開，去除內臟，清洗干凈，在水中煮沸45min，蒸煮用水收集留用；
2)脫鹽：用粉碎機將海參打成海參糜，用15倍體積的純化水泡發(fā)16小時脫鹽，每4小時換水一次，離心分離；
3)均質：向肉糜中加蒸餾水，使海參肉糜與水以1:5的質量比混合，然后利用均質機使海參肉糜與水充分混合；
4)酶解：準確稱量占海參肉糜重量5％的復合風味蛋白酶，加入海參肉糜水溶液中，在60℃的水浴中酶解反應4h，整個酶解過程中用攪拌器不斷的攪拌得到海參酶解液。
5)分子量截留：將海參酶解液通過5微米、0.22微米濾膜過濾，取濾液利用密理博切向流超濾系統(tǒng)截留分子量小于2000道爾頓的海參肽。
6)滅活：升溫至95℃，滅酶活10min。
2、將西洋參、枸杞子用粉碎機粉碎成300目后，加入10倍水浸泡6h，放入提取罐中水提2次，每次2h，藥渣棄去，將2次水煎液合并真空濃縮，得濃縮液。
3、海參蒸煮用水經(jīng)粗濾(200目篩網(wǎng))、精濾(0.22微米濾膜)、脫鹽脫色去重金屬(大孔樹脂)，煮沸蒸煮15min。將木糖醇、山梨酸鉀按量加入其中溶解，再將濃縮液、海參肽液加入混合，加入適量水定容，攪拌20min。
4、將攪拌均勻的料液通過灌裝機進行灌裝封口，再用壓力蒸汽滅菌柜滅菌，得成品。滅菌溫度為115℃，壓力為0.13mpa，時間20分鐘。
實施例3
將實施例1制得的口服液進行如下實驗，檢測其對巨噬細胞吞噬能力的影響，驗證其提高非特異性免疫力方面的功效。
1、實驗方法
用含10％胎牛血清的1640培養(yǎng)基培養(yǎng)巨噬細胞(raw264.7)，調整細胞濃度，將其接種于96孔細胞培養(yǎng)板中，使得細胞濃度為2×104個/孔，然后加入不同濃度樣品，使被測樣終濃度分別為1/1000原液、1/500原液、1/100原液、1/20原液、1/10原液。以空白培養(yǎng)基為對照。培養(yǎng)24小時之后吸去培養(yǎng)基，用pbs洗滌多余的培養(yǎng)基，加入0.08％中性紅，37℃下，5％co2孵育30min，pbs洗凈多余中性紅，加細胞裂解液(無水乙醇：冰醋酸＝1:1，體積比)，混勻后在酶標儀上540nm處測吸光度值，通過吸光值的大小評價樣品促進巨噬細胞吞噬中性紅能力。
2、數(shù)據(jù)統(tǒng)計
吞噬率＝od樣品組/od空白組
實驗結果見下表：
表1：樣品對巨噬細胞(raw264.7)吞噬中性紅能力的影響
注：*<0.05**<0.01代表各給藥組與陰性對照組比較的結果
結果分析：
樣品在1/1000原液、1/500原液時，對巨噬細胞吞噬中性紅的能力基本無作用，但是在1/100原液、1/20原液、1/10原液時吞噬能力明顯提高，且具有統(tǒng)計學意義。說明樣品具有促進非特異性免疫的功能。
實施例4
將實施例2制得的口服液進行動物實驗，利用免疫低下小鼠模型驗證雙參口服液對提高機體免疫力的實際效果。
1、實驗方法
動物適應性飼養(yǎng)5d,隨機分為6組，每組10只。除正常組外，各組在首次注射地塞米松處理后次日開始給藥，隔日腹腔注射地塞米松(40mg/kg·d)，連續(xù)5次，建立免疫低下模型。正常組、模型組灌胃生理鹽水，陽性對照組灌胃左旋咪唑(25mg/kg·d,現(xiàn)用現(xiàn)配)，實驗組灌胃不同濃度的口服液(5、10和20ml/kg·d)，即低、中、高劑量組，按照小鼠體質量0.1ml/10g灌胃，連續(xù)給藥21d。然后分別進行如下實驗：
1.1免疫器官重量的測定
于末次給藥后次日，稱重和處死小鼠，取脾，胸腺，稱重。計算小鼠脾指數(shù)及胸腺指數(shù)。
脾指數(shù)＝脾/體重(mg/g)胸腺指數(shù)＝胸腺/體重(mg/g)
1.2血液學指標測定
于末次給藥后次日，用edta抗凝管，眼內眥取血，用全自動血細胞分析儀分析白細胞和淋巴細胞數(shù)。
*
1.3血漿免疫球蛋白的測定
小鼠于末次給藥后次日，眼內眥取血，分離血漿，按照elisa試劑盒方法分別測定血漿中抗體iga、igg的含量。
1.4碳粒廓清能力的檢測
于末次給藥后次日，分別稱重小鼠。把印度墨汁3倍稀釋后，尾靜脈注入小鼠體內(0.1ml/10g),注入后第2min和第10min分別從內眥靜脈叢取血20μl，并將其加到2ml0.1％na2co2中，紫外分光光度計測定600nm處od值，并且稱量小鼠的體重、脾臟和肝臟。計算廓清指數(shù)k值及吞噬指數(shù)α。
廓清指數(shù)k＝(logod2—logod10)/t10—t2
吞噬指數(shù)α＝體重/(肝重+脾重)×k1/3
2、實驗結果
2.1對免疫器官重量影響
由表2可知，給與地塞米松造模后，小鼠脾指數(shù)與胸腺指數(shù)明顯降低(p<0.01)，與文獻報道一致。給與口服液后，與模型組相比，小鼠的脾指數(shù)與胸腺指數(shù)得到明顯恢復。脾指數(shù)上，低、中劑量組具有極其顯著性差異(p<0.01)，高劑量組有統(tǒng)計學意義(p<0.05)；胸腺指數(shù)上，中、高劑量組有統(tǒng)計學意義(p<0.05)。這初步顯示口服液能夠增強小鼠的免疫功能。
表2口服液對小鼠脾指數(shù)及胸腺指數(shù)的影響
注：**p<0.01，與正常組對照組比較；#p<0.05，##p<0.01與模型組比較；x±s，n＝10
2.2血液學指標測定
地塞米松是臨床常用的免疫抑制劑，能夠造成免疫功能低下，引起白細胞數(shù)量減少。表3表明，口服液能夠抵抗由地塞米松引起的小鼠外周血白細胞數(shù)量及淋巴細胞數(shù)量減少。相對模型組，中、高劑量能夠提高白細胞總數(shù)達75％、46％(p<0.05)。另外，不同劑量組均能夠提高淋巴細胞量(p<0.01)。
表3口服液對小鼠外周血白細胞及淋巴細胞的影響
注：**p<0.01，與正常組對照組比較；#p<0.05，##p<0.01與模型組比較；x±s，n＝10
2.3血漿免疫球蛋白的測定
外分泌抗體的水平，反應動物的體液免疫功能。下表顯示，不同劑量的口服液能夠不同程度的提高免疫低下小鼠抗體iga和igg的表達。與模型組相比，其中低、高劑量恢復iga的效果有顯著性差異(p<0.01)，中劑量有統(tǒng)計學差異(p<0.05)；另外，中劑量顯著性恢復igg的表達(p<0.01)，高劑量的作用效果也具有統(tǒng)計學意義(p<0.05)。這說明，口服液能夠改善免疫低下小鼠的體液免疫能力。
表4口服液對小鼠抗體表達的影響
2.4碳粒廓清能力的檢測
正常組吞噬細胞的吞噬活性明顯高于模型組(p<0.05)，說明模型成功。陽性藥左旋咪唑相對于模型組，吞噬能力得到一定程度的恢復(p<0.05)，與文獻報道一致。給與口服液組均能夠提升地塞米松引起的吞噬活性降低，其中低劑量組差異性顯著(p<0.01)，中、高劑量組也有統(tǒng)計學意義(p<0.05)。(表2)上述結果表明，口服液能顯著提高免疫功能低下小鼠的非特異性免疫功能。
表5口服液對小鼠炭粒廓清能力的影響
注：**p<0.01，與正常組對照組比較；#p<0.05，##p<0.01與模型組比較；x±s，n＝10
3、結果分析
許多研究表明：海參、西洋參、枸杞子都具有免疫調節(jié)能力，但是對于三者混合提取后是否具有類似的活性尚不清楚。本實驗中，對三者的提取物，即海參西洋參枸杞子口服液作用于免疫低下小鼠模型，觀察其對小鼠免疫能力的調節(jié)作用。
結果表明：口服液能增加小鼠免疫器官胸腺及脾的重量；增加小鼠末梢血白細胞尤其淋巴細胞的數(shù)量；提高小鼠igg和iga抗體分泌的功能；提高小鼠碳粒廓清能力，多途徑的提高小鼠的免疫功能。
實施例5
將實施例2制得的口服液利用油酸誘導hepg2細胞模型，驗證其在降脂方面的潛在功效。
1、模型說明
本實驗利用油酸(oleicacid,oa)作用于人肝癌細胞hepg2，導致細胞內脂質堆積，并使用降脂藥物辛伐他汀(simvastatin)作為陽性藥，起到降脂效果。油紅o染色后通過對比od358來比較化合物降脂效果。本模型可用來篩選潛在的具有降脂活性的化合物。
2、實驗方法
取對數(shù)生長期hepg2細胞12000個/孔接種于96孔板，100μl/孔；12h后融合度達到70-80％后換成無血清dmem培養(yǎng)基，每孔80μl，饑餓12h；12h后，空白對照加入20μl無血清培養(yǎng)基，其他組每孔加入誘導劑oa(終濃度80um)，10μl/孔；在此基礎上，模型組補充10μl無血清培養(yǎng)，給藥組加入10μl待測化合物，培養(yǎng)箱孵育24h；24h孵育完畢后，棄掉培養(yǎng)基，用pbs(室溫)緩沖液洗1次，每孔加入80μl4％多聚甲醛固定液室溫固定0.5h，pbs洗1次，60％異丙醇潤洗10min后每孔加入60μl0.3％油紅o(sigmao0625)染液室溫染色1h，然后用pbs緩沖液洗3次；用dmso溶解，100μl/孔，酶標儀358nm處測od值。
3、實驗結果
表6口服液體外降脂活性結果
結果分析：
通過對比od358，模型(oa)組可明顯誘導脂質堆積，陽性藥辛伐他汀在10μm能顯著性(p<0.01)降低胞內脂質含量，具有統(tǒng)計學意義。待測樣品海參肽稀釋20倍劑量下，有顯著(p<0.05)的降脂效果。
實施例6
將實施例2制得的口服液作用于蛋白酪氨酸磷酸酶1b(ptp1b)，通過體外活性抑制實驗，驗證口服液是否具有提高胰島素敏感性、輔助降血糖的功效。
1、模型說明
ptp1b是在體內廣泛分布的酪氨酸磷酸酶，主要通過對胰島素受體底物-1(irs-1)和胰島素受體底物-2(irs-2)的脫磷酸化作用，負向調控胰島素信號的傳導。經(jīng)過抑制ptp1b的活性，提高胰島素的敏感性，已經(jīng)成為治療ⅱ型糖尿病和肥胖癥的新靶點。
本實驗采用mes緩沖液為反應體系，利用人源蛋白酪氨酸磷酸酶1b(ptp1b)，以對硝基苯磷酸二鈉(pnpp)為特異性底物，選擇原釩酸鈉作為陽性藥、以dmso為陰性對照，建立了基于酶反應速率的96孔微板為載體的篩選模型，通過酶學方法尋找ptp1b抑制劑。
2、實驗方法
反應采用mes緩沖體系(25mm，ph6.5)，在96孔板內依次加入10μlpnpp(77mm)、86μlmes緩沖液、4μl化合物(2mm)、100μlptp1b溶液(50nm)，反應總體積為200μl。每組3個平行，以dmso為陰性對照，原釩酸鈉(2mm)為陽性對照，25℃下，在搖床上搖動1min，酶標儀上每隔60s讀數(shù)一次，動態(tài)測定5min，測其od405的變化(od/min)。每個孔的初始階段反應速率呈線性相關，動力學曲線線性部分的斜率決定ptp1b的反應速度，以速度表示酶活?；衔飳tp1b的抑制率計算公式：
抑制率(％)＝(νdmso-ν樣本)/νdmso*100
νdmso表示陰性對照組的初始平均反應速率，ν樣本表示化合物的初始平均反應速率。
3、實驗結果
海參西洋參枸杞子口服液對ptp1b活性的抑制結果如表7所示：與陰性對照組相比，陽性對照組(原釩酸鈉組，原釩酸鈉是一種磷酸酶抑制劑)對ptp1b的抑制率為95.37％(p＜0.01)；對口服液原液稀釋20倍后評價其對ptp1b的抑制活性，結果可見1/20原液可以顯著抑制ptp1b的酶活，抑制率為80.46％(p＜0.01)。
由此可推斷，按照實施例2制備的口服液可以通過抑制ptp1b酶活，提高胰島素的敏感性，從而達到輔助降血糖的效果。
表7海參西洋參枸杞子口服液對ptp1b活性的抑制結果
注：與陰性對照組相比較，*p＜0.05，**p＜0.01。
結合實施例3-6可以看出，本發(fā)明海參西洋參枸杞子口服液具有增強免疫力的顯著功效，實驗還證明其具有顯著的降脂效果，另外，通過提高胰島素敏感性達到顯著的降血糖效果。
以上具體實施方式僅用以說明本發(fā)明的技術方案而非限制，盡管參照較佳實施例對本發(fā)明進行了詳細說明，本領域的普通技術人員應當理解，可以對本發(fā)明的技術方案進行更動、潤飾或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術方案的精神和范圍，其均應屬于本發(fā)明的權利要求保護范圍當中。